KR20180049238A - 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 - Google Patents
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Abstract
목적하는 표적화된 단백질의 발현 및/또는 위치결정을 증진시키는데 사용하기 위한, 세포내 상실된 기능을 복구시키기 위한, 그리고, 질환을 치료하기 위한, 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질 및 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 기술되어 있다. 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 파트너로 변형된 목적하는 표적 단백질을 포함하는 추가의 융합 단백질도 개시되어 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은, 2012년 12월 5일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/733,884호 및 2012년 12월 5일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/733,743호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
본 발명은 가공된 단백질(engineered protein)의 분야이다. 특히, 본 발명은, 단백질의 발현을 증진시키기 위한 폴리펩타이드 및 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 목적하는 단백질의 생산 수준을 증가시키는 방법도 또한 제공된다.
연구, 개발 또는 상업적 사용을 위해 충분한 양으로 용이한 단리를 가능하게 하는 수준으로의 유전학적으로 가공된 세포의 배양시의 목적하는 단백질의 발현은, 다양한 재조합 기술 및 세포 배양 방법의 최적화를 필요로 한다. 상기 기술은, 목적하는 단백질 분자를 암호화하기 위한 핵산 분자를 단리하고 재조합하고, 상기 목적하는 암호화 서열을 적절한 전사 및 번역 요소들과 작동적으로 연결시키고, 상기 가공된 유전자 물질을 적절한 발현 벡터에 삽입시키고, 상기 수득한 재조합 발현 벡터를 상용성(compatible) 숙주 세포에 도입하고, 목적하는 재조합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 재조합 발현 벡터를 함유하는 상기 숙주 세포를 배양하는, 시험관내 방법을 포함한다. 상기 방법의 적절한 선택 및 최적화는, 세균, 진균류, 곤충, 식물 및 포유동물 숙주 세포를 포함하는 다양한 숙주 세포로부터 다양한 재조합 단백질의 발현 및 사용을 가능하게 하였다.
재조합 및 세포 배양 방법의 많은 진전에도 불구하고, 적절한 단백질의 폴딩을 보장하는 것의 문제점은, 유용한 양의 목적하는 재조합 단백질을 생산하기 위한 가장 고된 노력들을 여전히 좌절시킬 수 있다. 모든 단백질은 이들의 의도된 위치에서 적절히 기능하기 위해서는 적절한 2차원 및 3차원 입체배좌(conformation)를 성취해야만 한다. 적절한 입체배좌는 단백질이 이의 의도된 위치(예를 들어, 세포질, 핵, 세포내 구조, 기관, 세포막 또는 세포외 (분비된) 위치)에서 이의 의도된 기능(예를 들어, 효소적 활성, 신호 전달 또는 구조적 특징)을 갖는 세포 또는 다-세포 유기체를 제공할 것임을 보장한다. 적절한 구조 및 입체배좌를 위한 정보가 단백질의 아미노산 서열에 존재하지만, 일반적인 세포내 환경 및 다양한 자극, 및 산화 스트레스, 영양물 고갈 및 고온을 포함하는 환경적 스트레스는 심지어 내인성으로 생산된 단백질의 적절한 폴딩을 더 어렵게 하여 많은 단백질 분자는 목적하지 않는 구조를 취하게 되어 이들의 의도된 기능을 갖는 세포를 제공하는데 실패할 수 있다. 적절한 기능적 입체배좌를 달성하거나 유지하지 못하게 되는 계속적인 위험을 다루기 위해, 세포는, 초기 및 성숙한 단백질의 이의 적절한 입체배좌로의 폴딩 및 재폴딩을 돕기 위해 분자 샤페론(chaperone)으로서 작용하는 단백질 시스템을 소유한다. 열 충격 70kDa 단백질(본원에서 "Hsp70s"로서 언급됨)은, 다양한 종의 세포에서 가장 흔한 부류의 샤페론 단백질 중 하나를 구성한다. 상기 Hsp70 기구는, J 단백질과 같은 보조인자(또는 보조샤페론) 단백질 및 뉴클레오타이드 교환 인자(NEF)의 관여를 포함한다.
단백질을 폴딩하기 위한 Hsp70 샤페론 기구의 현재 모델에서, Hsp70은 ATP- 및 ADP-결합된 상태 사이를 주기적으로 반복한다. 상기 모델에서, J 단백질은 폴딩 또는 재폴딩을 필요로 하는 단백질("클라이언트 단백질"로서 언급됨)에 결합하고 ATP-결합된 상태의 Hsp70(Hsp70-ATP)과 상호작용한다. J 단백질-클라이언트 복합체에 의한 Hsp70-ATP로의 결합은, ATP 가수분해를 자극하고, 이는 헬릭스 리드(helix lid)를 폐쇄시키는 Hsp70 단백질에서의 입체배좌적 변화를 야기하여 클라이언트 단백질과 Hsp70-ADP 사이의 상호작용 및 다른 클라이언트 단백질에 결합하기 위해 유리되는 J 단백질의 방출을 안정화시킨다. Hsp70-ADP에 결합되어 있는 동안, 상기 클라이언트 단백질에 적절한 입체배좌로의 폴딩 또는 재폴딩을 허용하는 환경이 제공된다. 이어서, 뉴클레오타이드 교환 인자(NEF)는 Hsp70-ADP에 결합하여 ADP의 방출 및 ATP의 결합을 초래한다. 이어서, 상기 클라이언트 단백질은 Hsp70-ATP에 대한 이의 낮은 친화성(J 단백질의 부재시) 때문에 방출된다. 상기 클라이언트 단백질이 적절한 입체배좌를 성취하지 못하는 경우, 이것은 J 단백질에 의해 재결합될 수 있고 다시 상기 주기에 진입한다. 문헌[Kampinga et al., Nat. Rev., 11: 579-592 (2010)]을 참조한다. 따라서, 상기 모델에 따르면, J 단백질은 개별 클라이언트 단백질 및 또한 Hsp70 샤페론 단백질과 연합하여 광범위한 클라이언트 단백질의 Hsp70 기구로의 포획 및 굴복(submission)을 촉진시키는 브릿지 기능을 제공함에 의해 적절한 입체배좌로의 폴딩 또는 재폴딩을 촉진시킴으로써 Hsp70 기구에서 중요한 역할을 수행한다. Hsp70 샤페론 기구에 의한 시도가 단백질을 적절한 기능성 입체배좌로 폴딩시키거나 재폴딩시키는데 실패하는 경우, 상기 Hsp70 샤페론 기구는 또한 아미노산의 분해 및 재사이클링을 위해 부적절하게 폴딩된 단백질을 세포의 단백질분해 시스템(예를 들어, 프로테오좀)으로 전달하는 것을 촉진시킬 수 있다. J 단백질의 중요한 역할을 포함하는 Hsp70 샤페론 기구의 검토를 위해, 문헌[Kampinga et al, Nature Rev., 11: 579-592 (2010) 및 Voisine et al., Neurobiol. Dis., 40: 12-20 (2010)]을 참조한다.
따라서, 발현된 단백질은 적절한 입체배좌를 유지하기 위해 Hsp70 기구의 엄격한 품질 제어 시스템에 적용된다. 적절한 단백질 폴딩의 문제점은, 다양한 재조합 숙주 세포에서 발현되는 유용한 양의 기능성 외인성(재조합) 단백질을 생산하는 경우에 특정 쟁점이 된다. 상기 문제점은 진핵생물 및 원핵생물 숙주 세포 둘 다에서 발생할 수 있다. 세균 숙주 세포에서 발현되는 외인성 단백질의 적절한 폴딩의 실패는, 세포내 대형의 잠재적으로 독성인 외인성 단백질의 불활성 분자의 응집체를 형성시킬 수 있다. 상기 응집체는 "봉입체(inclusion body)"로서 언급되고 소수성 도메인의 노출과 함께 비기능성 입체배좌를 유도하여 결과적으로 다른 부적절하게 폴딩된 단백질 분자와의 연합 및 응집을 촉진시키는 비효과적인 단백질의 폴딩 때문인 것으로 생각된다.
단백질을 암호화하는 야생형 유전자가 돌연변이를 겪는 경우, 암호화된 돌연변이 형태의 단백질은 여전히 세포에서 발현될 수 있다. 상기 발현된 돌연변이 단백질은 통상적으로 적절한 기능성 입체배좌의 야생형 단백질을 성취하는데 실패하고 불활성 응집체를 형성할 수 있다. 상기 부적절하게 폴딩된 돌연변이 단백질 종은 전형적으로 Hsp70 기구에 의해 아미노산의 분해 및 재순환을 위해 세포의 단백질분해 시스템으로 도입된다. 물론, 부적절하게 폴딩된 돌연변이 단백질의 제거는, 여전히 세포의 기능성 단백질이 상실된 세포를 남기고 상기 기능 상실의 결과는 세포를 약화시키거나 심지어 치명적일 수 있다. 사실, 적절히 폴딩된 기능성 단백질 종의 상실은 입증되었거나, 프리온-관련 질환(전염가능한 해면 뇌병증), 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 및 낭포성 섬유증을 포함하는 다수의 질환에 연루되어 있다.
진핵생물에서 발견되는 BAG 계열의 단백질 구성원은 Hsp70의 ATPase 도메인과 상호작용할 수 있는 다양성 N-말단 도메인 및 보존성 C-말단 Hsp70-결합 도메인(BAG 도메인)을 갖는 뉴클레오타이드 교환 인자(NEF)이다. 예를 들어, 문헌[Kampinga et al., Nat. Rev. Biol., 11:579-592 (2010)]을 참조한다. 따라서, BAG 단백질은 Hsp70 샤페론 기구를 활용하는데 관여하도록 디자인된 단백질과 일치하는 형태, 결합 도메인 및 결합 특이성을 갖는다. BAG 단백질이 Hsp70 기구에서 NEF로서 관여할 수 있지만, 많은 연구는, BAG 단백질이 주로 세포 성장, 무활동 또는 아폽토시스(apoptosis)를 촉진시키고; 전사 복합체 형성을 조절하고; 신호 전달을 조정함을 포함하는 다양한 활성을 제어하는 조절 기작에 관여할 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 문헌[Takayama et al., Nat. Cell Biol., 3: E237-E241 (2001)]에 의한 검토를 참조한다. 최근에, 목적하는 재조합 단백질이 BAG 도메인에 연결되는 경우, 상기 수득한 융합 단백질이 단독의 단백질의 수준보다 더 큰 수준으로 발현됨이 보고되었다. 문헌[국제 공개 공보 제WO 2012/087835 A2호]을 참조한다.
일반적으로, 세포내 증가한 수준의 단백질 발현(재조합 유전자 발현 시스템에서 용이하게 일어날 수 있는 바와 같이)과 함께, 상기 단백질이 적절한 기능성 입체배좌로 폴딩하거나 재폴딩하는데 실패할 수 있는 위험이 증가한다. 따라서, 목적하는 외인성 또는 내인성 단백질의 발현을 증가시키기 위한 계속적인 요망과 함께 세포에서 발현되는 외인성 및 내인성 단백질의 적절한 폴딩을 증진시키기 위한, 즉 적절한 입체배좌의 기능성 단백질의 수율을 증가시키기 위한 수단이 계속 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 세포에 의해 생산되는 목적하는 표적 단백질의 발현 수준을 증진시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 숙주 세포에 의해 발현되는 경우 이의 의도된 위치에서 목적하는 특이적 표적 단백질의 발현 수준을 증진시킬 수 있는 유전학적으로 가공된 융합 단백질로 혼입될 수 있는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 제공한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
(a) J 단백질의 단리된 J 도메인;
(b) J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 단편;
(c) J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 유사체(상기 J 도메인 유사체 폴리펩타이드는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다):
[화학식 I]
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (서열번호 47)
(상기 화학식 I에서,
X1은 이소류신(I), 류신(L), 발린(V), 알라닌(A), 또는 메티오닌(M)이고;
X2 및 X3은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 K 또는 R이고;
X4는 임의의 아미노산이거나, X4는, X1 내지 X3이 존재하고 X5 내지 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X5는 티로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F)이고;
X6 및 X7은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이거나; X6 및 X7 중 어느 하나는, 다른 하나가 K 또는 R인 경우 및 X1 내지 X5가 존재하고 X8 및 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X8 및 X9는 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 류신(L) 또는 알라닌(A)이거나; X8 및 X9 중 하나는, 다른 하나가 L 또는 A이고 X1 내지 X7이 존재하는 경우에 부재할 수 있다); 및
(d) IKKAYKLALQ (서열번호 49),
IKKAYRLALQ (서열번호 50),
IKKAYRKALQ (서열번호 51), 또는
IKKAYRKLLQ (서열번호 52)로 이루어진 데카펩타이드 그룹으로부터 선택되는 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드.
본 발명에 따라, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드의 부재 하에 목적하는 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 숙주 세포에서 발현되는 목적하는 표적 단백질의 발현 수준을 증진시킨다. 본 발명의 폴리펩타이드의 사용은 생산 세포와 관련하여 목적하는 위치(격실)에서 목적하는 재조합 단백질의 양을 증가시키기 위한 수단을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 하기 표 1에 제시된 임의의 J 도메인 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단리된 J 도메인이다.
바람직하게, 본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 Erdj 단백질, SV40의 대형 T 항원, 또는 포유동물 시스테인 스트링 단백질 알파(CSP-α)의 단리된 J 도메인이다. 본 발명의 Erdj 단백질의 바람직한 단리된 J 도메인은 Erdj1, Erdj2, Erdj3, Erdj4, Erdj5, Erdj6 또는 Erdj7의 단리된 J 도메인이다. 특히, Erdj3의 단리된 J 도메인이 바람직하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 하기 임의의 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 J 도메인의 폴리펩타이드 단편이다:
I-K-K-A-Y-R-K-L-A (서열번호 48),
I-R-K-A-Y-R-K-L-S-L-T-L (서열번호 83),
I-K-K-Q-Y-R-L-L-S-L-K-Y (서열번호 84),
I-K-K-A-F-H-K-L-A-M-K-Y (서열번호 85),
I-R-Q-A-F-K-K-L-A-L-K-L (서열번호 86),
I-I-K-A-Y-R-K-L-A-L-Q-W (서열번호 87),
I-A-R-A-Y-R-Q-L-A-R-R-Y (서열번호 88),
I-K-R-A-Y-R-R-Q-A-L-R-Y (서열번호 89),
I-K-K-S-Y-R-K-L-A-L-K-Y (서열번호 90), 및
I-K-K-A-Y-K-R-L-A-M-K-Y (서열번호 91).
또 다른 실시형태에서, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 상기 화학식 I의 아미노산 서열을 갖는 J 도메인 유사체 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 단백질 증진 폴리펩타이드는 하기 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (서열번호 47)
여기서,
X1은 I, L, V, A, 또는 M이고;
디펩타이드 X2-X3은, KR, KK, RK, RR, AK, AR, KA, IK, NK, KQ, RQ, 및 RD로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 A, S, T, R, S, Q, E, F, C, 또는 I이고;
X5는 Y 또는 F이고;
디펩타이드 X6-X7은, KR, KK, RK, RR, RQ, FR, RL, KL, HK, LK, QK, 및 KV로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
디펩타이드 X8-X9는, LA, LL, AL, AA, LC, LV, QA, KA, LS, LI, LY, 및 RA로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 J 도메인 유사체 폴리펩타이드는 하기의 임의의 아미노산 서열 중 하나를 포함한다:
추가의 실시형태에서, 본 발명은 목적하는 표적 단백질에 융합된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공하고, 여기서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 융합 파트너는 J 단백질의 J 도메인이고, 목적하는 융합 파트너의 단백질의 발현을 증진시키기 위한 능력을 갖는 J 도메인 단편, 또는 상기된 바와 같은 화학식 I(서열번호 47)의 아미노산 서열을 갖는 J 도메인 유사체 폴리펩타이드이다. 상기 융합 단백질의 발현은 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 융합 파트너를 사용하지 않는 목적하는 표적 단백질의 발현과 비교하여 목적하는 융합된 표적 단백질의 증가된 발현을 유도한다. 표준 방법에 의한 융합 단백질의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 부분의 제거는 목적하는 표적 단백질의 증가된 회수를 유도한다.
목적하는 표적 단백질에 결합된 본원에 기재된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 융합 단백질은 분비된 단백질에 결합된 상기된 바와 같은 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산 분자를 포유동물 대상체(예를 들어, 사람, 비-사람 영장류, 설치류 또는 가축)의 세포로 삽입하는 단계를 포함하는, 단백질 기능을 제공하는 천연 분비된 단백질의 분비가 결핍된 포유동물 대상체의 세포에서 단백질 기능을 복구하기 위한 방법에 사용될 수 있고, 여기서, 상기 융합 단백질의 발현은 이의 분비가 외인성 핵산의 부재 하에 대상체의 세포에서 결핍된 천연 분비된 단백질의 기능을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 포유동물 대상체의 세포에서 단백질 기능을 복구시키기 위한 상기 방법은 대상체에서 천연 분비된 단백질의 결합된 분비와 연관된 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용된다. 상기 질환은 프리온-관련 질환, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 낭종 섬유증(CF), 및 α1-항트립신 결핍증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 실시형태에서, 단백질 기능을 복구하기 위한 방법은 낭종 섬유증 막관통 전도도 조절제 단백질(CFTR)의 분비가 결핍된 사람 대상체를 치료하기 위해 사용되고 상기 질환은 낭종 섬유증이다. 상기 실시형태에서, 사람 대상체의 세포로 삽입되는 외인성 핵산 분자는 CFTR에 연결된 상기된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화한다. 사람 대상체의 세포에서 융합 단백질의 발현은 CFTR 기능 결핍을 복구시킨다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 표적 단백질 결합 도메인에 결합된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공하고, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 요소는 J 단백질의 J 도메인, 목적하는 융합 파트너의 단백질의 발현을 증진시키기 위한 능력을 갖는 J 도메인 단편, 또는 상기된 화학식 I(서열번호 47)의 아미노산 서열을 갖는 J 도메인 유사체 폴리펩타이드이고 상기 표적 단백질 결합 도메인은 융합 단백질 및 목적하는 표적 단백질이 동일한 숙주 세포에서 동시 발현되는 경우 목적하는 표적 단백질에 결합할 수 있는 폴리펩타이드이다. 목적하는 표적 단백질에 결합하는 융합 단백질은 이의 적절한 세포 또는 세포외 위치에서 표적 단백질의 발현 수준을 증진시키고/시키거나 표적 단백질의 수준을 증진시킨다. 따라서, 본원에 기재된 융합 단백질은 소정의 목적을 위해 적절한 양으로 또는 적절한 세포 또는 세포외 위치에서 발현되지 않는 목적하는 표적 단백질의 발현 수준을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 융합 단백질이 유용한 상기 상황은 세포 배양에서 목적하는 내인성 또는 이종성(재조합) 단백질의 목적하는 양을 발현하는데 실패 및 하나 이상의 기능성 단백질의 부적절한 발현이 병리학적 상태(예를 들어, 제한 없이 프리온 관련 질환(전염가능한 해면뇌병증); 알츠하이머 질환; 파킨슨 질환; 헌팅톤 질환; 낭포성 섬유증; α1-항트립신 결핍증)를 유도하는 충분한 수준의 생체내 단백질을 발현하는데 실패를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
증진된 수준의 발현 및/또는 목적하는 세포 또는 세포외 위치에서 증진된 발현을 위해 본 발명의 융합 단백질에 의해 표적화된 단백질은 가용성 단백질, 막 연합 단백질 또는 분비된 단백질일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 표적 단백질 결합 도메인은 표적 단백질에 결합하는 폴리펩타이드이다. 바람직하게, 상기 표적 결합 도메인은 표적 단백질의 발현 수준에서 증진을 방해하는 것으로부터 다른 단백질을 배제할 정도로 충분히 특이적인 표적 단백질에 대한 결합 친화성을 갖는다. 본 발명의 표적 결합 도메인으로서 사용될 수 있는 폴리펩타이드의 예는 표적 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합부, 표적 면역글로불린 또는 이의 단편에 결합하는 면역글로불린-특이적 결합 단백질(예를 들어, 단백질 A, 단백질 L, 및 단백질 G), 표적 단백질의 Fc 도메인에 결합하는 Fc 결합 단백질(예를 들어, 단백질 A 및 단백질 G), 표적 단백질의 Fc 도메인에 결합하는 Fc 결합 펩타이드, 목적하는 표적 단백질에 결합하는 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인, 표적 단백질의 단백질 리간드(예를 들면, 수용체의 단백질 리간드), 표적 단백질의 PDZ 결합 도메인에 결합하는 PDZ 단백질의 PDZ 도메인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 표적 단백질이 사이토킨인 경우, 본 발명의 융합 단백질의 표적 결합 도메인은 표적 사이토킨 단백질에 결합하는 사이토킨 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 표적 단백질이 수용체 단백질 또는 이의 리간드 결합부인 경우, 본 발명의 융합 단백질의 표적 결합 도메인은 수용체 또는 이의 리간드 결합부에 의해 결합된 단백질 리간드를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 표적 단백질이 사이토킨 수용체 단백질 또는 이의 사이토킨 결합부인 경우, 상기 표적 결합 도메인은 사이토킨 수용체 또는 상기 수용체의 사이토킨 결합부에 의해 결합된 사이토킨을 포함한다.
낭종성 섬유증 막관통 전도도 조절제(CFTR) 단백질과 같은 표적 단백질이 PDZ-결합 도메인을 갖는 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질의 표적 결합 도메인은 PDZ 도메인을 갖는 임의의 다양한 단백질로부터 기원하는 PDZ 도메인을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 표적 단백질이 PDZ 결합 도메인을 갖는 경우, 본 발명의 융합 단백질의 표적 결합 도메인은 NHERF1(또한 NHERF, EBP50, 또는 SLC9A3R1로서 공지된), NHERF2(또한 E3KARP 또는 SLC9A3R2로서 공지된), 및 PDZK1(또한 CAP70 또는 NHERF3으로서 공지된)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 PDZ 어댑터 단백질의 NHERF 계열의 임의의 구성원으로부터 기원하는 PDZ 도메인을 포함한다.
본 발명의 표적 단백질-결합 융합 단백질의 특정 실시형태는 J 단백질의 J 도메인, 또는 이의 활성(발현 증진) 단편, 또는 링커 펩타이드의 존재 또는 부재 하에 표적 단백질 결합 도메인에 융합된 화학식 I의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함한다. 링커 펩타이드가 본 발명의 표적 단백질-결합 융합 단백질에 존재하는 경우, 상기 링커는 1 내지 10개의 아미노산, 1 내지 20개의 아미노산 및 심지어 1 내지 50개의 아미노산을 포함하는 하나 이상의 아미노산일 수 있다. 전형적으로, 링커는 20초과의 아미노산이 아니고 표적 단백질 결합 도메인 또는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드의 기능을 방해하지 않도록(유망하게 증진시키는) 선택되거나 디자인된다. 존재하는 경우, 상기 링커는 바람직하게 융합 단백질의 요소 둘 다의 기여를 최적화하여 목적하는 표적 단백질의 발현 수준 및/또는 적절한 위치를 증가시키기 위해 선택된다. 상기 링커는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드의 표적 단백질 결합 도메인으로의 직접적인 부착이 요소의 기능을 허용가능하지 않을 정도로 감소시키지 않거나 표적 단백질의 발현 수준 및/또는 위치에서 목적하는 증진을 허용가능하지 않을 정도로 감소시키지 않는 경우 생략될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에 유용한 링커는 효소적으로 절단가능한 펩타이드, 즉, 엔테로키나제, 엔테로키나제의 경쇄, 트롬빈, 우로키나제, 토바코 에치 바이러스 프로테아제(TEV), 조직 플라스미노겐 활성화제, 아연 의존성 엔도펩티다제, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 세라라이신, 아스타신, 아다마라이신, 디스인테그린, ADAM, 카스파제, 카뎁신, 칼파인, 등과 같은 효소에 대한 절단 부위를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 융합 단백질에서 절단가능한 링커의 사용은 융합 단백질의 기능을 정지시키거나 느리게하거나 세포에서의 이의 존재 또는 표적 단백질 분자의 집단에서 이의 존재를 제거하기 위해 유리할 수 있다. 일부 세포는 상응하는 단백질분해 인지 부위를 함유하는 폴리펩타이드 링커 분자를 절단할 수 있는 하나 이상의 세포내 프로테아제를 갖는다. 따라서, 세포내 프로테아제가 세포내 발현 후 융합 단백질을 절단할 수 있는 본 발명의 융합 단백질에 사용되는 절단가능한 링커가 선택될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 상기 융합 단백질을 검출하거나 단리를 원조하기 위해 에피토프 태그를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 에피토프 태그는 폴리히스티딘 태그(예를 들어, 6개 His), V5 에피토프 태그, Myc 에피토프 태그, 플래그 에피토프 태그 및 HA(사람 인플루엔자 헤마글루티닌) 에피토프 태그를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 융합 단백질은 즉 융합 단백질의 부재 하에서 단독의 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 표적 단백질의 발현 수준을 증진시키는 것으로 입증된다. 목적하는 표적 단백질의 발현 수준은 본원에 기재된 방법에 따라 적어도 약 1.5배, 및 2배, 4배, 6배, 8배, 10배, 25배 이상 증가될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 융합 단백질은 또한 이들의 적절한 세포성 또는 세포외 위치에서 표적 단백질의 수준을 증진시킨다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 상기 융합 단백질을 개체로 제공하기 위해 유용한 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 또한 융합 단백질 및 약제학적 허용되는 담체를 포함하는, 사람 개체를 포함하는 개체에서 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 하나 이상의 다른 치료학적 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 혼입될 수 있는 상기 추가의 치료학적 활성 화합물의 예는 항생제, 항-바이러스 화합물, 항암 화합물, 진정제, 자극제, 국부 마취제, 코르티코스테로이드, 진통제, 항-히스타민제, 비-스테로이드 소염 약물(NSAID) 및 이의 적절한 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 이의 발현이 본원에 기재된 융합 단백질 유형 중 하나에 의해 증진되는 목적하는 표적 단백질에 의해 제공될 수 있는 기능 또는 성질의 상실 또는 감소를 특징으로 하는 질환 상태에 대하여 사람 또는 동물 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 투여함을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 J 단백질의 단리된 J 도메인, 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키는 능력을 갖는 단리된 J 도메인 단편 또는 상기된 바와 같은 화학식 I의 아미노산 서열(서열번호 47)을 갖는 단리된 J 도메인 유사체 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명은, 또한, 상기된 단리된 핵산을 포함하는, 핵산 벡터를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 상기된 단리된 핵산 또는 핵산 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자가 삽입된 재조합 벡터 분자가 제공된다. 상기 재조합 벡터 분자는 형질감염된 숙주 세포에서 삽입된 핵산을 복제하기 위한 클로닝 벡터 및 또한 상용성 형질감염된 숙주 세포에서 암호화된 융합 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터를 포함한다. 당업계에서 가용한 임의의 다양한 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 융합 단백질을 생산할 수 있다. 본 발명의 융합체를 발현시키기 위해 유용한 발현 벡터의 예는 플라스미드 pcDNA, pcDNA3.3 TOPO(Life Technologies, New York), 플라스미드 pTT3, 플라스미드 pEF-BOS, 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 상용성 숙주 세포에서 시험관내 본 발명의 융합 단백질을 발현시키는데 사용하기 위해 단리된 J 도메인, 활성 J 도메인 단편 또는 화학식 I의 J 도메인 유사체를 암호화하는 단리된 핵산이 삽입된 발현 벡터 분자를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터는 또한 식물 또는 동물(사람, 비-사람 영장류, 설치류 및 가축과 같은 포유동물을 포함하는)에서 상실되거나 결핍된 표적 단백질 기능을 복구하기 위한 유전자 치료요법에서 생체내 본 발명의 융합 단백질을 발현하기 위한 유전자 치료요법 벡터를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 또는 본원에 기재된 융합 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 유용한 숙주 세포는 진핵 숙주 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진균류 숙주 세포, 진핵 조류 숙주 세포, 선충 숙주 세포, 원생동물 숙주 세포 및 어류 숙주 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, 베로 세포, SP2/0 세포, NS/0 골수종 세포, 사람 배아 신장(HEK293) 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 헬라 세포, 사람 B 세포, CV-1/EBNA 세포, L 세포, 3T3 세포, HEPG2 세포, PerC6 세포, 또는 MDCK 세포이다. 바람직한 진균류 숙주 세포는 아스퍼질러스(Aspergillus), 뉴로스포라(Neurospora), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia), 및 캔디다(Candida)를 포함한다. 보다 바람직하게, 사카로마이세스 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 세포이다.
본 발명은 융합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하에서 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적하는 표적 단백질에 연결된, J 단백질의 J 도메인, 이의 단백질 발현 증진 단편 또는 화학식 I의 J 도메인 유사체를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 구조적 유전자를 포함하는 발현 백터로 숙주 세포를 형질감염시키고 상기 형질감염된 숙주 세포를 융합 단백질의 발현을 유발하는 조건 하에서 배양함을 포함하는, 목적하는 표적 단백질에 연결된 상기된 바와 같은, J 단백질의 J 도메인, 이의 단백질 발현 증진 단편 또는 화학식 I의 J 도메인 유사체를 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는 목적하는 표적 단백질에 연결된 본원에 기재된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 방법을 제공한다:
1) 융합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자 서열을 작제하는 단계;
2) 상기 재조합 유전자 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 형성하는 단계(여기서, 상기 재조합 유전자 서열은 전사 프로모터 서열에 작동적으로 연결된다);
3) 상기 프로모터 서열과 상용성인 숙주 세포를 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염시키는 단계; 및
4) 상기 융합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계.
본 발명은 또한 융합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하에서 상기 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 본원에 기재된 단리된 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 상기된 바와 같은 J 단백질의 단리된 J 도메인, 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 능력을 갖는 단리된 J 도메인 단편, 또는 화학식 I의 아미노산 서열(서열번호 47)을 갖는 단리된 J 도메인 유사체 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 구조적 유전자를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키고, 상기 구조적 유전자에 의해 암호화된 상기 융합 단백질 및 목적하는 상기 표적 단백질의 동시 발현을 유발하는 조건 하에서 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에 의해 발현된 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 융합 단백질을 암호화하는 구조적 유전자를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계로서, 상기 융합 단백질이 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 J 단백질의 J 도메인, 이의 활성 단편 또는 화학식 I의 J 도메인 유사체를 포함하고, 상기 융합 단백질이 목적하는 표적 단백질에 결합하는, 단계 및 (b) 구조적 유전자 상에 암호화된 융합 단백질의 발현을 유발하는 조건 하에서 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키는 방법을 제공한다. 상기 구조적 유전자는 또한 J 도메인/J 도메인 단편/J 도메인 유사체 요소 및 표적 단백질 결합 도메인 요소를 연결하는 링커 펩타이드를 암호화하는 임의의 절편을 포함할 수 있고 또한 에피토프 태그, 효소 절단 부위 등을 암호화하는 절편을 포함할 수 있다. 상기 방법은 유리하게 하기의 단계에 따라 수행될 수 있다:
1) 표적 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자 서열을 작제하는 단계;
2) 상기 재조합 유전자 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 형성하는 단계(여기서, 상기 재조합 유전자 서열은 전사 프로모터 서열에 작동적으로 연결된다);
3) 상기 프로모터 서열과 상용성인 적합한 숙주 세포를 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염시키는 단계; 및
4) 상기 융합 단백질의 발현을 유도하는 조건 하에서 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 융합 단백질을 발현하고 표적 단백질의 발현 수준을 증진시켜 식물 또는 비-사람 동물에게 상실되거나 목적하는 기능을 제공하기 위해 식물 또는 비-사람 동물의 세포로 삽입된다. 상기 방법은 유전자 전이 식물 및 유전자 전이 동물을 생산함을 포함하고, 여기서, 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 기능성 유전자(전이유전자)로서 게놈으로 영구적으로 혼입되어 상기 식물 또는 비-사람 동물은 상기 융합 단백질 발현할 뿐만 아니라 발현가능한 전이유전자 카피를 후손에게 전달한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 대상체의 세포로 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산 분자를 삽입함을 포함하는, 표적 단백질의 발현이 결핍된 대상체의 세포에서 표적 단백질에 의해 제공된 기능을 복구하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 외인성 핵산 분자를 세포로 삽입한 후, 상기 융합 단백질은 발현되고 표적 단백질의 발현 수준을 증진시켜(이러한 증진은 내인성 표적 단백질을 안정화시키고, 적절히 폴딩된 표적 단백질의 양을 증가시키고, 목적하는 세포 또는 세포외 격실로의 표적 단백질의 위치화를 개선시키는(예를 들어, 분비된 단백질의 분비를 개선시키는) 등의 결과일 수 있다) 발현이 외인성 핵산의 부재 하에서 대상체의 세포에서 결핍된 표적 단백질의 기능을 제공한다. 상기 방법은 특히 대상체에서 단백질의 결핍된 발현과 관련된 질환을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다. 상기 질환은 프리온 관련 질환(전염가능한 해면뇌병증), 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 낭포성 섬유증 및 α1-항트립신(AAT) 결핍증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대상체가 낭포성 섬유증 막관통 전도도 조절제(CFTR) 단백질의 발현이 결핍된 사람 대상체이고 질환이 낭포성 섬유증이거나 대상체가 α1-항트립신이 결핍된 사람 대상체이고 질환이 1-항트립신(AAT) 결핍증인 방법의 실시형태가 특히 바람직하다.
도 1은 단독의 단백질(IL13Rα2WT) 또는 BAG 도메인(BAG3, BAG4, BAG5, 또는 BAG6 단백질 기원)을 갖는 융합 단백질로서 발현되는 것과 비교하여 표적 단백질이 J 도메인(Hsp40, SV40, 또는 CSP J 단백질 기원)에 연결된 변형된 정렬에서 목적하는 표적 단백질(IL13Rα2 수용체 단백질)의 발현 수준을 개선시킴을 입증하는 실시예 2에 기재된 일련의 실험들을 설명한다. 도 1A는 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 발현 벡터 플라스미드로의 삽입을 위한 구조적 유전자의 다이아그램을 도시한다. IL13Rα2 단백질(야생형 단백질, "WT")을 암호화하는 cDNA는 "IL13Rα2 WT" 발현 생성물에 대해 3' 말단에서 V5 에피토프를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. BAG 도메인 융합 단백질에 대해, IL13Rα2를 암호화하는 cDNA는 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편으로 연결된 BAG 도메인을 암호화하는 절편으로 프레임내 연결되어 BAG 도메인 융합 단백질 발현 생성물을 제공한다. 본 발명의 J 도메인 융합 단백질에 대해, IL13Rα2를 암호화하는 cDNA는 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편으로 연결된 J 도메인을 암호화하는 절편으로 프레임내 연결되어 J 도메인 융합 단백질 발현 생성물을 제공한다. 도 1B는 세포 용해물의 웨스턴 블롯(면역블롯) 분석의 화학발광 신호의 x-선 이미지를 보여주고 이는 형질감염된 세포에서 태그된 IL13Rα2 야생형(WT) 단백질 또는 융합 단백질 대응물의 상대적 발현 수준을 지적한다. 목적하는 IL13Rα2 단백질에 대한 융합 파트너로서 J 단백질 Hsp40, SV40, 또는 CSP의 J 도메인을 사용하는 것이 야생형 IL13Rα2 단백질(WT) 또는 BAG 단백질 BAG3, BAG4, BAG5 또는 BAG6의 BAG 도메인을 포함하는 임의의 BAG 도메인 융합 대응물에 비해 단백질 발현을 상당히 크게 유도함을 알 수 있다. 모든 형질감염체는 형질감염체의 성공적인 형질감염 및 작동가능성을 보여주기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 리포터 플라스미드를 사용하여 동시 형질감염시켰다. 도 1B의 하단 패널을 참조한다. 도 1C는 NIH 이미지 J이미지 프로세싱 프로그램을 사용하는 도 1B의 면역블롯에서 화학발광 신호의 밀도측정 분석 결과를 제공한다. 도 1C에서 막대 그래프는 명백하게 임의의 4개의 IL13Rα2-BAG 도메인 융합 단백질 또는 야생형 IL13Rα2 단백질(IL13Rα2 WT 발현 = 100%)에 대한 것과 비교하여 모든 3개의 분비된 IL13Rα2-J 도메인 융합 단백질에 대해 보다 큰 발현 수준을 보여준다.
도 2는 단독의 절단된 수용체 단백질(IL13Rα2 TF)과 비교하여, 절단된 형태("TF")의 IL13Rα2 수용체 단백질(리간드 결합 도메인을 함유하는 IL13Rα2 수용체 단백질의 세포외 성분인)이 J-도메인(J-IL13Rα2 TF)에 연결된 변형된 정렬에서 분비된 목적하는 표적 단백질의 발현 수준의 개선을 조사한 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 2A는 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 발현 벡터 플라스미드로의 삽입을 위한 구조적 유전자 작제물의 다이아그램을 도시한다. IL13Rα2 TF를 암호화하는 cDNA는 IL13Rα2 TF 발현 생성물에 대해 3' 말단에서 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. IL13Rα2 TF를 암호화하는 cDNA는 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 3' 말단에서 증강되고 본 발명의 J 도메인 융합 단백질 발현 생성물(J-IL13Rα2 TF)에 대해 J 도메인(J 단백질 Erdj3 기원)을 암호화하는 절편과 함께 5' 말단에 연결된다. 도 2B는 웨스턴 블롯에서 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고 이것은 세포(세포 용해물)에서 및 V5-태그된 IL13Rα2 TF 단백질 및 J 도메인 융합 단백질 대응물의 배양 배지(배지)로 분비되는 상대적 발현 수준을 지적한다. 목적하는 IL13Rα2 TF 단백질에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것이 J 도메인이 없는 IL13Rα2 TF 단백질과 비교하여 상당히 큰 단백질 발현 수준을 유도함을 알 수 있다. 모든 형질감염체는 형질감염체의 성공적인 형질감염 및 작동가능성을 보여주기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 리포터 플라스미드로 동시 형질감염시켰다. 도 2B의 하부 패널을 참조한다. 모방 배양물은 "공" 벡터, 즉 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유한다.
도 3은 절단된 수용체 단백질(IL13Rα2 TF), BAG 도메인-IL13Rα2 TF 융합 단백질(BAG-IL13Rα2 TF), 및 J 도메인-IL13Rα2 TF 융합 단백질(J-IL13Rα2 TF)을 발현하기 위한 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포의 배양 배지로 분비되는 단백질의 상대적 발현 수준을 비교하는 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 3A는, 형길감염된 세포의 배양 배지로 분비된 IL13Rα2TF, BAG-도메인-IL-13Rα2TF 융합 단백질, 및 J 도메인-IL13Rα2TF 융합 단백질의 도트 블롯 분석의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 모든 단백질은 항-V5 항체로 면역 검출을 위해 V5 에피토프 태그를 함유했다. 도 3B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 3A에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 3B에서 막대 그래프는 IL13Rα2 TF(막대 그래프 2) 또는 BAG 도메인-IL13Rα2 TF 융합 단백질(막대 그래프 3)에 비해 상당히 큰 분비된 J 도메인-IL13Rα2 TF 융합 단백질(막대 그래프 4)의 발현 수준을 보여준다. 모방 배양물(막대 그래프 1)은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다.
도 4는 단독의 단백질 또는 BAG 도메인을 갖는 융합 파트너로서 발현되는 것과 비교하여 분비된 α1 항-트립신(α1AT)이 J 도메인 융합 파트너에 연결된(과 융합된) 변형된 정렬에서 분비된 α1AT의 발현 수준의 개선을 조사하기 위한 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 4A는 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 발현 벡터 플라스미드로의 삽입을 위한 구조적 유전자 작제물의 다이아그램을 도시한다. α1AT를 암호화하는 cDNA는 α1AT 발현 생성물에 대해 3'말단에서 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. α1AT를 암호화하는 cDNA는 BAG 도메인 융합 단백질(α1 AT-BAG) 발현 생성물에 대해 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편에 연결된 BAG 도메인을 암호화하는 절편으로 프레임내 연결시켰다. α1AT를 암호화하는 cDNA는 본 발명의 J 도메인 융합 단백질(α1AT-J) 발현 생성물에 대해 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편에 연결된 J 도메인을 암호화하는 절편으로 프레임내 연결시켰다. 도 4B는 도트 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고, 이것은 배양 배지로 분비된 분비된 α1AT 단백질 또는 분비된 융합 단백질 대응물의 상대적 발현 수준을 지적한다. 목적하는 α1AT 단백질에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것(α1AT-J)이 단독의 α1AT 단백질 또는 BAG 도메인 융합 대응물(α1AT-BAG)과 비교하여 분비된 단백질(α1AT-J) 발현 수준을 상당히 크게 유도함을 알 수 있다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다. 도 4C는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 4B에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 4C에서 막대 그래프는 (융합되지 않은) α1AT(막대 그래프 2) 또는 BAG 도메인 α1AT 융합 단백질(막대 그래프 3)과 비교하여 상당히 크게 분비된 α1AT-J 융합 단백질(막대 그래프 4)의 발현 수준을 보여준다.
도 5는 단독의 단백질(TNFR1TF)과 비교하여, TNFR1TF가 J 도메인 융합 파트너에 연결된 변형된 정렬에서 분비된 절단된 형태의 TNFα-수용체 1 단백질(TNFR1TF)의 발현 수준에서의 개선을 입증하는 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 5A는 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 발현 벡터 플라스미드로 삽입을 위한 구조적 유전자 작제물의 다이아그램을 도시한다. TNFR1TF를 암호화하는 cDNA는 TNFR1TF 발현 생성물에 대해 3' 말단에서 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. TNFR1TF를 암호화하는 cDNA는 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편에 연결된 J 도메인을 암호화하는 절편에 프레임내 연결되어 본 발명의 J 도메인 융합 단백질 발현 생성물을 제공한다. 도 5B는 도트 블롯의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고 이것은 배양 배지로 분비된 TNFR1TF 및 TNFR1TF-J 도메인의 상대적 수준을 지적한다. 목적하는 TNFR1TF 단백질에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것(TNFR1TF-J)이 (융합되지 않은) TNFR1TF 단백질에 대한 것 보다 분비된 단백질의 발현을 상당히 크게 유도함을 알 수 있다. 도 5C는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 5B의 도트 블롯에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 5C에서 막대 그래프는 TNFR1TF(막대 그래프 2)와 비교하여 분비된 TNFR1TF-J 도메인 융합 단백질(막대 그래프 3)의 발현 수준이 상당히 높음을 명백히 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다.
도 6은 목적하는 3개의 표적 단백질 각각이 J 도메인 융합 파트너에 연결된 변형된 정렬에서 목적하는 표적 Fc 융합 단백질의 발현 수준에서의 개선을 입증하는 실시예 2에 기재된 일련의 실험 결과를 보여준다. 도 6A는 상기 실시예에 사용된 구조적 유전자 작제물의 다이아그램을 도시한다. Fc 융합 단백질에 대해, 목적하는 각각의 단백질(TNFR1TF, IL13Rα2TF, 또는 α1AT)을 암호화하는 cDNA는 면역글로불린 Fc 영역의 불변 도메인을 암호화하는 절편("Fc")에 연결된, 3' 말단에서의 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. J 도메인 융합에 대해, J 도메인을 암호화하는 cDNA는 목적하는 각각의 단백질을 암호화하는 cDNA와 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편 사이의 프레임내 연결되었다. 도 6A를 참조한다. 도 6B는 형질감염된 세포의 배양 기원의 배지에서 분비된 단백질에 대한 도트 블롯 분석을 보여준다. Fc 융합 단백질(TNFR1-V5-Fc, IL13Rα2TF-Fc, 및 α1AT-Fc) 각각은 도 6B에서 각각의 패널의 중앙 레인내 도트 블롯에서 보여지는 바와 같은 배양 배지에서 발현되었다. Fc 융합 단백질의 상기 발현 수준은 단독의 목적하는 단백질(즉, Fc 도메인에 대한 융합 없이; 데이터는 나타내지 않음) 각각에 대한 것 보다 높았다. 상당히 높은 수준의 발현은 J 도메인이 도 6B에서 각각의 패널의 우측 레인의 도트 블롯에서 보여지는 바와 같은 Fc 융합 단백질내 목적하는 절편의 단백질에 연결되는 각각의 경우에 수득되었다. 도 6B에서 도트 블롯의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과는 도 6C의 상응하는 패널에서 보여지고, 여기서, J 도메인 융합 단백질의 상당히 높은 수준의 발현은 도 6C의 패널 각각에서 막대 그래프 2(목적하는 단백질-Fc 융합 단백질)와 막대 그래프 3(목적하는 단백질-J 도메인-Fc 융합 단백질)을 비교함에 의해 명백해진다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다.
도 7은 단독의 p53 단백질과 비교하여, p53이 J 도메인 융합 파트너에 연결된(과 융합된) 변형된 정렬에서 세포질 p53 단백질의 발현 수준에서의 개선을 입증하는 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 7A는 상기 실험에 사용된 작제물의 다이아그램을 도시한다. p53을 암호화하는 cDNA는 이의 5' 말단에서 p53 발현 생성물에 대해 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. p53을 암호화하는 cDNA는 본 발명의 J 도메인 융합 단백질(J-p53) 발현 생성물에 대해 5' 말단에서 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편에 연결된 SV40 J 단백질의 J 도메인을 암호화하는 절편에 이의 5' 말단에서 프레임내 연결된다. 도 7B는 세포 용해물의 웨스턴 블롯의 화학 발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고 이는 태그된 p53 단백질 및 J 도메인 융합 단백질 대응물(J-p53)의 세포에서 상대적 발현 수준을 지적한다. 목적하는 p53 단백질에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것(J-p53)이 J 도메인이 없는 p53 단백질(p53)의 형질감염된 세포에서 발현 수준과 비교하여 형질감염된 세포에서 상당히 큰 발현 수준을 유도하였음을 알 수 있다. 유사 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다.
도 8은 단독의 단백질 각각 또는 BAG 도메인과의 융합체로서 발현되는 단백질 각각과 비교하여, 단백질 각각이 J 도메인 융합 파트너에 연결된(과 융합된) 변형된 정렬에서 목적하는 2개의 표적 단백질, 즉, 야생형 CFTR 단백질 및 상응하는 CFTR Δ508F 돌연변이 단백질(페닐알라닌 잔기의 508번 위치에서의 결실은 폴딩 결함과 CFTR Δ508F 돌연변이 단백질의 신속한 분해를 유도한다)의 발현 수준의 개선을 입증하는 실시예 2에 기재된 일련의 실험 결과를 보여준다. 도 8A는 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 발현 벡터 플라스미드로의 삽입을 위한 작제물의 다이아그램을 도시한다. 목적하는 각각의 단백질, 즉, 야생형 CFTR 단백질(CFTR WT) 또는 CFTR Δ508F 돌연변이 단백질(Δ508F)을 암호화하는 cDNA는 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 5' 말단에서 증강되었다. BAG 도메인 융합체에 대해, BAG 도메인을 암호화하는 cDNA는 목적하는 각각의 단백질을 암호화하는 cDNA와 V5 에피토프 태그를 암호화하는 5' 절편 사이에 프레임내 연결되었다. 본 발명의 J 도메인 융합 단백질 발현 생성물에 대해, SV40 J 도메인을 암호화하는 cDNA는 J 도메인에 대해 목적하는 각각의 단백질을 암호화하는 cDNA와 V5 에피토프 태그를 암호화하는 5' 절편 사이의 프레임내 연결되었다. 도 8A를 참조한다. 도 8B는 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고, 이는 목적하는 태그된 단백질(CFTR WT 및 CFTR Δ508F), BAG 도메인 융합 단백질(BAG-CFTR WT 및 BAG-CFTR Δ508F), 및 J 도메인 융합 단백질(J-CFTR WT 및 J-CFTR Δ508F)의 세포에서 상대적 발현 수준을 지적한다. CFTR WT와 CFTR Δ508F 단백질 둘 다에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것이(융합되지 않은) CFTR WT 및 돌연변이 CFTR Δ508F 단백질 또는 BAG 도메인 융합 대응물의 발현 수준과 비교하여 형질감염된 세포에서 상당히 큰 발현 수준을 유도함을 알 수 있다. 모든 형질감염체는 형질감체의 성공적인 형질감염 및 작동능력을 보여주기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 리포터 플라스미드로 동시 형질감염시켰다(도 8B의 하부 패널).
도 9는 본 발명의 융합 단백질의 동시-발현이 실시예 4에 기재된 바와 같은 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키는 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 비변형된 정렬의 일반 반응식의 다이아그램을 도시한다. 상기 반응식에서, 본 발명의 융합 단백질은 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(PEEP) 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 표적 단백질 결합 도메인은 목적하는 표적 단백질에 결합하여 상기 표적 단백질은 PEEP 도메인에 최근 접하게 되고 이는 이의 적절한 세포 또는 세포외 위치에서 표적 단백질의 발현 수준을 상승시킨다.
도 9B는 하기 실시예 4에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용된 발현 벡터 플라스미드로의 삽입을 위해 IL13Rα2TF 융합 단백질(표적 단백질)을 암호화하는 구조적 유전자의 다이아그램이다. IL13Rα2의 세포외 IL13 리간드 결합 도메인을 포함하는, 절단된 형태의 IL13Rα2 수용체 단백질(IL13Rα2TF)을 암호화하는 cDNA는 3' 말단에서 V5 에피토프를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다.
도 9C는 도 9B에 도시되고 실시예 4에 기재된 바와 같은 V5 태그된 IL13Rα2TF 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 본 발명의 융합 단백질 발현용 작제물을 도시한다. Erdj3 J 단백질의 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인)을 암호화하는 cDNA는 IL13 단백질(표적 단백질 결합 도메인)을 암호화하는 절편에 연결하였다. 플래그 에피토프 태그를 암호화하는 절편은 IL13 표적 단백질 결합 도메인을 암호화하는 절편의 3' 말단에 연결하였다.
도 10은 실시예 4에 기재된 바와 같이 단독으로 발현되는 경우(좌측으로부터 레인 2), 이의 IL13 리간드와 동시 발현되는 경우(유일한 IL13, 좌측으로부터 레인 3) 및 본 발명의 J 도메인-IL13 융합 단백질과 비변형된 정렬에서 동시 발현되는 경우(J-IL13, 좌측으로부터 레인 4), 절단된 형태의 IL13Rα2 수용체 단백질(IL13Rα2TF)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지(상부 패널) 및 세포 용해물(중앙 패널)의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 적절히 폴딩된 IL13Rα2TF 단백질(표적 단백질)은 형질감염된 숙주 세포로부터 분비되는 것으로 예상된다. J 도메인-IL13 융합 단백질과 함께 IL13Rα2TF 단백질의 동시 발현이 단독의 IL13Rα2TF 단백질의 발현(정상 패널, 좌측으로부터 레인 2) 또는 IL13Rα2TF 단백질과 이의 IL13 리간드의 동시 발현(정상 패널, 좌측으로부터 레인 3)과 비교하여, 분비된 IL13Rα2TF 단백질(정상 패널, 좌측으로부터 레인 4)의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다. 더욱이, IL13Rα2TF 단백질과 J 도메인-IL13 융합 단백질의 동시 발현은 단독의 IL13Rα2TF 단백질의 발현 수준(중앙 패널, 좌측으로부터 레인 2) 또는 IL13Rα2TF 단백질과 이의 IL13 리간드(중앙 패널, 좌측으로부터 레인 3)의 동시 발현과 비교하여 세포내 IL13Rα2TF 단백질(중앙 패널, 좌측으로부터 레인 4)의 발현 수준을 상당히 증진시켰다. 모든 형질감염체는 형질감염체의 성공적인 형질감염 및 작동능력을 보여주기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 리포터 플라스미드와 동시 형질감염시켰다. 도 10의 하부 패널을 참조한다. 모방 배양물은 "공 벡터", 즉, 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터(IL13Rα2TF 단백질 부재, 동시 발현 부재, 블롯의 좌측으로부터 레인 1에서 "부재")로 형질감염된 세포를 함유하였다. 상기 공 벡터 형질감염체는 그러나 GFP 벡터와 동시 형질감염시키고 성공적인 동시 형질감염은 도 10의 하부 패널에 도시된 GPF 발현에 의해 보여진다.
도 11은 하기 실시예 5에 기재된 실험용으로 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용된 발현 벡터 플라스미드내로 삽입하기 위한 단백질을 암호화하는 핵산 작제물의 도식적 다이아그램을 보여준다. 도 11A는 면역글로불린 Fc 도메인의 불변 도메인을 암호화하는 절편에 연결된, V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 3' 말단에서 증강된 목적하는 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 Fc 융합 단백질(표적 단백질)을 암호화하는 DNA 작제물을 도시한다. 하기 실시예 5를 위해, 상기 Fc 융합 단백질 표적은 목적하는 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질을 생산하기 위해 Fc 도메인에 연결된 V5 에피토프 태그에 연결된 절단된 형태의 IL13Rα2 수용체 단백질(IL13Rα2TF)을 포함했다. 도 11B는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물을 도시하고, 여기서, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(PEEP) 도메인(예를 들어, J 단백질의 J 도메인)은 표적 단백질 결합 도메인(예를 들어, Fc 도메인에 결합하는 것으로 공지된 단백질 A)에 연결되어 있다. 상기 작제물은 표준 항-플래그 항체를 사용한 용이한 동정 및 단리를 위한 플래그 에피토프 태그에 대한 암호화 절편과 함께 3' 말단에서 추가로 증강시켰다.
도 12는 표적 단백질이 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 비변형된 정렬에서 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현에서 상당한 증진을 입증하지만 표적 단백질이 단독의 단백질 A와 동시 발현되는 경우에는 그렇지 않음을 입증하는 실시예 5에 기재된 실험 결과를 보여준다.
도 12A는 실시예 5에 기재된 바와 같이, 단독으로 발현되는 경우(레인 2, 부재), 단독의 단백질 A와 동시 발현되는 경우(레인 3, 단지 단백질 A), Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 경우(레인 4, J-단백질 A) 및 Erdj5 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 경우(레인 5, J2-단백질 A) IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양으로부터 배지의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질(좌측으로부터 레인 1)을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질 및 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 4 및 5)의 동시 발현이 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 발현하거나 융합되지 않은 단백질 A와 IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질(좌측으로부터 레인 3)을 동시 발현하는 형질감염 세포에서의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 크게 유도함을 알 수 있다.
도 12B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 12A에서의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 12B의 막대 그래프 1-5는 도 12A에서의 레인 1 내지 5에서의 신호에 상응한다. 도 12B에서의 막대 그래프는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질(막대 그래프 4 및 5)의 동시 발현이 단독의 IL13Rα2TF-Fc(막대 그래프 2)의 발현 또는 단독의 (비융합된) 단백질 A와 IL13Rα2TF-Fc(막대 그래프 3)의 동시 발현과 비교하여 분비된 IL13Rα2TF-Fc의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 12C는 실시예 5에 기재된 바와 같이, Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2, J-단백질 A)과 동시 발현되는 경우 및 단독의 단백질 A(레인 3, 단지 단백질 A)와 동시 발현되는 경우, 단독의 IL13Rα2TF(Fc 도메인 없음) 단백질(레인 1, 부재)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양물로부터 배지의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 상기 결과는 도 12A 및 도 12B에서 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질의 증진된 수준이 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질의 Fc 도메인에 대한 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 표적 단백질 결합 도메인의 특이성에 의존하는 경우에 예상되는 바와 같은 분비된 IL13Rα2TF 단백질의 임의의 발현이 거의 관찰되지 않음을 보여준다. 도 12D는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 12C에서의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 따라서, 도 12C 및 도 12D는 상기 결과가 지적하는 바와 같이, IL13Rα2TF 단백질이 J 도메인-단백질 A 융합(표적 결합 도메인(단백질 A)에 대한 Fc 리간드가 부재임)에 의해 인지되지 않고 따라서 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인)에 의해 제공될 수 있는 발현 수준에서의 증진이 IL13Rα2TF에 표적화되지 않는다는 점에서 대조군 실험 결과를 보여준다.
도 13은 하기 실시예 6에 기재된 바와 같이, 본 발명의 상응하는 융합 단백질과 동시 발현되는 경우 3개의 상이한 Fc 융합 표적 단백질의 발현 수준의 상당한 증진을 입증하는 일련의 실험 결과를 제공한다. 도 13A(좌측 패널)는 하기 실시예 6.1에 기재된 바와 같고 실시예 5에 기재된 실험과 유사하게 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(좌측으로부터 레인 1)을 발현하는 형질감염된 세포 및 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질 및 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양물의 배지로 분비되는 IL13Rα2TF-Fc 융합 도메인(표적 단백질)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 13A의 우측 패널은 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 13A의 좌측 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 13A의 우측 패널에서 막대 그래프 1 및 2(좌측에서 우측으로)는 도 13A의 좌측 패널에서 레인 1 및 2(좌측에서 우측으로)에서의 신호에 상응한다. 상기 결과는, 본 발명의 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승(8배)시킴을 보여준다. 결과는 실시예 5 및 도 12에 기재된 것들과 일치한다.
도 13B(좌측 패널)는 하기 실시예 6.2에 기재된 바와 같이 단독의 TNFR1TF-Fc 융합 표적 단백질(좌측으로부터 레인 1)을 발현하는 형질감염된 세포 및 TNFR1TF-Fc 융합 단백질 및 J 도메인-단백질 A 융합(좌측으로부터 레인 2)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 TNFR1TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 13B의 우측 패널은 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 13B의 좌측 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 13B의 우측 패널에서 막대 그래프 1 및 2(좌측에서 우측으로)는 도 13B의 좌측 패널에서 레인 1 및 2(좌측에서 우측으로)에서의 신호에 상응한다. 상기 결과는, J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이, J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비되는 TNFR1TF-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승(6배) 시킴을 보여준다.
도 13C(좌측 패널)는 실시예 6.3에 기재된 바와 같이, 단독의 α1 AT-Fc 융합 표적 단백질(좌측으로부터 레인 1)을 발현하는 형질감염된 세포 및 α1 AT-Fc 융합 표적 단백질 및 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 α1 항-트립신(α1 AT)-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 13C의 우측 패널은 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 13C의 좌측 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 13C의 우측 패널에서 막대 그래프 1 및 2(좌측에서 우측으로)는 도 13C의 좌측 패널에서 레인 1 및 2(좌측에서 우측으로)의 신호에 상응한다. 상기 결과는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 α1 AT-Fc 융합 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승(3배)시킴을 보여준다.
도 14는 하기 실시예 7에 기재된 비변형된 정렬에서 분비된 사람화된 항-IL8 IgG1 항체의 발현 수준에서 증진을 시험하는 일련의 실험 기원의 결과를 제공한다. 도 14A는 단독의 항-IL8 항체(레인 2)를 발현하고, 항-IL8 항체 및 단백질 A(레인 3, 단지 단백질 A)를 동시 발현하고, 본 발명의 항-IL8 항체 및 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 4, J-단백질 A)을 동시 발현하고, 항-IL8 항체 및 단백질 L(레인 5, 단지 단백질 L)을 동시 발현하고, 본 발명의 항-IL8 항체 및 Erdj3 J 도메인-단백질 L 융합 단백질(레인 6, J-단백질 L)을 동시 발현하고, 항-IL8 항체 및 이의 IL8 리간드(레인 7, IL8)를 동시 발현하고, 본 발명의 Erdj3 J 도메인-IL8 리간드 융합 단백질(레인 8, J-IL8)을 동시 발현하고, 단독의 Erdj3 J-단백질 A 융합 단백질(레인 9, J-단백질 A)을 발현하고, 단독의 Erdj3 J 도메인-단백질 L 융합 단백질(레인 10, J-단백질 L)을 발현하고, Erdj3 J 도메인-IL8 리간드 융합 단백질(레인 11, J-IL8)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체(표적 단백질)의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학 발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(항-IL8 항체 부재, 레인 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다. 배양 배지에서 항-IL8 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체("항-huIgG Ab")(카탈로그 번호 AP112P, Millipore)를 사용한 도트 블롯 검정에서 분석하였다. 형질감염된 세포에서 항-IL8 항체와, J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 4), J 도메인-단백질 L 융합 단백질(레인 6) 또는 J 도메인-IL8 융합 단백질(레인 8)의 동시 발현이 단독의 항-IL8 항체(레인 2)를 발현하거나, 단독의 단백질 A(레인 3, 단지 단백질 A)와 동시 발현하거나, 단독의 단백질 L(레인 5, 단지 단백질 L)을 동시 발현하거나 단독의 IL8 리간드 단백질(레인 7)을 동시 발현하는 형질감염된 세포에서 발현된 항체의 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다. 단독의 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 9, J-단백질 A)을 발현하는 형질감염된 세포, 단독의 J 도메인-단백질 L 융합 단백질(레인 10, J-단백질 L)을 발현하는 형질감염된 세포 또는 단독의 J 도메인-IL8 융합 단백질(레인 10, J-IL8)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 어떠한 신호도 검출되지 않았고, 이것은 모든 3개의 융합 단백질이 특이적으로 표적화되어 동시 발현된 항-IL8 항체 표적 단백질의 발현을 증진시킴을 지적한다.
도 14B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 14A의 레인 각각에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 14B의 막대 그래프는 도 14A의 레인 번호에 상응하도록 번호매김하였다. 이러한 일련의 실험 결과는 표적 단백질 결합 도메인(여기서, 단백질 A, 단백질 L, 또는 IL8)에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(여기서, Erdj3 J 도메인)를 포함하는 본 발명의 융합 단백질과 표적화된 항-IL8 항체의 동시 발현이 단독의 융합되지 않은 표적 단백질 결합 도메인 단백질(단지 단백질 G, 단지 단백질 L 또는 단지 IL8)과 항체의 동시 발현과 비교하여 분비된 항-IL8 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 15는 하기 실시예 8에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 융합 단백질이 확립된 시판되는 관련 세포주에서 이미 안정하게 생산된 표적 단백질의 발현 수준을 증진시키기 위해 사용될 수 있음을 입증하는 결과를 제공한다. 도 15A는 항-IL8 항체 및 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 3, J-단백질 A)을 동시 발현하는 형질감염된 세포에서 및 단독의 항-IL8 항체(레인 2)를 발현하는 CHO-DP12 세포주(수탁번호. CRL-124444, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), Manassas, Virginia)의 세포 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체(표적 단백질)의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 배양 배지에서 항-IL8 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체("항-huIgG Ab")를 사용한 도트 블롯 검정에서 분석하였다. J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 항체의 동시 발현이 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2, 부재)의 부재 하에 발현된 항체의 수준과 비교하여 배양 배지로 분비된 항체(레인 3)의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다. 레인 1은 대조군(단지 배지)이다. 도 15B는 도 15B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸 바와 같이 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 15A의 레인에서 도트 블롯의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 상기 결과는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3)과 항체의 동시 발현이 분비된 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 지적하고, 항체가 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 2)의 부재 하에 발현되는 경우 수득되는 것과 비교하여 발현 수준을 대략 4배 내지 5배 초과로 증진시킨다. 상기 결과는 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 확립된 생산 세포주에서 이미 안정하게 발현되는 표적 단백질의 생산 수준을 상당히 증진시킴을 지적한다.
도 16은 하기 실시예 9.1에 기재된 바와 같이, 임의의 다양한 단백질에 연결된 J 단백질의 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인으로서)을 포함하는 다양한 융합 단백질을 시험하는 일련의 실험으로부터의 결과를 제공한다. 이어서 다양한 J 도메인 융합 단백질 및 다른 단백질을 시험하였고 형질감염된 HEK293 세포의 배양 배지로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현 수준을 증진시키는 이들의 능력에 대해 비교하였다. 도 16A는 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)(레인 1)을 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 단독의 단백질 A(레인 3, 단지 단백질 A)를 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 4)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-hFcR 융합 단백질(레인 5, J-hFcR)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-vFcR 융합 단백질(레인 6, J-vFcR)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-gI 융합 단백질(레인 7, J-gI)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-gE 융합 단백질(레인 8, J-gE)을 동시 발현하고 IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-gI 융합 단백질 및 J 도메인-gE 융합 단백질 둘 다(레인 9, J-gI + J-gE)를 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 16A에서 웨스턴 블롯의 화학발광 신호의 밀도측정 분석 결과는 도 16B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸다. 상세하게는 실시예 9.1을 참조한다.
도 17은 하기 실시예 9.2에 기재된 바와 같이, Fc 도메인을 갖는 단백질의 발현 수준을 증진시키는데 사용하기 위해 6개 Fc-결합 펩타이드(FcBP1 내지 FcBP6)의 각각에 연결된 J 단백질의 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인으로서)을 포함하는 다양한 융합 단백질을 시험하는 일련의 실험 결과를 제공한다. Fc 결합 펩타이드의 아미노산 서열은 도 17에서 패널 A와 B 사이에 주어진다. 도 17A는 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)(레인 1 및 3)을 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2, J-단백질 A)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP1 융합 단백질(레인 4, J-FcBP1)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP2 융합 단백질(레인 5, J-FcBP2)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP3 융합 단백질(레인 6, J-FcBP3)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP4 융합 단백질(레인 7, J-FcBP4)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J-도메인-FcBP5 융합 단백질(레인 8, J-FcBP5)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP6 융합 단백질(레인 9, J-FcBP6)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 10, J-단백질 G)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 17A에 나타낸 바와 같이, HEK293 형질감염체에서 6개 J 도메인-펩타이드 융합 단백질 각각과 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 동시 발현은 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(레인 1 및 3)의 발현 수준과 비교하여, 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(레인 4-9)의 발현 수준을 상당히 증진시켰다. 상기 실험은 또한 비교를 위해, 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현에 대한 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과, J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2) 또는 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 10)의 동시 발현 효과를 포함했다. 도 17A에 나타낸 바와 같이, IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과, J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2) 또는 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 10)의 동시 발현은 실시예 5(도 12), 6.1(도 13A) 및 9.1(도 16)에서 또한 관찰된 바와 같이 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시켰다. NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 17A에서 웨스턴 블롯에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과는 도 17B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸다.
도 18은 실시예 10에 기재된 비변형된 정렬에서 사용된 3개의 폴리펩타이드의 표적 단백질 발현 증진 활성의 비교 수준의 예를 보여주는 도트 블롯 검정에서 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도트 블롯에서 지적된 발현 수준, 즉, 고활성(HA), 활성(A) 및 비활성(NA)은 "3(J 도메인)", "3-45" 및 "3-72"로 지정된 폴리펩타이드에 대해 결정하였다(하기 표 58 참조). 각각의 폴리펩타이드는 단백질 A에 연결시켜 형질감염된 세포에서 V5-태그된 IL13Rα2-Fc 표적 단백질과 동시 발현되는 융합 단백질을 형성한다. 배양 배지에서 V5-태그된 IL13Rα2-Fc 표적 단백질의 발현 수준은 항-V5 항체를 사용한 도트 블롯에서 결정하였다. 상기 도트 블롯은 단독의 표적 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 발현하는 형질감염된 세포, 표적 단백질과 폴리펩타이드 3-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포, 표적 단백질과 폴리펩타이드 3-45-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 4)을 동시 발현하는 형질감염된 세포 및 표적 단백질과 폴리펩타이드 3-72-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 5)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 V5-태그된 IL13Rα2-Fc 표적 단백질의 발현을 보여준다. 비변형된 정렬에서 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 폴리펩타이드의 고활성(HA)은 도트 블롯의 레인 3(좌측으로부터)에서 보여지는 발현 수준을 나타낸다. 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 폴리펩타이드의 음성 대조군(A)에 비해 개선된 활성은 도트 블롯의 레인 4(좌측으로부터)에서 보여지는 발현 수준에 의해 나타난다. 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 폴리펩타이드의 비활성(NA)은 도트 블롯의 레인 5(좌측으로부터)에서 보여진다. 도트 블롯의 레인 1(좌측으로부터)은 표적 단백질 또는 임의의 폴리펩타이드-Fc 융합 단백질을 발현하지 않은 세포의 모방 배양 배지에서 어떠한 표적 단백질도 발현되지 않음을 보여준다.
도 19는 실시예 11에 기재된 바와 같은 전장 J 도메인의 N- 및 C- 말단 결실 돌연변이로서 생성된 일련의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는 Erdj3의 J 도메인의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. J 도메인의 알파 헬릭스 구조 및 루프 도메인은 괄호로 나타낸다. 또한, 폴리펩타이드 각각에 대해 지정 번호, 길이(아미노산 잔기), 단백질 발현 증진 활성(HA, NA) 및 서열번호를 보여준다. (표적 단백질 발현을 증진시키기 위한 고활성(HA), 개선된 활성(A) 및 비활성(NA)의 기재에 대해 도 18 및 실시예 10을 참조한다) 정렬에서 보여지는 바와 같이, J 도메인은 비변형된 정렬에서 폴리펩타이드 3으로 지정되고 길이는 61개 아미노산이고 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 고활성(HA)을 갖는다.
도 20은 변형된 정렬에서 사용된 2개의 폴리펩타이드의 표적 단백질 발현 증진 활성을 비교하는 실시예 12에 기재된 일련의 실험 결과를 보여준다. 도 20A는 세포를 형질감염시키기 위해 사용된 발현 벡터로 삽입하기 위한 핵산 작제물의 다이아그램을 보여준다. IL13Rα2TF 작제물은 C-말단 V5 에피토프 태그에 융합된 세포외 IL13 결합 도메인을 함유하는 절단된 형태의 IL13Rα2를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. IL13Rα2TF-BSC1 작제물은 C-말단 V5 에피토프 태그에 융합된 BSC1 서열(폴리펩타이드 3-29, IKKAYRKLA, 서열번호 48)에 융합된 절단된 형태의 IL13Rα2를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. IL13Rα2TF-BSC1MT 작제물은 C-말단 V5 에피토프 태그에 융합된 BSC1MT 서열(폴리펩타이드 3-55, IAQAYRKLA, 서열번호 298)에 융합된 절단된 형태의 IL13Rα2를 암호화한다. 폴리펩타이드 3-55의 아미노산 서열은 도 20A의 바닥에 보여지는 바와 같이 2개의 위치에서 폴리펩타이드 3-29의 서열과 상이하다. IL13Rα2TF 작제물을 함유하는 벡터로 형질감염된 세포는 대조군(BSC1 또는 BSC1MT 폴리펩타이드와 융합되지 않음)으로 취하였다.
도 20B는 항-V5 항체를 사용하여 IL13Rα2TF, IL13Rα2TF-BSC1, 및 IL13Rα2TF-BSC1MT 단백질을 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지의 도트 블롯 분석의 화학 발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 도 20B의 레인 2(좌측으로부터)는 단지 매우 낮은 수준의 IL13Rα2TF 융합 단백질이 대조군 세포의 배양 배지에서 검출됨을 보여준다. 도 20B에서 레인 3(좌측으로부터)은 상당 수준의 IL13Rα2TF-BSC1 융합 단백질이 IL13Rα2TF-BSC1 작제물을 함유하는 벡터로 형질감염된 세포의 배양 배지에서 발현됨을 보여준다. 도 20B에서 레인 4(좌측으로부터)는 매우 낮은 수준의 IL13Rα2TF-BSC1MT 융합 단백질이 IL13Rα2TF-BSC1MT 작제물을 함유하는 벡터로 형질감염된 세포의 배양 배지에서 발현되었음을 보여준다. 상기 결과들은 폴리펩타이드 3-29가 변형된 정렬에서 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 "고활성"을 갖는 반면, 폴리펩타이드 3-55는 변형된 정렬에서 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 "비활성"을 갖는 것으로 고려됨을 나타낸다.
도 21은 실시예 13에 기재된 바와 같은 HEK293 세포에서 BSC1-단백질 A와 비변형된 정렬에서 동시 발현된 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질의 IL13 결합 활성을 보여주는 막대 그래프이다. 폴리펩타이드 3-29(IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 융합 단백질이 단백질 A에 연결되는 경우의 BSC1-단백질 A 단백질은 실시예 13에 나타낸 바와 같다. IL13 결합 활성을 결정하기 위해 사용되는 분석은 샌드위치 ELISA이고 여기서 IL13이 IL13Rα2TF-Fc 단백질에 의해 포집되는 경우 사람 IL13의 검출이 감소한다. 도 21에서 제1 막대 그래프(좌측으로부터)는 어떠한 IL13 결합 활성이 IL13Rα2TF-Fc 또는 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 발현하지 않는 대조군 세포의 배양 배지에 존재하지 않음을 보여준다. 도 21에서 막대 2(중앙)는 일부 낮은 수준의 IL13 결합 활성이 IL13Rα2TF-Fc 단백질만을 발현하는 세포의 배양 배지에서 검출됨을 보여준다. 대조적으로, 도 21에서 막대 3(맨 우측)에서 보여지는 바와 같이, 상당 수준의 사람 IL13 결합 활성은 IL13Rα2TF-Fc와 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는 세포 배양 배지에 존재하였다. 상기 결과는 비변형된 정렬에서 배양 배지에서 증진된 수준으로 발현되는 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질이 이의 IL13 결합 활성을 보유하고 있음을 보여준다.
도 22는 실시예 14에 기재된 바와 같이 단백질 G에 연결된 폴리펩타이드 3-29(IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 G 융합 단백질과 비변형된 정렬에서 동시 발현되는 경우 배양 배지로 분비되는 인자 VII(FVII)-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현 수준에서 상당한 증진을 입증하는 실험 결과를 보여준다. 도 22A는 단독의 FVII-Fc 융합 단백질(레인 2)을 발현하는 형질감염된 세포, 및 FVII-Fc 융합 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질(레인 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 FVII-Fc 융합 단백질(상부 패널)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 레인 1은 대조군으로서 비-발현 세포 배양 배지를 보여준다. 항-플래그 항체를 사용하여 각각 세포 용해물에서 BSC1-단백질 G(중앙 패널) 및 분비된 BSC1-단백질 G(바닥 패널)를 검출하였다. 도 22B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 22A의 상부 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 22B에서 막대 그래프 1, 2, 및 3은 도 22A의 상부 패널에서 레인 1, 2, 및 3에서의 신호에 상응한다. 상기 결과는 FVII-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 부재 하에 발현된 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 FVII-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승시킴을 보여준다. 추가로, BSC1-단백질 G 융합 단백질은 분비되지 않고 세포에 잔류하였다. 세포 용해물에서 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 발현과 배지에서의 발현(도 22A의 바닥 패널)을 비교한다.
도 23은 실시예 15에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 폴리펩타이드 3-29(IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 존재 하에 인자 IX(FIX)-Fc 융합 단백질(FIX-Fc) 표적 단백질의 발현 수준에서의 개선을 입증하기 위한 실험 결과를 보여준다. 도 23A는 단독의 FIX-Fc 융합 단백질(열 2)을 발현하는 형질감염된 세포 및 FIX-Fc 융합 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 FIX-Fc 융합 단백질의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 열 1은 대조군으로서 비-발현 세포 배양 배지를 보여준다. 도 23B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 23A의 상부 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 23B에서 막대 그래프 1, 2 및 3은 도 23A에서 열 1, 2 및 3에서의 신호에 상응한다. 상기 결과는 FIX-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 FIX-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승시킴을 보여준다.
도 24는 실시예 16에 기재된 바와 같이 단백질 G에 연결된 폴리펩타이드 3-29(IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 G 융합 단백질과 비변형된 정렬에서 동시 발현되는 경우 인자 VIII(FVIII)-Fc 융합 단백질(FVIII-Fc)의 발현 수준의 상당한 증진을 입증하는 일련의 실험 결과를 제공한다. 배지는 BSC1-단백질 G 융합 단백질과 FVIII-Fc 융합 단백질(표적 단백질)을 동시 발현하는 형질감염된 HEK293 세포 또는 단독의 FVIII-Fc 융합 단백질을 발현하는 세포의 배양물로부터 수거하였다. 상기 배지는 ELISA(VisuLizeTM FVIII Antigen Kit, Affinity Biologicals Inc.)에 의해 FVIII 활성에 대해 분석하였다. 공 벡터가 형질감염된 세포 배양 배지는 음성 대조군(좌측으로부터 제1 막대)용으로 사용하였다. 좌측으로부터 제2 막대는 어떠한 FVIII도 단독의 FVIII-Fc 표적 단백질을 발현하는 세포 배지에서 검출되지 않았음을 보여준다. 좌측으로부터 제3 막대는 상당 수준의 FVIII-Fc 표적 단백질이 FVIII-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질을 동시 발현하는 세포의 배지로 분비되었음을 보여준다. 사람 혈청은 양성 대조군(좌측으로부터 마지막 막대)으로서 사용하였다. 상기 결과들은 FVIII-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 FVIII-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승시킴을 보여준다.
도 25는 실시예 17에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A와 비변형된 정렬에서 동시 발현되는 경우 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체(표적 단백질)의 개선된 발현 수준을 입증하는 실험 결과를 보여준다. 도 25A는 단독의 항-IL8 항체(열 2)를 발현하는 형질감염된 세포, 및 항-IL8 항체 및 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3, BSC1-단백질 A)을 동시 발현하는 세포의 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체(표적 단백질)의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 배양 배지에서 항-IL8 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체를 사용하는 도트 블롯 검정에서 분석하였다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현시키기 위한 구조적 유전자가 없는(항-IL8 항체 부재, 열 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. BSC1-단백질 A 융합 단백질과 항-IL8 항체의 형질감염된 세포에서 동시 발현(열 3)은 단독의 항-IL8 항체(열 2)를 발현하는 형질감염된 세포에서 발현된 항체 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다.
도 25B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 25A에서의 열 각각에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 25B의 막대는 도 25A의 열 번호에 상응하도록 번호매김한다. 상기 일련의 실험 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 표적화된 항-IL8 항체의 동시 발현이 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 항체의 발현 수준과 비교하여 분비된 항-IL8 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 25C는 발현된 항-IL8 항체(표적 단백질)에 의해 IL8 결합 활성을 검출하기 위한 ELISA 결과의 막대 그래프를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 IL8로 피복하고, 단독의 항-IL8 항체(막대 그래프 2)를 발현하거나, BSC1-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3, BSC1-단백질 A)과 항-IL8 항체를 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체(표적 단백질)로 항온처리하였다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(항-IL8 항체 부재, 막대 그래프 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 상기 일련의 실험 결과는 증진된 수준으로 발현되고 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체가 사람 IL8에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여주고, 이는 적절한 입체배좌의 항체임을 지적한다.
도 26은 실시예 18에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A 융합체와 동시 발현되는 경우, 항-VEGF 항체인 베바시부맙의 발현 수준에서의 상당한 증진을 입증하는 일련의 실험 결과를 보여준다. 도 26A는 단독의 항-VEGF 항체(열 2)를 발현하거나, 항-VEGF 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 항-VEGF 항체의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(어떠한 항-VEGF 항체 부재, 열 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 배양 배지에서 항-VEGF 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체를 사용한 도트 블롯 검정에서 분석하였다. BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3)과 항-VEGF 항체의 형질감염된 세포에서 동시 발현은 단독의 항-VEGF 항체(열 2)를 발현하는 형질감염된 세포에서 발현된 항체 수준과 비교하여 배양 배지로 분비된 항-VEGF 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다.
도 26B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 26A의 열 각각에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 26B의 막대 그래프는 도 26A에서 열 번호와 상응하도록 번호 매김한다. 상기 결과들은 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 항-VEGF 항체의 동시 발현이 단독의 발현된 항체 수준과 비교하여 분비된 항-VEGF 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 26C는 형질감염된 세포 배양 배지에서 발현된 항-VEGF 항체에 의해 VEGF 결합을 검출하기 위한 ELISA의 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 VEGF-A로 피복하고 단독의 항-VEGF 항체(막대 그래프 2)를 발현하거나 본 발명의 항-VEGF 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비된 항-VEGF 항체(표적 단백질)로 항온처리한다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(항-VEGF 항체 부재, 막대 그래프 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 상기 일련의 실험 결과는 증진된 수준으로 발현되고 배양 배지로 분비된 항-VEGF 항체가 사람 VEGF-A에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여주고 이것은 적절한 입체배좌의 분비된 항체를 지적한다.
도 27은 실시예 19에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A 융합체와 동시 발현되는 경우 치료학적 항-TNFα 항체인 아달리무맙(Humira®, AbbVie)의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 입증하는 일련의 실험으로부터의 결과를 보여준다. 도 27A는 단독의 항-TNFα 항체(열 2)를 발현하거나 항-TNFα 항체와 BSC1-단백질 A 융합체(열 3)를 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비된 항-TNFα 항체의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(열 1, 항-TNFα 항체 부재) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 배양 배지에서 항-TNFα 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체를 사용한 도트 블롯 검정에서 분석하였다. 항-TNFα 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(바닥 열)의 형질감염된 세포에서 동시 발현은 단독의 항-TNFα 항체(중앙)를 발현하는 형질감염된 세포에서 발현된 항체 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 항-TNFα 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다.
도 27B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 27A에서 열 각각에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 27B의 막대 그래프는 도 27A의 열 번호와 상응하도록 번호 매김한다. 상기 일련의 실험 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 항-TNFα 항체(표적 단백질)의 동시 발현이 분비된 항-TNFα 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 27C는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 발현된 항-TNFα 항체에 의한 TNFα 결합 활성을 검출하기 위한 ELISA의 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 TNFα로 피복하고 단독의 항-TNFα 항체(막대 그래프 2)를 발현하는 형질감염된 세포 또는 항-TNFα 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3)을 동시 발현하는 세포의 배양 배지로 분비되는 항-TNFα 항체(표적 단백질)로 항온처리한다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(막대 그래프 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 상기 일련의 실험 결과는, 증진된 수준으로 발현되고 배양 배지로 분비되는 항-TNFα 항체가 사람 TNFα에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여주고, 이는 적절한 입체배좌의 분비된 항체를 지적한다.
도 28은 확립된 시판되는 관련 세포주에서 이미 안정적으로 생산되는 단백질 발현 수준이 실시예 20에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A 융합체와 동시 발현되는 경우 증진될 수 있음을 입증하는 결과들을 제공한다. 도 28A는 단독의 항-IL8 항체(열 2)를 발현하는 CHO-DP12 세포주(수탁번호 CRL-124444, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, Manassas, Virginia) 및 항-IL8 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 세포 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체(표적 단백질)의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. BSC1-단백질 A 융합 단백질과 항체의 동시 발현이 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 2)의 부재 하에 발현된 항체의 수준과 비교하여 배양 배지로 분비된 항체(열 3)의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다. 열 1은 대조군이다(배지만). 도 28B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 28A의 열에서 도트 블롯의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과가 도 28B에서의 각각의 막대 그래프에서 나타남을 보여준다. 상기 결과들은 BSC1-단백질 A 융합 분자(막대 그래프 3)와 항체의 동시 발현이 항체가 BSC1-단백질 A 융합 분자(막대 그래프 2) 부재 하에서 발현된 경우 수득된 것과 비교하여 분비된 항체의 발현을 상당히 증진시켜 발현 수준에서 대략 4배 내지 5배 큰 증진을 제공함을 지적한다.
도 28C는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 발현되는 항-IL8 항체에 의해 IL8 결합 활성을 검출하기 위한 ELISA의 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 IL8로 피복시키고 항-IL8 항체(막대 그래프 2)를 안정적으로 발현하거나, 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3)을 동시 발현하는 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체(표적 단백질)로 항온처리한다. 배양 배지는 음성 대조군(막대 그래프 1, IL8 결합 활성 부재)으로서 사용하였다. 상기 일련의 실험 결과는 배양 배지로 증진된 수준으로 분비되는 항-IL8 항체가 사람 IL8에 대한 이의 결합 활성을 보유함을 명백히 보여주고, 이는 적절한 입체배좌의 분비된 항체를 지적한다.
도 29는 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 이의 적절한 입체배좌로 폴딩되지 않는 돌연변이 단백질에 의해 유발된 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지적하는 실시예 21에 기재된 실험 결과를 제공한다. 도 29A는 야생형 알파1-항트립신(AAT), 또는 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A의 동시 발현 존재 또는 부재 하에 사람 IgG 기원의 Fc 도메인에 연결된 Z 돌연변이(AATZ, 여기서 Glu는 코돈 342번에서 Lys로 대체된다)를 함유하는 돌연변이 알파1-항트립신을 포함하는 융합 단백질의 발현을 위한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 도 29의 상부 패널은 단독의 AAT-Fc 융합 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 발현하는 형질감염된 세포, 단독의 AATZ-Fc 융합 단백질(좌측으로부터 레인 3)을 발현하는 형질감염된 세포 및 AATZ-Fc 융합 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 4)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 Fc 융합 단백질의 발현을 보여준다. 레인 1은 대조군으로서 비-발현 세포 배양 배지를 보여준다. 명백하게 어떠한 AATZ-Fc 융합 단백질이 단독의 AATZ-Fc 융합 단백질(레인 3, 좌측으로부터)을 발현하는 세포 배양 배지로 분비되지 않았다. 도 29의 중앙 패널(세포 용해물)에서 보여지는 바와 같이, 단독의 AATZ-Fc 융합 단백질을 발현하는 세포에 대해, AATZ-Fc 융합 단백질이 세포에 유지되고(좌측으로부터 레인 3), 추측컨대 비융합된 AATZ 단백질에 대해 공지된 바와 같이 소포체에 체류한다. 대조적으로, AATZ-Fc 융합 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현은 도 29의 상부 패널(중앙)에서 레인 4(좌측으로부터)에 보여지는 바와 같이 배양 배지로 분비되는 AATZ-Fc 융합 단백질의 수준을 상당히 증진시켰다. 더욱이, 도 29의 중앙 패널(세포 용해물)에서 레인 4(좌측으로부터)에 보여지는 바와 같이, 실제로 어떠한 AATZ-Fc 융합 단백질이 상기 세포에 유지되지 않았다. 상기 동일한 막을 도 29에서 로딩 대조군(하부 패널)에 대한 항-튜불린 항체로 블롯팅하였다. 상기 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 AATZ-Fc가 실제로 세포에 보유되지 않는 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하의 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 AATZ-Fc 표적 단백질의 수준을 상당히 상승시킴을 보여준다.
도 2는 단독의 절단된 수용체 단백질(IL13Rα2 TF)과 비교하여, 절단된 형태("TF")의 IL13Rα2 수용체 단백질(리간드 결합 도메인을 함유하는 IL13Rα2 수용체 단백질의 세포외 성분인)이 J-도메인(J-IL13Rα2 TF)에 연결된 변형된 정렬에서 분비된 목적하는 표적 단백질의 발현 수준의 개선을 조사한 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 2A는 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 발현 벡터 플라스미드로의 삽입을 위한 구조적 유전자 작제물의 다이아그램을 도시한다. IL13Rα2 TF를 암호화하는 cDNA는 IL13Rα2 TF 발현 생성물에 대해 3' 말단에서 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. IL13Rα2 TF를 암호화하는 cDNA는 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 3' 말단에서 증강되고 본 발명의 J 도메인 융합 단백질 발현 생성물(J-IL13Rα2 TF)에 대해 J 도메인(J 단백질 Erdj3 기원)을 암호화하는 절편과 함께 5' 말단에 연결된다. 도 2B는 웨스턴 블롯에서 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고 이것은 세포(세포 용해물)에서 및 V5-태그된 IL13Rα2 TF 단백질 및 J 도메인 융합 단백질 대응물의 배양 배지(배지)로 분비되는 상대적 발현 수준을 지적한다. 목적하는 IL13Rα2 TF 단백질에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것이 J 도메인이 없는 IL13Rα2 TF 단백질과 비교하여 상당히 큰 단백질 발현 수준을 유도함을 알 수 있다. 모든 형질감염체는 형질감염체의 성공적인 형질감염 및 작동가능성을 보여주기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 리포터 플라스미드로 동시 형질감염시켰다. 도 2B의 하부 패널을 참조한다. 모방 배양물은 "공" 벡터, 즉 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유한다.
도 3은 절단된 수용체 단백질(IL13Rα2 TF), BAG 도메인-IL13Rα2 TF 융합 단백질(BAG-IL13Rα2 TF), 및 J 도메인-IL13Rα2 TF 융합 단백질(J-IL13Rα2 TF)을 발현하기 위한 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포의 배양 배지로 분비되는 단백질의 상대적 발현 수준을 비교하는 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 3A는, 형길감염된 세포의 배양 배지로 분비된 IL13Rα2TF, BAG-도메인-IL-13Rα2TF 융합 단백질, 및 J 도메인-IL13Rα2TF 융합 단백질의 도트 블롯 분석의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 모든 단백질은 항-V5 항체로 면역 검출을 위해 V5 에피토프 태그를 함유했다. 도 3B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 3A에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 3B에서 막대 그래프는 IL13Rα2 TF(막대 그래프 2) 또는 BAG 도메인-IL13Rα2 TF 융합 단백질(막대 그래프 3)에 비해 상당히 큰 분비된 J 도메인-IL13Rα2 TF 융합 단백질(막대 그래프 4)의 발현 수준을 보여준다. 모방 배양물(막대 그래프 1)은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다.
도 4는 단독의 단백질 또는 BAG 도메인을 갖는 융합 파트너로서 발현되는 것과 비교하여 분비된 α1 항-트립신(α1AT)이 J 도메인 융합 파트너에 연결된(과 융합된) 변형된 정렬에서 분비된 α1AT의 발현 수준의 개선을 조사하기 위한 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 4A는 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 발현 벡터 플라스미드로의 삽입을 위한 구조적 유전자 작제물의 다이아그램을 도시한다. α1AT를 암호화하는 cDNA는 α1AT 발현 생성물에 대해 3'말단에서 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. α1AT를 암호화하는 cDNA는 BAG 도메인 융합 단백질(α1 AT-BAG) 발현 생성물에 대해 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편에 연결된 BAG 도메인을 암호화하는 절편으로 프레임내 연결시켰다. α1AT를 암호화하는 cDNA는 본 발명의 J 도메인 융합 단백질(α1AT-J) 발현 생성물에 대해 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편에 연결된 J 도메인을 암호화하는 절편으로 프레임내 연결시켰다. 도 4B는 도트 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고, 이것은 배양 배지로 분비된 분비된 α1AT 단백질 또는 분비된 융합 단백질 대응물의 상대적 발현 수준을 지적한다. 목적하는 α1AT 단백질에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것(α1AT-J)이 단독의 α1AT 단백질 또는 BAG 도메인 융합 대응물(α1AT-BAG)과 비교하여 분비된 단백질(α1AT-J) 발현 수준을 상당히 크게 유도함을 알 수 있다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다. 도 4C는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 4B에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 4C에서 막대 그래프는 (융합되지 않은) α1AT(막대 그래프 2) 또는 BAG 도메인 α1AT 융합 단백질(막대 그래프 3)과 비교하여 상당히 크게 분비된 α1AT-J 융합 단백질(막대 그래프 4)의 발현 수준을 보여준다.
도 5는 단독의 단백질(TNFR1TF)과 비교하여, TNFR1TF가 J 도메인 융합 파트너에 연결된 변형된 정렬에서 분비된 절단된 형태의 TNFα-수용체 1 단백질(TNFR1TF)의 발현 수준에서의 개선을 입증하는 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 5A는 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 발현 벡터 플라스미드로 삽입을 위한 구조적 유전자 작제물의 다이아그램을 도시한다. TNFR1TF를 암호화하는 cDNA는 TNFR1TF 발현 생성물에 대해 3' 말단에서 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. TNFR1TF를 암호화하는 cDNA는 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편에 연결된 J 도메인을 암호화하는 절편에 프레임내 연결되어 본 발명의 J 도메인 융합 단백질 발현 생성물을 제공한다. 도 5B는 도트 블롯의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고 이것은 배양 배지로 분비된 TNFR1TF 및 TNFR1TF-J 도메인의 상대적 수준을 지적한다. 목적하는 TNFR1TF 단백질에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것(TNFR1TF-J)이 (융합되지 않은) TNFR1TF 단백질에 대한 것 보다 분비된 단백질의 발현을 상당히 크게 유도함을 알 수 있다. 도 5C는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 5B의 도트 블롯에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 5C에서 막대 그래프는 TNFR1TF(막대 그래프 2)와 비교하여 분비된 TNFR1TF-J 도메인 융합 단백질(막대 그래프 3)의 발현 수준이 상당히 높음을 명백히 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다.
도 6은 목적하는 3개의 표적 단백질 각각이 J 도메인 융합 파트너에 연결된 변형된 정렬에서 목적하는 표적 Fc 융합 단백질의 발현 수준에서의 개선을 입증하는 실시예 2에 기재된 일련의 실험 결과를 보여준다. 도 6A는 상기 실시예에 사용된 구조적 유전자 작제물의 다이아그램을 도시한다. Fc 융합 단백질에 대해, 목적하는 각각의 단백질(TNFR1TF, IL13Rα2TF, 또는 α1AT)을 암호화하는 cDNA는 면역글로불린 Fc 영역의 불변 도메인을 암호화하는 절편("Fc")에 연결된, 3' 말단에서의 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. J 도메인 융합에 대해, J 도메인을 암호화하는 cDNA는 목적하는 각각의 단백질을 암호화하는 cDNA와 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편 사이의 프레임내 연결되었다. 도 6A를 참조한다. 도 6B는 형질감염된 세포의 배양 기원의 배지에서 분비된 단백질에 대한 도트 블롯 분석을 보여준다. Fc 융합 단백질(TNFR1-V5-Fc, IL13Rα2TF-Fc, 및 α1AT-Fc) 각각은 도 6B에서 각각의 패널의 중앙 레인내 도트 블롯에서 보여지는 바와 같은 배양 배지에서 발현되었다. Fc 융합 단백질의 상기 발현 수준은 단독의 목적하는 단백질(즉, Fc 도메인에 대한 융합 없이; 데이터는 나타내지 않음) 각각에 대한 것 보다 높았다. 상당히 높은 수준의 발현은 J 도메인이 도 6B에서 각각의 패널의 우측 레인의 도트 블롯에서 보여지는 바와 같은 Fc 융합 단백질내 목적하는 절편의 단백질에 연결되는 각각의 경우에 수득되었다. 도 6B에서 도트 블롯의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과는 도 6C의 상응하는 패널에서 보여지고, 여기서, J 도메인 융합 단백질의 상당히 높은 수준의 발현은 도 6C의 패널 각각에서 막대 그래프 2(목적하는 단백질-Fc 융합 단백질)와 막대 그래프 3(목적하는 단백질-J 도메인-Fc 융합 단백질)을 비교함에 의해 명백해진다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다.
도 7은 단독의 p53 단백질과 비교하여, p53이 J 도메인 융합 파트너에 연결된(과 융합된) 변형된 정렬에서 세포질 p53 단백질의 발현 수준에서의 개선을 입증하는 실시예 2에 기재된 실험 결과를 보여준다. 도 7A는 상기 실험에 사용된 작제물의 다이아그램을 도시한다. p53을 암호화하는 cDNA는 이의 5' 말단에서 p53 발현 생성물에 대해 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다. p53을 암호화하는 cDNA는 본 발명의 J 도메인 융합 단백질(J-p53) 발현 생성물에 대해 5' 말단에서 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편에 연결된 SV40 J 단백질의 J 도메인을 암호화하는 절편에 이의 5' 말단에서 프레임내 연결된다. 도 7B는 세포 용해물의 웨스턴 블롯의 화학 발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고 이는 태그된 p53 단백질 및 J 도메인 융합 단백질 대응물(J-p53)의 세포에서 상대적 발현 수준을 지적한다. 목적하는 p53 단백질에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것(J-p53)이 J 도메인이 없는 p53 단백질(p53)의 형질감염된 세포에서 발현 수준과 비교하여 형질감염된 세포에서 상당히 큰 발현 수준을 유도하였음을 알 수 있다. 유사 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다.
도 8은 단독의 단백질 각각 또는 BAG 도메인과의 융합체로서 발현되는 단백질 각각과 비교하여, 단백질 각각이 J 도메인 융합 파트너에 연결된(과 융합된) 변형된 정렬에서 목적하는 2개의 표적 단백질, 즉, 야생형 CFTR 단백질 및 상응하는 CFTR Δ508F 돌연변이 단백질(페닐알라닌 잔기의 508번 위치에서의 결실은 폴딩 결함과 CFTR Δ508F 돌연변이 단백질의 신속한 분해를 유도한다)의 발현 수준의 개선을 입증하는 실시예 2에 기재된 일련의 실험 결과를 보여준다. 도 8A는 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용되는 발현 벡터 플라스미드로의 삽입을 위한 작제물의 다이아그램을 도시한다. 목적하는 각각의 단백질, 즉, 야생형 CFTR 단백질(CFTR WT) 또는 CFTR Δ508F 돌연변이 단백질(Δ508F)을 암호화하는 cDNA는 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 5' 말단에서 증강되었다. BAG 도메인 융합체에 대해, BAG 도메인을 암호화하는 cDNA는 목적하는 각각의 단백질을 암호화하는 cDNA와 V5 에피토프 태그를 암호화하는 5' 절편 사이에 프레임내 연결되었다. 본 발명의 J 도메인 융합 단백질 발현 생성물에 대해, SV40 J 도메인을 암호화하는 cDNA는 J 도메인에 대해 목적하는 각각의 단백질을 암호화하는 cDNA와 V5 에피토프 태그를 암호화하는 5' 절편 사이의 프레임내 연결되었다. 도 8A를 참조한다. 도 8B는 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여주고, 이는 목적하는 태그된 단백질(CFTR WT 및 CFTR Δ508F), BAG 도메인 융합 단백질(BAG-CFTR WT 및 BAG-CFTR Δ508F), 및 J 도메인 융합 단백질(J-CFTR WT 및 J-CFTR Δ508F)의 세포에서 상대적 발현 수준을 지적한다. CFTR WT와 CFTR Δ508F 단백질 둘 다에 대한 융합 파트너로서 J 도메인을 사용하는 것이(융합되지 않은) CFTR WT 및 돌연변이 CFTR Δ508F 단백질 또는 BAG 도메인 융합 대응물의 발현 수준과 비교하여 형질감염된 세포에서 상당히 큰 발현 수준을 유도함을 알 수 있다. 모든 형질감염체는 형질감체의 성공적인 형질감염 및 작동능력을 보여주기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 리포터 플라스미드로 동시 형질감염시켰다(도 8B의 하부 패널).
도 9는 본 발명의 융합 단백질의 동시-발현이 실시예 4에 기재된 바와 같은 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키는 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 비변형된 정렬의 일반 반응식의 다이아그램을 도시한다. 상기 반응식에서, 본 발명의 융합 단백질은 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(PEEP) 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 표적 단백질 결합 도메인은 목적하는 표적 단백질에 결합하여 상기 표적 단백질은 PEEP 도메인에 최근 접하게 되고 이는 이의 적절한 세포 또는 세포외 위치에서 표적 단백질의 발현 수준을 상승시킨다.
도 9B는 하기 실시예 4에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용된 발현 벡터 플라스미드로의 삽입을 위해 IL13Rα2TF 융합 단백질(표적 단백질)을 암호화하는 구조적 유전자의 다이아그램이다. IL13Rα2의 세포외 IL13 리간드 결합 도메인을 포함하는, 절단된 형태의 IL13Rα2 수용체 단백질(IL13Rα2TF)을 암호화하는 cDNA는 3' 말단에서 V5 에피토프를 암호화하는 절편과 함께 증강되었다.
도 9C는 도 9B에 도시되고 실시예 4에 기재된 바와 같은 V5 태그된 IL13Rα2TF 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 본 발명의 융합 단백질 발현용 작제물을 도시한다. Erdj3 J 단백질의 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인)을 암호화하는 cDNA는 IL13 단백질(표적 단백질 결합 도메인)을 암호화하는 절편에 연결하였다. 플래그 에피토프 태그를 암호화하는 절편은 IL13 표적 단백질 결합 도메인을 암호화하는 절편의 3' 말단에 연결하였다.
도 10은 실시예 4에 기재된 바와 같이 단독으로 발현되는 경우(좌측으로부터 레인 2), 이의 IL13 리간드와 동시 발현되는 경우(유일한 IL13, 좌측으로부터 레인 3) 및 본 발명의 J 도메인-IL13 융합 단백질과 비변형된 정렬에서 동시 발현되는 경우(J-IL13, 좌측으로부터 레인 4), 절단된 형태의 IL13Rα2 수용체 단백질(IL13Rα2TF)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지(상부 패널) 및 세포 용해물(중앙 패널)의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 적절히 폴딩된 IL13Rα2TF 단백질(표적 단백질)은 형질감염된 숙주 세포로부터 분비되는 것으로 예상된다. J 도메인-IL13 융합 단백질과 함께 IL13Rα2TF 단백질의 동시 발현이 단독의 IL13Rα2TF 단백질의 발현(정상 패널, 좌측으로부터 레인 2) 또는 IL13Rα2TF 단백질과 이의 IL13 리간드의 동시 발현(정상 패널, 좌측으로부터 레인 3)과 비교하여, 분비된 IL13Rα2TF 단백질(정상 패널, 좌측으로부터 레인 4)의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다. 더욱이, IL13Rα2TF 단백질과 J 도메인-IL13 융합 단백질의 동시 발현은 단독의 IL13Rα2TF 단백질의 발현 수준(중앙 패널, 좌측으로부터 레인 2) 또는 IL13Rα2TF 단백질과 이의 IL13 리간드(중앙 패널, 좌측으로부터 레인 3)의 동시 발현과 비교하여 세포내 IL13Rα2TF 단백질(중앙 패널, 좌측으로부터 레인 4)의 발현 수준을 상당히 증진시켰다. 모든 형질감염체는 형질감염체의 성공적인 형질감염 및 작동능력을 보여주기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 리포터 플라스미드와 동시 형질감염시켰다. 도 10의 하부 패널을 참조한다. 모방 배양물은 "공 벡터", 즉, 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터(IL13Rα2TF 단백질 부재, 동시 발현 부재, 블롯의 좌측으로부터 레인 1에서 "부재")로 형질감염된 세포를 함유하였다. 상기 공 벡터 형질감염체는 그러나 GFP 벡터와 동시 형질감염시키고 성공적인 동시 형질감염은 도 10의 하부 패널에 도시된 GPF 발현에 의해 보여진다.
도 11은 하기 실시예 5에 기재된 실험용으로 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용된 발현 벡터 플라스미드내로 삽입하기 위한 단백질을 암호화하는 핵산 작제물의 도식적 다이아그램을 보여준다. 도 11A는 면역글로불린 Fc 도메인의 불변 도메인을 암호화하는 절편에 연결된, V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 3' 말단에서 증강된 목적하는 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 Fc 융합 단백질(표적 단백질)을 암호화하는 DNA 작제물을 도시한다. 하기 실시예 5를 위해, 상기 Fc 융합 단백질 표적은 목적하는 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질을 생산하기 위해 Fc 도메인에 연결된 V5 에피토프 태그에 연결된 절단된 형태의 IL13Rα2 수용체 단백질(IL13Rα2TF)을 포함했다. 도 11B는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물을 도시하고, 여기서, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(PEEP) 도메인(예를 들어, J 단백질의 J 도메인)은 표적 단백질 결합 도메인(예를 들어, Fc 도메인에 결합하는 것으로 공지된 단백질 A)에 연결되어 있다. 상기 작제물은 표준 항-플래그 항체를 사용한 용이한 동정 및 단리를 위한 플래그 에피토프 태그에 대한 암호화 절편과 함께 3' 말단에서 추가로 증강시켰다.
도 12는 표적 단백질이 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 비변형된 정렬에서 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현에서 상당한 증진을 입증하지만 표적 단백질이 단독의 단백질 A와 동시 발현되는 경우에는 그렇지 않음을 입증하는 실시예 5에 기재된 실험 결과를 보여준다.
도 12A는 실시예 5에 기재된 바와 같이, 단독으로 발현되는 경우(레인 2, 부재), 단독의 단백질 A와 동시 발현되는 경우(레인 3, 단지 단백질 A), Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 경우(레인 4, J-단백질 A) 및 Erdj5 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 경우(레인 5, J2-단백질 A) IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양으로부터 배지의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질(좌측으로부터 레인 1)을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질 및 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 4 및 5)의 동시 발현이 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 발현하거나 융합되지 않은 단백질 A와 IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질(좌측으로부터 레인 3)을 동시 발현하는 형질감염 세포에서의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 크게 유도함을 알 수 있다.
도 12B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 12A에서의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 12B의 막대 그래프 1-5는 도 12A에서의 레인 1 내지 5에서의 신호에 상응한다. 도 12B에서의 막대 그래프는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질(막대 그래프 4 및 5)의 동시 발현이 단독의 IL13Rα2TF-Fc(막대 그래프 2)의 발현 또는 단독의 (비융합된) 단백질 A와 IL13Rα2TF-Fc(막대 그래프 3)의 동시 발현과 비교하여 분비된 IL13Rα2TF-Fc의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 12C는 실시예 5에 기재된 바와 같이, Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2, J-단백질 A)과 동시 발현되는 경우 및 단독의 단백질 A(레인 3, 단지 단백질 A)와 동시 발현되는 경우, 단독의 IL13Rα2TF(Fc 도메인 없음) 단백질(레인 1, 부재)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양물로부터 배지의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 상기 결과는 도 12A 및 도 12B에서 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 표적 단백질의 증진된 수준이 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질의 Fc 도메인에 대한 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 표적 단백질 결합 도메인의 특이성에 의존하는 경우에 예상되는 바와 같은 분비된 IL13Rα2TF 단백질의 임의의 발현이 거의 관찰되지 않음을 보여준다. 도 12D는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 12C에서의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 따라서, 도 12C 및 도 12D는 상기 결과가 지적하는 바와 같이, IL13Rα2TF 단백질이 J 도메인-단백질 A 융합(표적 결합 도메인(단백질 A)에 대한 Fc 리간드가 부재임)에 의해 인지되지 않고 따라서 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인)에 의해 제공될 수 있는 발현 수준에서의 증진이 IL13Rα2TF에 표적화되지 않는다는 점에서 대조군 실험 결과를 보여준다.
도 13은 하기 실시예 6에 기재된 바와 같이, 본 발명의 상응하는 융합 단백질과 동시 발현되는 경우 3개의 상이한 Fc 융합 표적 단백질의 발현 수준의 상당한 증진을 입증하는 일련의 실험 결과를 제공한다. 도 13A(좌측 패널)는 하기 실시예 6.1에 기재된 바와 같고 실시예 5에 기재된 실험과 유사하게 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(좌측으로부터 레인 1)을 발현하는 형질감염된 세포 및 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질 및 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양물의 배지로 분비되는 IL13Rα2TF-Fc 융합 도메인(표적 단백질)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 13A의 우측 패널은 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 13A의 좌측 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 13A의 우측 패널에서 막대 그래프 1 및 2(좌측에서 우측으로)는 도 13A의 좌측 패널에서 레인 1 및 2(좌측에서 우측으로)에서의 신호에 상응한다. 상기 결과는, 본 발명의 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승(8배)시킴을 보여준다. 결과는 실시예 5 및 도 12에 기재된 것들과 일치한다.
도 13B(좌측 패널)는 하기 실시예 6.2에 기재된 바와 같이 단독의 TNFR1TF-Fc 융합 표적 단백질(좌측으로부터 레인 1)을 발현하는 형질감염된 세포 및 TNFR1TF-Fc 융합 단백질 및 J 도메인-단백질 A 융합(좌측으로부터 레인 2)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 TNFR1TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 13B의 우측 패널은 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 13B의 좌측 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 13B의 우측 패널에서 막대 그래프 1 및 2(좌측에서 우측으로)는 도 13B의 좌측 패널에서 레인 1 및 2(좌측에서 우측으로)에서의 신호에 상응한다. 상기 결과는, J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이, J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비되는 TNFR1TF-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승(6배) 시킴을 보여준다.
도 13C(좌측 패널)는 실시예 6.3에 기재된 바와 같이, 단독의 α1 AT-Fc 융합 표적 단백질(좌측으로부터 레인 1)을 발현하는 형질감염된 세포 및 α1 AT-Fc 융합 표적 단백질 및 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 α1 항-트립신(α1 AT)-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 13C의 우측 패널은 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 13C의 좌측 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 13C의 우측 패널에서 막대 그래프 1 및 2(좌측에서 우측으로)는 도 13C의 좌측 패널에서 레인 1 및 2(좌측에서 우측으로)의 신호에 상응한다. 상기 결과는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 α1 AT-Fc 융합 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승(3배)시킴을 보여준다.
도 14는 하기 실시예 7에 기재된 비변형된 정렬에서 분비된 사람화된 항-IL8 IgG1 항체의 발현 수준에서 증진을 시험하는 일련의 실험 기원의 결과를 제공한다. 도 14A는 단독의 항-IL8 항체(레인 2)를 발현하고, 항-IL8 항체 및 단백질 A(레인 3, 단지 단백질 A)를 동시 발현하고, 본 발명의 항-IL8 항체 및 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 4, J-단백질 A)을 동시 발현하고, 항-IL8 항체 및 단백질 L(레인 5, 단지 단백질 L)을 동시 발현하고, 본 발명의 항-IL8 항체 및 Erdj3 J 도메인-단백질 L 융합 단백질(레인 6, J-단백질 L)을 동시 발현하고, 항-IL8 항체 및 이의 IL8 리간드(레인 7, IL8)를 동시 발현하고, 본 발명의 Erdj3 J 도메인-IL8 리간드 융합 단백질(레인 8, J-IL8)을 동시 발현하고, 단독의 Erdj3 J-단백질 A 융합 단백질(레인 9, J-단백질 A)을 발현하고, 단독의 Erdj3 J 도메인-단백질 L 융합 단백질(레인 10, J-단백질 L)을 발현하고, Erdj3 J 도메인-IL8 리간드 융합 단백질(레인 11, J-IL8)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체(표적 단백질)의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학 발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(항-IL8 항체 부재, 레인 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하였다. 배양 배지에서 항-IL8 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체("항-huIgG Ab")(카탈로그 번호 AP112P, Millipore)를 사용한 도트 블롯 검정에서 분석하였다. 형질감염된 세포에서 항-IL8 항체와, J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 4), J 도메인-단백질 L 융합 단백질(레인 6) 또는 J 도메인-IL8 융합 단백질(레인 8)의 동시 발현이 단독의 항-IL8 항체(레인 2)를 발현하거나, 단독의 단백질 A(레인 3, 단지 단백질 A)와 동시 발현하거나, 단독의 단백질 L(레인 5, 단지 단백질 L)을 동시 발현하거나 단독의 IL8 리간드 단백질(레인 7)을 동시 발현하는 형질감염된 세포에서 발현된 항체의 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다. 단독의 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 9, J-단백질 A)을 발현하는 형질감염된 세포, 단독의 J 도메인-단백질 L 융합 단백질(레인 10, J-단백질 L)을 발현하는 형질감염된 세포 또는 단독의 J 도메인-IL8 융합 단백질(레인 10, J-IL8)을 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 어떠한 신호도 검출되지 않았고, 이것은 모든 3개의 융합 단백질이 특이적으로 표적화되어 동시 발현된 항-IL8 항체 표적 단백질의 발현을 증진시킴을 지적한다.
도 14B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 14A의 레인 각각에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 14B의 막대 그래프는 도 14A의 레인 번호에 상응하도록 번호매김하였다. 이러한 일련의 실험 결과는 표적 단백질 결합 도메인(여기서, 단백질 A, 단백질 L, 또는 IL8)에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(여기서, Erdj3 J 도메인)를 포함하는 본 발명의 융합 단백질과 표적화된 항-IL8 항체의 동시 발현이 단독의 융합되지 않은 표적 단백질 결합 도메인 단백질(단지 단백질 G, 단지 단백질 L 또는 단지 IL8)과 항체의 동시 발현과 비교하여 분비된 항-IL8 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 15는 하기 실시예 8에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 융합 단백질이 확립된 시판되는 관련 세포주에서 이미 안정하게 생산된 표적 단백질의 발현 수준을 증진시키기 위해 사용될 수 있음을 입증하는 결과를 제공한다. 도 15A는 항-IL8 항체 및 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 3, J-단백질 A)을 동시 발현하는 형질감염된 세포에서 및 단독의 항-IL8 항체(레인 2)를 발현하는 CHO-DP12 세포주(수탁번호. CRL-124444, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), Manassas, Virginia)의 세포 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체(표적 단백질)의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 배양 배지에서 항-IL8 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체("항-huIgG Ab")를 사용한 도트 블롯 검정에서 분석하였다. J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 항체의 동시 발현이 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2, 부재)의 부재 하에 발현된 항체의 수준과 비교하여 배양 배지로 분비된 항체(레인 3)의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다. 레인 1은 대조군(단지 배지)이다. 도 15B는 도 15B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸 바와 같이 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 15A의 레인에서 도트 블롯의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 상기 결과는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3)과 항체의 동시 발현이 분비된 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 지적하고, 항체가 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 2)의 부재 하에 발현되는 경우 수득되는 것과 비교하여 발현 수준을 대략 4배 내지 5배 초과로 증진시킨다. 상기 결과는 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 확립된 생산 세포주에서 이미 안정하게 발현되는 표적 단백질의 생산 수준을 상당히 증진시킴을 지적한다.
도 16은 하기 실시예 9.1에 기재된 바와 같이, 임의의 다양한 단백질에 연결된 J 단백질의 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인으로서)을 포함하는 다양한 융합 단백질을 시험하는 일련의 실험으로부터의 결과를 제공한다. 이어서 다양한 J 도메인 융합 단백질 및 다른 단백질을 시험하였고 형질감염된 HEK293 세포의 배양 배지로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현 수준을 증진시키는 이들의 능력에 대해 비교하였다. 도 16A는 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)(레인 1)을 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 단독의 단백질 A(레인 3, 단지 단백질 A)를 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 4)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-hFcR 융합 단백질(레인 5, J-hFcR)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-vFcR 융합 단백질(레인 6, J-vFcR)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-gI 융합 단백질(레인 7, J-gI)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-gE 융합 단백질(레인 8, J-gE)을 동시 발현하고 IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-gI 융합 단백질 및 J 도메인-gE 융합 단백질 둘 다(레인 9, J-gI + J-gE)를 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 16A에서 웨스턴 블롯의 화학발광 신호의 밀도측정 분석 결과는 도 16B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸다. 상세하게는 실시예 9.1을 참조한다.
도 17은 하기 실시예 9.2에 기재된 바와 같이, Fc 도메인을 갖는 단백질의 발현 수준을 증진시키는데 사용하기 위해 6개 Fc-결합 펩타이드(FcBP1 내지 FcBP6)의 각각에 연결된 J 단백질의 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인으로서)을 포함하는 다양한 융합 단백질을 시험하는 일련의 실험 결과를 제공한다. Fc 결합 펩타이드의 아미노산 서열은 도 17에서 패널 A와 B 사이에 주어진다. 도 17A는 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(표적 단백질)(레인 1 및 3)을 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2, J-단백질 A)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP1 융합 단백질(레인 4, J-FcBP1)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP2 융합 단백질(레인 5, J-FcBP2)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP3 융합 단백질(레인 6, J-FcBP3)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP4 융합 단백질(레인 7, J-FcBP4)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J-도메인-FcBP5 융합 단백질(레인 8, J-FcBP5)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-FcBP6 융합 단백질(레인 9, J-FcBP6)을 동시 발현하고, IL13Rα2TF-Fc와 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 10, J-단백질 G)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지 샘플에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 17A에 나타낸 바와 같이, HEK293 형질감염체에서 6개 J 도메인-펩타이드 융합 단백질 각각과 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 동시 발현은 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(레인 1 및 3)의 발현 수준과 비교하여, 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(레인 4-9)의 발현 수준을 상당히 증진시켰다. 상기 실험은 또한 비교를 위해, 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현에 대한 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과, J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2) 또는 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 10)의 동시 발현 효과를 포함했다. 도 17A에 나타낸 바와 같이, IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과, J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2) 또는 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 10)의 동시 발현은 실시예 5(도 12), 6.1(도 13A) 및 9.1(도 16)에서 또한 관찰된 바와 같이 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시켰다. NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 17A에서 웨스턴 블롯에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과는 도 17B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸다.
도 18은 실시예 10에 기재된 비변형된 정렬에서 사용된 3개의 폴리펩타이드의 표적 단백질 발현 증진 활성의 비교 수준의 예를 보여주는 도트 블롯 검정에서 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도트 블롯에서 지적된 발현 수준, 즉, 고활성(HA), 활성(A) 및 비활성(NA)은 "3(J 도메인)", "3-45" 및 "3-72"로 지정된 폴리펩타이드에 대해 결정하였다(하기 표 58 참조). 각각의 폴리펩타이드는 단백질 A에 연결시켜 형질감염된 세포에서 V5-태그된 IL13Rα2-Fc 표적 단백질과 동시 발현되는 융합 단백질을 형성한다. 배양 배지에서 V5-태그된 IL13Rα2-Fc 표적 단백질의 발현 수준은 항-V5 항체를 사용한 도트 블롯에서 결정하였다. 상기 도트 블롯은 단독의 표적 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 발현하는 형질감염된 세포, 표적 단백질과 폴리펩타이드 3-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포, 표적 단백질과 폴리펩타이드 3-45-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 4)을 동시 발현하는 형질감염된 세포 및 표적 단백질과 폴리펩타이드 3-72-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 5)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 V5-태그된 IL13Rα2-Fc 표적 단백질의 발현을 보여준다. 비변형된 정렬에서 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 폴리펩타이드의 고활성(HA)은 도트 블롯의 레인 3(좌측으로부터)에서 보여지는 발현 수준을 나타낸다. 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 폴리펩타이드의 음성 대조군(A)에 비해 개선된 활성은 도트 블롯의 레인 4(좌측으로부터)에서 보여지는 발현 수준에 의해 나타난다. 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 폴리펩타이드의 비활성(NA)은 도트 블롯의 레인 5(좌측으로부터)에서 보여진다. 도트 블롯의 레인 1(좌측으로부터)은 표적 단백질 또는 임의의 폴리펩타이드-Fc 융합 단백질을 발현하지 않은 세포의 모방 배양 배지에서 어떠한 표적 단백질도 발현되지 않음을 보여준다.
도 19는 실시예 11에 기재된 바와 같은 전장 J 도메인의 N- 및 C- 말단 결실 돌연변이로서 생성된 일련의 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는 Erdj3의 J 도메인의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. J 도메인의 알파 헬릭스 구조 및 루프 도메인은 괄호로 나타낸다. 또한, 폴리펩타이드 각각에 대해 지정 번호, 길이(아미노산 잔기), 단백질 발현 증진 활성(HA, NA) 및 서열번호를 보여준다. (표적 단백질 발현을 증진시키기 위한 고활성(HA), 개선된 활성(A) 및 비활성(NA)의 기재에 대해 도 18 및 실시예 10을 참조한다) 정렬에서 보여지는 바와 같이, J 도메인은 비변형된 정렬에서 폴리펩타이드 3으로 지정되고 길이는 61개 아미노산이고 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 고활성(HA)을 갖는다.
도 20은 변형된 정렬에서 사용된 2개의 폴리펩타이드의 표적 단백질 발현 증진 활성을 비교하는 실시예 12에 기재된 일련의 실험 결과를 보여준다. 도 20A는 세포를 형질감염시키기 위해 사용된 발현 벡터로 삽입하기 위한 핵산 작제물의 다이아그램을 보여준다. IL13Rα2TF 작제물은 C-말단 V5 에피토프 태그에 융합된 세포외 IL13 결합 도메인을 함유하는 절단된 형태의 IL13Rα2를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. IL13Rα2TF-BSC1 작제물은 C-말단 V5 에피토프 태그에 융합된 BSC1 서열(폴리펩타이드 3-29, IKKAYRKLA, 서열번호 48)에 융합된 절단된 형태의 IL13Rα2를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화한다. IL13Rα2TF-BSC1MT 작제물은 C-말단 V5 에피토프 태그에 융합된 BSC1MT 서열(폴리펩타이드 3-55, IAQAYRKLA, 서열번호 298)에 융합된 절단된 형태의 IL13Rα2를 암호화한다. 폴리펩타이드 3-55의 아미노산 서열은 도 20A의 바닥에 보여지는 바와 같이 2개의 위치에서 폴리펩타이드 3-29의 서열과 상이하다. IL13Rα2TF 작제물을 함유하는 벡터로 형질감염된 세포는 대조군(BSC1 또는 BSC1MT 폴리펩타이드와 융합되지 않음)으로 취하였다.
도 20B는 항-V5 항체를 사용하여 IL13Rα2TF, IL13Rα2TF-BSC1, 및 IL13Rα2TF-BSC1MT 단백질을 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지의 도트 블롯 분석의 화학 발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 도 20B의 레인 2(좌측으로부터)는 단지 매우 낮은 수준의 IL13Rα2TF 융합 단백질이 대조군 세포의 배양 배지에서 검출됨을 보여준다. 도 20B에서 레인 3(좌측으로부터)은 상당 수준의 IL13Rα2TF-BSC1 융합 단백질이 IL13Rα2TF-BSC1 작제물을 함유하는 벡터로 형질감염된 세포의 배양 배지에서 발현됨을 보여준다. 도 20B에서 레인 4(좌측으로부터)는 매우 낮은 수준의 IL13Rα2TF-BSC1MT 융합 단백질이 IL13Rα2TF-BSC1MT 작제물을 함유하는 벡터로 형질감염된 세포의 배양 배지에서 발현되었음을 보여준다. 상기 결과들은 폴리펩타이드 3-29가 변형된 정렬에서 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 "고활성"을 갖는 반면, 폴리펩타이드 3-55는 변형된 정렬에서 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 "비활성"을 갖는 것으로 고려됨을 나타낸다.
도 21은 실시예 13에 기재된 바와 같은 HEK293 세포에서 BSC1-단백질 A와 비변형된 정렬에서 동시 발현된 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질의 IL13 결합 활성을 보여주는 막대 그래프이다. 폴리펩타이드 3-29(IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 융합 단백질이 단백질 A에 연결되는 경우의 BSC1-단백질 A 단백질은 실시예 13에 나타낸 바와 같다. IL13 결합 활성을 결정하기 위해 사용되는 분석은 샌드위치 ELISA이고 여기서 IL13이 IL13Rα2TF-Fc 단백질에 의해 포집되는 경우 사람 IL13의 검출이 감소한다. 도 21에서 제1 막대 그래프(좌측으로부터)는 어떠한 IL13 결합 활성이 IL13Rα2TF-Fc 또는 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 발현하지 않는 대조군 세포의 배양 배지에 존재하지 않음을 보여준다. 도 21에서 막대 2(중앙)는 일부 낮은 수준의 IL13 결합 활성이 IL13Rα2TF-Fc 단백질만을 발현하는 세포의 배양 배지에서 검출됨을 보여준다. 대조적으로, 도 21에서 막대 3(맨 우측)에서 보여지는 바와 같이, 상당 수준의 사람 IL13 결합 활성은 IL13Rα2TF-Fc와 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는 세포 배양 배지에 존재하였다. 상기 결과는 비변형된 정렬에서 배양 배지에서 증진된 수준으로 발현되는 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질이 이의 IL13 결합 활성을 보유하고 있음을 보여준다.
도 22는 실시예 14에 기재된 바와 같이 단백질 G에 연결된 폴리펩타이드 3-29(IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 G 융합 단백질과 비변형된 정렬에서 동시 발현되는 경우 배양 배지로 분비되는 인자 VII(FVII)-Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현 수준에서 상당한 증진을 입증하는 실험 결과를 보여준다. 도 22A는 단독의 FVII-Fc 융합 단백질(레인 2)을 발현하는 형질감염된 세포, 및 FVII-Fc 융합 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질(레인 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 FVII-Fc 융합 단백질(상부 패널)의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 레인 1은 대조군으로서 비-발현 세포 배양 배지를 보여준다. 항-플래그 항체를 사용하여 각각 세포 용해물에서 BSC1-단백질 G(중앙 패널) 및 분비된 BSC1-단백질 G(바닥 패널)를 검출하였다. 도 22B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 22A의 상부 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 22B에서 막대 그래프 1, 2, 및 3은 도 22A의 상부 패널에서 레인 1, 2, 및 3에서의 신호에 상응한다. 상기 결과는 FVII-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 부재 하에 발현된 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 FVII-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승시킴을 보여준다. 추가로, BSC1-단백질 G 융합 단백질은 분비되지 않고 세포에 잔류하였다. 세포 용해물에서 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 발현과 배지에서의 발현(도 22A의 바닥 패널)을 비교한다.
도 23은 실시예 15에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 폴리펩타이드 3-29(IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 존재 하에 인자 IX(FIX)-Fc 융합 단백질(FIX-Fc) 표적 단백질의 발현 수준에서의 개선을 입증하기 위한 실험 결과를 보여준다. 도 23A는 단독의 FIX-Fc 융합 단백질(열 2)을 발현하는 형질감염된 세포 및 FIX-Fc 융합 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 FIX-Fc 융합 단백질의 발현에 대한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 열 1은 대조군으로서 비-발현 세포 배양 배지를 보여준다. 도 23B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 23A의 상부 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 제공한다. 도 23B에서 막대 그래프 1, 2 및 3은 도 23A에서 열 1, 2 및 3에서의 신호에 상응한다. 상기 결과는 FIX-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 FIX-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승시킴을 보여준다.
도 24는 실시예 16에 기재된 바와 같이 단백질 G에 연결된 폴리펩타이드 3-29(IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 G 융합 단백질과 비변형된 정렬에서 동시 발현되는 경우 인자 VIII(FVIII)-Fc 융합 단백질(FVIII-Fc)의 발현 수준의 상당한 증진을 입증하는 일련의 실험 결과를 제공한다. 배지는 BSC1-단백질 G 융합 단백질과 FVIII-Fc 융합 단백질(표적 단백질)을 동시 발현하는 형질감염된 HEK293 세포 또는 단독의 FVIII-Fc 융합 단백질을 발현하는 세포의 배양물로부터 수거하였다. 상기 배지는 ELISA(VisuLizeTM FVIII Antigen Kit, Affinity Biologicals Inc.)에 의해 FVIII 활성에 대해 분석하였다. 공 벡터가 형질감염된 세포 배양 배지는 음성 대조군(좌측으로부터 제1 막대)용으로 사용하였다. 좌측으로부터 제2 막대는 어떠한 FVIII도 단독의 FVIII-Fc 표적 단백질을 발현하는 세포 배지에서 검출되지 않았음을 보여준다. 좌측으로부터 제3 막대는 상당 수준의 FVIII-Fc 표적 단백질이 FVIII-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질을 동시 발현하는 세포의 배지로 분비되었음을 보여준다. 사람 혈청은 양성 대조군(좌측으로부터 마지막 막대)으로서 사용하였다. 상기 결과들은 FVIII-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 FVIII-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승시킴을 보여준다.
도 25는 실시예 17에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A와 비변형된 정렬에서 동시 발현되는 경우 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체(표적 단백질)의 개선된 발현 수준을 입증하는 실험 결과를 보여준다. 도 25A는 단독의 항-IL8 항체(열 2)를 발현하는 형질감염된 세포, 및 항-IL8 항체 및 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3, BSC1-단백질 A)을 동시 발현하는 세포의 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체(표적 단백질)의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 배양 배지에서 항-IL8 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체를 사용하는 도트 블롯 검정에서 분석하였다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현시키기 위한 구조적 유전자가 없는(항-IL8 항체 부재, 열 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. BSC1-단백질 A 융합 단백질과 항-IL8 항체의 형질감염된 세포에서 동시 발현(열 3)은 단독의 항-IL8 항체(열 2)를 발현하는 형질감염된 세포에서 발현된 항체 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다.
도 25B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 25A에서의 열 각각에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 25B의 막대는 도 25A의 열 번호에 상응하도록 번호매김한다. 상기 일련의 실험 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 표적화된 항-IL8 항체의 동시 발현이 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 항체의 발현 수준과 비교하여 분비된 항-IL8 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 25C는 발현된 항-IL8 항체(표적 단백질)에 의해 IL8 결합 활성을 검출하기 위한 ELISA 결과의 막대 그래프를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 IL8로 피복하고, 단독의 항-IL8 항체(막대 그래프 2)를 발현하거나, BSC1-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3, BSC1-단백질 A)과 항-IL8 항체를 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체(표적 단백질)로 항온처리하였다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(항-IL8 항체 부재, 막대 그래프 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 상기 일련의 실험 결과는 증진된 수준으로 발현되고 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체가 사람 IL8에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여주고, 이는 적절한 입체배좌의 항체임을 지적한다.
도 26은 실시예 18에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A 융합체와 동시 발현되는 경우, 항-VEGF 항체인 베바시부맙의 발현 수준에서의 상당한 증진을 입증하는 일련의 실험 결과를 보여준다. 도 26A는 단독의 항-VEGF 항체(열 2)를 발현하거나, 항-VEGF 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 항-VEGF 항체의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(어떠한 항-VEGF 항체 부재, 열 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 배양 배지에서 항-VEGF 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체를 사용한 도트 블롯 검정에서 분석하였다. BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3)과 항-VEGF 항체의 형질감염된 세포에서 동시 발현은 단독의 항-VEGF 항체(열 2)를 발현하는 형질감염된 세포에서 발현된 항체 수준과 비교하여 배양 배지로 분비된 항-VEGF 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다.
도 26B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 26A의 열 각각에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 26B의 막대 그래프는 도 26A에서 열 번호와 상응하도록 번호 매김한다. 상기 결과들은 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 항-VEGF 항체의 동시 발현이 단독의 발현된 항체 수준과 비교하여 분비된 항-VEGF 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 26C는 형질감염된 세포 배양 배지에서 발현된 항-VEGF 항체에 의해 VEGF 결합을 검출하기 위한 ELISA의 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 VEGF-A로 피복하고 단독의 항-VEGF 항체(막대 그래프 2)를 발현하거나 본 발명의 항-VEGF 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비된 항-VEGF 항체(표적 단백질)로 항온처리한다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(항-VEGF 항체 부재, 막대 그래프 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 상기 일련의 실험 결과는 증진된 수준으로 발현되고 배양 배지로 분비된 항-VEGF 항체가 사람 VEGF-A에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여주고 이것은 적절한 입체배좌의 분비된 항체를 지적한다.
도 27은 실시예 19에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A 융합체와 동시 발현되는 경우 치료학적 항-TNFα 항체인 아달리무맙(Humira®, AbbVie)의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 입증하는 일련의 실험으로부터의 결과를 보여준다. 도 27A는 단독의 항-TNFα 항체(열 2)를 발현하거나 항-TNFα 항체와 BSC1-단백질 A 융합체(열 3)를 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비된 항-TNFα 항체의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(열 1, 항-TNFα 항체 부재) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 배양 배지에서 항-TNFα 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체를 사용한 도트 블롯 검정에서 분석하였다. 항-TNFα 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(바닥 열)의 형질감염된 세포에서 동시 발현은 단독의 항-TNFα 항체(중앙)를 발현하는 형질감염된 세포에서 발현된 항체 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 항-TNFα 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다.
도 27B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 27A에서 열 각각에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 27B의 막대 그래프는 도 27A의 열 번호와 상응하도록 번호 매김한다. 상기 일련의 실험 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 항-TNFα 항체(표적 단백질)의 동시 발현이 분비된 항-TNFα 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 27C는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 발현된 항-TNFα 항체에 의한 TNFα 결합 활성을 검출하기 위한 ELISA의 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 TNFα로 피복하고 단독의 항-TNFα 항체(막대 그래프 2)를 발현하는 형질감염된 세포 또는 항-TNFα 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3)을 동시 발현하는 세포의 배양 배지로 분비되는 항-TNFα 항체(표적 단백질)로 항온처리한다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는(막대 그래프 1) 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유했다. 상기 일련의 실험 결과는, 증진된 수준으로 발현되고 배양 배지로 분비되는 항-TNFα 항체가 사람 TNFα에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여주고, 이는 적절한 입체배좌의 분비된 항체를 지적한다.
도 28은 확립된 시판되는 관련 세포주에서 이미 안정적으로 생산되는 단백질 발현 수준이 실시예 20에 기재된 바와 같이 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A 융합체와 동시 발현되는 경우 증진될 수 있음을 입증하는 결과들을 제공한다. 도 28A는 단독의 항-IL8 항체(열 2)를 발현하는 CHO-DP12 세포주(수탁번호 CRL-124444, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, Manassas, Virginia) 및 항-IL8 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 3)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 세포 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체(표적 단백질)의 발현에 대한 도트 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. BSC1-단백질 A 융합 단백질과 항체의 동시 발현이 BSC1-단백질 A 융합 단백질(열 2)의 부재 하에 발현된 항체의 수준과 비교하여 배양 배지로 분비된 항체(열 3)의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다. 열 1은 대조군이다(배지만). 도 28B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 28A의 열에서 도트 블롯의 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과가 도 28B에서의 각각의 막대 그래프에서 나타남을 보여준다. 상기 결과들은 BSC1-단백질 A 융합 분자(막대 그래프 3)와 항체의 동시 발현이 항체가 BSC1-단백질 A 융합 분자(막대 그래프 2) 부재 하에서 발현된 경우 수득된 것과 비교하여 분비된 항체의 발현을 상당히 증진시켜 발현 수준에서 대략 4배 내지 5배 큰 증진을 제공함을 지적한다.
도 28C는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 발현되는 항-IL8 항체에 의해 IL8 결합 활성을 검출하기 위한 ELISA의 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 IL8로 피복시키고 항-IL8 항체(막대 그래프 2)를 안정적으로 발현하거나, 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질(막대 그래프 3)을 동시 발현하는 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체(표적 단백질)로 항온처리한다. 배양 배지는 음성 대조군(막대 그래프 1, IL8 결합 활성 부재)으로서 사용하였다. 상기 일련의 실험 결과는 배양 배지로 증진된 수준으로 분비되는 항-IL8 항체가 사람 IL8에 대한 이의 결합 활성을 보유함을 명백히 보여주고, 이는 적절한 입체배좌의 분비된 항체를 지적한다.
도 29는 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 이의 적절한 입체배좌로 폴딩되지 않는 돌연변이 단백질에 의해 유발된 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지적하는 실시예 21에 기재된 실험 결과를 제공한다. 도 29A는 야생형 알파1-항트립신(AAT), 또는 단백질 A에 연결된 3-29 폴리펩타이드 (IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 포함하는 BSC1-단백질 A의 동시 발현 존재 또는 부재 하에 사람 IgG 기원의 Fc 도메인에 연결된 Z 돌연변이(AATZ, 여기서 Glu는 코돈 342번에서 Lys로 대체된다)를 함유하는 돌연변이 알파1-항트립신을 포함하는 융합 단백질의 발현을 위한 웨스턴 블롯 검정의 화학발광 신호의 X-선 필름 이미지를 보여준다. 도 29의 상부 패널은 단독의 AAT-Fc 융합 단백질(좌측으로부터 레인 2)을 발현하는 형질감염된 세포, 단독의 AATZ-Fc 융합 단백질(좌측으로부터 레인 3)을 발현하는 형질감염된 세포 및 AATZ-Fc 융합 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질(좌측으로부터 레인 4)을 동시 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지에서 Fc 융합 단백질의 발현을 보여준다. 레인 1은 대조군으로서 비-발현 세포 배양 배지를 보여준다. 명백하게 어떠한 AATZ-Fc 융합 단백질이 단독의 AATZ-Fc 융합 단백질(레인 3, 좌측으로부터)을 발현하는 세포 배양 배지로 분비되지 않았다. 도 29의 중앙 패널(세포 용해물)에서 보여지는 바와 같이, 단독의 AATZ-Fc 융합 단백질을 발현하는 세포에 대해, AATZ-Fc 융합 단백질이 세포에 유지되고(좌측으로부터 레인 3), 추측컨대 비융합된 AATZ 단백질에 대해 공지된 바와 같이 소포체에 체류한다. 대조적으로, AATZ-Fc 융합 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현은 도 29의 상부 패널(중앙)에서 레인 4(좌측으로부터)에 보여지는 바와 같이 배양 배지로 분비되는 AATZ-Fc 융합 단백질의 수준을 상당히 증진시켰다. 더욱이, 도 29의 중앙 패널(세포 용해물)에서 레인 4(좌측으로부터)에 보여지는 바와 같이, 실제로 어떠한 AATZ-Fc 융합 단백질이 상기 세포에 유지되지 않았다. 상기 동일한 막을 도 29에서 로딩 대조군(하부 패널)에 대한 항-튜불린 항체로 블롯팅하였다. 상기 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 AATZ-Fc가 실제로 세포에 보유되지 않는 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하의 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 AATZ-Fc 표적 단백질의 수준을 상당히 상승시킴을 보여준다.
본 발명은 목적하는 표적 단백질의 발현 수준을 증진시키기 위한 새로운 계열의 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 목적하는 표적 단백질이, 숙주 세포내에서 2개의 정렬 중 어느 하나에서,
J 단백질의 단리된 J 도메인,
J 도메인의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 단편, 또는
하기 화학식을 포함하는 단백질 발현 증진 J 도메인 유사 폴리펩타이드
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (서열번호 47)
(여기서,
X1은 이소류신(I), 류신(L), 발린(V), 알라닌(A), 또는 메티오닌(M)이고;
X2 및 X3은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 적어도 하나는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이고;
X4는 임의의 아미노산이거나; X4는, X1 내지 X3이 존재하고 X5 내지 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X5는 티로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F)이고;
X6 및 X7은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 적어도 하나는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이거나; X6 및 X7 중 하나는, 다른 하나가 K 또는 R인 경우 및 X1 내지 X5가 존재하고 X8 및 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X8 및 X9는 임의의 아미노산이고, 단, 적어도 하나는 류신(L) 또는 알라닌(A)이거나 X8 및 X9 중 하나는, 다른 하나가 L 또는 A인 경우 및 X1 내지 X7이 존재하는 경우에 부재할 수 있다)
를 포함하는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드와 동시 발현되는 경우,
상당히 높은 수준으로 및 적절한 세포 또는 세포외 위치에서 발현될 수 있다는 발견을 기초로 한다.
본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 숙주 세포에 의한 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 2개의 정렬 중 어느 하나에서 사용될 수 있다. "변형된" 정렬에서, 융합 단백질은 목적하는 표적 단백질에 연결된(융합된) 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 융합 단백질은 따라서 목적하는 표적 단백질에 대한 기능성 대용물로서 작용하고, 단독의 비변형된 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 숙주 세포에 의해 증진된 수준으로 발현되는 "변형된" 표적 단백질이다. "비변형된" 정렬에서, 융합 단백질은 목적하는 정규의 "비변형된" 표적 단백질에 대한 친화성을 갖고 이에 결합하는 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서, 숙주 세포에서 융합 단백질 및 목적하는 표적 단백질의 동시 발현은 본 발명에 따른 표적 단백질-결합 융합 단백질의 부재 하의 발현 수준과 비교하여 비변형된 표적 단백질의 발현을 증진시킨다. 본 발명에 따라, 변형되고 비변형된 정렬에서 증진된 수준의 단백질 발현은 목적하는 표적 단백질의 적절한 위치(세포성 또는 세포외)에서 목적하는 각각의 변형되거나 비변형된 표적 단백질의 발현을 포함한다.
따라서, 본 발명은 세포내 목적하는 내인성 또는 이종성(재조합) 단백질을 목적하는 양으로 발현하는데 실패하는 경우에 기술적 해결을 제공한다. 본 발명은 또한 단백질 또는 이의 기능성 부분의 부적절한 발현이 병리학적 상태를 유발하는 생체내에서 충분한 수준의 기능성 단백질을 발현시키는데 실패하는 질환 또는 장애에 대해 개체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 부적절하게 폴딩된 단백질 종이 입증되거나 연루된 질환의 예는 프리온 관련 질환(전염가능한 해면뇌병증), 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환 및 낭포성 섬유증(CF)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 보다 명백하게 기재하기 위해, 하기와 같은 용어에 대한 설명 및 정의가 적용된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 경우, 본 발명과 연계하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 용어의 의미 및 범위는 명백해야 하지만, 그러나, 임의의 잠재적으로 모호한 경우에 본원에 제공된 정의는 임의의 사전적 또는 외적인 정의 보다 선례를 취한다. 추가로, 달리 문단에 의해 요구되지 않는 경우, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 상기 적용에서, 용어 "또는"의 사용은 달리 진술되지 않는 경우 "및/또는"을 의미한다. 추가로, 용어 "포함하는", 및 다른 형태, 예를 들어, "포함하다" 및 "포함되는"의 사용은 제한적이지 않다.
일반적으로, 본원에 기재된 단백질 및 핵산 화학(재조합 핵산 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함하는), 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 유전학, 미생물학, 생화학, 단백질체학, 약리 및 약제학적 과학의 기술과 연계하여 사용되는 명명법은 당업계에서 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 발명의 상기 방법 및 기술은 일반적으로 당업계의 통상적인 방법에 따라 및 당업계에 가용한 다양한 일반 및 보다 구체적인 문헌에 기재된 바와 같이 수행한다. 검정 및 정제 기술은 당업계에서 통상적으로 수행되거나 본원에 기재된 바와 같이 실험 기술 매뉴얼 및 제조업자의 설명서를 포함하는 당업계에서 가용한 프로토콜에 따라 수행한다.
달리 지적되지 않는 경우, 용어 "약" 및 "대략적으로"가 양, 수, 또는 수치의 조합으로 사용되는 경우 상기 조합은 단독으로 명시된 양, 수 또는 수치, 및 상기 양, 수 또는 수치의 +/- 10%의 양, 수 또는 수치를 의미한다. 예를 들어, 상기 문장 "약 40%" 및 "대략적으로 40%"는 "40%" 및 "36% 내지 44%" 둘 다를 포괄함을 의미한다.
용어 "목적하는 표적 단백질", "표적 단백질" 또는 "목적하는 단백질"은 이의 의도된 세포성(세포내 및 막 연합된 것을 포함하는) 또는 세포외 (분비된) 위치에서 발현 수준을 증진시킬 필요가 있거나 요망되는 임의의 단백질을 언급한다.
"단리된 분자"(예를 들어, "단리된 단백질" 또는 "단리된 핵산")에서와 같은 용어 "단리된"은 어원에 근거하여 천연 상태에서 이를 수반하는 천연적으로 연합된 성분과 연합되어 있지 않거나, 동일한 종 기원의 다른 종류의 분자가 실질적으로 없거나, 상이한 종으로부터 세포에 의해 발현되거나, 천연에 존재하지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 이것이 천연적으로 기원하는 세포와는 상이한 세포성 시스템에서 합성되는 단백질 또는 핵산 분자는 이의 천연적으로 연합된 성분으로부터 단리된다. 단백질 또는 핵산 분자는 또한 당업계에 널리 공지된 각각의 단백질 또는 핵산 분자 정제 기술을 사용한 단리에 의해 천연 연합된 성분이 실질적으로 없도록 된 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 한가지 유형의 벡터는 추가의 핵산 절편이 삽입될 수 있는 환형 이중 나선 핵산(전형적으로, DNA) 루프를 언급하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈으로 삽입될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터(예를 들어, 세균 복제 오리진을 갖는 세균성 벡터 및 에피좀성 포유동물 벡터)는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다 . 다른 벡터(예를 들어, 비-에피좀성 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로서 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서의 용도를 갖는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본원 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 형태의 벡터이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 균등하거나 필적하는 기능을 제공하는 바이러스 벡터와 같은 다른 형태의 발현 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 렌티바이러스 유래된 벡터 및 아데노바이러스 유래된 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
상기 용어 "작동적으로 연결된"은 성분들이 이들의 의도된 방식으로 기능을 가능하게 하는 관계에 있도록 기재된 성분들이 인접해 있음을 언급한다. 암호화 서열에 "작동적으로 연결된" 대조군 서열은 암호화 서열의 발현이 대조군 서열과 상용성인 조건 하에서 성취되는 방식으로 연결되어 있다. "작동적으로 연결된" 서열은 목적하는 유전자와 연속적인 발현 대조군 서열, 및 트랜스로 작용하거나 목적하는 유전자를 제어하기 위해 일정 거리에서 작용하는 발현 대조군 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 용어 "발현 대조군 서열"은 이들이 연결된 암호화 서열의 발현 및 프로세싱을 수행하기에 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 발현 대조군 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱과 같은 효율적인 RNA 프로세싱 신호 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열(예를 들어, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 목적하는 경우 단백질 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 상기 대조군 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하고; 원핵 세포에서, 상기 대조군 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵 세포에서, 일반적으로, 상기 대조군 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "대조군 서열"은 이의 존재가 발현 및 프로세싱을 위해 필수적인 성분들을 포함하는 것으로 의도되고 또한 이의 존재가 유리한 추가의 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다. 달리 진술되지 않는 경우, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 발현 벡터로 삽입하는 것에 관한 기재 또는 진술은 상기 삽입된 핵산이 또한 벡터내에서 기능성 프로모터로 작동적으로 연결되고, 삽입된 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터가 상용성 숙주 세포 또는 유기체의 상용성 세포로 도입되는 경우 암호화된 융합 단백질의 발현을 위해 요구되는 번역 대조군 요소들에 작동적으로 연결됨을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 형용사로서 사용되는 경우 용어 "재조합"은 비-천연적으로 변형되거나 조작된 핵산, 외인성 핵산으로 형질감염된 숙주 세포, 또는 단리된 핵산(전형적으로 DNA)의 조작 및 숙주 세포의 형질감염 또는 비-내인성 핵산의 도입에 의해 내인성 핵산의 또 다른 발현으로의 조작을 통해 비천연적으로 발현된 폴리펩타이드를 의미한다. "재조합"은 구체적으로 유전학적 가공 기술을 사용한 시험관내 작제된 DNA 분자를 포괄하는 용어이고, 분자, 작제물, 벡터, 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 기재하기 위해 형용사로서의 용어 "재조합"의 사용은 구체적으로 이들의 각각의 비단리된 천연 위치(예를 들어, 세포내, 조직 또는 기관 위치)에서 천연적으로 존재하는("내인성") 상기 분자, 작제물, 벡터, 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 배제한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히 문단에서 "숙주 세포")는 외인성 핵산이 도입된 세포를 언급하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 상기 세포의 후손을 언급하려 하는 것으로 이해되어야만 한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속적 세대에 존재할 수 있기 때문에, 상기 후손은 실제로 모 세포와 동일할 수 없지만 본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위내에 여전히 포함된다. 본 발명의 다양한 양상에서 유용한 숙주 세포는 원핵 및 진핵 세포일 수 있다. 바람직한 원핵 숙주 세포는 에스케리치아 콜라(Escherichia coli)를 포함하는 다양한 세균 세포를 포함할 수 있다. 본 발명과 관련된 핵산 또는 암호화된 폴리펩타이드의 일부 조작, 작제, 발현 또는 복제가 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 사용하여 수행될 수 있지만, 본원에 기재된 변형되거나 변형되지 않은 정렬에서든 상관 없이 목적하는 표적 단백질의 증진된 발현을 위해 바람직한 숙주 세포는 진핵 숙주 세포이다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진균류 숙주 세포, 진핵 조류 숙주 세포, 선충 숙주 세포, 원생동물 숙주 세포 및 어류 숙주 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, 베로 세포, SP2/0 세포, NS/0 골수종 세포, 사람 배아 신장(HEK293) 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 헬라 세포, 사람 B 세포, CV-1/EBNA 세포, L 세포, 3T3 세포, HEPG2 세포, PerC6 세포, 또는 MDCK 세포이다. 바람직한 진균류 숙주 세포는 아스퍼질러스(Aspergillus), 뉴로스포라(Neurospora), 사카로마이세스(Saccharomyces) 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia) 및 캔디다(Candida)를 포함한다. 특히 바람직한 사카로마이세스 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 세포이다. 특히 바람직한 곤충 숙주 세포는 Sf9 세포이다.
용어 "이종성" 및 "외인성"은 동의어이고 분자를 함유하거나 발현하는 숙주 세포에 고유하지 않은 임의의 분자(예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드, 핵산)를 언급하기 위한 형용사로서 광범위하게 사용된다. 따라서, "이종성" 및 "외인성"은 상기 정의된 바와 같은 용어 "재조합"을 포괄한다.
당업계에 공지되고 본원에 사용된 바와 같은 "유전자 전이 유기체"는 전이유전자를 함유하는 세포를 갖는 유기체를 언급하고, 여기서, 상기 유기체(또는 유기체의 선조)로 도입되는 전이유전자는 유기체에서 천연적으로 발현되지 않거나 유기체로 폴리펩타이드의 의도된 기능을 제공하기 위해 정상적이거나 적절한 수준으로 천연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "전이유전자"는 유전자 전이 유기체가 생성되는 세포의 게놈으로 안정하게 및 작동적으로 통합된 핵산 작제물이고 이는 유전자 전이 유기체의 하나 이상의 세포 유형 또는 조직에서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 지시한다.
용어 "질환" 및 "장애"는 당업계에서 허용되는 의학적 표준 및 관행에 따라 동정된 병리학적 상태를 지적하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유효량"은 질환 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 지속성을 감소시키거나 완화시키거나, 치명적이거나 병리학적 상태의 도래를 예방하거나, 병리학적 상태를 퇴행시키거나, 병리학적 상태와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발병, 개시 또는 진행을 예방하거나, 장애를 검출하거나, 치료요법(예, 또 다른 예방학적 또는 치료학적 제제의 투여)의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)를 증진시키거나 개선시키기에 충분한 치료제의 양을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 "생물학적 샘플"은 생유기체 또는 이전 생유기체 기원의 임의의 양의 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 유기체는 사람, 비-사람 영장류, 마우스, 래트, 몽키, 개, 토끼, 반추동물 및 기타 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 생물학적 샘플의 상기 물질은 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 침, 가래, 점액, 활액, 밀크, 정액, 세포, 기관(예를 들어, 심장, 비장, 폐, 신장, 유방, 뇌, 눈, 혀, 위, 췌장, 장, 담낭, 생식 기관, 맹장), 조직(예를 들어, 골, 연골, 근육, 피부), 골수 및 림프절을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
하나 이상의 요소들 또는 단계들을 "포함하는"(또는 "포함하다")으로서 본원에 기재된 조성물 또는 방법은 개방형이고 명시된 요소들 또는 단계들이 필수적이지만 다른 요소들 또는 단계들이 상기 조성물 및 방법의 범위내에 첨가될 수 있음을 의미한다. 장황함을 피하기 위해, 하나 이상의 명시된 요소들 또는 단계들을 "포함하는"(또는 "포함하다)으로서 기재된 임의의 조성물 및 방법은 또한 동일한 명시된 요소들 또는 단계들"로 필수적으로 이루어진"(또는 "필수적으로 이루어진다") 상응하는 보다 제한된 조성물 및 방법을 기재하는 것으로 또한 이해되고 이것은 상기 조성물 또는 방법이 명시된 필수적 요소들 또는 단계들을 포함하고 상기 조성물 또는 방법의 기본 특성 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 추가의 요소 또는 단계를 또한 포함할 수 있음을 의미한다. 또한, 하나 이상의 명시된 요소들 또는 단계들을 "포함하는" 또는 "필수적으로 이루어진"으로서 본원에 기재된 임의의 조성물 및 방법은 또한 명시된 요소들 또는 단계들로 "이루어진"(또는 "로 이루어진다") 상응하는 보다 제한되고 폐쇄된 조성물 또는 방법을 기재하고 임의의 다른 명시되지 않은 요소 또는 단계는 배제되는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "J 도메인 유사체"는 화학식 I의 아미노산 서열(서열번호 47)을 포함하는 표적 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(또는 PEEP)를 언급한다. 변형된 표적 단백질을 제조하기 위해 표적 단백질 서열로 혼입되는 경우 또는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드-표적 단백질 결합 도메인 융합 단백질을 작제하기 위해 사용되는 경우 상기 폴리펩타이드는 목적하는 표적 단백질의 발현 증가에 영향을 미치는데 유용하다.
용어 "J 도메인 활성 단편" 또는 "J 도메인의 활성 단편"은 본원에 기재된 2가지 유형의 융합 단백질(PEEP/표적 단백질 융합체 또는 PEEP/표적 단백질 결합 도메인 융합체)에 사용되는 경우 표적 단백질의 발현 수준을 증가시키는 능력을 보유하는 J 단백질의 J 도메인의 단편을 언급한다. 하기 실시예는 J 도메인 활성 단편이 α헬릭스 II의 최극단 C 말단에서 J 도메인의 영역을 공통적으로 보유하고 있음을 지적한다. J 도메인의 대형 부분은 또한 활성일 수 있지만 α헬릭스 II의 C 말단 9개 아미노산 모두 또는 일부의 절단이 영구적으로 단백질 발현 증진 활성을 실활시킬 수 있다.
본원에 기재된 임의의 조성물 및 방법에서, 임의의 명시된 필수 요소 또는 단계의 공지 또는 기재된 균등물은 상기 요소 또는 단계를 대체할 수 있다.
구체적으로 지정되지 않는 경우, 조성물 또는 방법은 특정 방법 단계가 또 다른 단계의 이전에 수행되어야 하는 경우가 아니라면 임의의 특정 순서의 열거된 요소 또는 단계에 의해 제한되지 않는다.
또한, "로 이루어진 그룹으로부터 선택되는" 또는 "중 임의의"(또는 균등 표현) 요소 또는 단계는 열거된 요소들 또는 단계들 중 임의의 2개 이상의 조합을 포함하는, 하기의 목록에서 하나 이상의 요소 또는 단계를 언급하는 것으로 이해된다.
본 발명에 유용한 J 도메인
다양한 J 단백질의 J 도메인이 결정되었다. 예를 들어, 문헌[Kampinga et al., Nat. Rev., 11: 579-592 (2010); Hennessy et al., Protein Science, 14:1697-1709 (2005)]을 참조한다. 본 발명의 융합 단백질을 제조하는데 유용한 J 도메인(변형되거나 변형되지 않은 정렬이든 상관 없이)은 J 단백질 계열의 임의의 구성원의 J 도메인 중 주요 정의된 특징을 갖는다. 따라서, 본 발명에 유용한 단리된 J 도메인은 4개의 α-헬릭스(I, II, III, IV)를 특징으로 하고 통상적으로 헬릭스 II와 III 사이에 히스티딘, 프롤린 및 아스파르트산의 고로도 보존된 트리펩타이드 서열("HPD 모티프"로서 언급됨) 기원의 폴리펩타이드 도메인을 포함한다. 전형적으로, J 단백질의 J 도메인은 길이가 50개 및 70개의 아미노산이고, Hsp70-ATP 샤페론 단백질과 J 도메인의 상호작용(결합) 부위는 헬릭스 II로부터 연장하여 HPD 모티프를 포함하는 영역인 것으로 사료된다. 대표적인 J 도메인은 ERdj 단백질의 J 도메인(예를 들어, ERdj3 또는 ERdj5의 J 도메인), SV40의 대형 T 항원의 J 도메인 및 포유동물 시스테인 스트링 단백질(CSP-α)의 J 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들, 및 본 발명의 융합 단백질에 사용될 수 있는 다른 J 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 1에 제공된다.
단백질 발현 증진 활성을 갖는 J 도메인 단편 및 유사체
아미노 말단 및 카복시 말단 결실 분석을 포함하는 서열 분석을 사용한 J 도메인의 추가의 연구는 J 도메인의 비교적 작은 부분만이 단백질 발현 증진 활성을 제공하기 위해 요구됨을 밝혔다. 놀랍게도, 상기 분석은 본 발명에 따른 단백질 발현 증진 활성이 J 도메인내로부터 단리되고 9개 또는 10개의 적은 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 단편에 의해 제공될 수 있음을 밝혔다. 하기 실시예 10 및 11을 참조한다. 단리된 J 도메인에 관하여, 상기 J 도메인 폴리펩타이드 단편은 이의 의도된 세포성(세포내, 막-연합된) 또는 세포외(분비된) 위치에서 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 개별 J 도메인 폴리펩타이드 단편들은 아미노산 서열에 있어서 모두 동일하지는 않지만 본원에 기재된 변형되거나 비변형된 정렬에서 단백질 발현 증진 활성을 제공하는 것 뿐만 아니라 일부 서열 상동성 및 구조적 특징을 공유할 수 있다.
상기 언급된 J 도메인 폴리펩타이드 단편의 추가의 결실 및 치환 돌연변이 분석은 표적 단백질 발현 증진 활성을 소유하는 새로운 계열의 J 도메인 유사체 폴리펩타이드에 대한 구조식을 한정하기 위한 근거를 제공했다. 유사체 폴리펩타이드의 상기 계열의 구성원은 8개 내지 9개 아미노산을 포함하고 현재 J 도메인의 라이브러리에서 이전에 동정되지 않은 폴리펩타이드 뿐만 아니라 일부 J 도메인 폴리펩타이드 단편을 포함한다. 실시예 11을 참조한다.
완전한(전장) J 도메인과 비교하여 보다 작은 크기의 J 도메인 폴리펩타이드 단편 및 J 도메인 유사체 폴리펩타이드는 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 본 발명의 변형되고 비변형된 정렬에서 작제될 수 있고 발현될 수 있는 융합 단백질의 크기를 감소시킨다. 따라서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 분자의 크기는 상응하게, 완전한 J 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자보다 작을 수 있다. 비교적 작은 크기의 본 발명의 J 도메인 폴리펩타이드 단편 및 J 도메인 유사체 폴리펩타이드는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가, 목적하는(연결되지 않은) 표적 단백질 대신 대상체에게 투여되거나 발현되는 변형된(융합) 표적 단백질을 형성하기 위해 목적하는 표적 단백질에 연결된(융합된) 변형된 정렬의 융합 단백질의 면역원성을 감소시키는데 특히 이로울 수 있다. 융합 단백질의 면역원성이 적을 수록 상기 융합 단백질에 지시된 면역 반응에 의해 신속하게 제거되거나 억제되는 것 없이 융합 단백질의 이로운 성질 또는 효과를 대상체에게 제공하기 위해 대상체에서 융합 단백질이 지속될 가능성이 높다.
단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질
본 발명에 따라, 본원에 기재된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 발현을 개선시킬 필요가 있는 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키는 융합 단백질의 성분으로서 사용된다. 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 목적하는 발현된 표적 단백질의 1차 구조(아미노산 서열)를 갖는 2개의 정렬 중 어느 하나에서 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 사용된다.
단백질 발현을 증진시키기 위해 "변형된" 정렬에서, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 목적하는 표적 단백질에 연결되어 융합 단백질, 즉, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드의 부재 하에 불량하게 발현되는 비변형된 표적 단백질의 것과 비교하여 증진된 수준으로 발현되는 목적하는 "변형된" 표적 단백질을 형성한다. 따라서, 변형된 정렬에서 융합 단백질은 불량하게 발현된 비변형된 표적 단백질 대신 대용물로서 발현되고 사용되는 목적하는 변형된 형태의 표적 단백질이다.
단백질 발현을 증진시키기 위한 "비변형된" 정렬에서, 목적하는 표적 단백질의 1차 구조는 이것이 단백질 발현 증진 폴리펩타이드에 융합되지 않은 점에서 변화되지 않은("비변형된") 상태로 남아있다. 본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 목적하는 표적 단백질에 친화성을 갖고 이에 결합하는 표적 단백질 결합 도메인에 연결된다. 숙주 세포에서 융합 단백질과 목적하는 비변형된 표적 단백질의 동시 발현은 표적 단백질-결합 융합 단백질의 부재 하의 발현 수준과 비교하여 목적하는 표적 단백질의 증진된 발현 수준을 유도한다.
목적하는 표적 단백질의 1차 구조(아미노산 서열)가 비변형된 정렬에서 변화되지 않은(융합 단백질에 연결되어 있지 않은) 상태로 남아있기 때문에, 많은 응용을 위해, 단백질 발현을 증진시키기 위해 비변형된 정렬이 변형된 정렬 보다 바람직할 가능성이 높다. 그러나, 또한 하기 설명된 바와 같이, 융합 단백질의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 성분이 용이하게 절단되어 융합 단백질 기원의 추가의 잔류 아미노산이 없거나 소수의 아미노산을 갖는 표적 단백질의 본래의 아미노산 서열을 포함하는 표적 단백질 성분을 방출하도록 변형된 정렬의 융합 단백질을 가공할 수 있다. 상기 융합 단백질은 특정 응용을 위해 비변형된 표적 단백질 보다 더 적합할 수 있다.
직접적인 합성(예를 들어, 고형상 펩타이드 합성, 용액상 합성 등)을 사용하는 어느 정렬에서도 융합 단백질을 합성할 수 있지만 대부분의 경우에 본원에 기재된 융합 단백질은 세포 배양 방법 또는 유전자 전이 방법과 함께 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 포함하는 표준 재조합 핵산 기술을 사용하여 보다 경제적으로 제조될 수 있다.
표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 세포의 형질감염(예를 들어, 제한 없이, 전기천공, 리포좀 매개된 형질감염, 형질감염 방법) 및 세포 및 조직 배양 방법에 대해 사용하여 본 발명의 융합 단백질을 발현할 수 있다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조업자의 지침사항에 기재된 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 당업계에서 통상적으로 성취되는 바와 같이 수행할 수 있다. 이전의 기술 및 과정은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법 및 다양한 일반적인 및 본원 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 보다 전문적인 문헌에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) and Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 2012)]을 참조하고 이는 본원에서 참조문헌으로서 인용된다.
상기된 바와 같이, 용어 "변형된" 및 "비변형된"은 목적하는 표적 단백질이 단백질 발현 증진 폴리펩타이드에 연결되어 있는지의 여부를 언급한다. 변형되고 비변형된 정렬 둘 다의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 도메인을 융합 단백질 또는 목적하는 표적 단백질에 연결하는 것이 이로울 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 임의의 널리 공지된 에피토프 태그 펩타이드(에피토프 태그)는 발현된 단백질의 검출 및/또는 정제를 촉진시키기 위해 단백질에 혼입될 수 있다. 상기 에피토프 태그는 V5 에피토프 태그(GKPIPNPLLGLDST (서열번호 110)), 플래그 에피토프 태그(DYKDDDDK (서열번호 111)), 헥사-히스티딘 에피토프 태그(HHHHHH (서열번호 112)), 헤마글루티닌 에피토프 태그(YPYDVPDYA (서열번호 113)), c-myc 에피토프 태그(EQKLISEEDL (서열번호 114)), VSV-G 에피토프 태그(YTDIEMNRLGK (서열번호 115)), 및 HSV 에피토프 태그(QPELAPEDPED (서열번호 116))를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하기 설명된 바와 같이, 또한 단백질 용해 효소에 의해 절단되어 단백질로부터 제거(또는 실질적으로 제거되는)될 수 있는 링커를 사용하여 단백질과 상기 에피토프를 연결할 수 있다.
링커
임의의 도메인은 당업계에 공지된 방법에 의해 본 발명의 융합 단백질내 또 다른 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변형된 정렬에서, 융합 단백질은 목적하는 표적 단백질에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서 상기 발현된 융합 단백질은 융합되지 않고 불량하게 발현된 목적하는 표적 단백질에 대한 대용물로서 사용될 수 있는 변형된 표적 단백질이다. 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 목적하는 표적 단백질에 직접 연결되거나 링커 분자를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 비변형된 정렬에서, 융합 단백질은 목적하는 표적 단백질에 대해 친화성을 갖고 이에 결합하는 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함한다. 목적하는 표적 단백질과 융합 단백질의 동시 발현은 융합 단백질의 부재 하의 발현 수준과 비교하여 목적하는 비변형된(융합되지 않은) 표적 단백질의 발현 수준을 증진시킨다. 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 표적 단백질 결합 도메인에 직접 연결되거나 링커 분자를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 다른 도메인은 또한 변형되고 비변형된 정렬에서 융합 단백질 또는 융합되지 않은 단백질에 연결되어 하나 이상의 추가의 특징을 제공할 수 있다. 예를 들어, 에피토프 태그는 융합 단백질 또는 융합되지 않은 단백질에 연결되어 태그된 단백질의 검출 또는 정제를 촉진시킬 수 있다.
아미노산 수준에서, 링커는 1 내지 10개 아미노산, 1 내지 20개 아미노산 및 심지어 1 내지 50개 아미노산을 포함하는 하나 이상의 아미노산일 수 있다. 전형적으로, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 목적하는 표적 단백질(변형된 정렬에서)에 연결시키거나 표적 단백질 결합 도메인(비변형된 정렬에서)에 연결시키는 것과 관련하여, 목적하는 표적 단백질 또는 표적 단백질 결합 도메인에 직접 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 연결시키는 것이 목적하는 단백질 또는 표적 단백질 결합 도메인의 필요한 생화학적 및 기능적 성질을 상당히 감소시키지 않는 것으로 보이기 때문에 20개 이상의 아미노산인 링커를 사용할 필요는 없다(데이터는 나타내지 않음).
본 발명에 따른 융합 단백질을 생산하기 위해 하나 이상의 링커를 선택하는 것은 당업자의 지식 및 기술 범위내에 있다. 예를 들어, 문헌[Arai et al., Protein Eng., 14(8): 529-532 (2001); Crasto et al., Protein Eng., 13(5): 309-314 (2000); George et al., Protein Eng., 15(11): 871-879 (2003); Robinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5929-5934 (1998).]을 참조한다. 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 목적하는 표적 단백질 또는 표적 단백질 결합 도메인에 연결하기 위해 특정 링커를 사용하기 위한 일반적 고려는, 예를 들면, 가공된 기능성 결합 단백질을 제조하기 위한 다양한 포맷으로 면역글로불린 가변 및/또는 불변 도메인에서 고려될 수 있는 바와 같이, 하나의 기능성 도메인이 또 다른 기능성 도메인에 연결된 다른 융합 단백질을 제조하는데 고려 사항들을 포함할 수 있다. 명백하게, 링커는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드에 연결되는 목적하는 표적 단백질 또는 표적 단백질 결합 도메인의 폴딩을 방해하지 말아야 한다. 존재하는 경우, 융합 단백질내 링커는 변형된 정렬에서 융합 단백질의 발현 수준 또는 수율 또는 비변형된 정렬에서 목적하는(융합되지 않은) 표적 단백질의 발현 수준 또는 수율을 증가시키도록 단백질 발현 증진 폴리펩타이드의 기여를 최적화하기 위해 선택되고 목적하는 표적 단백질 또는 표적 단백질 결합 도메인으로의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드의 직접적인 부착이 목적하는 증가된 수준의 발현을 성취하는 경우 생략될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질에 존재하는 링커 분자는 단백질 도메인(예를 들어, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드, 목적하는 단백질, 표적 단백질 결합 도메인) 또는 전체 융합 단백질을 암호화하는 핵산 절편이 프레임내 삽입되는 발현 벡터의 클로닝 부위내 또는 주변에 핵산 절편 상에 존재하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
링커 분자들, 특히, 4개의 아미노산 또는 보다 긴 길이의 아미노산인 분자들은 바람직하게 목적하는 단백질이 이의 적절한 입체배좌로 폴딩을 가능하게 하는 유연성을 소유한다. 다양한 상대적으로 유연한 링커는 기능성 도메인을 연결하기 위한 분야에 공지되어 있다. 링커는 또한 에피토프 태그와 같은 하나 이상의 추가의 도메인을 본 발명의 목적하는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 융합 단백질에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있는 링커는 DIAAA (서열번호 117); DIAAALE (서열번호 118); GTGSEF (서열번호 119); AS; TVA; ASTK (서열번호 120); GGGSGGSGGSGG (서열번호 121); DIGGGSGGSGGSGGAAA (서열번호 122); AKTTPKLEEGEFSEAR (서열번호 123); AKTTPKLEEGEFSEARV (서열번호 124); AKTTPKLGG (서열번호 125); SAKTTPKLGG (서열번호 126); SAKTTP (서열번호 127); RADAAP (서열번호 128); RADAAPTVS (서열번호 129); RADAAAAGGPGS (서열번호 130); RADAAAA(G4S)4 (서열번호 131); SAKTTPKLEEGEFSEARV (서열번호 132); ADAAP (서열번호 133); ADAAPTVSIFPP (서열번호 134); TVAAP (서열번호 135); TVAAPSVFIFPP (서열번호 136); QPKAAP (서열번호 137); QPKAAPSVTLFPP (서열번호 138); AKTTPP (서열번호 139); AKTTPPSVTPLAP (서열번호 140); AKTTAP (서열번호 141); AKTTAPSVYPLAP (서열번호 142); ASTKGP (서열번호 143); ASTKGPSVFPLAP (서열번호 144), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 145); GENKVEYAPALMALS (서열번호 146); GPAKELTPLKEAKVS (서열번호 147); GHEAAAVMQVQYPAS (서열번호 148); GGGGGGGP (서열번호 149); GGGGGGGGP (서열번호 150); PAPNLLGGP (서열번호 151); PNLLGGP (서열번호 152); GGGGGGP (서열번호 153); PAPELLGGP (서열번호 154); PTISPAPNLLGGP (서열번호 155); TVAADDDDKSVFIVPP (서열번호 156); TVDDDDKAAP (서열번호 157); LVPRGSAAP (서열번호 158); ASTKGPSV (서열번호 159); ASTKGPSVFP (서열번호 160); TVAAPSV (서열번호 161); TVAAPSVFI (서열번호 162) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 하나 이상의 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 하나 이상의 링커를 함유할 수 있다. 상기 링커는 인지 서열에서 또는 이의 근처에서 단백질의 절단을 위해 프로테아제에 의해 인지되는 아미노산 서열을 소유한다. 하나 이상의 절단가능한 링커 분자를 융합 단백질에 혼입하는 것은 발현된 융합 단백질로부터 하나 이상의 도메인을 제거하는 옵션을 제공한다. 비제한적인 예를 통해 일부 응용 또는 제조에서 목적하는 단백질에 연결된 폴리펩타이드 발현 증진 폴리펩타이드를 제거하고(예를 들어, 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해)/하거나 발현된 융합 단백질의 검출 또는 정제를 촉진시키기 위해 융합 단백질로 혼입되는 에피토프 태그를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 융합 단백질이 분비되는 경우, 절단 가능한 링커에 의해 목적하는 단백질에 연결되는 폴리펩타이드 발현 증진 폴리펩타이드(또는 다른 도메인)는 적절한 프로테아제를 융합 단백질을 발현하는 배양 배지로 직접 첨가함에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 절단 가능한 링커에 의해 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(또는 다른 도메인)는 배양 배지로부터 융합 단백질을 정제하기 위한 하나 이상의 단계를 수행한 후 제거될 수 있다.
일부 상황에서 단백질에 연결된 도메인 또는 에피토프 태그를 제거하는 것이 유용할 수 있다. 이것은 예를 들어, 세포에서 추가의 도메인 또는 태그를 포함하는 단백질을 발현시킴에 의해 성취될 수 있고, 상기 세포에서 단백질의 링커를 절단할 수 있는 프로테아제의 발현이 조절된다, 예를 들어, 세포가 융합 단백질을 발현한 후 배양물로 적용될 수 있는 신호(예를 들어, 온도 전이) 또는 제제(이온 교환)에 의해 조절될 수 있는 프로모터의 제어하에 적절한 프로테아제에 대한 재조합 유전자를 세포에 혼입함에 의해 조절된다. 다양한 프로모터가 원핵 또는 진핵 세포에서의 유전자 발현을 조절하기 위해 당업계에서 가용하다. 추가로, 일부 세포는 상응하는 절단 부위를 함유하는 링커 분자를 절단할 수 있는 하나 이상의 프로테아제를 발현한다. 숙주 세포에 의해 발현될 수 있는 프로테아제의 사용이 동일한 숙주 세포에 의해 발현되는 융합 단백질에서 링커를 절단하기 위해 유용할 수 있는지를 결정하는 것은 당업자의 기술 범위내에 있다. 대안적으로, 프로테아제-절단가능한 링커를 통해 추가의 도메인 또는 태그에 연결된 단백질을 함유하는 배양 배지 또는 세포 용해물과 같은 샘플에 적절한 프로테아제를 첨가할 수 있다.
단백질 용해 절단 부위를 함유하는 다양한 링커 분자들은 하나의 단백질 또는 단백질 도메인을 또 다른 도메인에 연결하기 위해 당업계에 공지되어 있고 가용하다. 상기 링커는 하기의 예 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 여기서, 별표(*)는 단백질 용해 절단 부위를 지적한다: DYKDDDDK* (서열번호 163); ASDDDDK*GGP (서열번호 164); ALVPR*GSGP (서열번호 165); ASTDDDDK*SVFPLAP (서열번호 166); TVALVPR*GSVFIFPP (서열번호 167); ASTLVPR*GSVFPLAP (서열번호 168); TVAADDDK*SVFIVPP (서열번호 169); ASTDDDK*SVFPLAP (서열번호 170); LEVLFQ*GP (서열번호 171); TVAALEVLFQ*GPAP (서열번호 172); ASTLEVLFQ*GPLAP (서열번호 173); PAPLEVLFQ*GP (서열번호 174); TAENLYFQ*GAP (서열번호 175); AENLYFQ*GA (서열번호 176); PGPFGR*SAGGP (서열번호 177); PGPFGR*SAGG (서열번호 178); PQRGR*SAG (서열번호 179); PHYGR*SGG (서열번호 180); GPFGR*SAGP (서열번호 181); GDDDDK*GGP (서열번호 182); AGDDDDK*GGP (서열번호 183); GGDDDDK*GGP (서열번호 184); ENLYFQ*G (서열번호 185); ENLYFQ*S (서열번호 186) 등.
본 발명의 단백질에 사용되는 절단 가능한 링커를 절단하기 위해 사용될 수 있는 다양한 단백질 용해 효소가 당업계에 공지되어 있다. 명백하게, 목적하는 표적 단백질을 포함하는 융합 단백질에서 절단 가능한 링커를 절단하기 위해 선택된 프로테아제는 또한 링커의 절단 후 체류가 요망되는 목적하는 표적 단백질 또는 임의의 다른 도메인을 절단하지 말아야 한다. 융합 단백질내 링커내 부위에서 융합 단백질을 절단하기 위해 사용될 수 있는 단백질 용해 효소는 엔테로키나제, 인자 Xa, 트롬빈, 프레시션(PreScission), 토바코 에치 바이러스(tobacco etch virus)(TEV) 프로테아제, 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA), 아연 의존성 엔도펩티다제, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 세라라이신, 아스타신, 아다마라이신, 디스인테그린, ADAM, 카스파제, 카뎁신, 칼파인 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
융합 단백질을 암호화하는 핵산
당업계에 가용한 표준 방법을 사용하여, 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 변형되거나 비변형된 정렬에서 사용되는 융합 단백질을 암호화하는 핵산(전형적으로 DNA) 분자가 작제된다. 단백질의 검출 및/또는 정제를 촉진시키기 위해 사용되는 표준 에피토프 태그와 같은 하나 이상의 추가의 도메인이 또한 단백질에 혼입될 수 있다. 목적하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 융합 단백질을 위해 재조합 구조적 유전자를 복제하기 위해 당업계에 가용한 임의의 다양한 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 융합 단백질을 발현하기 위해, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 당업계에서 가용한 임의의 다양한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 삽입된 핵산을 갖는 발현 벡터는 이어서 발현 벡터로부터 융합 단백질의 발현을 허용하는 상용성 숙주 세포로 도입된다. 비변형된 정렬의 경우에, 벡터는 또한 숙주 세포가 목적하는 표적 단백질에 대한 기능성 유전자를 소유하지 않는 경우 목적하는 비변형된 표적 단백질을 암호화하는 기능성 구조적 유전자 카피를 함유할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 본원에 기재된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 절편, 및 융합 단백질의 또 다른 도메인을 암호화하는 핵산 분자가 삽입될 수 있는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 암호화 서열의 5' 또는 3'에 위치한 하나 이상의 클로닝 부위(예를 들어, 유일한 제한 효소 부위)를 포함하는 발현 벡터 분자를 포함한다: 변형된 정렬에서, 목적하는 표적 단백질을 암호화하는 핵산은 목적하는 융합 단백질(변형된 표적 단백질)을 형성하기 위해 삽입될 수 있는 반면, 비변형된 정렬에서, 표적 단백질 결합 도메인을 암호화하는 핵산은 목적하는 비변형된 표적 단백질에 결합할 수 있고 이의 발현을 증진시킬 수 있는 융합 단백질을 형성하기 위해 삽입될 수 있다. 발현 벡터는 또한 목적하는 융합 단백질을 작제하고 발현하기 위해 하나 이상의 다른 목적하는 도메인(예를 들어, 에피토프 태그, Fc 영역 등)을 암호화하는 하나 이상의 추가 핵산 절편의 삽입을 허용하는 다중 클로닝 부위를 소유할 수 있다. 목적하는 융합체를 암호화하는 최종 핵산 융합 작제물은 발현 벡터 상에서 프로모터에 작동적으로 연결된다. 클로닝 부위를 벡터 분자로 가공하고 목적하는 단백질을 암호화하는 삽입된 핵산 절편을 프로모터 및 상용성 숙주 세포에서 단백질의 발현을 위해 요구되는 다른 신호에 작동적으로 연결시키는 것은 당업계의 기술 범위내에 있다.
본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 작제물을 어셈블리하기 위한 본원의 기재가 다양한 핵산 분자의 연결에 이어서 완전히 어셈블리된 핵산 작제물을 발현 벡터로 삽입하기 위한 특정 단계적 순서를 제안할 수 있지만, 목적하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 작제물을 제조하기 위한 핵산 분자의 절편들을 연결하는 정확한 순서는 당업계의 숙련가의 식별, 기술 및 경험 범위 내인 것으로 이해되고 인식된다. 더욱이, 먼저 발현 벡터로의 삽입 전에 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 형성하기 위해 모든 절편들을 함께 연결할 수 있지만, 일부 경우에, 하나 이상의 도메인을 암호화하는 핵산 절편은 이미 적절히 발현 벡터내에 위치하여 이미 발현 벡터에 위치한 절편(들)에 인접하게 하나 이상의 핵산 절편을 삽입함으로써 상기 발현 벡터내에 본 발명의 목적하는 융합 단백질에 대해 작동적으로 연결된 구조적 유전자를 어셈블리할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터로 특정 발현 벡터 기원의 융합 단백질을 발현하기 위해 상용성인 임의의 다양한 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 재조합 구조적 유전자를 작제하는 과정에서 일부 단계는 원핵 또는 진핵 세포에서 수행될 수 있지만, 본 발명에 따른 융합 단백질의 증진된 발현을 위해 바람직한 숙주 세포는 진핵 세포이다. 본 발명에 유용한 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진균류 숙주 세포, 진핵 조류 숙주 세포, 선충 숙주 세포, 원생동물 숙주 세포 및 어류 숙주 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 융합 단백질을 발현하기 위해 유용한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, 베로 세포, SP2/0 세포, NS/0 골수종 세포, 사람 배아 신장(HEK293) 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 헬라 세포, 사람 B 세포, CV-1/EBNA 세포, L 세포, 3T3 세포, HEPG2 세포, PerC6 세포, 및 MDCK 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 J 도메인 융합 단백질을 발현하기 위해 유용한 진균류 숙주 세포는 아스퍼질러스, 뉴로스포라, 사카로마이세스, 피치아, 한세눌라, 쉬조사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 야로위아 및 캔디다를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히 유용한 사카로마이세스 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애 세포이다.
당업계에 가용한 방법을 사용하여, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 융합 단백질의 용이한 정제를 가능하게 하는 수준으로 융합 단백질을 발현할 목적으로 또는 발현된 융합 단백질내 목적하는 단백질에 의해 제공되는 기능의 이득을 식물, 사람 또는 비-사람 동물에게 제공하기 위한 유전자 치료요법으로서 식물 또는 비-사람 동물의 세포로 도입될 수 있다. 상기 방법은 융합 단백질을 암호화하는 전달된 핵산(전이유전자)에 의해 암호화된 융합 단백질을 발현하는 유전자 전이 식물 또는 동물을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 식물 및 비-사람 동물의 경우에, 단백질을 암호화하는 발현가능한 핵산을 생식선으로 혼입하여 유전자 전이 유기체의 후손이 또한 융합 단백질을 발현할 수 있도록 하는 기술은 가용하다. 누출된 DNA의 세포로의 시린지 주사, 탄도 전달(ballistic transfer)(예를 들어, 유전자 총을 사용한), 리포좀 및 바이러스 유래된 벡터 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 벡터 및 방법이 핵산을 식물 또는 비-사람 동물의 세포로 도입하기 위해 가용하다.
본 발명에 따른 사람 대상체를 치료하기 위한 유전자 치료요법은 본원에 기재된 변형되거나 비변형된 정렬에서 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자를 사용할 수 있다. 상기 유전자 치료요법은 특히 부적절하게 폴딩된 단백질 종이 임상적으로 인지되는 병리학적 병태를 유발하는 기능적 상실 또는 실질적 상실을 유도하는 질환에 유용하다. 기능 상실을 유도하는 부적절하게 폴딩된 단백질 종이 입증되거나 연루된 질환의 예는 프리온 관련 질환(전염가능한 해면뇌병증), 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 낭포성 섬유증(CF) 및 α1-항트립신(AAT) 결핍증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 변형된 정렬을 사용하는 유전자 치료요법에서, 목적하는 표적 단백질에 연결되는 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자를 작제한다. 상기 재조합 유전자는 벡터로 삽입되고, 상기 벡터는 이어서 사람 대상체의 체세포 게놈으로 통합된다. 대부분의 경우에, 특정 질환과 관련될 수 있는 세포의 서브 집단외에 재조합 벡터가 모든 체세포의 게놈으로 흡수되어 통합될 필요는 없다. 사람 대상체의 체세포에서 통합된 재조합 유전자로부터 발현된 융합 단백질은 실활되거나, 상실되거나 사람 대상체에서 임상적으로 인지된 질환을 유발할 정도로 감소된 목적하는 내인성 표적 단백질의 기능을 복구함에 의해 질환을 치료한다.
본 발명의 비변형된 정렬을 사용하는 유전자 치료요법에서, 목적하는 표적 단백질에 대해 친화성을 갖고 이에 결합하는 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자를 작제한다. 상기 재조합 유전자는 벡터로 삽입되고 이어서 상기 벡터는 사람 대상체의 체세포 게놈으로 통합된다. 다시, 대부분의 경우에 특정 질환과 관련될 수 있는 세포의 서브 집단외에 재조합 벡터가 모든 체세포의 게놈으로 흡수되고 통합될 필요는 없다. 사람 대상체의 세포내에서 통합된 재조합 유전자 기원의 융합 단백질의 발현은 목적하는 내인성 표적 단백질의 발현을 증진시켜 상기 단백질은 임상적으로 인지된 질환을 피하도록 표적 단백질에 의해 제공되는 요구된 기능을 세포에 제공할 수 있다. 목적하는 내인성 표적 단백질에 대한 내인성 유전자가 기능하지 않거나 결실된 경우, 목적하는 표적 단백질을 암호화하는 재조합 유전자가 또한 작제되고 융합 단백질과 함께 발현하기 위해 사람 대상체의 게놈으로의 통합을 위한 벡터로 삽입되어야만 한다.
변형된 바이러스(예를 들어, 변형된 아데노바이러스, 변형된 렌티바이러스), 바이러스-관련된 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 관련된 바이러스), 누출된 DNA(예를 들어, 누출된 플라스미드 DNA), 나노입자내 압축된 DNA 및 리포좀(예를 들어, 다양한 양이온 지질을 사용한)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 벡터, 제제 및 방법을 사용하여 핵산 분자를 사람 대상체의 체세포로 도입할 수 있다.
변형된 정렬에서 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 및 목적하는 표적 단백질을 포함하는 융합 단백질
본 발명의 변형된 정렬에서 융합 단백질은 목적하는 표적 단백질에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(또는 PEEP, 본원에 기재된 바와 같이 단리된 J 도메인, 활성 J 도메인 폴리펩타이드 단편 또는 J 도메인 유사체 폴리펩타이드를 포함하는)를 포함한다. 바람직하게, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 목적하는 표적 단백질의 아미노(N) 말단 또는 카복시(C) 말단에 연결한다. 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 또한 링커, 효소 절단 부위, 에피토프 태그 등과 같은 하나 이상의 간섭 폴리펩타이드 서열에 의해 목적하는 단백질로부터 이격될 수 있다. 목적하는 표적 단백질 내 단백질 발현 증진 폴리펩타이드의 삽입이 가능하지만 실질적인 문제로서 이것은 보다 복잡한 재조합 DNA 가공을 요구하고 목적하는 표적 단백질의 적절한 폴딩, 목적하는 기능, 또는 다른 성질을 방해할 가능성이 높아 일반적으로 덜 바람직하다. 본 발명에 따른 변형된 정렬의 융합 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있는 목적하는 표적 단백질은 정상적으로 세포내 위치에 체류하는 가용성 단백질; 막-연합된 단백질(막관통 단백질을 포함하는); 분비된 단백질; 및 유전학적으로 가공된, 비천연 단백질을 포함하는, 목적하는 성질을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 가공된 비천연 단백질은 재조합 가용성 형태의 천연 막-연합된 단백질, 예를 들어, 막관통 단백질(예를 들어, 인테그린, 보체 조절 단백질)의 세포외 도메인을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 정렬에서 융합 단백질의 표적 단백질 성분으로서 사용될 수 있는 가공된 비천연 단백질의 또 다른 예는 세포 표면 수용체의 세포외 결합 도메인이 면역글로불린 Fc 도메인 또는 면역글로불린 스캐폴드에 융합된 재조합 가용성 수용체 분자를 포함하는 재조합 융합 단백질이다. 상기 비천연 융합 단백질의 비제한적인 예는 p75 사람 TNFα 수용체 분자의 세포외 도메인이 IgG1 면역글로불린의 힌지 및 Fc 도메인에 연결된 에타너셉트이다. 본 발명의 변형된 정렬의 융합 단백질에서 목적하는 표적 단백질로서 사용되는 다른 단백질은 항체 및 이의 항원 결합부, 사이토킨, 펩타이드 호르몬, 효소(예를 들어, 트롬빈, 락타제, 프로테아제, 트랜스퍼라제, 키나제 등) 및 형태형성 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
비변형된 정렬에서 단백질 증진 발현 폴리펩타이드 및 표적 단백질 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질
단백질 발현 증진 폴리펩타이드(본원에 기재된 바와 같은 단리된 J 도메인, 활성 J 도메인 폴리펩타이드 단편 또는 J 도메인 유사체 폴리펩타이드)는 또한 이의 의도된 위치에서 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위해 비변형된 정렬에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 비변형된 정렬에서, 융합 단백질은 목적하는 표적 단백질에 대해 친화성을 갖고 이에 결합하는 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 본 발명의 비변형된 정렬에서, 목적하는 표적 단백질은 융합 단백질의 성분이 아니고 따라서 이의 변화되지 않은 1차 구조(아미노산 서열)를 보유한다. 임의의 특정 기작에 얽매이지 않으면서, 목적하는 표적 단백질의 상기 융합 단백질의 표적 단백질 결합 도메인으로의 결합은 목적하는 표적 단백질이 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(또한 융합 단백질에 존재하는)에 비교적 가깝게 근접하여 융합 단백질의 부재 하의 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여, 이의 의도된 세포성 또는 세포외 위치에서 표적 단백질의 증진된 발현 수준을 제공하는 것으로 나타난다. 이것은 단백질 폴딩, 격막분리 또는 분비에 관여하는 샤페론 단백질 또는 다른 번역 후 세포 기작의 증가된 채택을 포함할 수 있거나 세포성 분해 경로의 회피를 증가시킴을 포함할 수 있다. 상기 효과는 목적하는 세포내 또는 세포외 위치에서 발현된 단백질의 출현에 있어서 상당한 증가에 의해 입증된다.
비변형된 정렬에서 유용한 표적 단백질 결합 도메인
본 발명의 비변형된 정렬에서 융합 단백질은 이의 적절한 세포성 또는 세포외성 위치에서 발현 상승이 바람직한 목적하는 표적 단백질에 결합하는 표적 단백질 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 표적 단백질-결합 융합 단백질의 표적 단백질 결합 도메인은 표적 단백질에 결합하는 것으로 공지된 임의의 단백질 또는 이의 결합 도메인일 수 있다. 단백질 또는 이의 결합 도메인의 결합 친화성이 표적 단백질에 대해 보다 특이적일 수록 다른 단백질이 목적하는 표적 단백질에 대해 요구되는 발현 수준의 증가를 잠재적으로 방해할 가능성이 적다.
표적 단백질 결합 도메인의 예는 천연 및 유전학적으로 가공된 항체 및 이의 항원 결합 단편으로부터 단리된 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서, 항체 또는 항원 결합 단편의 상기 항원 결합부는 발현 상승이 요망되는 표적 단백질에 결합한다. 상기 문단에서, 당업계에서 가용한 표준 방법을 사용하여, 목적하는 표적 단백질에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편이 용이하게 상승될 수 있다. 본 발명의 비변형된 정렬에서 융합 단백질의 표적 단백질 결합 도메인의 공급원으로서 사용될 수 있는 다양한 유전학적으로 가공된 항체 포맷은 당업계에 공지되어 있다. 상기 포맷은 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일쇄 Fv(scFv) 항체 및 단일 도메인 항체(dAb)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[a review of the variety of functional genetically engineered antibody binding formats available in the art in Marvin et al., Acta Pharmacol. Sin., 26(6): 649-658 (2005); Kufer et al, Trends Biotechnol., 22(5): 238-244 (2004); Kontermann, Acta Pharmacol. Sin., 26(1): 1-9 (2005), and Chan et al., Nat. Rev, 10: 301-316 (2010)]을 참조한다.
본 발명에 특히 유용한 것은 표적 단백질에 지시된 항원 결합 도메인이 단일 폴리펩타이드로 제공된 항체 분자 또는 단편인데 그 이유는 상기 폴리펩타이드가 표준 시험관내 DNA 방법을 사용하여 본 발명의 융합 단백질을 형성하기 위해 단백질 발현 증진 폴리펩타이드에 용이하게 연결될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 단일쇄 Fv 항체(scFv)는 단일 폴리펩타이드로 연결된 항원 결합 부위의 VH 및 VL 도메인 둘 다를 포함한다. 단일쇄 항원 결합 부위의 또 다른 공급원은 전체 항원 결합 부위가 단일중쇄 가변 도메인에 존재하는 단일 도메인 항체(dAb)이다. 예를 들어, 문헌[Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989); Muyldermans et al., Protein Eng., 7: 1129-1135 (1994); Vu et al., Mol. Immunol., 34: 1121-1131 (1997); Muyldermans et al., Trends Biochem. Sci., 26: 230-235 (2001); Nguyen et al., Immunogenetics, 54: 39-47 (2002)]을 참조한다.
면역글로불린 Fc 도메인을 소유하는 표적 단백질에 대해서, 표적 단백질 결합 도메인은 상기 논의된 바와 같이 항체 또는 이의 항원(Fc 도메인) 결합 단편일 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 도메인에 대한 대용물은 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 것으로 공지된 임의의 다양한 비-면역글로불린 단백질 및 폴리펩타이드이다. Fc 결합 도메인을 소유하는 단백질은 단백질 A, 단백질 G, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형(HSV-1)의 gE 단백질 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Fc 도메인에 결합하는 다수의 합성 펩타이드가 또한 동정되었다. 예를 들어, 문헌[DeLano et al., Science, 287:1279-1283 (2000); Yang et al., J. Peptide Res., 66(Suppl. 1): 120-137 (2006)]을 참조한다. 하기 실시예에서 보여지는 바와 같이 상기 Fc 결합 단백질 및 펩타이드는 Fc 도메인을 포함하는 목적하는 표적 단백질에 지시된 본 발명의 융합 단백질에 대해 표적 결합 도메인으로서 용이하게 사용된다.
목적하는 표적 단백질이 단백질 리간드에 결합하는 수용체 또는 이의 기능성 부분인 경우에, 상기 단백질 리간드는 본 발명의 융합 단백질에서 표적 결합 도메인으로서 사용될 수 있다. 수용체의 기능성 부분은 기능성 리간드 결합 도메인을 포함하는 막-연합된 수용체의 세포외 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 기능성 리간드 결합 도메인을 포함하는 상기 세포외 부분은 수용체의 막관통 및 세포질 도메인이 제거되기 때문에 "절단된 수용체"로서 언급된다. 본 발명에 따라, 상기 절단된 수용체 분자의 발현은 수용체의 단백질 리간드를 포함하는 본 발명의 융합 단백질과 동시 발현함에 의해 상승될 수 있다. 따라서, 본 발명의 변형된 정렬에서 융합 단백질의 표적 결합 도메인으로서 사용하기에 특히 적합한 것은 하기 실시예에 보여지는 바와 같이 특정 사이토킨 폴리펩타이드(예를 들어, IL8, IL13 등)와 같은 단일 폴리펩타이드인 리간드 단백질이다. 표적 수용체 단백질 또는 이의 리간드 결합 부분에 결합하기 위해 융합 단백질에서 사용될 수 있는 다른 단백질 리간드는 폴리펩타이드 공동-수용체, 폴리펩타이드 공동-리프레서 및 폴리펩타이드 보조인자를 포함한다.
표적 단백질이 공지된 수용체 분자에 의해 결합되는 단백질 리간드(예를 들어, 사이토킨)인 경우에, 본 발명의 비변형된 정렬에서 융합 단백질의 표적 단백질 결합 도메인은 표적 단백질에 결합하는 동족 수용체 또는 상기 수용체의 세포외 리간드 결합 부분을 포함할 수 있다.
BAG 도메인은 표적 단백질의 발현 증진을 위한 융합 파트너로서 당업계에서 제안되었다. 다양한 BAG 단백질의 BAG 도메인이 결정되었다. 예를 들어, 문헌[Takayama et al., Nat. Cell Biol., 3: E237-E241 (2001)]을 참조한다. BAG 도메인은 임의의 BAG 단백질 계열의 구성원의 BAG 도메인의 주요 한정된 특징을 갖는다. 따라서, BAG 도메인은 길이가 전형적으로 85 내지 124개 아미노산이고, Hsp70 샤페론 단백질의 ATPase 도메인에 결합하고 3개의 역평행 α-헬릭스(I, II, III, IV)를 특징으로 하는 BAG 단백질의 폴리펩타이드 도메인을 포함하고 여기서, 헬릭스 III 및 IV는 Hsp70 샤페론 단백질의 ATPase 도메인과 상호작용한다. 최근에, 목적하는 재조합 단백질이 BAG 도메인에 연결되는 경우 상기 수득한 융합 단백질은 단독의 단백질의 발현 보다 크게 발현되는 것으로 보고되었다. 문헌[ International Publication No. WO 2012/087835 A2]을 참조한다.
하기 실시예로부터, 비변형된 정렬에서 사용되는 BAG 도메인은 목적하는 표적 단백질의 발현 수준의 상당한 증진을 제공하지 못하였다. 대조적으로, 본원에 기재된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 변형된 및 비변형된 정렬 둘 다에서 목적하는 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시킨다. 하기 실시예에서 보여지는 바와 같이, 목적하는 표적 단백질(본 발명의 변형된 정렬에서)에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(예를 들어, 본원에 기재된 화학식 I 또는 이의 특정 10 내지 12개 아미노산 동족체의 단리된 J 도메인, 활성 J 도메인 단편 또는 J 도메인 유사체 폴리펩타이드)를 포함하는 융합 단백질은 대조군 세포(융합 단백질의 부재)의 수준 보다 상당히 높은 수준으로 발현하였다. 다른 연구는 표적 단백질 결합 도메인(비변형된 정렬에서)에 연결된 본원에 기재된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이 상기 융합 단백질의 부재 하의 수준(대조군) 또는 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 BAG 도메인을 포함하는 융합 단백질의 수준과 비교하여 상당히 큰 발현 수준의 비변형된 목적하는 표적 단백질을 제공하는데 효과적이었다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는 변형되고 비변형된 정렬 둘 다에서 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키는데 사용하기 위한 새로운 계열의 폴리펩타이드를 제공한다.
낭종성 섬유증을 치료하기 위한 유전자 치료요법
낭종성 섬유증(CF)은 낭종성 섬유증 막관통 전도 조절제(CFTR) 단백질, cAMP-조절된 클로라이드 채널 및 채널 조절제를 암호화하는 유전자내 돌연변이에 의해 유발되는 상염색체 퇴행성 장애이다. CFTR에서 위치 508에서의 페닐알라닌 결실(Δ508F)은 CFTR 단백질의 입체배좌를 변화시킴에 이어서 소포체(ER) 품질 시스템에 의해 신속하게 분해되는 가장 흔한 돌연변이이다. 일반적인 공통 사항은 CF 환자에게 이로운 치료를 제공하기 위해서는 야생형 CFTR 단백질 기능이 단지 부분적으로 복구되어야 한다는 것이다. 따라서, CFTR과 함께 다수의 유전자 치료요법이 시도되었지만 CFTR에 대한 유전자의 비효율적인 전달 및 비히클(예를 들어, 바이러스 벡터)의 면역원성으로 인해 아직 성공적이지 못하였다. 야생형 CFTR의 적절한 단백질 폴딩이 어렵다는 것이 공지되어 있다는 사실 관점에서, CFTR 단백질의 단백질 폴딩이 개선될 수 있다면 매우 유용할 것이다.
낭종성 섬유증(CF)을 치료하기 위한 유전자 치료요법의 20개 이상의 임상적 시험은 20년 이상 이전에 CFTR 유전자의 동정 및 단리 이후 수행되어 왔다. 문헌[a review of gene therapy for cystic fibrosis in Davies et al., Proc. Am. Thor. Soc., 7: 408-414 (2010)]을 참조한다. 상기 임상적 시험은 대체용 낭종 섬유증 막관통 조절제(CFTR) 단백질을 제공하기 위한 개념적 증거를 이미 확립시켰지만, 사람 대상체 세포에서 대체용 CFTR 단백질의 유효 발현 수준의 지속성은 CF를 치료하기 위해 효과적인 유전자 치료요법의 개발에 있어서 가장 만성적 과제 중 하나로 남아있다. 상기 CFTR 야생형 단백질은 이의 불안정성 때문에 널리 공지된 단백질이다. CF 환자들 중 90% 이상은 위치 508번 중에 페닐알라닌의 부재가 고도로 불안정한 단백질을 유발하여 세포에서 신속하게 분해되는 CFRT에 대한 하나 이상의 돌연변이된 (CFTRΔ508F) 유전자 카피를 소유한다. 이것은 CF를 치료하기 위한 융합 유전자 치료요법 접근이 CF를 앓는 자들에게 증가된 CFTR 기능 또는 복구된 CFTR 기능을 유도할 것임을 시사한다. 상기 유전자 치료요법은 본 발명의 변형되거나 비변형된 정렬에서 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다.
하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 야생형 CFTR 단백질 또는 CFTRΔ508F 단백질이 변형된 정렬에서 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(예를 들어, J 도메인)에 융합된 융합 단백질은 비융합된 단백질 보다 상당히 높은 수준으로 발현되었다. 이것은 CF를 치료하기 위한 J 도메인 융합 유전자 치료요법 접근이 CF를 앓는 자들에게 증가된 CFTR 기능 또는 복구된 CFTR 기능을 유도할 것임을 시사한다. 따라서, 본 발명의 변형된 정렬은 상당히 높은 수준으로 발현됨에 따라 다양한 질환과 연관된 실활되거나 상실된 단백질 기능을 대체하거나 복구하기 위한 과거 치료요법 보다 더 효과적인 새로운 형태의 유전자 치료요법을 제공한다.
비변형된 정렬에 대해, 융합 단백질은 야생형 CFTR 단백질 또는 CFTRΔ508F 단백질에 결합하는 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함한다. 다수의 단백질은 CFTR의 고도로 보존된 카복시 말단의 PDZ 결합 영역에 결합하는 PDZ 도메인을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 비변형된 정렬에서 융합 단백질내 표적 단백질 결합 도메인으로서 사용하기 위한 PDZ 도메인의 공급원으로서 사용될 수 있는 단백질은 NHERF1(또한 NHERF, EBP50, 또는 SLC9A3R1로서 공지된), NHERF2(또한 E3KARP 또는 SLC9A3R2로서 공지된), 및 PDZK1(또한 CAP70 또는 NHERF3으로서 공지된)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 PDZ 어댑터 단백질의 NHERF 계열의 임의의 구성원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Haggie et al., J. Biol. Chem., 279(7): 5494-5500 (2004); Guggino, W.B., Proc. Am. Thorac. Soc., 1: 28-32 (2004); and Singh et al., J. Clin. Investig., 119(3): 540-550 (2009)]을 참조한다. 따라서, PDZ 단백질의 PDZ 도메인은 특히 본 발명의 유전자 치료요법에서 CFTRΔ508F 및 야생형 CFTR 단백질 중 어느 하나 또는 둘 다를 표적화하도록 디자인된 융합 단백질에서 표적 단백질 융합 도메인으로서 유용할 수 있다
따라서, 본 발명은 내인성 불안정한 단백질(예를 들어, 불안정한 CFTRΔ508F)의 발현 수준 및/또는 목적하는 이종성 단백질(예를 들어, 야생형 CFTR)의 발현 수준을 상당히 상승시켜 다양한 질환과 연관된 소실되거나 상실된 단백질 기능을 대체하거나 복구하기 위한 과거 치료요법 보다 더 효과적인 융합 단백질을 제공하는 새로운 형태의 유전자 치료요법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태 및 특징은 하기의 비제한적인 실시예로부터 명백할 것이다.
실시예
실시예 1. 변형된 정렬을 사용한 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 조성물 및 방법
발현 벡터 플라스미드는 상응하는 항-태그 항체 및 표준 면역블롯 검정을 사용한 용이한 동정 또는 단리를 위해 단백질 작제물의 카복시(C) 말단 또는 아미노(N) 말단에 통상적으로 부착된 표준 에피토프 태그에 연결될 수 있는, 본원에 기재된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드에 연결된 목적하는 표적 단백질을 발현시키기 위해 작제하였다.
다양한 제한 효소 부위를 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 링커 분자는 하기에 나타낸 서열(5'에서 3')을 갖는 2개의 단일 가닥의 DNA 분자를 어닐링시킴에 의해 제조하였다:
AGCTTGGTACCGGATCCGAATTCGATATCGCGGCCGCTCTCGAGTCTAGAGGGCC (서열번호 187) 및
CTCTAGACTCGAGAGCGGCCGCGATATCGAATTCGGATCCGGTACCA (서열번호 188).
이어서 상기 어닐링된 링커 분자는 HindIII 및 ApaI로 분해된 플라스미드 pcDNA3(카탈로그 번호. V790-20, Invitrogen)으로 삽입시켜 플라스미드 pcDNA'를 수득하였다.
V5 에피토프 태그(GKPIPNPLLGLDST (서열번호 47)) 또는 플래그 에피토프 태그(DYKDDDDK (서열번호 111))를 암호화하는 DNA 분자는 플라스미드 pcDNA'에 삽입하였다. N-말단 메티오닌과 함께 V5 에피토프 태그에 대한 암호화 서열, 즉, ATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACG (서열번호 189)를 갖는 이중 나선 DNA 분자는 XhoI 및 XbaI로 분해된 pcDNA'에 삽입하여 플라스미드 V5(C)-pcDNA'를 수득하거나 HindIII 및 KpnI로 분해된 pcDNA'에 삽입하여 플라스미드 V5(N)-pcDNA'를 수득하였다.
플래그 에피토프 태그에 대한 암호화 서열, 즉, GATTACAAGGATGACGATGACAAG (서열번호 190)를 갖는 DNA 분자는 XhoI 및 XbaI로 분해된 플라스미드 pcDNA'로 삽입하여 플라스미드 플래그(N)-pcDNA'를 수득하였다.
DNA 분자의 제조
단백질 서열을 암호화하는 DNA 분자는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 유전자 합성 또는 표준 프로토콜을 사용한 상보적인 DNA 분자의 어닐링에 의해 수득하였다. 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자는 표준 올리고뉴클레오타이드 합성에 의해 제조하였다. 글라이신-세린 링커 서열 GGGSGGSGGSGG (서열번호 121)를 암호화하는 DNA 서열 GGAGGCGGAAGTGGT GGGAGCGGTGGAAGCGGAGGC (서열번호 191)를 갖는 DNA 분자는 표준 방법에 의해 합성된 상보적인 단일 가닥을 어닐링시킴에 의해 제조하였다.
J 도메인 융합 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터 플라스미드의 제조
C-말단 V5-태그된 IL13Rα2 수용체 단백질을 발현하기 위해(도 1A 참조), IL13Rα2 수용체 단백질을 암호화하는 DNA 분자는 HindIII 및 KpnI로 분해된 플라스미드 V5(C)-pcDNA'에 삽입하였다.
J 도메인 또는 BAG 도메인이 IL13Rα2 수용체 단백질의 N 말단에 부착된 융합 단백질을 발현하기 위해(도 3A 참조), 이의 신호 서열이 결실된 절단된 IL13Rα2 수용체 단백질은 NotI 및 XhoI로 분해된 플라스미드 V5(C)-pcDNA'에 삽입하였다.
V5-태그된, 절단된 TNR1 수용체 단백질을 발현하기 위해(도 5A 참조), 절단된(단지 세포외 도메인) TNR1 수용체 단백질을 암호화하는 DNA 분자는 HindIII 및 KpnI로 분해된 플라스미드 V5(C)-pcDNA'에 삽입하였다.
V5-태그된 α1 항-트립신("α1 AT")을 발현하기 위해(도 4A 참조), α1 항-트립신을 암호화하는 DNA 분자는 HindIII 및 KpnI로 분해된 플라스미드 V5(C)-pcDNA'에 삽입하였다.
N-말단 V5-태그된 p53 단백질을 발현하기 위해(도 7A 참조), p53 단백질을 암호화하는 DNA 분자는 NotI 및 XhoI로 분해된 플라스미드 V5(N)-pcDNA'에 삽입하였다.
V-태그된 CFTR 및 V5-태그된 돌연변이 CFTRΔ508F를 발현하기 위해(도 8A 참조), CFTR 단백질 또는 CFTRΔ508F 단백질을 암호화하는 DNA 분자는 NotI 및 XhoI로 분해된 플라스미드 V5(N)-pcDNA'에 삽입하였다.
J 도메인에 융합된 목적하는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현하기 위해, J 도메인을 암호화하는 DNA 분자는 플라스미드 V5(C)-pcDNA' 또는 EcoRV 플라스미드 V5(N)-pcDNA'의 EcoRI 부위에 서브클로닝하여 각각 플라스미드 벡터 J-V5(C)-pcDNA' 또는 V5(N)-J-pcDNA'를 수득하였다. 융합 단백질은 Hsp40, SV40, 및 CSP J 도메인을 사용하여 제조하였다.
BAG 도메인에 융합된 목적하는 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현하기 위해, BAG 도메인을 암호화하는 DNA 분자는 플라스미드 V5(C)-pcDNA' 또는 플라스미드 V5(N)-pcDNA'의 EcoRI 및 EcoRV 부위에 서브클로닝하여 각각 플라스미드 벡터 BAG-V5(C)-pcDNA' 또는 V5(N)-BAG-pcDNA'를 수득하였다. 융합 단백질은 하기 지적된 바와 같이 BAG3, BAG4, BAG5, 및 BAG6 도메인을 사용하여 제조하였다.
이어서, IL13Rα2, TNFR1, α1AT, p53, 또는 CFTR(야생형 또는 Δ508F 돌연변이)을 암호화하는 DNA 분자는 암호화된 단백질의 간편한 동정을 위해 N-말단 또는 C-말단 V5 에피토프 태그를 또한 소유하는, 수득한 융합 단백질을 발현하기 위한 하나 이상의 발현 벡터에서 J 도메인(또는 일부 경우에, BAG 도메인) 서열과 프레임내 삽입하였다.
HEK293 세포에서 단백질의 발현 및 검출
X-tremeGENE HP 형질감염 시약(카탈로그 번호 06365752001, Roche)과 함께 다양한 단백질 작제물을 암호화하는 발현 벡터 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 하기의 실시예에 지적된 바와 같이, 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 별도의 플라스미드와 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 각각의 발현 벡터 플라스미드로 동시 형질감염시켜 형질감염 효율을 모니터링하였다. 형질감염 세포의 배양물은 2일 동안 항온처리하고 배양 배지 및/또는 세포 용해물은 도트 블롯 또는 웨스턴 면역블롯 검정을 사용하여 발현된 단백질에 대해 분석하였다. 배양 배지의 샘플을 원심분리하여 분석 전에 파쇄물을 제거하였다. 세포 용해물을 위해, 세포는 2mM PMSF를 함유하는 용해 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2% SDS) 중에서 용해시켰다. 간략한 초음파 처리 후, 상기 샘플은 도트 블롯 또는 웨스턴 면역블롯 검정을 사용하여 발현 단백질에 대해 분석하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 샘플은 SDS-샘플 완충액 중에서 비등시키고 폴리아크릴아미드 전기영동상에서 전개함에 이어서 분리된 단백질 밴드를 막(PVDF 막)으로 이동시켰다.
내부 형질감염 대조군으로서 GFP의 발현은 항-GFP 항체를 사용하여 검출하였다. 도트 블롯 및 웨스턴 블롯에서 발현된 단백질은 화학발광 신호를 사용하여 검출하였다. 간략하게, 블롯은 단백질에 의해 운반되는 특정 에피토프 태그(예를 들어, V5 또는 플래그)에 결합하는 1차 항체와 반응시켰다. 미반응된 1차 항체를 세정 제거한 후, 2차 효소 연결된 항체(예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제 연결된 항-IgG 항체)는 상기 블롯에 결합된 1차 항체 분자와 반응하도록 방치하였다. 세정 후 제조업자의 화학발광 시약을 첨가하였다. 블롯내 화학발광 신호는 x-선 필름 상에 포획하였다. 지시된 경우, 화학발광 신호의 이미지는 밀도측정기로 스캐닝하고 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용하여 분석하였다.
단백질 활성에 대한 검정
표준 검정은 본원에 기재된 J 도메인 융합 단백질을 제조하는데 사용되는 목적하는 단백질의 활성을 검출하기 위해 가용하다.
IL13Rα2 결합 기능에 대한 결합 검정은 문헌[참조: "Identification of distinct roles for a dileucine and a tyrosine internalization motif in the interleukin (IL)-13 binding component IL13 receptor alpha 2 chain," J. Biol. Chem., 276(27): 25114-25120 (2001)]에 기재되어 있다.
TNFR 결합 기능에 대한 결합 검정은 문헌[참조: "Recombinant 55-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor: Stoichiometry of binding to TNF alpha and TNF beta and inhibition of TNF activity," J. Biol. Chem., 266(27): 18324-18329 (1991)]에 기재되어 있다.
α1-항트립신(α1AT) 활성에 대한 검정은 문헌[참조: "Alpha 1-antitrypsin and protease complexation is induced by lipopolysaccharide, interleukin-1beta, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes," Am. J. Respir. Crit. Care Med., 157(1): 246-255 (1998)]에 기재되어 있다.
p53 활성에 대한 검정은 문헌[참조: "Influenza virus infection increases p53 activity: role of p53 activity in cell death and viral replication," J. Virol., 79(14): 8802-8811 (2005)]에 기재되어 있다.
CFTR 활성에 대한 검정은 문헌[참조: "Pharmacology of CFTR chloride channel activity," Physiol. Rev., 79(1 Suppl.): S109-S144 (1999)]에 기재되어 있다.
실시예 2. 변형된 정렬에서 표적 단백질의 발현 증진
도 1A는 C-말단 V5 에피토프 태그된, 전장의 IL13Rα2 단백질("IL13Rα2 WT") 및 BAG 또는 J 도메인과 융합된 IL13Rα2를 포함하는 C 말단 V5 에피토프-태그된 융합 단백질에 대한 작제물의 일반 다이아그램을 보여준다.
상기 V5 태그된 IL13Rα2 WT 단백질은 발현 벡터의 클로닝 부위 기원의 12개의 C-말단 아미노산 잔기에 연결되는, V5 에피토프 태그에 C-말단에서 연결된 전장 IL13Rα2 단백질에 대한 아미노산 서열을 포함한다. V5 태그된 IL13Rα2 WT에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
상기 V5 태그된 IL13Rα2 WT-BAG3 도메인 융합 단백질은 발현 벡터의 클로닝 부위 기원의 12개의 C-말단 아미노산 잔기에 연결되는, V5 에피토프 태그에 연결되는, BAG3 단백질 기원의 BAG 도메인에 연결된 전장 IL13Rα2 단백질에 대한 아미노(N)-말단 아미노산 서열을 포함한다. IL13Rα2WT-BAG3 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
상기 V5 태그된 IL13Rα2 WT-BAG4 도메인 융합 단백질은 발현 벡터의 클로닝 부위 기원의 12개의 C-말단 아미노산 잔기에 연결되는, V5 에피토프 태그에 연결되는, BAG4 단백질 기원의 BAG 도메인에 연결된 전장 IL13Rα2 단백질에 대한 아미노(N)-말단 아미노산 서열을 포함한다. IL13Rα2WT-BAG4 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
상기 V5 태그된 IL13Rα2 WT-BAG5 도메인 융합 단백질은 발현 벡터의 클로닝 부위 기원의 12개의 C-말단 아미노산 잔기에 연결되는, V5 에피토프 태그에 연결된 BAG5 단백질 기원의 BAG 도메인에 연결된 전장 IL13Rα2 단백질에 대한 아미노(N)-말단 아미노산 서열을 포함한다. IL13Rα2WT-BAG5 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
상기 V5 태그된 IL13Rα2 WT-BAG6 도메인 융합 단백질은 발현 벡터의 클로닝 부위 기원의 12개의 C-말단 아미노산 잔기에 연결되는, V5 에피토프 태그에 연결된 BAG6 단백질 기원의 BAG 도메인에 연결된 전장 IL13Rα2 단백질에 대한 아미노(N)-말단 아미노산 서열을 포함한다. IL13Rα2WT-BAG6 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
상기 V5 태그된 IL13Rα2 WT-Hsp40 J 도메인 융합 단백질은 발현 벡터의 클로닝 부위 기원의 12개의 C-말단 아미노산 잔기에 연결되는, V5 에피토프 태그에 연결된 Hsp40 단백질 기원의 J 도메인에 연결된 전장 IL13Rα2 단백질에 대한 아미노(N)-말단 아미노산 서열을 포함한다. IL13Rα2-Hsp40 J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
상기 V5 태그된 IL13Rα2 WT-SV40 J 도메인 융합 단백질은 발현 벡터의 클로닝 부위 기원의 12개의 C-말단 아미노산 잔기에 연결되는, V5 에피토프 태그에 연결된 SV40 J 단백질 기원의 J 도메인에 연결된 전장 IL13Rα2 단백질에 대한 아미노(N)-말단 아미노산 서열을 포함한다. IL13Rα2-SV40 J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
상기 V5 태그된 IL13Rα2 WT-CSP J 도메인 융합 단백질은 발현 벡터의 클로닝 부위 기원의 12개의 C-말단 아미노산 잔기에 연결되는, V5 에피토프 태그에 연결된 CSP 단백질 기원의 J 도메인에 연결된 전장 IL13Rα2 단백질에 대한 아미노(N)-말단 아미노산 서열을 포함한다. IL13Rα2WT-CSP J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
상기된 발현 벡터를 사용하여, 발현 IL13Rα2-V5의 수준을 형질감염된 HEK293 세포에서 BAG 도메인 또는 J 도메인을 포함하는 다양한 IL13Rα2 융합 단백질의 수준과 비교하였다. 세포에서 다양한 융합 단백질의 발현 수준은 도 1B의 웨스턴 블롯에 나타낸다. 제1 열은 동일한 양의 세포 용해 단백질이 로딩된 겔의 레인을 나타낸다. 제2 열은 내부 형질감염 대조군으로서 GFP의 발현을 나타낸다. 도 1B의 제1 열에 나타낸 바와 같이, 야생형(WT) IL13Rα2 단백질의 발현을 나타내도록 사용되었던 V5-태그된 IL13Rα2에 대해서 희미한 밴드가 검출되었고, 이는 발현의 불량함을 지적한다. IL13Rα2 및 BAG 도메인(BAG3, BAG4, BAG5, BAG6)을 포함하는 융합 단백질은 약간 높은 수준으로 발현하였다. 대조적으로, IL13Rα2 및 임의의 J 도메인을 포함하는 융합 단백질은 모두 V5 태그된 IL13Rα2, 또는 IL13Rα2 및 BAG 도메인을 포함하는 융합 단백질 보다 급격히 높은 수준으로 발현하였다. 도 1B에서 신호의 밀도 측정 분석 결과는 도 1C에 나타낸다. IL13Rα2 및 임의의 J 도메인을 포함하는 융합 단백질은 V5 에피토프 태그된 IL13Rα2(100%로 하였을때) 보다 25배 정도의 높은 수준으로 발현하였다. 도 1C의 막대 그래프를 참조한다.
절단 형태의 IL13Rα2 발현 및 분비
IL13Rα2는 인터류킨-13(IL13)에 결합하고 알레르기성 염증을 매개하는 막 수용체 단백질이다. 막-연합된 IL13Rα2 수용체로의 IL13의 결합은 신호를 세포질로 전달하여 염증 반응을 개시한다. 상기 반응은 특히 천식의 경우에 치명적이다. 발현된 막 연합된 IL13Rα2 분자의 일부는 세포 표면상에서 절단되어 가용성의 절단된 형태의 IL13Rα2(IL13Rα2 TF)를 세포외 공간으로 방출한다. 절단된 형태의 IL13Rα2는 IL13에 결합하는 능력을 보유하지만 전장의 막 연합 단백질에서 발견되는 막관통 및 세포질 영역의 부재로 인해 신호를 세포로 전달할 수 없다. 따라서, 절단된 형태의 IL13Rα2는 염증 반응을 개시하는 신호의 세포로의 전달 없이 IL13 분자에 결합시킴에 의해 천식을 치료하기 위한 미끼(decoy) 수용체로서 사용되어 왔다. 상기 치료학적 응용을 위해, 유전학적으로 가공된 절단된 형태의 IL13Rα2는 포유동물 세포에서 발현되었고 배양 배지로부터 분비된 단백질로서 정제되었다. 그러나, 절단된 형태의 IL13Rα2의 제조는 단백질의 발현 및 분비의 어려움으로 인해 비효율적이다.
가용성의 절단된 형태의 IL13Rα2(IL13Rα2 TF)의 발현을 증진시키는 J 도메인의 능력을 연구하였다. J 도메인의 절단된 형태의 IL13Rα2로의 접합이 분비된 단백질의 발현을 증진시키는지를 확인하기 위해, IL13Rα2TF 또는 IL13Rα2 TF, 및 Erdj3 기원의 N-말단 J 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 플라스미드를 작제하였다. 상기 단백질은 또한 용이한 동정을 위한 V5 에피토프 태그를 소유했다. 도 2A에서 작제물의 다이아그램을 참조한다.
본 실험에 사용된 V5 태그된 IL13Rα2 TF에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
Erdj3 J 단백질의 N-말단 J 도메인, 성숙한(즉, 신호 서열이 없는) 및 절단된 IL13Rα2(IL13Rα2TF) 및 V5 에피토프 태그를 포함하는 J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
신호 서열, BAG3의 BAG 도메인, 성숙한(즉, 신호 서열이 없음) 및 절단된 IL13Rα2(IL13Rα2TF), 및 V5 에피토프 태그를 포함하는 BAG 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
발현 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 세포 용해물의 샘플 및 상기 형질감염된 세포의 2일 배양물 기원의 배양 배지를 IL13Rα2TF 또는 IL13Rα2TF-J 도메인 융합 단백질의 발현에 대해 항-V5 항체로 면역블롯팅함에 의해 분석하였다. 도 2B에 나타낸 바와 같이, IL13Rα2TF 단백질의 발현은 세포 용해물에서 약간 검출되었고(레인 2) 배지에서는 어떠한 검출도 관찰되지 않았다. 대조적으로, IL13Rα2TF-J 도메인 융합 단백질의 발현 수준은 세포내(세포 용해물 샘플)에서 및 배지로 분비됨에 따라 둘 다에서 매우 높았다. 도 2B를 참조한다. J 도메인이 절단된 형태의 IL13Rα2의 C-말단에 부착되는 경우 유사한 효과가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
도트 블롯 면역검정을 사용하는 또 다른 실험을 수행하여 분비된 단백질을 보다 잘 정량하였다. HEK293 세포는 IL13Rα2TF, IL13Rα2TF에 융합된 BAG 도메인(BAG-IL13RαTF) 또는 IL13Rα2TF에 융합된 J 도메인(J-IL13RαTF)을 발현하기 위한 발현 벡터 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 2일동안 배양하고 세포 배양 배지의 샘플은 도트 블롯 면역검정을 사용하여 분비된 단백질에 대해 분석하였다. 상기 결과는 도 3A 및 도 3B에 나타낸다. 도 3A는 배양 배지로 분비된 V5-태그된 단백질에 대한 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, IL13Rα2TF에 연결된 BAG 도메인을 포함하는 융합 단백질(레인 3)이 비융합된 IL13Rα2TF(레인 2)와 비교하여 분비된 단백질 수준이 일부 약간 증가되었음을 나타내었지만 IL13Rα2TF에 연결된 J 도메인을 포함하는 융합 단백질(레인 3)은 비융합된 IL13Rα2TF(레인 2) 또는 BAG 도메인-IL13Rα2TF 융합 단백질(레인 3)에 상대적으로 상당히 증진된 수준의 분비된 단백질을 나타내었다. NIH 이미지 J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 3A에서 도트 블롯의 신호에 대한 밀도측정 분석 결과는 도 3B에 나타낸다. 도 3B에서 막대 그래프는 IL13Rα2TF(막대 그래프 2) 또는 BAG 도메인-IL13Rα2TF 융합 단백질(막대 그래프 3)과 비교하여 분비된 J 도메인-IL13Rα2TF 융합 단백질(막대 그래프 4)에 대해 상당히 높은 수준의 발현을 명백하게 보여준다. J 도메인 융합의 사용은 단독의 IL13Rα2TF 단백질을 발현하도록 형질전환된 세포의 발현 수준과 비교하여, 형질전환된 세포에 의해 분비되는 IL13Rα2TF의 양에 있어서 대략 3.5배 증가시켰다.
사람 세포내 변형된 정렬에서 J 도메인-α1 항-트립신 융합 단백질
α1 항-트립신(α1 AT) 단백질은 간으로부터 분비되어 혈관에서 순환한다. α1 AT의 기능은 조직, 특히 폐 조직을 과도한 프로테아제로부터 보호하는 것이다. 폐는 α1 항-트립신 결핍증으로 불리우는 질환에서 프로테아제에 의해 손상된다. α1 항-트립신 결핍증을 앓는 대상체에서는 기종, 천식 및/또는 만성 폐색성 폐 질환(COPD)이 발병할 수 있다. 현재 α1 AT(사람 혈청으로부터 정제된)는 α1 항-트립신 결핍증을 앓는 환자의 치료를 위해 사용된다. 상기 치료는 고가이고 사람 혈청을 수용한 대상체는 상기 사람 혈청에 존재하는 병원체와 접촉할 위험에 처한다.
J 도메인을 α1 항-트립신(α1AT)에 융합시키는 효과는 형질감염된 세포에서 요망되는 치료학적으로 유용한 단백질의 발현 및 분비 수준을 증진시키기 위한 전략으로서 연구되었다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, V5 태그된 α1AT, V5-태그된 α1AT-BAG 도메인 융합 단백질 및 V5-태그된 α1AT-J 도메인 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물을 제조하였다.
V5-태그된 α1AT 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
α1AT, BAG3의 BAG 도메인 및 V5 에피토프 태그를 포함하는 BAG 도메인 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
α1AT, Erdj3 J 도메인 및 V5 에피토프 태그를 포함하는 J 도메인 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
상기 3개의 재조합 α1AT 단백질 작제물을 암호화하는 발현 벡터 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포의 2일 배양 기원의 배양 배지를 수거하고 배지로 분비된 재조합 α1AT 단백질의 수준을 도트 블롯 면역검정으로 결정하였다. 도 4B는 도트 블롯 검정의 x-선 필름 화학발광 신호를 보여준다. 비융합된 α1AT(레인 2)와 α1AT-BAG 도메인 융합 단백질(레인 3) 둘 다의 검출가능한 양이 배양 배지로 분비된다 해도, 보다 더 높은 수준의 발현은 분비된 α1AT-J 도메인 융합 단백질(레인 3)에 대해서 수득되었다. NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 4B에서 도트 블롯의 신호에 대한 밀도측정 분석 결과는 도 4C에 나타낸다. 도 4C에서 막대 그래프는 α1AT(막대 그래프 2) 또는 α1AT-BAG 도메인 융합 단백질(막대 그래프 3)의 발현 수준과 비교하여 분비된 α1AT-J 도메인 융합 단백질(막대 그래프 4)의 상당히 보다 높은 수준의 발현을 명백히 보여준다. J 도메인 융합의 사용은 단독의 α1AT 단백질 또는 α1AT-BAG 융합 단백질을 발현하도록 형질전환된 세포의 발현 수준과 비교하여 상기 형질감염된 세포에 의해 분비된 IL13Rα2TF의 양에 있어서 1.5배 더 큰 증가를 유도하였다.
변형된 정렬에서 절단된 형태의 TNFR1 단백질
치료학적 활성 융합 단백질을 디자인하기 위한 한가지 포맷은 융합 단백질에 증진된 생체내 반감기를 부여하는, 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 목적하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 조합한다. 상기 부류의 약물의 예는 종양 괴사 인자(TNFα)에 결합하고 이의 효과를 억제하는 에타너셉트이고 이는 다수의 자가면역 질환에 관여하는 면역계의 주요 단백질이다. 예를 들어, 에타너셉트는 면역글로불린 Fc 도메인에 연결된 절단된 형태의 종양 괴사 인자 α 수용체(TNFR1TF)를 갖는다. 에타너셉트의 TNFR1TF 부분은 약물 표적(TNFα)에 대한 특이성을 제공하고, 상기 Fc 도메인은 생체내 약물의 안정성 및 전달성을 부가하는 것으로 사료된다. 그럼에도 불구하고, 상기 Fc 도메인은 또한 일부 질환에 대한 치료 프로토콜에서 요망되지 않을 수 있는 특정 이펙터 기능을 갖는 것으로 공지되어 있다.
J 도메인을 절단된 형태의 수용체 분자로 융합시키는 효과는 요망되는 수용체 기반 분자의 발현 및 분비의 수준을 증진시키기 위한 가능한 전략으로서 연구되었다. 상기 J 도메인 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 도메인에 연결된 절단된 형태의 수용체 분자를 포함하는 이전 약물 디자인에 대한 가능한 대용물을 제공할 수 있다. J 도메인의 존재 또는 부재 하에 절단된 형태의 종양 괴사 인자 수용체(TNFR1TF)의 발현은 발현 벡터 플라스미드 TNFR1TF-V5-pcDNA' 및 TNFR1TF-J 도메인-V5-pcDNA'을 사용하여 연구되었다. 상기 발현 벡터는 항-V5 항체를 사용한 용이한 검출을 위해 2개의 단백질에 V5 에피토프 태그를 부가한다. 도 5A에서 작제물에 대한 다이아그램을 참조한다.
V5 태그된 TNFR1TF의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
TNFR1TF, Erdj3 J 도메인 및 V5 에피토프 태그를 포함하는 J 도메인 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
발현 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 세포 용해물의 샘플 및 형질감염된 세포의 2일 배양물 기원의 배양 배지는 TNFR1TF 또는 TNFR1TF-J 도메인 융합 단백질의 발현에 대해 항-V5 항체로 면역블롯팅함에 의해 분석하였다. 도 5B의 도트 블롯에 나타낸 바와 같이, 일부 TNFR1TF는 배지(레인 2)에서 검출되었지만 배지에서 검출된 TNFR1TF-J 도메인 융합 단백질의 수준은 상당히 높았다(레인 3). NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 5B에서 도트 블롯의 신호에 대한 밀도 측정 분석 결과는 도 5C에 나타낸다. 명백하게, 분비된 TNFR1TF-J 도메인 융합 단백질(막대 그래프 3)의 발현 수준은 (비융합된) TNFR1TF 단백질(막대 그래프 2)의 수준 보다 상당히 높았고, 즉, 단독의 TNFR1TF의 수준 보다 약 6배 증가하였다.
변형된 정렬에서 Fc-융합 단백질의 분비
분비된 절단된 형태의 TNFR1의 발현 수준이 J 도메인의 접합에 의해 증진되었음을 보여주는 상기 결과의 관점에서(도 5B 및 도 5C), J 도메인이 TNF1TF-Fc 융합 단백질과 같이, 면역글로불린 Fc 도메인에 융합된 목적하는 단백질의 발현을 증진시키는지를 조사하였다. 상기 Fc 융합 분자는 중증 류마티스 관절염, 다관절 소아 특발성 관절염(JIA), 건성성 관절염, 강직성 척추염 및 판상형 건선과 같은 다수의 자가면역 질환을 치료하기 위해 승인된 TNF1TF-Fc 융합 단백질인 약물 에타너셉트(ENBREL®로서 시판됨)에 의해 설명되는 약물 포맷 유형이다.
상기 연구를 위해, 목적하는 각각의 단백질(TNFR1TF, IL13Rα2TF 또는 α1AT)을 암호화하는 cDNA는 면역글로불린 Fc 영역의 불변 도메인을 암호화하는 절편에 연결된, 3' 말단의 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편과 함께 증강시켰다. J-도메인 융합을 위해, J 도메인을 암호화하는 cDNA는 목적하는 각각의 단백질을 암호화하는 cDNA와 V5 에피토프 태그를 암호화하는 절편 사이의 프레임내 연결시켰다. 도 6A에서 작제물의 도해를 참조한다. 상응하는 발현 벡터 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 배양 배지는 도트 블롯 검정에 의해 분비된 단백질에 대해 분석하였다.
TNFR1TF-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
TNFR1TF-J 도메인-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
IL13Rα2TF-J 도메인-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
α1AT-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
α1AT-J 도메인-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
Fc 융합 단백질(TNFRI-V5-Fc, IL13Rα2TF-Fc, α1AT-Fc) 각각은 도 6B에서 각각의 패널의 중앙 레인의 도트 블롯에 보여지는 바와 같은 배양 배지에서 발현하였다. Fc 융합 단백질의 상기 발현 수준은 단독의(즉, Fc 도메인으로의 융합 없이; 데이터는 나타내지 않음) 목적하는 단백질의 각각에 대한 수준 보다 높았다. 그러나, J 도메인이 도 6B에서 각각의 패널의 우측 레인의 도트 블롯에 나타낸 바와 같이 Fc 융합 단백질내 목적하는 단백질 절편에 연결되는 경우, 각각의 경우에 상당히 높은 수준의 발현이 수득되었다. 도 6B에서 도트 블롯의 화학발광 신호의 밀도측정 분석 결과는 도 6C의 상응하는 패널에 나타나고, 여기서, 상당히 보다 높은 수준의 J 도메인 융합 단백질의 발현이 명백히 나타난다.
사람 세포에서 변형된 정렬에서 p53 단백질의 증진된 발현
IL13Rα2, TNFR 및 α1AT와 같은 단백질은 세포막으로의 전달 또는 세포로부터의 분비를 위해 소포체(ER)에서 합성된다. 세포질 단백질의 발현에 대한 J 도메인의 존재 효과를 결정하기 위해, p53 단백질과 J 도메인의 융합 발현이 연구되었다. 상기 p53 단백질은 게놈 안정성에 중요한 역할을 수행하는 전사 인자이다. 암 환자의 절반 이상은 p53이 관여하는 경로에서 일부 이상을 갖는다. 따라서, 암 환자에서 p53의 과발현은 암에 대한 치료로서 시도되었다.
p53을 암호화하는 cDNA는 발현 플라스미드 V5(N)-pcDNA'에 삽입하여 N-말단 V5 에피토프 태그를 함유하는 p53 단백질을 발현하기 위해 플라스미드 V5(N)-p53-pcDNA를 수득하였다. p53-J 도메인 융합 단백질을 발현하기 위해, SV40 대형 T 항원의 J 도메인을 암호화하는 cDNA는 이어서 V5와 p53 암호화 영역 사이의 V5(N)-p53-pcDNA' 벡터에 삽입하였다. 도 7A에서 작제물의 다이아그램을 참조한다.
V5-태그된 p53 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
V5 에피토프 태그, SV40 J 도메인 및 p53 단백질을 포함하는 J 도메인 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
플라스미드 V5(N)-p53-pcDNA' 및 V5(N)-J-p53-pcDNA'로 MCF 세포를 형질감염시키고 2일 동안 항온처리하였다. 세포를 용해 완충액에서 용해시키고 단백질은 항-V5 항체를 사용한 웨스턴 면역블롯 검정에 의해 검출하였다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, p53-J 도메인 융합 단백질(레인 3)의 발현 수준은 J 도메인 없는 p53 단백질의 수준 보다 상당히 높았다. 따라서, 상기 결과는 J 도메인과의 융합이 막 연합되고 분비된 단백질 뿐만 아니라 세포질 단백질을 증진시킬 수 있음을 지적한다.
사람 세포에서 변형된 정렬에서 CFTR 발현
낭종성 섬유증(CF)은 낭종성 섬유증 막관통 전도도 조절제(CFTR) 단백질, cAMP-조절된 클로라이드 채널 및 채널 조절제를 암호화하는 유전자내 돌연변이에 의해 유발되는 상염색체 열성 장애이다. CFTR에서 위치 508(Δ508F)에서 페닐알라닌의 결실은 CFTR 단백질의 입체배좌를 변화시키는 가장 흔한 돌연변이이고, 상기 단백질은 ER 품질 시스템에 의해 신속하게 분해된다. 일반 공통사항은 야생형 CFTR 단백질 기능의 단지 부분적 복구가 CF 환자에게 이로운 치료를 제공하기 위해 요구된다는 것이다. 따라서, CFTR을 사용한 다수의 유전자 치료요법이 시도되었지만 CFTR에 대한 유전자의 비효율적인 전달 및 비히클(예를 들어, 바이러스 벡터)의 면역원성으로 인해 아직 성공적이지 못하였다. 야생형 CFTR의 적절한 단백질 폴딩이 어려운 것으로 공지된 사실의 관점에서, CFTR 단백질의 폴딩이 개선될 수 있다면 매우 유용할 것이다.
cftr 유전자 또는 이의 Phe508 결실 돌연변이(cftrΔ508F)는 플라스미드 V5(N)-pcDNA'에 삽입하였다. BAG3 단백질의 BAG 도메인을 암호화하는 DNA 또는 Hsp40 J 단백질 기원의 J 도메인을 암호화하는 DNA는 V5와 cftr 암호화 서열 사이의 플라스미드에 삽입하여, N-말단 V5 에피토프 태그에 연결된 야생형 CFTR 또는 돌연변이 CFTR(Δ508F) 단백질을 발현하거나 N-말단 V5 에피토프 태그에 융합된, BAG 또는 J 도메인에 N 말단에서 융합된 야생형 또는 돌연변이 CFTR 단백질을 발현하는 플라스미드를 수득하였다. 본 실험에서 사용된 다양한 작제물의 다이아그램은 도 8A에 나타낸다.
V5-태그된 야생형 CFTR(CFTR WT)의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
V5 태그된 BAG-CFTR(야생형) 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
V5 에피토프 태그, SV40 J 도메인 및 CFTR 야생형 단백질을 포함하는 J 도메인 융합체의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
V5 태그된 CFTR(Δ508F) 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
V5 태그된 BAG 도메인-CFTR(Δ508F) 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
V5 태그된 J 도메인-CFTR(Δ508F) 융합 단백질의 아미노산은 하기 표에 나타낸다.
다양한 CFTR 단백질 작제물의 발현을 연구하기 위해, 상기 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포의 2일 배양물 기원의 세포 용해물의 샘플은 항-V5 항체를 사용한 면역블롯팅에 의해 분석하였다. 도 8B에 나타낸 바와 같이, 야생형 CFTR 단백질 또는 돌연변이체 CFTR(Δ508F) 단백질 어느 것도 형질감염된 세포에서 잘 발현되지 않았다. 단백질과 BAG3 도메인의 융합(BAG-CFTR WT, BAG-CFTR Δ508F)은 발현을 일부 증진시켰다. 대조적으로, J 도메인과의 융합은 야생형 및 돌연변이체 단백질(J-CFTR WT, J-CFTR Δ508F) 둘 다의 발현 수준을 상당히 증진시켰다. 도 8B를 참조한다.
결과들에 대한 결론
상기 실험 결과는 J 도메인과의 융합이 치료학적으로 유용한 단백질을 포함하는, 목적하는 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
실시예 3. 비변형된 정렬을 사용한 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 조성물 및 방법
발현 벡터 플라스미드는 특이적 단백질(표적 단백질)의 발현을 증진시키기 위한 융합 단백질을 발현시키기 위해 작제하였다. 하기된 바와 같이, 융합 단백질은 통상적으로 상응하는 항-태그 항체 및 표준 면역블롯(예를 들어, 도트 블롯, 웨스턴 블롯) 검정을 사용한 용이한 동정 또는 분리를 위해 표준 에피토프 태그에 연결하였다.
이종성 DNA 분자를 클로닝하기 위해 다양한 제한 효소 부위를 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 링커 분자는 하기에 나타낸 바와 같이(5'에서 3') 2개의 단일 가닥 DNA 분자를 어닐링시킴에 의해 제조하였다:
AGCTTGGTACCGGATCCGAATTCGATATCGCGGCCGCTCTCGAGTCTAGAGGGCC (서열번호 187) 및
CTCTAGACTCGAGAGCGGCCGCGATATCGAATTCGGATCCGGTACCA (서열번호 188).
상기 어닐링된 링커 분자를 이어서 CMV 프로모터의 다운스트림에서 HindIII 및 ApaI로 분해된 플라스미드 pcDNA3(카탈로그 번호. V790-20, Invitrogen)에 삽입하여 포유동물 숙주 세포에 사용하기 위한 발현 벡터 플라스미드 pcDNA'를 수득하였다.
V5 에피토프 태그(GKPIPNPLLGLDST; 서열번호 110) 또는 플래그 에피토프 태그(DYKDDDDK; 서열번호 111)를 암호화하는 DNA 분자를 합성하고 HindIII 및 KpnI로 분해된 플라스미드 pcDNA'에 삽입하였다. N-말단 메티오틴을 갖는 V5 에피토프 태그에 대한 암호화 서열을 갖는 이중 가닥 DNA 분자, 즉, ATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACG (서열번호 189)를 XhoI 및 XbaI로 분해된 pcDNA'에 삽입하여 플라스미드 V5-pcDNA'를 수득하였다.
플래그 에피토프 태그에 대한 암호화 서열을 갖는 DNA 분자, 즉,
GATTACAAGGATGACGATGACAAG (서열번호 190)를 XhoI 및 XbaI로 분해된 플라스미드 pcDNA'에 삽입하여 플라스미드 플래그-pcDNA'를 수득하였다.
IL13Rα2 수용체 단백질을 발현하기 위해, IL13Rα2 수용체 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 HindIII 및 KpnI로 분해된 플라스미드 V5-pcDNA'에 삽입하였다.
TNR1 수용체 단백질을 발현하기 위해, TNR1 수용체 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 HindIII 및 KpnI로 분해된 플라스미드 V5-pcDNA'에 삽입하였다.
α1 항-트립신("α1AT")을 발현하기 위해, α1 항-트립신을 암호하하는 DNA 분자를 HindIII 및 KpnI로 분해된 플라스미드 V5-pcDNA'에 삽입하였다.
사람 IgG1 분자의 Fc 영역 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 합성하고 XbaI 및 ApaI로 분해된 V5-pcDNA'에 삽입하였다.
달리 지적되지 않는 경우, 특정 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자는 Erdj3 J 단백질의 J 도메인을 암호화하는 DNA 절편을 삽입하기 위해 EcoRI 및 EcoRV로 분해되거나 Erdj5 J 단백질의 J 도메인을 암호화하는 DNA 절편을 삽입하기 위해 KpnI 및 BamHI로 분해된 플라스미드 플래그-pcDNA'에 클로닝하여 플라스미드(J 도메인)-플래그-pcDNA'를 수득하고, 여기서, "(J 도메인)"은 하기 실시예에 명시된 특정 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 언급한다.
달리 지적되지 않는 경우, 하기 실시예에서 상응하는 표적 단백질에 대한 표적 반응 도메인을 암호화하는 각각의 DNA 분자는 NotI 및 XhoI로 분해된 플라스미드 플래그-pcDNA'에 삽입하였다.
HEK293 세포에서 표적 단백질의 발현 및 검출
X-tremeGENE HP 형질감염 시약(카탈로그 번호 06365752001, Roche)과 함께 다양한 단백질 작제물을 암호화하는 발현 벡터 플라스미드로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 하기 실시예에 지적된 바와 같이, 형질감염 효율을 모니터링하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 별도의 플라스미드와 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 각각의 발현 벡터 플라스미드를 동시 형질감염시켰다. 형질감염 세포의 배양물을 2일동안 배양하고 세포를 2mM PMSF를 함유하는 용해 완충액(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2% SDS) 중에서 용해시켰다. 간략한 초음파 처리 후, 상기 샘플은 도트 블롯 또는 웨스턴 면역블롯 검정을 사용하여 발현 단백질에 대해 분석하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 샘플을 SDS-샘플 완충액 중에서 비등시키고 폴리아크릴아미드 전기영동상에 전개함에 이어서 분리된 단백질 밴드를 막(PVDF 막)에 전달하였다. 내부 형질감염 대조군으로서 GFP의 발현은 항-GFP 항체를 사용하여 검출하였다.
도트 및 웨스턴 블롯에서 발현된 단백질은 화학발광 신호를 사용하여 검출하였다. 간략하게, 블롯은 단백질에 의해 운반되는 특정 에피토프 태그(예를 들어, V5 또는 플래그)에 결합하는 1차 항체와 반응시켰다. 미반응된 1차 항체를 세정한 후, 2차 효소-연결된 항체(예를 들어, 서양고추냉이 연결된 항-IgG 항체)는 상기 블롯에 결합된 1차 항체 분자와 반응하도록 하였다. 세정한 후, 제조업자의 화학발광 시약을 첨가하였다. 블롯에서 화학발광 신호는 x-선 필름상에 포획하였다. 지적된 경우, 화학발광 신호의 이미지는 밀도측정기로 스캐닝하고 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용하여 분석하였다.
사람화된 항-IL-8 항체를 발현하는 세포(CHO DP-12 클론, 클론 번호. 1933; 카탈로그 번호. CRL-12444) 및 플라스미드 p6G425V11N35A.choSD(카탈로그 번호. 209552)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Manassas, Virginia)으로부터 구입하였다.
실시예 4. 비변형된 정렬에서 분비된 IL13Rα2TF 단백질의 증진된 발현
IL13 수용체인 IL13Rα2는 인터류킨-13(IL13)에 결합하고 알레르기성 염증을 매개하는 막 단백질이다. 상기 IL13Rα2 수용체 단백질은 단백질 폴딩의 어려움으로 인해 포유동물 세포에서 불안정한 단백질인 것으로 공지되어 있다(문헌참조: Genetic Engineering & Biotechnology News, 28(5) (2008)). 발현된 IL13Rα2 단백질 부분은 세포 표면상에서 분해되고 세포외 공간으로 분출된다. 상기 절단된 형태의 IL13Rα2(또한 "IL13Rα2TF"로서 언급됨)는 여전히 IL13을 결합하는 능력을 소유하고 있지만 전장 IL13Rα2 단백질의 막관통 및 세포질 영역의 부재로 인해 신호를 세포에 전달할 수 없다. 따라서, 절단된 형태의 IL13Rα2는 염증 반응을 개시하는 신호를 세포로 전달하는 것 없이 IL13 분자에 결합함에 의해 천식을 치료하기 위해 한 유형의 미끼 수용체로서 사용되어 왔다(문헌참조: Zhang, et al., J. Biol. Chem., 272(14): 9474-80 (1997)). 유전학적으로 가공된 절단된 형태의 IL13Rα2는 세균에서 발현되었지만 상기 단백질은 봉입체로 응집되고 이로부터 단백질은 정제되었다(문헌참조: Tang et al., Molec. Immunol. 39: 719-727 (2003)). 그러나, 형질감염된 세포에 의한 IL13Rα2TF 단백질의 발현에 대한 한가지 한계는 이들의 적절한 기능성 입체배좌로의 비효율적인 폴딩으로 인한 것으로 공지되어 있다. 단백질이 이들의 적절한 입체배좌로 폴딩할 수 없는 경우, 이들은 아미노산의 분해 및 스캐빈징을 위해 프로테오좀으로 인도된다. 따라서, 형질감염된 세포에서 IL13Rα2TF 분자의 제조는 단백질의 발현 및 분비의 수반되는 한계인 것으로 인지되었다(문헌참조: Lee et al., Cell Technol. for Cell Products, 29-39 (2007)).
본 실험은 목적하는 표적 단백질이 본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드로의 융합에 의해 변형되는 실시예 1 내지 3에 기재된 "변형된" 정렬에 대한 또 다른 정렬을 사용한 IL13Rα2TF 단백질의 수준 및 분비의 증진을 연구했다. "비변형된" 정렬에서, 목적하는 표적 단백질은 이것이 본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드에 융합되지 않았지만 대신 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단백질 융합 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질과 동시 발현된다는 점에서 "비변형된"이다. 도 9A는 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키기 위한 상기 비변형된 정렬에 대한 도식적 다이아그램을 보여준다. 상기 도식에 따라, 목적하는 표적 단백질은 또한 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 융합 단백질의 표적 단백질 결합 도메인에 의해 결합되어 있다. 추측컨대, 표적 단백질의 융합 단백질로의 결합은 표적 단백질이 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인에 근접하게 하여 이것은 목적하는 표적 단백질의 증진된 발현을 유도한다.
도 9B는 IL13Rα2TF 단백질을 암호화하는 cDNA가 V5 에피토프 태그를 암호화하는 핵산과 함께 3' 말단에서 증강되는 핵산 작제물의 다이아그램을 보여준다. 도 9C는 본 발명의 융합 단백질에 대한 핵산 작제물의 다이아그램을 보여준다. 본 실험을 위해, 본 발명에 따른 융합 단백질은 표적 결합 도메인으로서 IL13 단백질에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드로서 Erdj3 J 단백질의 J 도메인을 포함하였다.
V5 태그된 IL13Rα2TF 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
본 실험에서 사용된 바와 같은 IL13 단백질의 아미노산 서열은 플래그 에피토프 태그, 신호 서열 및 하기 표에 나타낸 바와 같이 단백질을 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 기원의 13개 추가의 C-말단 아미노산 잔기를 포함하였다.
J 도메인-IL13 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸 바와 같은 플래그 에피토프 태그를 포함하였다.
HEK293 세포는 V5 태그된 IL13Rα2TF를 발현하고 J 도메인-IL13 융합 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터로 동시 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 2일 동안 배양하였고 세포 용해물 및 세포 배지의 샘플을 수거하고 항-V5 항체를 사용한 웨스턴 블롯(면역블롯) 검정에 의해 분석하여 분비된 V5 태그된 IL13Rα2TF를 검출하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 단독의 IL13Rα2TF 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터로 형질감염된 세포는 세포에서 일부 단백질(중앙 패널, 좌측으로부터 레인 2)을 발현하였지만 그렇다 해도 단지 매우 소량의 IL13Rα2TF 단백질이 배양 배지에서 검출되었다(상부 패널, 좌측으로부터 레인 2). IL13Rα2TF 단백질 및 이의 IL13 단백질 리간드의 동시 발현은 형질감염된 세포(중앙 패널, 좌측으로부터 레인 3) 및 배양 배지(상부 패널, 좌측으로부터 레인 3)에서 IL13Rα2TF 단백질의 일부 검출가능한 발현을 유도하였다. 상기 결과는 IL13Rα2TF와 이의 IL13 리간드의 동시 발현이 IL13Rα2TF의 분비를 개선시킨다는 초기 보고와 일치한다(문헌참조: Lee et al., Cell Technol. for Cell Products, 29-39 (2007)). 그러나, IL13Rα2TF와 본 발명에 따른 J 도메인-IL13 융합 단백질의 동시 발현은 단독의 IL13Rα2TF(상부 패널, 좌측으로부터 레인 2)의 발현 또는 IL13Rα2TF와 IL13 리간드(상부 패널 좌측으로부터 레인 3)의 동시 발현과 비교하여 세포내(중앙 패널, 좌측으로부터 레인 4) IL13Rα2TF의 발현 수준을 더 증진시켰고 분비된 IL13Rα2TF 단백질(상부 패널, 좌측으로부터 레인 4)의 발현 수준을 급격히 증진시켰다. 상기 결과는 IL13Rα2TF 단백질의 안정성 및 분비 둘 다가 본 발명의 J 도메인-IL13 융합 단백질과의 동시 발현에 의해 개선됨을 지적한다.
실시예 5. 비변형된 정렬에서 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 증진된 발현
상기 주지된 바와 같이, 절단된 형태의 IL13Rα2(IL13Rα2TF)는 기능성 IL13 리간 결합 도메인을 포함하는, IL13Rα2 수용체 단백질의 세포외 도메인을 포함한다. 그러나, IL13Rα2TF의 제조는 또한 단백질의 발현 및 분비에서의 어려움으로 인해 비효율적이다. 보다 안정한 형태의 치료학적 관련 단백질 및 특히 수용체 단백질을 제조하기 위해 사용되어 왔던 한가지 전략은 목적하는 단백질의 모든 또는 기능성 부분의 단백질이 면역글로불린 Fc 도메인의 불변 도메인에 연결되는 융합 단백질을 제조하는 것이다. 상기 Fc 융합 단백질 포맷은 요망되는 치료학적 관련 활성을 제공하고 Fc 도메인으로 인해 투약 횟수를 감소시키는 증가된 생체내 혈청 반감기를 나타내는 잠재적으로 유용한 약물 계열을 디자인하기 위해 사용되어 왔다. 상기 Fc 융합 단백질내에서, "목적하는 단백질" 도메인(예를 들어, 수용체 단백질의 세포외, 리간드-결합 도메인)은 이의 요구되는 기능성 성질(예를 들어, 리간드 결합)을 보유한다.
본 실험은 Fc 융합 단백질이 비변형된 정렬에서 본 발명의 융합 단백질과 함께 동시 발현되는 경우 Fc 융합 단백질(표적 단백질)의 발현 수준에 대한 효과를 조사하였다. IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질은 Fc 융합 단백질 약물의 대표적인 예로서 사용되었다. IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질은 또한 항-V5 에피토프 항체를 사용한 용이한 동정을 위해 IL13Rα2TF("목적하는 단백질") 도메인과 Fc 도메인 사이에 V5 에피토프 태그를 소유하고 있다. 도 11A에서 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질에 대한 DNA 작제물의 도해를 참조한다. 본 실험을 위해, 본 발명에 따른 융합 단백질의 예는 표적 결합 도메인으로서 면역글로불린 Fc 도메인에 결합하는 단백질 A에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인으로서 J 단백질의 J 도메인을 포함했다. 도 11B를 참조한다.
본 실험에 사용된 V5 태그된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
본 실험의 하나의 양상에서, 단백질 A 분자와 동시 발현되는 경우의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준을 조사하였다. 표준 항-플래그 항체를 사용한 용이한 동정을 위해 단백질 A 분자에 플래그 에피토프 태그를 부착하였다. 플래그-태그된 단백질 A의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현을 증진시키기 위한 융합 단백질의 예는 단백질 A에 연결된 Erdj3 단백질 기원의 J 도메인을 소유했다. 플래그 에피토프 태그는 단백질 A 도메인의 C-말단에 연결하였다. 도 11B에서 DNA 작제물의 도해를 참조한다. J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현을 증진시키기 위한 융합 단백질의 또 다른 예는 단백질 A에 연결된 Erdj5 단백질 기원의 J 도메인을 소유했다. 플래그 에피토프 태그는 단백질 A 도메인의 C 말단에 연결하였다. 도 11B에서 DNA 작제물의 도해를 참조한다. 플래그-태그된 Erdj5 J 도메인-단백질 A 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
HEK293 세포는 단독으로 발현된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질, 단백질 A("단지 단백질 A")와 동시 발현된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질, Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질("J-단백질 A")과 동시 발현된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질, 및 Erdj5 J 도메인-단백질 A 융합 단백질("J2-단백질 A")과 동시 발현된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 배양 배지에서 발현 수준을 비교하기 위해 발현 벡터 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 2일 동안 배양하였고, 세포 배지의 샘플은 수거하고 항-V5 항체를 사용한 웨스턴 블롯(면역블롯) 검정에 의해 분석하여 분비된 V5 태그된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질을 검출하였다. 도 12A는 배양 배지의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 12A의 레인 1은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터(공 벡터)로 형질감염된 세포의 "모방" 배양물의 배양 배지이다. 단독으로 발현되는 경우(레인 2), 일부 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질은 배지에서 검출하였다. 도 12A의 레인 3에 나타낸 바와 같이, 단백질 A(단지 단백질 A)와의 동시 발현은 배지로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 수준에 있어서 상당한 증진을 제공하지 않았다. 그러나, J 도메인-단백질 A 융합 단백질과의 동시 발현은 배지로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질(도 12A의 레인 4 및 5)의 발현 수준을 상당히 증진시켰다. 중요하게, 단독의 단백질 A와 IL13Rα2TF-Fc의 동시 발현이 IL13Rα2TF-Fc(레인 3)의 분비에 영향을 미치지 않는다는 사실은 (1) J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 J 도메인이 분비된 IL13Rα2TF-Fc의 발현 수준을 증진시키기 위해 필수적이고 (2) J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 단백질 A 도메인이 분비된 IL13Rα2TF-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 증진시키기 위해 표적 특이성을 제공하는데 필수적임을 지적한다.
NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한, 도 12A의 레인에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과는 도 12B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸다. 도 12B에서의 막대 그래프는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 IL13Rα2TF-Fc의 동시 발현(막대 그래프 4 및 5)이 단독의 IL13Rα2TF-Fc의 발현(막대 그래프 2) 또는 단독의 단백질 A와 IL13Rα2TF-Fc의 동시 발현(막대 그래프 3)과 비교하여 분비된 IL13Rα2TF-Fc의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 12A 및 도 12B에서 분비된 IL13Rα2TF-Fc 단백질 발현의 증진된 수준이 Fc 도메인에 대한 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 표적 결합 도메인의 특이성에 의존한다는 것은 도 12C에 나타낸 결과에 의해 지지된다. 도 12C의 좌측 패널에서 배양 배지의 웨스턴 블롯 분석에 나타낸 바와 같이, 분비된 IL13Rα2TF(Fc 도메인 없음)의 상당한 발현은 형질감염된 세포가 단독의 IL13Rα2TF 단백질(레인 1)을 발현하거나, IL13Rα2TF 단백질과 J-단백질 A 융합 단백질(레인 2)을 동시 발현하거나 IL13Rα2TF 단백질과 단독의 단백질 A(단지 단백질 A, 레인 3)를 동시 발현하는 경우 배양 배지에서 검출되지 않았다. NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 12C의 좌측 패널의 레인에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과는 도 12C의 우측 패널에 각각의 막대 그래프에서 나타낸다.
실시예 6. 비변형된 정렬에서 추가의 분비된 Fc 융합 단백질의 증진된 발현
일련의 실험을 수행하여 여러 상이한 Fc 융합 단백질을 증진시키기 위한 본 발명의 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 효과를 시험하고 비교하였다. 형질감염된 세포의 배양으로부터 기원하는 배양 배지의 웨스턴 블롯 분석 결과는 도 13에 나타낸다.
실시예 6.1. 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 증진된 발현
실시예 5의 상기 결과와 일치하여, 형질감염된 세포에서 IL13Rα2TF-Fc 단백질과 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현은 단독의 IL13Rα2TF-Fc 단백질(도 13A의 좌측 패널의 레인 1)을 발현하는 형질감염된 세포에 대해 관찰되는 것과 비교하여 배양 배지로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시켰다(도 13A의 좌측 패널의 레인 2). 분비된 IL13Rα2TF-Fc 단백질의 발현 수준의 상당한 증진은 또한 도 13A의 우측 패널에서 각각의 막대 그래프에 나타낸 바와 같이 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 13A의 좌측 패널에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과로부터 명백하다.
실시예 6.2. 분비된 TNFRITF-Fc 융합 단백질의 증진된 발현
종양 괴사 인자-α(TNFα)는 TNFα 수용체(TNFR1)에 결합하여 류마티스 관절염, 크론 질환 및 건선과 같은 다수의 자가면역 질환에 관여하는 염증 반응을 유도하는 주요 사이토킨이다. TNFα 수용체(TNFR1TF)의 절단된 단백질은 TNFα에 결합하여 TNFα 활성을 억제하는 미끼 수용체로서 사용된다. 에타너셉트(ENBREL®로서 시판됨, Amgen)는 절단된 형태의 TNFR이 Fc 도메인(TNFR1TF-Fc)에 융합된 TNFα 차단제이다. 분자의 TNFR1TF 도메인은 요망되는 TNFα 결합 특이성을 제공하고 면역글로불린 Fc 도메인은 환자에서 순환하는 약물에 대한 생체내 안정성을 부가하는 것으로 사료된다.
본 실험에 사용되는 TNFR1TF-Fc 융합 표적 단백질은 또한 TNFR1과 Fc 도메인 사이에 V5 에피토프 태그를 소유하였다. 본 실험에 사용되는 TNFR1TF-Fc 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
도 13B의 좌측 패널은 단독의 TNFR1TF-Fc 융합 단백질을 발현(레인 1)하거나TNFR1TF-Fc 융합 단백질과 상기된 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현(레인 2)하는 형질감염된 세포 기원 배양 배지의 웨스턴 블롯 분석에서 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 상기 결과는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 발현된 TNFR1TF-Fc 융합 단백질 수준과 비교하여, TNFR1TF-Fc 융합 단백질과 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는 형질감염된 세포에서 분비된 TNFR1TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 보여준다. 분비된 TNFR1TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준에서 상당한 증진은 또한 도 13B의 우측 패널에 각각의 막대 그래프에서 나타낸 바와 같이 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 13B의 좌측 패널에서 레인의 신호의 밀도 측정 분석 결과로부터 명백하다.
실시예 6.3. 분비된 α1AT-Fc 융합 단백질의 증진된 발현
α1 항-트립신 단백질(α1AT)은 간으로부터 순환계로 분비된다. α1AT의 기능은 조직, 특히 폐 조직을 과도한 프로테아제 활성으로부터 보호하는 것이다. α1 항-트립신 결핍증을 앓는 환자의 폐 조직은 프로테아제에 의해 심하게 손상될 수 있다. 상기 환자는 폐기종, 천식 및/또는 만성 폐색성 폐 질환(COPD)을 발병할 수 있다. 현재 α1AT(사람 혈청으로부터 정제된)는 α1 항-트립신 결핍증을 앓는 환자의 치료를 위해 사용된다. 상기 치료는 고가이고 정제된 α1AT를 복용하는 환자들은 사람 혈청에 존재하는 병원체와 접촉할 위험에 처할 수 있다.
본 실험에 사용되는 표적 α1AT-Fc 융합 단백질은 또한 α1AT와 Fc 도메인 사이에 V5 에피토프 태그를 소유한다. 본 실험에 사용된 α1AT-Fc 융합 단백질(α1AT-Fc)의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
도 13C의 좌측 패널은 단독의 α1AT-Fc 융합 단백질을 발현(레인 1)하거나 α1AT-Fc 융합 단백질 및 상기된 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현(레인 2)하는 형질감염된 세포 기원의 배양 배지에 대한 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호의 x-선 필름 이미지를 보여준다. 상기 결과는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 발현되는 α1AT-Fc 융합 단백질의 수준(레인 1)과 비교하여, 분비된 α1AT-Fc 융합 단백질의 수준(레인 2)에서 상당한 증진을 보여준다. 분비된 α1AT-Fc 융합 단백질의 발현 수준에 있어서 상당한 증진은 또한 도 13C의 우측 패널에서 각각의 막대 그래프에 나타낸 바와 같이 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 13C의 좌측 패널의 레인에서 신호의 밀도측정 분석 결과로부터 명백하다.
실시예 7. 비변형된 정렬에서 분비된 IgG1 항체 분자의 발현 증진
상기 연구는 Fc-융합 단백질의 발현 및 분비가 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현에 의해 상당히 증진됨을 보여주었다. 단백질 A는 면역글로불린 Fc 영역에 결합하는 널리 공지된 단백질의 예이다. 상기 연구는 J 단백질의 J 도메인을 갖는 면역글로불린 도메인과 결합하는 것으로 공지된 다른 단백질의 융합이 분비된 표적 항체의 발현 수준을 증진시킬 수 있는지를 조사하였다.
본 연구에서, 사람화된 IgG1 항-IL8 항체는 표적 항체 단백질로서 사용하였다. 분비된 항-IL8 항체의 발현 수준은 하기된 다양한 J 도메인 융합 단백질의 존재 및 부재 하에 조사하였다.
본 실험의 한 양상에서, 항-IL8 항체의 발현 수준은 면역글로불린 Fc 도메인과 결합하는 것으로 공지된 단백질 A 분자와 동시 발현되는 경우 조사하였다. 단백질 A 분자는 상기 실시예 5에 기재된 것과 동일한 플래그-태그된 단백질 A이다.
본 실험의 또 다른 양상에서, 항-IL8 항체의 발현 수준은 항체 경쇄와 결합하는 것으로 공지된 단백질 L 분자와 동시 발현되는 경우 조사하였다. 상기된 단백질 A 분자와 관련하여, 본 실험에 사용되는 단백질 L 분자는 표준 항-플래그 항체를 사용한 용이한 동정을 위해 플래그 에피토프 태그에 부착시켰다. 플래그-태그된 단백질 L의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
Erjd3 J 도메인-단백질 L 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸 바와 같이 플래그 에피토프 태그를 포함하였다.
본 실험에 사용된 IL8 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸 바와 같이 단백질을 발현하기 위해 사용된 발현 벡터로부터 플래그 에피토프 태그, 신호 서열 및 13개의 추가의 C-말단 아미노산 잔기를 포함하였다.
Erdj3 J 도메인-IL8 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸 바와 같은 플래그 에피토프 태그를 포함하였다.
HEK293 세포는 단독의 항-IL8 항체를 발현하고, 항-IL8 항체 및 단백질 A(단지 단백질 A)를 동시 발현하고, 항-IL8 항체와 본 발명의 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(J-단백질 A)을 동시 발현하고, 항-IL8 항체와 단백질 L(단지 단백질 L)을 동시 발현하고, 항-IL8 항체와 본 발명의 Erdj3 J 도메인-단백질 L 융합 단백질(J-단백질 L)을 동시 발현하고, 항-IL8 항체와 이의 IL8 리간드(IL8)를 동시 발현하고, 본 발명의 Erdj3 J 도메인-IL8 리간드 융합 단백질(J-IL8)을 동시 발현하고, 단독의 본 발명의 Erdj3 J-단백질 A 융합 단백질(J-단백질 A)을 발현하고, 단독의 본 발명의 Erdj3 J 도메인-단백질 L 융합 단백질(J-단백질 L)을 발현하고, 단독의 본 발명의 Erdj3 J 도메인 IL8 리간드 융합 단백질(J-IL8)을 발현하기 위한 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 배양 배지에서 항-IL8 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체(항-hIgG 항체, 카탈로그 번호 AP112P, Millipore)를 사용한 도트 블롯 검정에 의해 분석하였다.
도 14A에서 배양 배지의 도트 블롯에 나타낸 바와 같이, 형질감염된 세포에서 항-IL8 항체와, J 도메인-단백질 A 융합 단백질과의 동시 발현(레인 4), J 도메인-단백질 L 융합 단백질과의 동시 발현(레인 6) 또는 J 도메인-IL8 융합 단백질과의 동시 발현(레인 8)은 단독의 항-IL8 항체를 발현(레인 2)하거나, 단독의 단백질 A와 동시 발현(레인 3, 단지 단백질 A)하거나, 단독의 단백질 L을 동시 발현(레인 5, 단지 단백질 L)하거나, 단독의 IL8 리간드를 동시 발현(레인 7)하는 형질감염된 세포에서 발현되는 항체의 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 항-IL8 항체 발현 수준을 상당히 증진시켰다. 단독의 J 도메인-단백질 A 융합 단백질을 발현(레인 9, J 단백질 A)하거나, 단독의 J 도메인-단백질 L 융합 단백질을 발현(레인 10, J-단백질 L)하거나, 단독의 J 도메인-IL8 융합 단백질을 발현(레인 10, J-IL8)하는 형질감염된 세포의 배양 배지에서는 어떠한 신호도 검출되지 않았고, 이것은 모든 3개의 융합 단백질을 특이적으로 표적화하고 동시 발현된 항-IL8 항체를 증진시킴을 지적한다.
NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 14A에서 레인의 신호에 대한 밀도측정 분석 결과는 도 14B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸다. 이러한 일련의 실험 결과는 표적 결합 도메인(여기서, 단백질 A, 단백질 L 또는 IL8)에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드(여기서, Erdj3 J 도메인)를 포함하는 본 발명의 융합 단백질과 표적화된 항-IL8 항체의 동시 발현이 단독의 비융합된 표적 결합 도메인 단백질(단지 단백질 G, 단지 단백질 L 또는 단지 IL8)과 항체의 동시 발현과 비교하여 분비된 항-IL8 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
실시예 8. 비변형된 정렬을 사용한 CHO-DP12 생산 세포주에서 확립된 발현의 증진
본 실시예는 본 발명의 융합 단백질이 통상적으로 확립된 관련 생산 세포주에서 이미 생산되는 표적 단백질의 발현 수준을 개선시키기 위해 사용될 수 있는지를 조사하였다. 이러한 실험을 위해, 항-IL8 항체를 발현하기 위한 발현 벡터 플라스미드(수탁번호 209552, ATCC, Manassas, Virginia)와 함께, 기탁기관(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(수탁번호 CRL-124444, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia))에서 수득한 사람화된 항-IL8 IgG1 항체를 안정적으로 발현하는 CHO-DP12 세포주를 사용하였다. 본 발명의 융합 단백질은 상기된 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질이다. CHO-DP12 생산 세포주의 세포는 Erdj3 J 도메인-단백질 A 융합 단백질을 암호화하는 작동적으로 연결된 구조적 유전자를 갖는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 효율은 HEK293 세포와 비교하여 CHO-DP12 세포에서는 높지 않았다. 그럼에도 불구하고 도 15A의 도트 블롯 검정에서 보여지는 바와 같이, J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 사람화된 항체의 동시 발현은 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 발현된(레인 2, 부재) 항체의 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비되는 항체 발현 수준(레인 3)을 상당히 증진시켰다.
NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 15A에서 레인의 도트 블롯에 대한 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과는 도 15B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸다. 상기 결과는 J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 항체의 동시 발현(막대 그래프 3)이 분비된 항체의 발현을 상당히 증진시켜 항체가 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 발현(막대 그래프 2)되는 경우 수득되는 것과 비교하여, 발현 수준에서 대략 4 내지 5배 큰 증진을 제공함을 지적한다.
상기 결과는 본 발명의 융합 단백질이 확립된 생산 세포주에서 이미 안정적으로 발현되는 단백질의 생산 수준을 상당히 증진시키기 위해 사용될 수 있음을 지적한다.
실시예 9. 비변형된 정렬에서 분비된 Fc-함유 분자의 발현을 증진시키기 위한 다른 융합 단백질
실시예 9.1. 추가의 단백질 종 기원의 Fc 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질
본 실시예는 항체 분자의 Fc 영역에 결합하는 것으로 보고된 임의의 다양한 폴리펩타이드(표적 결합 도메인으로서)에 연결된 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인으로서)를 포함하는 다양한 융합 단백질을 시험하기 위한 일련의 실험을 제공한다. 이어서 다양한 J 도메인 융합 단백질을 시험하고 형질감염된 HEK293 세포의 배지로 분비되는, 상기 실시예 5에 기재된 바와 같은 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준을 증진시키는 이들의 능력에 대해 비교하였다.
본 실시예에 사용되는 본 발명의 J-단백질 A 융합 단백질은 상기 실시예 5에 기재된 Erdj3-단백질 A 융합 단백질이다.
본원에 기재된 실험에 사용된 또 다른 융합 단백질에서, Erdj3 J 단백질로부터 기원하는 J 도메인을 특정 면역글로불린 Fc 도메인에 결합하는 것으로 공지된 단백질 G에 연결하였다. 플래그 에피토프 태그는 실시예 5 및 도 11B에서 J-단백질 A 융합 단백질에 대해 나타낸 바와 같이 단백질 G 도메인의 C 말단에 연결하였다. 본 발명의 플래그-태그된 J 도메인-단백질 G 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
본원에 기재된 실험에 사용된 또 다른 융합 단백질에서, Erdj3 J 단백질 기원의 J 도메인은 특정 면역글로불린 Fc 도메인에 결합하는 수용체인 사람 FcR(hFcR) 수용체 단백질에 연결하였다. 플래그 에피토프 태그는 실시예 5 및 도 11B에서 J-단백질 A 융합 단백질에 대해 나타낸 바와 같이 hFcR 도메인의 C 말단에 연결하였다. 플래그-태그된 J 도메인-hFcR 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
본원에 기재된 실험에 사용된 또 다른 융합 단백질에서, Erdj3 J 단백질 기원의 J 도메인은 특정 면역글로불린 Fc 도메인에 결합하는 수용체인 마카카 물라타(Macaca mulatta) 라디노바이러스 FcR 수용체 단백질(vFcR)에 연결하였다. 플래그 에피토프 태그는 실시예 5 및 도 11B에서 J-단백질 A 융합 단백질에 대해 나타낸 바와 같이 vFcR 도메인의 C 말단에 연결하였다. 플래그-태그된 J 도메인-vFcR 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
본원에 기재된 실험에 사용된 또 다른 융합 단백질에서, Erdj3 J 단백질 기원의 J 도메인은 상당한 Fc 결합 활성을 갖지 않는 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 gI 단백질에 연결하였다. 플래그 에피토프 태그는 실시예 5 및 도 11B에서 J-단백질 A 융합 단백질에 대해 나타낸 바와 같이 gI 도메인의 C 말단에 연결하였다. 플래그-태그된 J 도메인-gI 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
본원에 기재된 실험에 사용된 또 다른 융합 단백질에서, Erdj3 J 단백질 기원의 J 도메인은 면역글로불린 Fc 도메인에 대해 비교적 약한 친화성을 갖는 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 gE 단백질에 연결하였다. 플래그 에피토프 태그는 실시예 5 및 도 11B에서 J-단백질 A 융합 단백질에 대해 나타낸 바와 같이 gE 도메인의 C 말단에 연결하였다. 플래그-태그된 J 도메인-gE 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
HEK293 세포는 발현 벡터 플라스미드로 형질감염시키고 단독으로 발현되고, J 도메인-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되고(실시예 5에서 상기된 바와 같이), 단백질 A와 동시 발현되고(실시예 5에 기재된 바와 같이 "단지 단백질 A"), J 도메인-단백질 G 융합 단백질(J-단백질 G)과 동시 발현되고, J 도메인이 사람 FcR 수용체 단백질("J-hFcR")에 연결된 J 도메인 융합 단백질과 동시 발현되고, J 도메인이 바이러스 FcR 수용체 단백질("J-vFcR")에 연결된 J 도메인 융합 단백질과 동시 발현되고, J 도메인이 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 gI 단백질("J-gI")에 연결된 J 도메인 융합 단백질과 동시 발현되고, J 도메인이 헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 gE 단백질("J-gE")에 연결된 J 도메인 융합 단백질과 동시 발현되고, J-gI 및 J-gE 융합 단백질 둘 다("J-gI + J-gE")와 동시 발현되는 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 배양 배지에서의 발현 수준을 비교하였다. 형질감염된 세포는 2일동안 배양하고 세포 배지의 샘플을 수거하고 항-V5 항체를 사용한 웨스턴 블롯(면역블롯) 검정에 의해 분석하여 분비된 V5 태그된 IL13Rα2TF를 검출하였다.
도 16A는 형질감염된 세포의 배양 기원의 배양 배지의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호에 대한 x-선 필름 이미지를 보여준다. 도 16A의 레인 1은 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로 형질감염된 세포의 배양물 기원의 배지이다. 단독으로 발현되는 경우, 일부 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질이 배지(도 16A의 레인 1)에서 검출되었다. 일부 IL13Rα2TF-Fc 단백질은 또한 실시예 5 및 도 12A에 기재된 결과에 관하여 이전에 상기된 바와 같이 단지 단백질 A와 함께 발현(도 16A의 레인 3)되는 경우 검출되었다. 또한 상기 이전에 실시예 5 및 도 12A에 기재된 바와 같이, IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과 J 도메인-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현은 단독의 IL13Rα2TF의 발현(도 16A의 레인 1) 또는 IL13Rα2TF-Fc와 단독의 단백질 A의 동시 발현(도 16A의 레인 3) 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준(도 16A의 레인 2)을 상당히 증진시켰다. IL13Rα2TF-Fc 단백질과 J 도메인-단백질 G 융합 단백질의 동시 발현은 또한 단독의 IL13Rα2TF의 발현(도 16A의 레인 1) 또는 IL13Rα2TF-Fc와 단독의 단백질 A의 동시 발현(도 16A의 레인 3) 수준과 비교하여 분비된 IL13Rα2TF-Fc 단백질(도 16A의 레인 4)의 발현 수준을 상당히 증진시켰다.
헤르페스 심플렉스 바이러스 1형 기원의 바이러스 단백질 gI 및 gE는 이종이량체를 형성하는 것으로 공지되어 있고, 여기서, 상기 gE 단백질은 항체 분자와 약하게 결합한다. 추가로, 단독의 gE 단백질은 항체 분자와 약하게 결합하는 반면, 단독의 gI는 항체 분자와 결합하지 않는다. 이들 이전의 발견과 일치하여, IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과 J 도메인-gI 융합 단백질의 동시 발현(도 16A의 레인 7)은 단독의 IL13Rα2TF-Fc를 발현하는 세포에서 관찰되는 것(도 16A의 레인 1)과 유사하게 비교적 낮은 수준의 분비된 IL13Rα2TF-Fc의 발현을 유도하였다. 대조적으로, IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과 J 도메인-gE 융합 단백질의 동시 발현은 분비된 IL13Rα2TF-Fc의 발현 수준(도 16A의 레인 8)을 상당히 증진시켰다. 분비된 IL13Rα2TF-Fc의 수준에서 유사한 증진은 IL13Rα2TF-Fc가 J-gI와 J-gE 융합 단백질과 동시 발현(도 16A의 레인 9)되는 경우 관찰되었고, 이것은 J-gI 융합 단백질이 gI 단백질이 Fc 도메인과 결합하지 않는다는 이전 발견과 일치되게 분비된 IL13Rα2TF-Fc의 발현 수준을 상당히 증진시키지 못함을 지적한다.
사람 Fc 결합 수용체(hFcR) 및 마카카 물라타 라디노바이러스 Fc 결합 수용체(vFcR)는 항체 분자의 Fc 영역에 결합하는 것으로 널리 특징 분석된 수용체이다. 이들 FcR 분자를 포함하는 J 도메인 융합체를 제조하고 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현을 증진시키는 능력에 대해 시험하였다. 도 16A에서 보여지는 바와 같이, IL13Rα2TF-Fc 단백질과 J 도메인-hFcR 융합 단백질 또는 J 도메인-vFcR 융합 단백질의 동시 발현은 분비된 IL13Rα2TF-Fc의 발현(도 16A의 레인 5 및 6)을 증진시키지 못할 뿐만아니라 실제로 단독의 IL13Rα2TF-Fc 단백질을 발현하는 세포에서 관찰되는 분비된 단백질의 낮은 발현 수준(도 16A의 레인 1)을 억제하는 것으로 나타났다. 심지어 기준선 분비에 대한 상기 명백한 억제에 대한 한가지 가능한 설명은 이들 실험에 사용되는 J 도메인-FcR 융합 단백질이 소포체(ER)에 포획되기 때문일 수 있다. Fc 영역을 소유하는 단백질을 표적화하고 이의 발현을 증진시키기 위해 FcR 영역을 함유하는 기능성 작제물을 모색하기 위해서는 추가의 연구가 요구된다.
NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 16A에서의 웨스턴 블롯에서 화학발광 신호에 대한 밀도측정 분석 결과는 도 16B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸다.
실시예 9.2. 비변형된 정렬에서 표적 단백질의 발현을 증진시키는데 사용하기 위해 Fc 표적화 펩타이드를 포함하는 융합 단백질
면역글로불린 분자의 Fc 도메인에 결합하는 다양한 펩타이드가 공지되어 있다. 상기 실험은 Fc 도메인을 소유하는 단백질의 발현 수준을 증진시키는데 사용하기 위해 여러 대표적인 Fc-결합 펩타이드(표적 결합 도메인으로서) 각각에 연결된 J 도메인(단백질 발현 증진 폴리펩타이드로서)을 포함하는 다양한 융합 단백질을 시험하였다. 융합 단백질을 작제하기 위해 사용되는 6개의 펩타이드는 하기 표에 나타낸다.
발현 벡터 플라스미드는 6개 펩타이드 각각에 연결된 J 도메인(Erdj3 단백질 기원)을 포함하는 J 도메인 융합 단백질을 발현하기 위해 제조하였다. IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질은 Fc 도메인을 포함하는 대표적인 표적 단백질로서 사용하였다.
본 실험에 사용된 FcBP1 펩타이드에 연결된 Erdj3 J 단백질의 J 도메인을 포함하는 J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 플래그 에피토프 태그, 및 하기 표에 나타낸 바와 같이 단백질을 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 기원의 13개 추가의 C 말단 아미노산 잔기를 포함하였다.
본 실험에 사용된 FcBP2 펩타이드에 연결된 Erdj3 J 단백질의 J 도메인을 포함하는 J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 플래그 에피토프 태그, 및 하기 표에 나타낸 바와 같이 단백질을 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 기원의 13개 추가의 C 말단 아미노산 잔기를 포함하였다.
본 실험에 사용된 FcBP3 펩타이드에 연결된 Erdj3 J 단백질의 J 도메인을 포함하는 J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 플래그 에피토프 태그, 및 하기 표에 나타낸 바와 같이 단백질을 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 기원의 13개 추가의 C 말단 아미노산 잔기를 포함하였다.
본 실험에 사용된 FcBP4 펩타이드에 연결된 Erdj3 J 단백질의 J 도메인을 포함하는 J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 플래그 에피토프 태그, 및 하기 표에 나타낸 바와 같이 단백질을 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 기원의 13개 추가의 C 말단 아미노산 잔기를 포함하였다.
본 실험에 사용된 FcBP5 펩타이드에 연결된 Erdj3 J 단백질의 J 도메인을 포함하는 J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 플래그 에피토프 태그, 및 하기 표에 나타낸 바와 같이 단백질을 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 기원의 13개 추가의 C 말단 아미노산 잔기를 포함하였다.
본 실험에 사용된 FcBP6 펩타이드에 연결된 Erdj3 J 단백질의 J 도메인을 포함하는 J 도메인 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 플래그 에피토프 태그, 및 하기 표에 나타낸 바와 같이 단백질을 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 기원의 13개 추가의 C 말단 아미노산 잔기를 포함하였다.
형질감염된 세포는 2일동안 배양하였고 세포 배지의 샘플을 수거하고 항-V5 항체를 사용한 웨스턴 블롯 검정에 의해 분석하여 분비된 V5 태그된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질을 검출하였다. 도 17A는 배양 배지의 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호에 대한 X-선 필름 이미지를 보여준다. 도 17A에서 보여지는 바와 같이, HEK293 형질감염체에서 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과, 6개 J 도메인-펩타이드 융합 단백질 각각의 동시 발현은 단독의 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준(레인 1 및 3)과 비교하여 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준(레인 4 내지 9)을 상당히 증진시켰다. 상기 실험은 또한 비교용으로 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현에 대한 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과, J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2) 또는 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 10)의 동시 발현 효과를 포함하였다. 도 17A에서 보여지는 바와 같이, IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질과 J 도메인-단백질 A 융합 단백질(레인 2) 또는 J 도메인-단백질 G 융합 단백질(레인 10)의 동시 발현은 분비된 IL13Rα2TF-Fc 융합 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시켰다.
NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 17A의 웨스턴 블롯에서 화학발광 신호에 대한 밀도측정 분석 결과는 도 17B에서 각각의 막대 그래프에 나타낸다.
실험 결과의 결론
상기된 실험 결과는 목적하는 표적 단백질과, 표적 단백질에 결합하는 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 도메인을 포함하는 융합 단백질의 동시 발현이 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 이의 적절한 세포 또는 세포외 위치에서 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 지적한다.
실시예 10. 단백질 발현 증진 폴리펩타이드에 대한 최소 서열 필요 조건
비변형되거나 변형된 정렬에서 사용된 경우 목적하는 표적 단백질의 발현 수준을 증진시키기 위해 효과적인 최소 아미노산 서열을 결정하기 위해 추가의 분석에 착수하였다.
BLAST를 사용하는 서열 상동성 분석은 J 도메인 서열의 기존 라이브러리에 대해 수행하여 J 도메인이 단백질 발현 수준을 증진시킬 수 있는 유사한 최소 "코어" 서열을 공유하는지를 결정하였다. 상기 분석은 Erdj3 단백질의 J 도메인이 전형적인 다른 J 단백질의 J 도메인임을 지적했다. Erdj3의 J 도메인은 변형된 및 비변형된 정렬 둘 다에서 단백질 발현을 증진시키는데 효과적인 것으로 이미 공지되었기 때문에(상기 실시예 참조), 단백질 발현 증진 활성을 보유하는 최소 폴리펩타이드 서열이 동정될 수 있는지를 결정하기 위해 추가의 결실 및 치환 돌연변이 분석을 선택하였다.
본 연구에서, Erdj3의 J 도메인의 다양한 결실 및 치환 돌연변이는 목적하는 표적 단백질로서 가공된 IL13Rα2TF-V5-Fc 단백질의 발현을 증진시키는 것에 대해 평가하였다. 상기 가공된 단백질은 IL13Rα2TF 폴리펩타이드와 Fc 도메인 사이에 V5 에피토프 태그를 소유하고 이는 항-V5 항체를 사용한 용이한 검출을 가능하게 한다. Erdj3의 전장 J 도메인, 또는 가공된 IL13Rα2-Fc 표적 단백질의 Fc 도메인(표적 단백질 결합 도메인으로서 작용하는)에 결합하는 단백질 A에 연결된 다양한 돌연변이된 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 작제하였다. 따라서, 돌연변이된 폴리펩타이드 각각에 대해, 상기 연구에 사용되는 상응하는 융합 단백질의 화학식은 다음과 같다:
신호 서열-링커 1-(J 도메인, 단편 또는 J 도메인 유사체 폴리펩타이드 서열-링커 2-단백질 A-링커 3-플래그 에피토프 태그.
삽입된 J 도메인, J 도메인 단편 또는 J 도메인 유사체 서열을 배제한, 상기 융합 단백질의 도메인의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
각각의 융합 단백질의 단백질 발현 증진 활성은 검출가능한 항-V5 항체를 사용한 도트 블롯 검정에 의해 결정하였다. IL13Rα2-V5-Fc 표적 단백질은 각각의 돌연변이된 폴리펩타이드 서열을 함유하는 융합 단백질의 존재 또는 부재 하에 발현시키고 세포 배양 배지를 수거하고 간략하게 회전시켜 파쇄물을 제거한다. 상기 샘플을 니트로셀룰로스 막상에 블롯팅하고 건조된 막은 면역블롯 검정을 위해 프로세싱하였다. 단백질 발현 증진 활성에 대해 시험된 결실 및 치환 폴리펩타이드는 면역블롯팅함에 의해 결정된 단백질 발현 증진 활성과 함께 하기 표에 나타낸다.
상기 표에 지적된 바와 같이, 각각의 돌연변이된 폴리펩타이드는 IL13Rα2-V5-Fc 표적 단백질과 동시 발현되는 경우의 발현 증진 활성에 대해 평가하였다. 발현 수준은 고활성("HA"), 활성("A"), 또는 비활성("NA")으로서 분류하였다. 이들 발현 수준의 예는 도 18의 면역블롯에서 보여진다. 융합 단백질의 부재 하에 IL13Rα2-V5-Fc 표적 단백질의 발현 수준은 "비활성"으로서 취한다. 레인 2(좌측으로부터)(도 18)를 참조한다. 단백질 A에 연결된 상기 표 58에서 폴리펩타이드 3으로 지정된 Erdj3의 완전한 J 도메인을 포함하는 융합 단백질의 동시 발현은 분비된 IL13Rα2-V5-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 급격히 증진시켰다. 도 18에서 좌측으로 레인 3을 참조한다. 상기 발현 증진 수준은 "고활성"으로서 나타낸다. 도 18의 레인 4에서 보여지는 바와 같이, 단백질 A에 연결된 3-45로 지정된 내부 결실 돌연변이된 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 동시 발현은 대조군(비융합 단백질, 도 18의 레인 2)과 비교하여 분비된 IL13Rα2-V5-Fc 표적 단백질의 상당히 증진된 발현 수준을 명백하게 제공했지만, 발현 수준은 도 18의 레인 3에 보여지는 고활성 보다는 약간 낮았다. 상기 발현 증진 수준은 "활성"으로 지정한다. 대조적으로, 도 18의 레인 5에서 보여지는 바와 같이, 단백질 A에 연결된 3-72로 지정된 최소 폴리펩타이드 서열내 치환 돌연변이를 포함하는 융합 단백질의 동시 발현은 도 18의 레인 2에서 대조군에 대해 검출된 발현 수준만을 제공했다. 이것은 "비활성"으로 지정된다.
상기 분석 결과는 3-29로 지정된 Erdj3의 J 도메인의 내부 폴리펩타이드 단편이 단백질 발현을 증진시키기 위해 고활성을 제공하는 최소 폴리펩타이드 서열 (IKKAYRKLA; 서열번호 48)을 가짐을 지적했다. 상기 폴리펩타이드 3-29 서열은 J 도메인의 α헬릭스 II내에 위치하지만 인접한(C 근접) 루프 도메인의 임의의 잔기를 포함하지 않는다.
J 도메인 단편 3-29 서열의 다양한 돌연변이를 제조하고 단백질 발현 증진 활성에 대해 평가하였다. 돌연변이된 서열은 상기 표에 나타내고 폴리펩타이드 번호 3-44 내지 3-88을 참조한다.
다른 J 단백질의 J 도메인은 또한 Erdj3의 J 도메인내 3-29 폴리펩타이드와 유사한 위치에 위치한 내부 폴리펩타이드 서열에 대해 평가하였다. 상기 표에서 상기 서열은 3-89 내지 3-99로 지정한다. 이들 폴리펩타이드의 대부분은 분비된 IL13Rα2-V5-Fc 표적 단백질의 증진된 발현에 대한 분석에서 완전하거나 부분적인 활성을 제공했다. 그러나, 3-98 및 3-99로 지정된 2개의 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 3-29가 서열로부터 상당히 다양해진 아미노산 서열을 소유하였고 이들 폴리펩타이드는 또한 단백질 발현 증진 활성이 없다.
실시예 11. 신규 계열의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 한정하는 구조식
하기는 단백질 발현 증진 활성을 제공하는 Erdj3의 J 도메인의 폴리펩타이드 단편(폴리펩타이드 3-29, 서열번호 48)의 최소 서열의 발견을 초래하였을 뿐만 아니라 하기에 나타낸 바와 같이 신규 계열의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 한정하는 구조식을 유도하는 폴리펩타이드 서열 돌연변이 데이터의 분석에 대한 개요이다.
도 19는 각각의 폴리펩타이드가 상기된 바와 같이 플래그-태그된 단백질 A 융합 단백질을 작제하기 위해 사용된, 비변형된 정렬을 사용하여 결정된 단백질 발현 증진 활성과 함께, 일련의 결실 돌연변이된 폴리펩타이드와 함께 Erdj3의 J 도메인에 대한 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 각각의 플래그-태그된 단백질 A 융합체 및 IL13Rα2-V5-Fc 표적 단백질을 동시 발현하는 세포의 배양 배지에서 분비된 IL13Rα2-V5-Fc 표적 단백질의 발현 수준은 상기된 바와 같이 항-V5 항체를 사용한 면역블롯에 의해 결정하였다.
도 19에서 3-6, 3-7, 3-8, 및 3-9로 지정된 결실 돌연변이된 폴리펩타이드는 모두 단백질 발현 증진 활성이 없었고(비활성) 이는 α헬릭스 II 아미노산 서열이 활성에 필수적임을 지적한다. 도 19에서 3-15 및 3-17로 지정된 결실 돌연변이된 폴리펩타이드는 고활성을 보유하고, 이는 서열 DIKKAYRKLALQL (서열번호 274)이 고 단백질 발현 증진 활성을 제공하기에 충분함을 지적한다. 상기 폴리펩타이드는 이어서 하기 표에 보여지는 바와 같이 추가의 돌연변이 분석에 적용하였다.
상기된 바와 같이, 3-21로 지정된 폴리펩타이드의 활성(고활성, HA)과 3-22로 지정된 폴리펩타이드의 활성(비활성, NA)간의 활성 차이는 C-말단 류신(L) 잔기가 단백질 발현 증진 활성에 필수적임을 지적했다. 유사하게, 폴리펩타이드 3-25의 활성과 폴리펩타이드 3-26의 활성간의 활성 차이는 N-말단 이소류신(I)이 활성을 위해 필수적임을 지적했다. 이전에 지적된 바와 같이, 폴리펩타이드 3-29는 완전한 단백질 발현 증진 활성을 제공하기 위한 Erdj3의 J 도메인의 최소 폴리펩타이드 서열을 한정한다.
상기된 결과에 추가로, 하기에 명시된 바와 같은 추가의 분석은 본 발명의 단백질 발현 증진 폴리펩타이드에 대한 필수 아미노산 컨센서스 서열의 동정을 유도하였다.
단백질 발현 증진 활성에 대한 필수 아미노산 서열을 동정하기 위해, 3-29 서열의 각각의 아미노산은 결실시키고 상기 폴리펩타이드는 상기된 비변형된 정렬에서 IL13Rα2-V5-Fc 표적 단백질을 사용한 단백질 발현 증진 활성에 대해 시험하였다.
Erdj3의 J 도메인의 폴리펩타이드 단편의 최소 서열로 시작하여, 폴리펩타이드 3-29 서열 (IKKAYRKLA; 서열번호 48)은 9개 아미노산 위치의 각각에서 하기의 돌연변이 분석에 적용하였다:
(a) 3-29: I KKAYRKLA (서열번호 48), 위치 1에 관하여 요약 분석(1)을 참조하고,
(b) 3-44: IK AYRKLA (서열번호 295), 비활성, 위치 3에 관한여 하기 요약 분석(2)을 참조하고,
(c) 3-45: IKK YRKLA (서열번호 53), 일부 활성, 위치 4에 관하여 하기 요약 분석(3)을 참조하고,
(d) 3-39: IKKA RKLA (서열번호 294), 비활성, 위치 5에 관하여, 하기 요약 분석(4)을 참조하고,
(e) 3-46: IKKAY KLA (서열번호 54), 일부 활성, 위치 6에 관하여 하기 요약 분석(5)을 참조하고,
(f) 3-47: IKKAYR LA (서열번호 55), 일부 활성, 위치 7에 관하여 하기 요약 분석(5)을 참조하고,
(g) 3-48: IKKAYRK A (서열번호 56), 일부 활성, 위치 8에 관하여 하기 요약 분석(6)을 참조하고,
(h) 3-29: IKKAYRKL A (서열번호 48), 고활성, 위치 9에 관하여 하기 요약 분석(6)을 참조한다.
요약 분석
(1) IKKAYRKLA (서열번호 48)
제1 아미노산은 상기 활성을 위해 필수적이다.
J 구성원들(47개 J 단백질들) 중 제1 아미노산에 대한 비교 결과는 위치 1에서 하기 아미노산이 존재함을 지적했다:
I(34), L(6), V(4), M(1), A(1), R(1)
이들 아미노산 모두는 Arg(R)를 제외하고는, 비극성 측쇄 그룹을 갖는다.
다른 J 구성원으로부터 유래된 하기의 작제가 제조되고 시험되었다:
3-49:
LKKAYRKLA
(서열번호 57), 고활성
3-50:
VKKAYRKLA
(서열번호 58), 고활성
3-51:
MKKAYRKLA
(서열번호 59), 고활성
3-52:
AKKAYRKLA
(서열번호 60), 고활성
3-53:
SKKAYRKLA
(서열번호 296), 비활성
3-54:
FKKAYRKLA
(서열번호 297), 비활성.
따라서, 제1 위치는 바람직하게 I, L, V, A, 및 M인 비극성 아미노산 측쇄 그룹을 갖는 아미노산이다.
(2) IK AYRKLA (서열번호 295); 비활성
이것은 2가지 가능성을 의미한다:
a) 2개의 아미노산은 상기 위치에서 요구되고
3-55:
IAQAYRKLA (서열번호 298), 비활성
3-56:
ILAAYRKLA (서열번호 299), 비활성
이것은 일부 특정 아미노산이 요구됨을 지적한다.
*b) 2개의 라이신이 요구되거나 단지 하나가 충분하다.
J 구성원(47개 J 단백질) 중 이들 2개의 위치의 비교를 통해, 이들 2개의 위치는 하기의 빈도에 의해 지적된 바와 같이 잘 보존되어 있다:
KK(26), KR(5), RK(3), AR(3), KA(2), KQ(2), KL(1), IK(1), NK(1), RQ(1), RD(1), LA(1)
이들 모두는 한가지를 제외하고는 염기성 아미노산 측쇄를 갖는 하나 이상의 아미노산을 갖는다.
따라서, 하기의 치환 돌연변이를 제조하고 시험하였다:
3-57:
IAKAYRKLA (서열번호 61), 일부 활성
3-58:
IKAAYRKLA (서열번호 62), 일부 활성.
따라서, 위치 2 및 3에서 하나 이상의 아미노산은 염기성 아미노산 K 또는 R인 것으로 결론지었다.
(3) IKK YRKLA (서열번호 53), 일부 활성
상기 결과는 이 위치에서 일부 아미노산을 갖는 것이 양호하지만 절대적으로 필요한 것은 아님을 지적한다.
J 구성원(47개 J 단백질) 중 상기 위치의 비교를 통해, 상기 위치는 또한 하기의 빈도에 의해 지적된 바와 같이 널리 보존되어 있다:
A(36), K(2), R(2), S(2), Q(2), T(1), I(1), E(1)
하기의 폴리펩타이드를 작제하고 시험하였다:
염기성 아미노산
3-59
IKKRYRKLA (서열번호 63); 고활성
극성 비하전된 아미노산
3-60
IKKSYRKLA (서열번호 64); 일부 활성
극성 비하전된 아미노산
3-61
IKKQYRKLA (서열번호 65); 일부 활성
산성 아미노산
3-62
IKKEYRKLA (서열번호 66); 일부 활성
방향족 아미노산
3-63
IKKFYRKLA (서열번호 67); 일부 활성
극성 비하전된 아미노산
3-64
IKKCYRKLA (서열번호 68); 일부 활성.
상기 치환 돌연변이로부터, 20개의 천연 아미노산 중 임의의 아미노산은 이 위치에서의 결실이 여전히 활성을 보유하고 있기 때문에 위치 4를 차지할 수 있음을 결론짓는다.
(4) IKKA RKLA (서열번호 312); 비활성
상기 결과는 위치 5에서 일부 아미노산이 필수적임을 의미한다.
J 구성원(47개 J 단백질) 중 상기 위치의 비교를 통해, 아미노산 분포가 하기에 주어진다.
Y(34), F(10), H(2), I(1)
따라서, 하기의 폴리펩타이드를 제조하고 시험하였다:
방향족 아미노산
3-65
IKKAFRKLA (서열번호 69), 고활성
양전하 아미노산
3-66
IKKAHRKLA (서열번호 300), 비활성
비극성 아미노산
3-67
IKKAIRKLA (서열번호 301), 비활성
방향족 아미노산
3-68
IKKAWRKLA (서열번호 70), 고활성
비극성 아미노산
3-69
IKKAARKLA (서열번호 302), 비활성
비극성 아미노산
3-70
IKKASRKLA (서열번호 303), 비활성.
따라서, 위치 5에서 아미노산은 Y, F, 또는 W인 방향족 아미노산이다.
(5)
IKKAY KLA (서열번호 313), 일부 활성
IKKAYR LA (서열번호 314) 일부 활성
J 구성원(47개 J 단백질) 중 상기 위치의 비교를 통해, 하나 이상의 아미노산이 염기성 아미노산인 경우는 47개 중 43개(23개는 2개이고 20개는 하나이다)이다.
하기의 돌연변이된 폴리펩타이드는 위치 6 및 7에서 2개의 아미노산이 대체되었다:
3-71
IKKAYHQLA (서열번호 304), 비활성
3-72
IKKAYYQLA (서열번호 305), 비활성
3-73
IKKAYFSLA (서열번호 306), 비활성.
따라서, 위치 6 및 7에서 아미노산 중 하나 이상이 염기성 K 또는 R이다.
(6) IKKAYRK A (서열번호 56), 일부 활성
IKKAYRKL (서열번호 315), 일부 활성
J 구성원(47개 J 단백질) 중 이들 위치의 비교를 통해, 2개의 위치가 L 및 A로 차지되는 경우는 47개 중 25개(여기서, 이들 모두는 L-A이다)이다. 이들 위치에서 하나 이상의 아미노산이 L 또는 A인 경우는 L 또는 A가 아님을 지적한다.
하기의 돌연변이된 폴리펩타이드는 2개의 아미노산을 대체하여 제조되고 활성에 대해 시험된다:
3-74
IKKAYRKQS (서열번호 307), 비활성
3-75
IKKAYRKQC (서열번호 308), 비활성
3-76
IKKAYRKDI (서열번호 309), 비활성.
하기의 돌연변이된 폴리펩타이드는 지적된 바와 같이 위치 8에서 대체되어 있다:
극성 아미노산
3-77
IKKAYRKQA (서열번호 71), 고활성
비극성 아미노산
3-78
IKKAYRKMA (서열번호 72), 고활성
비극성 아미노산
3-79
IKKAYRKIA (서열번호 73), 일부 활성
비극성 아미노산
3-80
IKKAYRKAA (서열번호 74), 일부 활성
비극성 아미노산
3-81
IKKAYRKVA (서열번호 75), 일부 활성
염기성 아미노산
3-82
IKKAYRKRA (서열번호 76), 일부 활성.
하기의 돌연변이된 폴리펩타이드는 지적된 바와 같이 위치 9에서 대체되어 있다:
비극성 아미노산
3-83
IKKAYRKLM (서열번호 77), 고활성
비극성 아미노산
3-84
IKKAYRKLI (서열번호 78), 고활성
비극성 아미노산
3-85
IKKAYRKLV (서열번호 79), 고활성
극성 비하전된 아미노산
3-86
IKKAYRKLC
(서열번호 80), 일부 활성
극성 비하전된 아미노산
3-87
IKKAYRKLS (서열번호 81), 고활성
방향족 아미노산
3-88
IKKAYRKLY (서열번호 82), 일부 활성.
다른 돌연변이된 폴리펩타이드의 결과:
대체 L 및 A
3-42
IKKAYRKALQ (서열번호 51), 고활성
이중 L
3-43
IKKAYRKLLQ (서열번호 52), 고활성.
따라서, X8 및 X9에서의 아미노산 중 하나 이상은 L 또는 A이다.
이들 연구를 통해, 단리된 단백질 발현 증진 J 도메인 유사체 폴리펩타이드가 하기의 식을 포함하는 것으로 결론짓는다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (서열번호 47), 여기서:
X1은 이소류신(I), 류신(L), 발린(V), 알라닌(A), 또는 메티오닌(M)이고;
X2 및 X3은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 1개 또는 2개는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이고;
X4는 임의의 아미노산이거나, X4는, X1 내지 X3이 존재하고 X5 내지 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X5는 티로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F)이고;
X6 및 X7은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 1개 또는 2개는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이거나; 다른 하나가 K 또는 R이고 X1 내지 X5가 존재하고 X8 및 X9가 존재하는 경우 X6 및 X7 중 어느 하나는 부재일 수 있고;
X8 및 X9는 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 2개는 류신(L) 또는 알라닌(A)이거나; X8 및 X9 중 하나는, 다른 하나가 L 또는 A이고 X1 내지 X7이 존재하는 경우에 부재할 수 있다.
상기 식은 다른 J 단백질 기원의 하기의 폴리펩타이드의 서열에 적용될 수 있고, 이들 폴리펩타이드 모두는 활성을 갖는다:
Erdj1
3-89
IRKAYRKLSLTL (서열번호 83), 일부 활성
Erdj2
3-90
IKKQYRLLSLKY (서열번호 84), 일부 활성
Erdj4
3-91
IKKAFHKLAMKY (서열번호 85), 고활성
Erdj5
3-92
IRQAFKKLALKL (서열번호 86), 일부 활성
Erdj6
3-93
IIKAYRKLALQW (서열번호 87), 일부 활성
Erdj7
3-94
IARAYRQLARRY (서열번호 88), 고활성
Hsp40
3-95
IKRAYRRQALRY (서열번호 89), 고활성
CSP
3-96
IKKSYRKLALKY (서열번호 90), 고활성
DnaJ
3-97
IKKAYKRLAMKY (서열번호 91), 고활성
다른 J 단백질 기원의 하기 서열은 상기 식에 일치하지 않고 이들 폴리펩타이드는 단백질 발현 증진 활성을 갖지 않는다:
SV40 J 단백질 기원
3-98
MRKAYLKKC (서열번호 310), 비활성
Dnaj 동족체 서브패밀리 C 구성원 12 기원
3-99
ILAEFKVRAL (서열번호 NO:311), 비활성.
상기 요약된 분석 및 결과는 상기 식이 단백질 발현 증진 활성을 제공하는 신규 계열의 폴리펩타이드를 한정함을 지적한다.
실시예 12. J 도메인의 최소 폴리펩타이드는 변형된 정렬에서 표적 단백질의 발현을 주지시킨다
상기 설명된 바와 같이, Erdj3의 J 도메인의 돌연변이 분석 결과는 3-29로 지정된 내부 폴리펩타이드 서열이 비변형된 정렬에서 상기 분석을 사용하는 단백질 발현 증진을 위한 고활성을 제공하기 위한, 폴리펩타이드(IKKAYRKLA; 서열번호 48)에 대한 J 도메인과 함께 최소 서열이다. 3-29 폴리펩타이드의 단백질 발현 증진 활성은 또한 변형된 정렬에서 조사되었다.
본 실험에서, 제1 융합 단백질은 V5 에피토프 태그에 연결된 BSC1 폴리펩타이드(서열번호 48)에 연결된 목적하는 표적 단백질로서 IL13Rα2TF를 포함했다. 상기 융합 단백질은 하기 표에 나타낸 IL13Rα2TF-BSC1로 지정하였다.
제2 융합 단백질은 "IL13Rα2TF-BSC1MT"로 지정된 BSC1 폴리펩타이드의 돌연변이된 버젼에 연결된 목적하는 표적 단백질로서 IL13Rα2TF를 포함했고, 여기서, BSC1 폴리펩타이드의 제2 및 제3 위치는 하기 표에 나타낸 바와 같이 K-K에서 A-Q로 돌연변이되었다. BSC1MT 폴리펩타이드는 3-55로 지정한다.
IL13Rα2TF(단독의 표적 단백질), IL13Rα2TF-BSC1, 및 IL13Rα2TF-BSC1MT 단백질의 도식적 다이아그램은 도 20A에 나타낸다. IL13Rα2TF(대조군), IL13Rα2TF-BSC1, 또는 IL13Rα2TF-BSC1MT를 암호화하는 재조합 유전자를 포함하는 벡터로 세포를 형질감염시키고 상기된 바와 같이 별도의 배양물에서 성장시킨다. 각각의 배양물 기원의 배양 배지는 상기된 바와 같이 항-V5 항체를 사용한 면역블롯에 의해 단백질의 존재에 대해 분석하였다.
도 20B에 나타낸 바와 같이, 비교적 적은 IL13Rα2TF 단백질은 대조군 세포 배양물의 배양 배지에서 검출되었다. 도 20B의 레인 2를 참조한다. 대조적으로, 상당히 높은 수준의 IL13Rα2TF-BSC1 융합 단백질은 IL13Rα2TF-BSC1 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질감염된 세포의 배양 배지에서 검출되었다. 도 20B의 레인 3을 참조한다. 배양 배지에서 검출된 IL13Rα2TF-BSC1 융합 단백질의 양은 또한 IL13Rα2TF-BSC1MT 융합 단백질을 암호화하는 벡터로 형질감염된 세포의 배양 배지에서 검출된 단백질 수준보다 상당히 높았다. 이러한 후자 단백질은 대조군 세포에서 IL13Rα2TF 단백질에 대해 검출된 것과 대략 동일한 낮은 수준으로 발현되었다. 도 20B의 레인 4를 참조한다. 상기 결과는 BSC1 폴리펩타이드(IKKAYRKLA; 서열번호 48)가 본 발명의 변형된 정렬에서 단백질 발현 증진 폴리펩타이드로서 효과적이고 내부 K-K 디펩타이드의 변형이 상기 활성을 파괴시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 13. BSC1-단백질 A 융합 단백질은 비변형된 정렬에서 IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질의 발현을 증진시킨다
상기된 Erdj3의 J 도메인의 최소 폴리펩타이드 단편인, BSC1 폴리펩타이드(IKKAYRKLA, 서열번호 48)를 사용하여 하기 표에서 나타낸 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 작제하고 BSC1-단백질 A 융합 단백질이 비변형된 정렬에서 상기된 IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질의 발현을 증진시키는지를 결정하였다.
IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질은 HEK293 세포에서 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 존재 또는 부재 하에 발현시켰다. 배양물은 2일동안 성장시키고 배지를 수거하고 원심분리하여 파쇄물을 제거하였다. IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질의 발현은 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하의 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 표적 단백질 및 BSC1-단백질 A 융합체를 동시 발현하는 세포의 배지에서 상당히 증진되었다(데이터는 나타내지 않음).
배양 배지에서 발현된 IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질이 IL13 결합 활성을 보유하고 있는지를 결정하기 위해, 하기의 결합 검정을 수행하였다. 재조합 사람 IL13은 단백질들 중 어느 하나도 발현하지 못하고(대조군), 단지 IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질만을 발현하고, IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는 세포의 배양물 기원의 배지 샘플에 첨가하였다. 상기 샘플을 2시간동안 IL13과 항온처리하였다. 상기 샘플은 IL13 검출 검정(RayBio® 사람 IL13 ELISA Kit; ELH-IL13-001)에 사용하였다. 상기 검정에서, 사람 IL13의 검출은 사람 IL13이 IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질에 의해 포집되는 경우 감소한다. 도 21B에 나타낸 바와 같이, 어느 단백질도 발현하지 않는 세포의 배양물 기원의 배지는 고수준의 흡광도에 의해 지적된 바와 같이 IL13과 명백하게 결합하지 않았다(도 21의 레인 1). IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질만을 발현하는 세포 배양물 기원의 배지는 일부 IL13에 결합하였지만(레인 2), IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는(레인 3) 세포의 배양물 기원의 배지는 상당한 대량의 IL13에 결합하였다. 상기 결과는 보다 많은 사람 IL13이 IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질의 증진된 발현 수준을 함유하는 배지에서 결합되었음을 명백히 보여준다. 따라서, 증진된 수준으로 배양 배지에서 발현된 IL13Rα2TF-V5-Fc 표적 단백질은 이의 IL13 결합 활성을 보유하였다.
실시예 14. BSC1-단백질 G 융합 단백질은 비변형된 정렬에서 인자 VII-V5-Fc 표적 단백질의 발현을 증진시킨다
인자 VII(FVII)는 고유 응고 경로의 세린 에스테라제이고 다양한 출혈 합병증을 치료하기 위해 광범위하게 사용된다. 문헌[Hedner, Semin. Hematol., 43(suppl 1): S105-S107 (2006)]을 참조한다. 인지질 및 칼슘의 존재하에 FVII 및 조직인자(TF)의 복합체는 인자 X를 인자 Xa로 활성화시킨다.
BSC1 폴리펩타이드를 사용하여 BSC1-단백질 G 융합 단백질을 작제하여 상기 융합 단백질이 비변형된 정렬에서 FVII-V5-Fc 표적 단백질을 증진시키는데 효과적인지를 결정하였다.
V5 태그된 FVII-Fc 표적 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
플래그-태그된 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
FVII-Fc 표적 단백질의 발현 수준은 어느 단백질도 발현하지 않는 세포, FVII-Fc 표적 단백질만을 발현하는 세포 및 FVII-Fc 표적 단백질 및 BSC1-단백질 G 융합 단백질을 동시 발현하는 세포의 배양 배지 및 용해물 둘 다에서 항-플래그 항체를 사용한 면역블롯 검정에 의해 결정하였다. 상기 결과는 도 22A에 나타낸다. 도 22A의 상부 패널에 나타낸 바와 같이, 배양 배지로 분비되는 FVII-Fc 표적 단백질의 발현 수준은 단독의 FVII-Fc 표적 단백질을 발현하는 세포(레인 3)의 배양물에서 보다 FVII-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질을 동시 발현하는 세포(레인 2)의 배양물에서 상당히 컸다. 도 22A의 중앙 패널은 항-플래그 항체를 사용한 세포 용해물의 면역블롯이다. 상기 면역블롯은 BSC1-단백질 G 융합 단백질이 FVII-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질 둘 다를 발현하는 세포에서 발현됨을 보여준다. 도 22A의 바닥 패널에서 나타낸 바와 같이, BSC1-단백질 G 융합 단백질의 상당량이 FVII-Fc 표적 단백질과 함께 배지로 분비되지 않았다(레인 3 참조).
도 22B는 도 22A에서 상부 면역블롯에 보여지는 배양 배지에서 FVII-Fc 표적 단백질 발현에 대한 신호의 밀도측정 분석 막대 그래프를 보여준다. 도 22B의 막대 그래프 1, 2, 및 3은 도 22A에서 상부 면역블롯에서 레인 1, 2, 및 3의 신호에 상응한다.
상기 결과는 BSC1-단백질 G 융합 단백질과 FVII-Fc 표적 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 부재 하의 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 보여준다.
실시예 15. BSC1-단백질 A 융합 단백질은 비변형된 정렬에서 인자 IX-V5-Fc 표적 단백질의 발현을 증진시킨다
인자 IX는 혈우병 B의 치료를 위해 광범위하게 사용되어 왔고 이의 Fc 융합 단백질(FIX-Fc)은 현재 긍정적인 결과(지연된 효과)와 함께 임상 시험(단계 III) 중에 있다.
본 실험에서, 비변형된 정렬에서 FIX-Fc 표적 단백질의 발현 수준에 대한 상기된 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 효과를 결정하였다.
V5 태그된 FIX-Fc 표적 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
도 23A는 단독의 FIX-Fc 표적 단백질을 발현하는 형질감염된 세포(레인 2) 및 FIX-Fc 융합 단백질 및 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는 형질감염된 세포(레인 3)의 배양 배지로 분비되는 FIX-Fc 표적 단백질의 발현을 보여준다. 도 23A의 레인 1은 대조군으로서 비-발현 세포의 배양물 기원의 배지를 보여준다. 도 23A의 레인 2에 나타낸 바와 같이, 일부 FIX-Fc 표적 단백질은 단독의 FIX-Fc 표적 단백질을 발현하는 세포에 의해 분비된다. 그러나, 도 23A의 레인 3에 명백히 나타낸 바와 같이, 배지로 분비된 표적 단백질의 발현 수준은 FIX-Fc 표적 단백질 및 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 발현하는 세포에서 상당히 증진된다. 도 23B는 도 23A의 면역블롯에서 신호의 밀도측정 분석의 막대 그래프를 보여준다. 도 23B의 막대 그래프 1, 2, 및 3은 도 23A의 레인 1, 2 및 3의 신호에 상응한다.
상기 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 FIX-Fc 표적 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하의 수준과 비교하여, 배양 배지로 분비되는 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
실시예 16. BSC1-단백질 G 융합 단백질은 비정렬된 정렬에서 인자 VIII-V5-Fc 표적 단백질의 발현을 증진시킨다
인자 FVIII의 생물학적 중요성은 X-염색체 관련된 FVIII 결핍증으로부터 비롯되는 남성에서 주로 발생하는 선천성 출혈 장애인 혈우병 A에서 입증된다. 표준 치료는 출혈을 멈추게 하기 위해 소실된 FVIII를 보충함을 포함한다. FVIII-Fc 융합 단백질은 혈우병 A 환자에서 FVIII 활성의 지연된 반감기를 제공하기 위해 개발되었다(문헌참조: Powell et al., Blood, 119(13): 3031-3037 (2012)). 상기 융합 단백질은 미국 식품 안전청에서 승인되었다[the United States Food and Drug Administration in 2013 (ELOCTATETM Biogen Idec)].
본 실험은 비변형된 정렬에서 V5 태그된 FVIII-Fc 표적 단백질의 발현 수준에 대한 상기된 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 효과를 조사했다. V5-태그된 FVIII-Fc 표적 단백질의 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
본 실험에서, BSC1-단백질 G 융합 단백질의 존재 및 부재 하의 FVIII-Fc 표적 단백질의 발현 수준. 어느 단백질도 발현하지 않는 세포(HEK293), FVIII-Fc 표적 단백질만을 발현하는 세포 및 BSC1-단백질 G 융합 단백질 및 FVIII-Fc 표적 단백질을 동시 발현하는 세포 배양물로부터의 배지는 시판되는 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA)(VisulizeTM FVIII Antigen Kit, Affinity Biologics Inc.)을 사용하여 FVIII에 대해 분석하였다. 상기 결과는 도 24에서 450nm에서 흡광도의 막대 그래프로서 나타낸다. 공벡터로 형질감염되고 어느 단백질도 발현하지 않는 세포 기원의 배양 배지는 음성 대조군(도 24에서 좌측으로부터 제1 막대 그래프)으로서 사용하였고, 사람 혈청은 양성 대조군(도 24의 우측상에 마지막 막대 그래프)으로서 사용하였다. 상기 결과는 FVIII-Fc 표적 단백질과 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 G 융합 단백질의 부재 하의 표적 단백질의 발현 수준(도 24에서 좌측으로부터 제2 막대 그래프)과 비교하여 배양 배지로 분비되는 FVIII-Fc 표적 단백질의 발현 수준(도 24에서 좌측으로부터 제3 막대 그래프)을 상당히 증진시켰다.
실시예 17. BSC1-단백질 A 융합 단백질은 비변형된 정렬에서 항-IL-8 항체 표적 단백질의 발현을 증진시킨다
본 실험은 상기된 바와 같은 BSC1-단백질 A 융합 단백질이 비변형된 정렬에서 사용되어 형질감염된 HEK293 세포에서 발현되는 항-IL-8 항체 표적 단백질의 발현 수준을 개선시키는지를 조사하였다.
배양 배지에서 항-IL-8 항체의 발현은 항-IgG 항체를 사용한 면역블롯 도트에 의해 결정하였다. 도 25A의 면역도트 블롯에 나타낸 바와 같이, 항-IL8 항체 표적 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현은 단독의 항체를 발현하는 세포에서 발현되는 항체의 수준(도 25A의 중앙 열 2)과 비교하여 배양 배지로 분비되는 항체 발현 수준(도 25A의 바닥 열 3)을 상당히 증진시켰다. 도 25A의 상부 열은 어느 단백질도 발현하지 않는 대조군 세포의 모방 배양으로부터 어떠한 항체를 배지에 분비하지 않음을 보여준다.
NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 25A의 열에서 도트 블롯의 화학발광 신호에 대한 밀도 측정 분석 결과는 도 25B의 각각의 막대 그래프에 나타낸다. 도 25B의 막대는 도 25A의 열 번호에 상응하도록 번호 매김한다. 일련의 실험 결과는 항-IL8 항체 표적 단백질과, 단백질 A(표적 단백질 결합 도메인)에 연결된 BSC1 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 융합 단백질의 동시 발현이 분비된 항-IL8 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 25C는 ELISA 검정 결과를 보여준다. 96웰 플레이트에 재조합 정제된 사람 IL8로 피복하고 단독의 항-IL8 항체를 발현하는 형질감염된 세포(레인 2) 및 항-IL8 항체 표적 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질(레인 3, BSC1-단백질 A)을 동시 발현하는 세포의 배양 배지로 분비되는 항-IL-8 항체(표적 단백질)로 항온처리하였다. 모방 배양물은 임의의 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터(어떠한 항-IL8 항체 없음, 제1 레인)로 형질감염된 세포를 함유하였다. 상기 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 경우 증진된 수준으로 발현된 분비된 항-IL8 항체가 사람 IL8에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여준다.
실시예 18. BSC1-단백질 A 융합 단백질은 비변형된 정렬에서 치료학적 항-VEGF 항체(베카시주맙) 표적 단백질의 발현을 증진시킨다
본 실험은 상기된 바와 같이 BSC1-단백질 A 융합 단백질이 비변형된 정렬에서 사용되어 치료학적 항체의 발현 수준을 개선시킬 수 있는지를 조사하였다.
베바시주맙(Avastin®, Genentech/Roche)은 혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)를 억제함에 의해 혈관형성을 억제하는 사람화된 모노클로날 항체이다. 2010년에 베바시주맙의 판매는 거의 70억불이었고 모든 다른 항체 약물을 초월했다. 표준 치료에 베바시주맙의 첨가는 유방 및 폐암 환자의 수명을 미국에서 대략 10만불의 현재 비용으로 몇달까지 연장시킬 수 있다.
베바시주맙의 경쇄 및 중쇄에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
항-VEGF 항체 베바시주맙(표적 단백질)은 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 존재 및 부재 하에 사람 세포에서 발현시켰다. 모방 배양물은 어느 단백질도 발현하지 않는 세포를 함유하였다. 세포 배양물 기원의 배지 샘플은 항-사람 IgG 항체를 사용한 면역블롯 검정에 의해 항체에 대해 검정하였다.
도 26A는 단독의 베바시주맙을 발현(중앙 열)하고 베바시주맙 및 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현(바닥 열)하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비되는 베바시주맙(항-VEGF 항체)의 발현을 위한 도트 블롯 분석을 보여준다. 도 26A의 상부 열은 어느 단백질에 대한 구조적 유전자가 없는 대조군 세포의 모방 배양물 기원의 배지로 분비되었음을 보여준다. 상기 결과는 형질감염된 세포에서 베바시주맙 표적 단백질과 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 단독의 베바시주맙을 발현하는 세포 배양 배지로 분비되는 항체의 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 베바시주맙의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 보여준다.
도 26B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 26A에서 도트 블롯의 각각의 열에서 화학발광 신호의 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 26B의 막대 그래프는 도 26A의 열 번호에 상응하도록 번호 매김한다. 상기 일련의 실험 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 항-VEGF 항체 표적 단백질의 동시 발현이 배양 배지로 분비되는 항-VEGF 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 26C는 배양 배지에서 VEGF 결합 활성을 검출하기 위한 ELISA의 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 VEGF-A로 피복하고 단독의 항-VEGF 항체를 발현하는 형질감염된 세포(막대 그래프 2) 또는 항-VEGF 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는 형질감염된 세포(막대 그래프 3)의 배양 배지로 분비된 베바시주맙(항-VEGF 항체 표적 단백질)으로 항온처리하였다. 도 26C의 막대 그래프 1은 어떠한 상당한 VEGF 결합 활성이 어느 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포의 모방 배양물 기원의 배지에 존재하지 않음을 보여준다. 상기 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 경우 증진된 수준으로 발현되는 분비된 항-VEGF 항체가 사람 VEGF-A에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여준다.
실시예 19. BSC1-단백질 A 융합 단백질은 비변형된 정렬에서 치료학적 항-TNFα 항체(아달리무맙) 표적 단백질의 발현을 증진시킨다
본 실험은 상기된 BSC1-단백질 A 융합 단백질이 비변형된 정렬에서 사용되어 치료학적 항-TNFα 항체(아달리무맙: Humira®, AbbVie)의 발현 수준을 개선시키는지를 조사하였다.
도 27A는 단독의 항-TNFα 항체를 발현하는 형질감염된 세포(중앙 열) 및 항-TNFα 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는 형질감염된 세포(도 27A의 바닥 열)의 배양 배지로 분비되는 항-TNFα 항체(표적 단백질)의 발현을 위한 도트 블롯 검정을 보여준다. 어떠한 항-TNFα 항체도 어느 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포(도 27A의 상부 열)를 함유하는 모방 배양물 배지에서 검출되지 않았다. 배양 배지에서 항-TNFα 항체의 발현은 항-사람 IgG 항체를 사용한 도트 블롯 검정에서 분석하였다. 형질감염된 세포에서 항-TNFα 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현(바닥 열)이 단독의 항-TNFα 항체를 발현하는 형질감염된 세포(중앙 열)에서 발현되는 항체 수준과 비교하여 배양 배지로 분비된 항-TNFα 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 알 수 있다.
도 27B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 27A의 열 각각에서 도트 블롯의 화학발광 신호에 대한 밀도측정 분석 결과를 보여준다. 도 27B의 막대 그래프는 도 27A의 열 번호에 상응하도록 번호매김한다. 이러한 일련의 실험 결과는 표적 결합 도메인(단백질 A)에 연결된 BSC1 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질과 항-TNFα 항체 표적 단백질의 동시 발현이 분비된 항-TNFα 항체의 발현 수준을 상당히 증진시킴을 명백히 보여준다.
도 27C는 발현된 항-TNFα 항체에 의한 TNFα 결합 활성에 대한 ELISA의 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트를 재조합 정제된 사람 TNFα로 피복하고 단독의 항-TNFα 항체를 발현하는 형질감염된 세포 또는 항-TNFα항체(막대 그래프 2)와 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는(막대 그래프 3) 형질감염된 세포의 배양 배지로 분비된 항-TNFα 항체(표적 단백질)로 항온처리하였다. 어떠한 TNFα 결합 능력이 어느 단백질을 발현하기 위한 구조적 유전자가 없는 발현 벡터로 형질감염된 세포를 함유하는 모방 배양물 기원의 배지에서 검출되었다(막대 그래프 1). 이러한 일련의 실험 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 경우 증진된 수준으로 발현되는 분비된 항-TNFα 항체가 사람 TNFα에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여준다.
실시예 20. BSC1-단백질 A 융합 단백질은 비변형된 정렬에서 CHO-D12 세포주에서 항-IL8 항체의 확립된 발현을 증진시켰다
상기 실시예 8과 유사한 디자인으로, 본 실험은 BSC1-단백질 A 융합 단백질이 확립된 시판되는 관련 생산 CHO-DP12 세포주(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 수탁번호 CRL-124444, 아메리칸 타입 컬쳐콜렉션, Manassas, Virginia)에서 이미 생산된 항-IL8 항체의 발현 수준을 증진시킬 수 있는지를 조사하였다.
도 28A는 단독의 항-IL8 항체(중앙 열 2)를 발현하는 CHO-DP12 세포주(중앙 열 2) 및 항-IL8 항체 및 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는 세포(바닥 열 3)의 배양 배지로 분비된 항-IL8 항체(표적 단백질)의 발현에 대한 면역 도트 블롯 분석 결과를 보여준다. BSC1-단백질 A 융합 분자와 항체의 동시 발현이 BSC1-단백질 A 융합 분자의 부재 하에 발현된 항체 수준(열 2)과 비교하여 배양 배지로 분비된 항체의 발현 수준(바닥 열 3)을 상당히 증진시킴을 알 수 있다. 어떠한 항체도 단독의 배지(도 28A의 상부 열)에서 검출되지 않았다.
도 28B는 NIH 이미지J 이미지 프로세싱 프로그램을 사용한 도 28A의 열에서 도트 블롯에서 화학발광 신호에 대한 밀도 측정 분석 결과를 보여준다. 도 28B에서 막대 그래프는 도 28A에서의 열에 상응하도록 번호매김한다. 상기 결과는 BSC1-단백질 A 융합 분자와 항체의 동시 발현(막대 그래프 3)이 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 항체가 발현되는 경우 수득되는 것(막대 그래프 2)과 비교하여 발현 수준에서 대략 4배 내지 5배 큰 증진을 제공하면서, 분비된 항체의 발현을 상당히 증진시킴을 지적한다.
도 28C는 IL8 결합에 대한 ELISA의 결과를 보여준다. 96-웰 플레이트는 재조합 정제된 사람 IL8로 피복하고 단독의 항-IL8 항체를 안정적으로 발현하거나(막대 그래프 2) 항-IL8 항체와 BSC1-단백질 A 융합 단백질을 동시 발현하는(막대 그래프 3) 배양물의 배지로 분비되는 항-IL8 항체(표적 단백질)로 항온처리하였다. 세포 배양 배지를 음성 대조군(막대 그래프 1, 항-IL8 항체 없음)으로서 사용하였다. 상기 일련의 실험 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질과 동시 발현되는 경우 증진된 수준으로 발현되는 분비된 항-IL8 항체가 IL8에 대한 이의 결합 활성을 보유하고 있음을 명백히 보여준다.
상기 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질이 비변형된 정렬에서 확립된 생산 세포주에서 이미 안정적으로 발현된 표적 단백질의 생산 수준을 상당히 증진시키기 위해 사용될 수 있음을 지적한다.
실시예 21. 분비된 알파-1 항트립신 Z 단백질의 발현 증진
본 실험은 본 발명에 따른 단백질 발현의 증진이 중요한 단백질의 부적절한 입체배좌로부터 비롯되는 질환을 치료하기 위한 잠재력을 가짐을 지적한다.
알파1 항트립신(AAT) 결핍증은 남성 및 여성 둘 다에 영향을 미치는 상염색체 유전학적 장애이다. AAT는 간에서 주로 생성되는 52-kDa 세린 프로테아제 억제제이다. 90개 이상의 유전학적 변이체가 AAT 결핍증과 관련된 염색체 14 상의 프로테아제 억제제 1(PI) 유전자에서 동정되었다. AAT 결핍증의 가장 공통된 기본은 코돈 342(Glu342Lys)에서 Glu를 Lys로 변화시키는 단일 염기쌍 치환인 Z 돌연변이이다. Z 돌연변이(AATZ 단백질)를 갖는 돌연변이체 AAT 단백질은 야생형 AAT 단백질의 세린 프로테아제 활성의 대략 80%를 보유한다. AATZ 단백질은 또한 정상적인 입체배좌를 확립하도록 폴딩될 수 없어 결과적으로 소포체(ER)내에서 응집물로 응집한다. 간 세포에서 응집된 AATZ의 응집은 간 독성 및 간 경화를 유발한다.
이러한 실험을 위해, 표적 단백질은 가공된 AAT-Fc 융합 단백질 및 가공된 V5 태그된 α1ATZ-Fc 융합 단백질이다. AAT-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 상기 실시예 4.3에 기재된 바와 같이 동일하다. AATZ-Fc 융합 단백질에 대한 아미노산 서열은 하기 표에 나타낸다.
도 29A는 V5 태그된 AAT- 및 AATZ-Fc 융합 단백질의 발현을 검출하기 위해 항-V5 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석의 화학발광 신호에 대한 이미지를 보여준다. 도 29A의 상부 패널에서 레인 1은 대조군으로서 비-발현 세포 배양 배지를 보여준다. 상부 패널의 레인 2는 단독의 AAT-Fc를 발현하는 세포의 배양 배지를 보여준다. 야생형 AAT 단백질에 대해 예상된 바와 같이, AAT-Fc 융합체는 배양 배지로 분비되었다. 도 29A의 상부 패널의 레인 3은 AATZ-Fc 단백질이 단독의 AATZ-Fc 융합 단백질을 발현하는 형질감염된 세포의 배양 배지로 거의 분비되지 않음을 보여준다. 소포체에 보유되는 것으로 공지된 AATZ 단백질에 대해 예상된 바와 같이, AATZ-Fc 융합 단백질은 단독의 AATZ-Fc 단백질을 발현하는 세포의 세포 용해물에서 검출되었다. 중앙 패널(세포 용해물)의 레인 3을 참조한다. 놀랍게도, 도 29A의 상부 패널의 레인 4에 보여지는 바와 같이, AATZ-Fc 단백질 및 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현은 배양 배지로 분비된 AATZ-Fc 단백질의 발현 수준에 있어서 급격한 증가를 유도하였다. 더욱이, AATZ-Fc 융합 단백질은 세포 용해물(레인 4, 도 29A의 중앙 패널)에서 거의 검출되지 않았다. 동일한 막은 로딩 대조군을 위해 항-튜불린 항체로 블롯팅하였다.
상기 결과는 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 동시 발현이 BSC1-단백질 A 융합 단백질의 부재 하에 표적 단백질의 발현 수준과 비교하여 배양 배지로 분비되는 AATZ-Fc 표적 단백질의 발현 수준을 상당히 상승시킴을 명백히 보여준다. 더욱이, AATZ-Fc 단백질은 세포 용해물에서 거의 검출되지 않았고, 이것은 AATZ-Fc 단백질이 소포체내에 보유되지 않음을 지적한다. 따라서, 이들 데이터는 처음으로 본 발명의 AATZ-결합 도메인 및 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공하는 유전자 치료요법이 개체의 세포로부터 분비된 AATZ 단백질의 발현을 증진시킴에 의해 소포체내 AATZ의 체류로 인한 간독성을 제거하거나 감소시키고 개체에 대한 요구되는 수준의 세포외 AAT 세린 프로테아제 활성을 복구시켜 Z 돌연변이로 인한 AAT 결핍증에 대해 개체를 치료하는데 효과적임을 시사한다.
상기에 인용된 모든 특허, 출원 및 공보는 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 기재된 본 발명의 변화 및 실시형태에 대해 본 발명의 기재 또는 하기 특허청구범위로부터 벗어나는 것 없이 당업자에게 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> STRATEGIA THERAPEUTICS, INC.
<120> PROTEIN EXPRESSION ENHANCING POLYPEPTIDES
<130> BSC-102.1PCT
<150> US 61/733,743
<151> 2012-12-05
<150> US 61/733,884
<151> 2012-12-05
<160> 329
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile Ala Glu
35 40 45
Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Leu Asn Phe Tyr Gln Phe Leu Gly Val Gln Gln Asp Ala Ser Ser Ala
1 5 10 15
Asp Ile Arg Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ser Leu Thr Leu His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Lys Asp Glu Asn Ala Glu Thr Gln Phe Arg Gln Leu Val Ala
35 40 45
Ile Tyr Glu Val Leu Lys Asp Asp Glu Arg
50 55
<210> 3
<211> 55
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Tyr Asn Pro Tyr Glu Val Leu Asn Leu Asp Pro Gly Ala Thr Val Ala
1 5 10 15
Glu Ile Lys Lys Gln Tyr Arg Leu Leu Ser Leu Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Gly Gly Asp Glu Val Met Phe Met Arg Ile Ala Lys Ala Tyr Ala
35 40 45
Ala Leu Thr Asp Glu Glu Ser
50 55
<210> 4
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys
1 5 10 15
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp
20 25 30
Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly
35 40 45
Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Lys Ser Tyr Tyr Asp Ile Leu Gly Val Pro Lys Ser Ala Ser Glu Arg
1 5 10 15
Gln Ile Lys Lys Ala Phe His Lys Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Lys Ser Pro Asp Ala Glu Ala Lys Phe Arg Glu Ile Ala Glu
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Ala Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Ala Asn Arg
50 55
<210> 6
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Asp Phe Tyr Ser Leu Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Glu Ile Arg Gln Ala Phe Lys Lys Leu Ala Leu Lys Leu His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asn Asn Pro Asn Ala His Gly Asp Phe Leu Lys Ile Asn
35 40 45
Arg Ala Tyr Glu Val Leu Lys Asp Glu Asp Leu
50 55
<210> 7
<211> 62
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Arg Asp Tyr Tyr Lys Ile Leu Gly Val Lys Arg Asn Ala Lys Lys Gln
1 5 10 15
Glu Ile Ile Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Trp His Pro Asp
20 25 30
Asn Phe Gln Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Ala Glu Lys Lys Phe Ile
35 40 45
Asp Ile Ala Ala Ala Lys Glu Val Leu Ser Asp Pro Glu Met
50 55 60
<210> 8
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Glu Ser Leu Tyr His Val Leu Gly Leu Asp Lys Asn Ala Thr Ser Asp
1 5 10 15
Asp Ile Lys Lys Ser Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asp Asn Pro Glu Ala Ala Asp Lys Phe Lys Glu Ile Asn
35 40 45
Asn Ala His Ala Ile Leu Thr Asp Ala Thr Lys
50 55
<210> 9
<211> 57
<212> PRT
<213> Simian virus 40
<400> 9
Leu Gln Leu Met Asp Leu Leu Gly Leu Glu Arg Ser Ala Trp Gly Asn
1 5 10 15
Ile Pro Leu Met Arg Lys Ala Tyr Leu Lys Lys Cys Lys Glu Phe His
20 25 30
Pro Asp Lys Gly Gly Asp Glu Glu Lys Met Lys Lys Met Asn Thr Leu
35 40 45
Tyr Lys Lys Met Glu Asp Gly Val Lys
50 55
<210> 10
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu Arg
1 5 10 15
Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Arg Asn Gln Gly Asp Lys Glu Ala Glu Ala Lys Phe Lys Glu Ile Lys
35 40 45
Glu Ala Tyr Glu Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys
50 55
<210> 11
<211> 68
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Asn Pro Phe Glu Val Leu Gln Ile Asp Pro Glu Val Thr Asp Glu Glu
1 5 10 15
Ile Lys Lys Arg Phe Arg Gln Leu Ser Ile Leu Val His Pro Asp Lys
20 25 30
Asn Gln Asp Asp Ala Asp Arg Ala Gln Lys Ala Phe Glu Ala Val Asp
35 40 45
Lys Ala Tyr Lys Leu Leu Leu Asp Gln Glu Gln Lys Lys Arg Ala Leu
50 55 60
Asp Val Ile Gln
65
<210> 12
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Glu Ala Leu Tyr Glu Ile Leu Gly Leu His Lys Gly Ala Ser Asn Glu
1 5 10 15
Glu Ile Lys Lys Thr Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys His His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asp Asp Pro Ala Ala Thr Glu Lys Phe Lys Glu Ile Asn
35 40 45
Asn Ala His Ala Ile Leu Thr Asp Ile Ser Lys
50 55
<210> 13
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Leu Asn Pro Phe His Val Leu Gly Val Glu Ala Thr Ala Ser Asp Val
1 5 10 15
Glu Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Gln Leu Ala Val Met Val His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn His His Pro Arg Ala Glu Glu Ala Phe Lys Val Leu Arg Ala
35 40 45
Ala Trp Asp Ile Val Ser Asn Ala Glu Lys
50 55
<210> 14
<211> 69
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Arg Asp Cys Tyr Glu Val Leu Gly Val Ser Arg Ser Ala Gly Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ile Ala Arg Ala Tyr Arg Gln Leu Ala Arg Arg Tyr His Pro Asp
20 25 30
Arg Tyr Arg Pro Gln Pro Gly Asp Glu Gly Pro Gly Arg Thr Pro Gln
35 40 45
Ser Ala Glu Glu Ala Phe Leu Leu Val Ala Thr Ala Tyr Glu Thr Leu
50 55 60
Lys Asp Glu Glu Thr
65
<210> 15
<211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Ser Tyr Tyr Glu Ile Leu Asp Val Pro Arg Ser Ala Ser Ala Asp
1 5 10 15
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Arg Lys Ala Leu Gln Trp His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asp Asn Lys Glu Phe Ala Glu Lys Lys Phe Lys Glu Val
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Lys His Lys
50 55 60
<210> 16
<211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Ala Ser Tyr Tyr Glu Ile Leu Asp Val Pro Arg Ser Ala Ser Ala Asp
1 5 10 15
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Arg Lys Ala Leu Gln Trp His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asp Asn Lys Glu Phe Ala Glu Lys Lys Phe Lys Glu Val
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Lys His Lys
50 55 60
<210> 17
<211> 56
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Thr Thr Tyr Tyr Asp Val Leu Gly Val Lys Pro Asn Ala Thr Gln Glu
1 5 10 15
Glu Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asn Glu Gly Glu Lys Phe Lys Gln Ile Ser Gln Ala Tyr
35 40 45
Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys
50 55
<210> 18
<211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ala Ser Tyr Tyr Glu Ile Leu Asp Val Pro Arg Ser Ala Ser Ala Asp
1 5 10 15
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Arg Lys Ala Leu Gln Trp His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asp Asn Lys Glu Phe Ala Glu Lys Lys Phe Lys Glu Val
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Lys His Lys
50 55 60
<210> 19
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Lys Asp Ser Trp Asp Met Leu Gly Val Lys Pro Gly Ala Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Val Asn Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Val Leu Leu His Pro Asp
20 25 30
Lys Cys Val Ala Pro Gly Ser Glu Asp Ala Phe Lys Ala Val Val Asn
35 40 45
Ala Arg Thr Ala Leu Leu Lys Asn Ile Lys
50 55
<210> 20
<211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Val Asp Tyr Tyr Glu Val Leu Asp Val Pro Arg Gln Ala Ser Ser Glu
1 5 10 15
Ala Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Trp His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Glu Asn Lys Glu Glu Ala Glu Arg Arg Phe Lys Gln Val
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys
50 55 60
<210> 21
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Gly Asp Tyr Tyr Gln Ile Leu Gly Val Pro Arg Asn Ala Ser Gln Lys
1 5 10 15
Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Tyr Gln Leu Ala Lys Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Thr Asn Lys Asp Asp Pro Lys Ala Lys Glu Lys Phe Ser Gln Leu Ala
35 40 45
Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Glu Val Lys
50 55
<210> 22
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Gly Ser Tyr Tyr Asp Ile Leu Gly Val Pro Lys Ser Ala Ser Glu Arg
1 5 10 15
Gln Ile Lys Lys Ala Phe His Lys Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Lys Ser Pro Asp Ala Glu Ala Lys Phe Arg Glu Ile Ala Glu
35 40 45
Ala Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Ala Asn Arg
50 55
<210> 23
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Gly Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Arg Gly Ala Ser Asp Glu
1 5 10 15
Asp Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Leu Lys Phe His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn His Ala Pro Gly Ala Thr Glu Ala Phe Lys Ala Ile Gly Thr
35 40 45
Ala Tyr Ala Val Leu Ser Asn Pro Glu Lys
50 55
<210> 24
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Lys Glu Pro Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile Ala Glu
35 40 45
Ala Tyr Asp Val Leu Ser Asp Pro Arg Lys
50 55
<210> 25
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Thr Ala Leu Tyr Asp Leu Leu Gly Val Pro Ser Thr Ala Thr Gln Ala
1 5 10 15
Gln Ile Lys Ala Ala Tyr Tyr Arg Gln Cys Phe Leu Tyr His Pro Asp
20 25 30
Arg Asn Ser Gly Ser Ala Glu Ala Ala Glu Arg Phe Thr Arg Ile Ser
35 40 45
Gln Ala Tyr Val Val Leu Gly Ser Ala Thr Leu
50 55
<210> 26
<211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Ala Asn Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Val Gln Ala Ser Ala Ser Pro Glu
1 5 10 15
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Arg Trp His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asp Asn Lys Glu Glu Ala Glu Lys Lys Phe Lys Leu Val
35 40 45
Ser Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Lys Lys
50 55 60
<210> 27
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Glu Asp Tyr Tyr Thr Leu Leu Gly Cys Asp Glu Leu Ser Ser Val Glu
1 5 10 15
Gln Ile Leu Ala Glu Phe Lys Val Arg Ala Leu Glu Cys His Pro Asp
20 25 30
Lys His Pro Glu Asn Pro Lys Ala Val Glu Thr Phe Gln Lys Leu Gln
35 40 45
Lys Ala Lys Glu Ile Leu Thr Asn Glu Glu Ser
50 55
<210> 28
<211> 57
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Ser Ile Leu Lys Glu Val Thr Ser Val Val Glu Gln Ala Trp Lys Leu
1 5 10 15
Pro Glu Ser Glu Arg Lys Lys Ile Ile Arg Arg Leu Tyr Leu Lys Trp
20 25 30
His Pro Asp Lys Asn Pro Glu Asn His Asp Ile Ala Asn Glu Val Phe
35 40 45
Lys His Leu Gln Asn Glu Ile Asn Arg
50 55
<210> 29
<211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Val Asp Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Val Gln Arg His Ala Ser Pro Glu
1 5 10 15
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Trp His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Glu Asn Lys Glu Glu Ala Glu Arg Lys Phe Lys Gln Val
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys
50 55 60
<210> 30
<211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Val Asp Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Val Gln Arg His Ala Ser Pro Glu
1 5 10 15
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Trp His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Glu Asn Lys Glu Glu Ala Glu Arg Lys Phe Lys Gln Val
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys
50 55 60
<210> 31
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Lys Ser Tyr Tyr Asp Ile Leu Gly Val Pro Lys Ser Ala Ser Glu Arg
1 5 10 15
Gln Ile Lys Lys Ala Phe His Lys Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Lys Ser Pro Asp Ala Glu Ala Lys Phe Arg Glu Ile Ala Glu
35 40 45
Ala Tyr Glu Thr Leu Ser Asp Ala Asn Arg
50 55
<210> 32
<211> 60
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Leu Asn Pro Phe Glu Val Leu Gln Ile Asp Pro Glu Val Thr Asp Glu
1 5 10 15
Glu Ile Lys Lys Arg Phe Arg Gln Leu Ser Ile Leu Val His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Gln Asp Asp Ala Asp Arg Ala Gln Lys Ala Phe Glu Ala Val
35 40 45
Asp Lys Ala Tyr Lys Leu Leu Leu Asp Gln Glu Gln
50 55 60
<210> 33
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Asp Asp Ala Tyr Glu Val Leu Asn Leu Pro Gln Gly Gln Gly Pro His
1 5 10 15
Asp Glu Ser Lys Ile Arg Lys Ala Tyr Phe Arg Leu Ala Gln Lys Tyr
20 25 30
His Pro Asp Lys Asn Pro Glu Gly Arg Asp Met Phe Glu Lys Val Asn
35 40 45
Lys Ala Tyr Glu Phe Leu Cys Thr Lys Ser Ala
50 55
<210> 34
<211> 35
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Arg Glu Ala Ala Leu Ile Leu Gly Val Ser Pro Thr Ala Asn Lys Gly
1 5 10 15
Lys Ile Arg Asp Ala His Arg Arg Ile Met Leu Leu Asn His Pro Asp
20 25 30
Lys Gly Lys
35
<210> 35
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Glu Ser Leu Tyr His Val Leu Gly Leu Asp Lys Asn Ala Thr Ser Asp
1 5 10 15
Asp Ile Lys Lys Ser Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asp Asn Pro Glu Ala Ala Asp Lys Phe Lys Glu Ile Asn
35 40 45
Asn Ala His Ala Ile Leu Thr Asp Ala Thr Lys
50 55
<210> 36
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Ser Thr Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Val His Pro Gly Ala Ser Thr Glu
1 5 10 15
Glu Val Lys Arg Ala Phe Phe Ser Lys Ser Lys Glu Leu His Pro Asp
20 25 30
Arg Asp Pro Gly Asn Pro Ser Leu His Ser Arg Phe Val Glu Leu Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Arg Val Leu Ser Arg Glu Gln Ser
50 55
<210> 37
<211> 65
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Lys Asp Trp Tyr Ser Ile Leu Gly Ala Asp Pro Ser Ala Asn Ile Ser
1 5 10 15
Asp Leu Lys Gln Lys Tyr Gln Lys Leu Ile Leu Met Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Gln Ser Thr Asp Val Pro Ala Gly Thr Val Glu Glu Cys Val Gln
35 40 45
Lys Phe Ile Glu Ile Asp Gln Ala Trp Lys Ile Leu Gly Asn Glu Glu
50 55 60
Thr
65
<210> 38
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Asp Leu Tyr Ala Leu Leu Gly Ile Glu Glu Lys Ala Ala Asp Lys
1 5 10 15
Glu Val Lys Lys Ala Tyr Arg Gln Lys Ala Leu Ser Cys His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asp Asn Pro Arg Ala Ala Glu Leu Phe His Gln Leu Ser
35 40 45
Gln Ala Leu Glu Val Leu Thr Asp Ala Ala Ala
50 55
<210> 39
<211> 58
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Lys Ser Tyr Tyr Asp Ile Leu Gly Val Pro Lys Ser Ala Ser Glu Arg
1 5 10 15
Gln Ile Lys Lys Ala Phe His Lys Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Lys Ser Pro Asp Ala Glu Ala Lys Phe Arg Glu Ile Ala Glu
35 40 45
Gly Ala Ser Val Pro Ala Ala Ser Ser Phe
50 55
<210> 40
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Ser Thr Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Val His Pro Gly Ala Ser Thr Glu
1 5 10 15
Glu Val Lys Arg Ala Phe Phe Ser Lys Ser Lys Glu Leu His Pro Asp
20 25 30
Arg Asp Pro Gly Asn Pro Ser Leu His Ser Arg Phe Val Glu Leu Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Arg Val Leu Ser Arg Glu Gln Ser
50 55
<210> 41
<211> 59
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Ser Thr Tyr Tyr Glu Leu Leu Gly Val His Pro Gly Ala Ser Thr Glu
1 5 10 15
Glu Val Lys Arg Ala Phe Phe Ser Lys Ser Lys Glu Leu His Pro Asp
20 25 30
Arg Asp Pro Gly Asn Pro Ser Leu His Ser Arg Phe Val Glu Leu Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Arg Val Leu Ser Arg Glu Gln Ser
50 55
<210> 42
<211> 62
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Glu Asp Tyr Tyr Ser Leu Leu Asn Val Arg Arg Glu Ala Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Arg Leu Cys Met Leu Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys His Arg Asp Pro Glu Leu Lys Ser Gln Ala Glu Arg Leu Phe Asn
35 40 45
Leu Val His Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Pro Gln Thr
50 55 60
<210> 43
<211> 65
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Lys Asp Trp Tyr Ser Ile Leu Gly Ala Asp Pro Ser Ala Asn Ile Ser
1 5 10 15
Asp Leu Lys Gln Lys Tyr Gln Lys Leu Ile Leu Met Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Gln Ser Thr Asp Val Pro Ala Gly Thr Val Glu Glu Cys Val Gln
35 40 45
Lys Phe Ile Glu Ile Asp Gln Ala Trp Lys Ile Leu Gly Asn Glu Glu
50 55 60
Thr
65
<210> 44
<211> 66
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Arg Asp Tyr Phe Ser Leu Met Asp Cys Asn Arg Ser Phe Arg Val Asp
1 5 10 15
Thr Ala Lys Leu Gln His Arg Tyr Gln Gln Leu Gln Arg Leu Val His
20 25 30
Pro Asp Phe Phe Ser Gln Arg Ser Gln Thr Glu Lys Asp Phe Ser Glu
35 40 45
Lys His Ser Thr Leu Val Asn Asp Ala Tyr Lys Thr Leu Leu Ala Pro
50 55 60
Leu Ser
65
<210> 45
<211> 69
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Arg Asp Cys Tyr Glu Val Leu Gly Val Ser Arg Ser Ala Gly Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ile Ala Arg Ala Tyr Arg Gln Leu Ala Arg Arg Tyr His Pro Asp
20 25 30
Arg Tyr Arg Pro Gln Pro Gly Asp Glu Gly Pro Gly Arg Thr Pro Gln
35 40 45
Ser Ala Glu Glu Ala Phe Leu Leu Val Ala Thr Ala Tyr Glu Thr Leu
50 55 60
Lys Asp Glu Glu Thr
65
<210> 46
<211> 49
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Thr Thr Tyr Tyr Asp Val Leu Gly Val Lys Pro Asn Ala Thr Gln Glu
1 5 10 15
Glu Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr His Pro Asp
20 25 30
Lys Asn Pro Asn Glu Gly Glu Lys Val Lys Met Leu Tyr Ile Ser Ser
35 40 45
Gln
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ile, Leu, Val, Ala or Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(3)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Any amino acid or absent
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Tyr, Trp or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(9)
<223> Any amino acid or absent
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 47
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 48
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 49
Ile Lys Lys Ala Tyr Lys Leu Ala Leu Gln
1 5 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 50
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Leu Ala Leu Gln
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 51
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Ala Leu Gln
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 52
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Gln
1 5 10
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 53
Ile Lys Lys Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 54
Ile Lys Lys Ala Tyr Lys Leu Ala
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 55
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Leu Ala
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 56
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Ala
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 57
Leu Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 58
Val Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 59
Met Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 60
Ala Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 61
Ile Ala Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 62
Ile Lys Ala Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 63
Ile Lys Lys Arg Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 64
Ile Lys Lys Ser Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 65
Ile Lys Lys Gln Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 66
Ile Lys Lys Glu Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 67
Ile Lys Lys Phe Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 68
Ile Lys Lys Cys Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 69
Ile Lys Lys Ala Phe Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 70
Ile Lys Lys Ala Trp Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 71
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Gln Ala
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 72
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Met Ala
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 73
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Ile Ala
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 74
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Ala Ala
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 75
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Val Ala
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 76
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Arg Ala
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 77
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Met
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 78
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ile
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 79
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Val
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 80
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Cys
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 81
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ser
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 82
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Tyr
1 5
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 83
Ile Arg Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ser Leu Thr Leu
1 5 10
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 84
Ile Lys Lys Gln Tyr Arg Leu Leu Ser Leu Lys Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 85
Ile Lys Lys Ala Phe His Lys Leu Ala Met Lys Tyr
1 5 10
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 86
Ile Arg Gln Ala Phe Lys Lys Leu Ala Leu Lys Leu
1 5 10
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 87
Ile Ile Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Trp
1 5 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 88
Ile Ala Arg Ala Tyr Arg Gln Leu Ala Arg Arg Tyr
1 5 10
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 89
Ile Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 90
Ile Lys Lys Ser Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr
1 5 10
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 91
Ile Lys Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr
1 5 10
<210> 92
<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 92
Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro
20 25 30
Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu
35 40 45
Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys Arg
50 55 60
<210> 93
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 93
Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala
1 5 10 15
Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp
20 25 30
Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val
35 40 45
Leu Ser Asp Ser Glu Lys Arg
50 55
<210> 94
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 94
Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys
20 25 30
Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys
35 40 45
Arg
<210> 95
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 95
Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro
20 25 30
Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu
35 40 45
Gly
<210> 96
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 96
Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala
1 5 10 15
Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp
20 25 30
Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly
35 40
<210> 97
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 97
Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys
20 25 30
Phe Gln Asp Leu Gly
35
<210> 98
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 98
Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro
1 5 10 15
Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly
20 25
<210> 99
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 99
Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro
1 5 10 15
Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr
20 25 30
Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys Arg
35 40
<210> 100
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 100
Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
1 5 10 15
Lys Phe Gln Asp Leu Gly
20
<210> 101
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 101
Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
1 5 10 15
Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu
20 25 30
Lys Arg
<210> 102
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 102
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His
1 5 10 15
Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp
20 25 30
Leu Gly
<210> 103
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 103
Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
20 25 30
<210> 104
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 104
Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gln Leu His Pro Asp Arg Asn
20
<210> 105
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 105
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His
1 5 10 15
Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
20 25
<210> 106
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 106
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His
1 5 10 15
Pro Asp Arg Asn
20
<210> 107
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 107
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp
1 5 10 15
Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
20 25
<210> 108
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 108
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His
1 5 10 15
Pro Asp
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 109
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu
1 5 10 15
<210> 110
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 110
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 111
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 112
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 112
His His His His His His
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 113
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 114
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 115
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
<210> 116
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 116
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp
1 5 10
<210> 117
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 117
Asp Ile Ala Ala Ala
1 5
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 118
Asp Ile Ala Ala Ala Leu Glu
1 5
<210> 119
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 119
Gly Thr Gly Ser Glu Phe
1 5
<210> 120
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 120
Ala Ser Thr Lys
1
<210> 121
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 121
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 122
Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 123
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 123
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg
1 5 10 15
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 124
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg
1 5 10 15
Val
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 125
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1 5
<210> 126
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 126
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly
1 5 10
<210> 127
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 127
Ser Ala Lys Thr Thr Pro
1 5
<210> 128
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 128
Arg Ala Asp Ala Ala Pro
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 129
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
1 5
<210> 130
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 130
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser
1 5 10
<210> 131
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 131
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 132
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 132
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala
1 5 10 15
Arg Val
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 133
Ala Asp Ala Ala Pro
1 5
<210> 134
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 134
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 135
Thr Val Ala Ala Pro
1 5
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 136
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 137
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 137
Gln Pro Lys Ala Ala Pro
1 5
<210> 138
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 138
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro
1 5 10
<210> 139
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 139
Ala Lys Thr Thr Pro Pro
1 5
<210> 140
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 140
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 141
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 141
Ala Lys Thr Thr Ala Pro
1 5
<210> 142
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 142
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 143
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 143
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1 5
<210> 144
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 144
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 145
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 145
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 146
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 146
Gly Glu Asn Lys Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Met Ala Leu Ser
1 5 10 15
<210> 147
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 147
Gly Pro Ala Lys Glu Leu Thr Pro Leu Lys Glu Ala Lys Val Ser
1 5 10 15
<210> 148
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 148
Gly His Glu Ala Ala Ala Val Met Gln Val Gln Tyr Pro Ala Ser
1 5 10 15
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 149
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro
1 5
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<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 150
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 151
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 152
Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 153
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro
1 5
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<400> 154
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 155
Pro Thr Ile Ser Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 156
Thr Val Ala Ala Asp Asp Asp Asp Lys Ser Val Phe Ile Val Pro Pro
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<210> 157
<211> 10
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 157
Thr Val Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Pro
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 158
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Ala Pro
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<211> 8
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 159
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 160
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
1 5 10
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<211> 7
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 161
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 162
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 163
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 164
Ala Ser Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 165
Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Pro
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 166
Ala Ser Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 167
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 167
Thr Val Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 168
Ala Ser Thr Leu Val Pro Arg Gly Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 169
Thr Val Ala Ala Asp Asp Asp Lys Ser Val Phe Ile Val Pro Pro
1 5 10 15
<210> 170
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 170
Ala Ser Thr Asp Asp Asp Lys Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 171
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 171
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 172
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 172
Thr Val Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 173
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 173
Ala Ser Thr Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 174
Pro Ala Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5 10
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 175
Thr Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Pro
1 5 10
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 176
Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala
1 5
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 177
Pro Gly Pro Phe Gly Arg Ser Ala Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 178
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 178
Pro Gly Pro Phe Gly Arg Ser Ala Gly Gly
1 5 10
<210> 179
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 179
Pro Gln Arg Gly Arg Ser Ala Gly
1 5
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 180
Pro His Tyr Gly Arg Ser Gly Gly
1 5
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 181
Gly Pro Phe Gly Arg Ser Ala Gly Pro
1 5
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 182
Gly Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Pro
1 5
<210> 183
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 183
Ala Gly Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 184
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 184
Gly Gly Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 185
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 185
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 186
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 186
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
<210> 187
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 187
agcttggtac cggatccgaa ttcgatatcg cggccgctct cgagtctaga gggcc 55
<210> 188
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 188
ctctagactc gagagcggcc gcgatatcga attcggatcc ggtacca 47
<210> 189
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 189
atgggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacg 45
<210> 190
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 190
gattacaagg atgacgatga caag 24
<210> 191
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 191
ggaggcggaa gtggtgggag cggtggaagc ggaggc 36
<210> 192
<211> 419
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 192
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
85 90 95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
100 105 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
115 120 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
130 135 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
210 215 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
275 280 285
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
290 295 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305 310 315 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
325 330 335
Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu
340 345 350
Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr
355 360 365
Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr Gly Thr Gly Ser
370 375 380
Glu Phe Asp Ile Ala Ala Ala Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro
385 390 395 400
Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser
405 410 415
Pro Lys Cys
<210> 193
<211> 501
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 193
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
85 90 95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
100 105 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
115 120 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
130 135 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
210 215 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
275 280 285
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
290 295 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305 310 315 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
325 330 335
Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu
340 345 350
Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr
355 360 365
Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr Gly Thr Gly Ser
370 375 380
Glu Phe His Pro Gly Val Leu Lys Val Glu Ala Ile Leu Glu Lys Val
385 390 395 400
Gln Gly Leu Glu Gln Ala Val Asp Asn Phe Glu Gly Lys Lys Thr Asp
405 410 415
Lys Lys Tyr Leu Met Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Lys Glu Leu Leu Ala
420 425 430
Leu Asp Ser Val Asp Pro Glu Gly Arg Ala Asp Val Arg Gln Ala Arg
435 440 445
Arg Asp Gly Val Arg Lys Val Gln Thr Ile Leu Glu Lys Leu Glu Gln
450 455 460
Lys Ala Ile Asp Asp Ile Ala Ala Ala Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro
465 470 475 480
Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile
485 490 495
Val Ser Pro Lys Cys
500
<210> 194
<211> 503
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 194
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
85 90 95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
100 105 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
115 120 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
130 135 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
210 215 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
275 280 285
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
290 295 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305 310 315 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
325 330 335
Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu
340 345 350
Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr
355 360 365
Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr Gly Thr Gly Ser
370 375 380
Glu Phe Glu Ser Thr Pro Pro Ser Ile Lys Lys Ile Ile His Val Leu
385 390 395 400
Glu Lys Val Gln Tyr Leu Glu Gln Glu Val Glu Glu Phe Val Gly Lys
405 410 415
Lys Thr Asp Lys Ala Tyr Trp Leu Leu Glu Glu Met Leu Thr Lys Glu
420 425 430
Leu Leu Glu Leu Asp Ser Val Glu Thr Gly Gly Gln Asp Ser Val Arg
435 440 445
Gln Ala Arg Lys Glu Ala Val Cys Lys Ile Gln Ala Ile Leu Glu Lys
450 455 460
Leu Glu Lys Lys Gly Leu Asp Ile Ala Ala Ala Leu Glu Gly Lys Pro
465 470 475 480
Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Arg Gly Pro Tyr
485 490 495
Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
500
<210> 195
<211> 502
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 195
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
85 90 95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
100 105 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
115 120 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
130 135 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
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210 215 220
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Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
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Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
275 280 285
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 201
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 202
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<210> 203
<211> 457
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 203
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305 310 315 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
325 330 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly
355 360 365
Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile
370 375 380
Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu
385 390 395 400
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405 410 415
Gln Lys Gly Thr Gly Ser Glu Phe Asp Ile Ala Ala Ala Leu Glu Gly
420 425 430
Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Arg Gly
435 440 445
Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
450 455
<210> 204
<211> 539
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 204
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1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
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35 40 45
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 205
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245 250 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
325 330 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly
355 360 365
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435 440 445
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 206
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<211> 311
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 207
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
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Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 208
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435 440 445
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465 470
<210> 209
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 209
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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<210> 210
<211> 599
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 210
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
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485 490 495
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565 570 575
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580 585 590
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595
<210> 211
<211> 660
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 211
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
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35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
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210 215 220
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660
<210> 212
<211> 678
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 212
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<210> 213
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 213
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<210> 214
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 214
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435
<210> 215
<211> 516
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 215
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<210> 216
<211> 1506
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 216
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595 600 605
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<211> 1585
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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Ile Pro Ala Val Thr Thr Trp Asn Thr Tyr Leu Arg Tyr Ile Thr Val
945 950 955 960
His Lys Ser Leu Ile Phe Val Leu Ile Trp Cys Leu Val Ile Phe Leu
965 970 975
Ala Glu Val Ala Ala Ser Leu Val Val Leu Trp Leu Leu Gly Asn Thr
980 985 990
Pro Leu Gln Asp Lys Gly Asn Ser Thr His Ser Arg Asn Asn Ser Tyr
995 1000 1005
Ala Val Ile Ile Thr Ser Thr Ser Ser Tyr Tyr Val Phe Tyr Ile
1010 1015 1020
Tyr Val Gly Val Ala Asp Thr Leu Leu Ala Met Gly Phe Phe Arg
1025 1030 1035
Gly Leu Pro Leu Val His Thr Leu Ile Thr Val Ser Lys Ile Leu
1040 1045 1050
His His Lys Met Leu His Ser Val Leu Gln Ala Pro Met Ser Thr
1055 1060 1065
Leu Asn Thr Leu Lys Ala Gly Gly Ile Leu Asn Arg Phe Ser Lys
1070 1075 1080
Asp Ile Ala Ile Leu Asp Asp Leu Leu Pro Leu Thr Ile Phe Asp
1085 1090 1095
Phe Ile Gln Leu Leu Leu Ile Val Ile Gly Ala Ile Ala Val Val
1100 1105 1110
Ala Val Leu Gln Pro Tyr Ile Phe Val Ala Thr Val Pro Val Ile
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Val Ala Phe Ile Met Leu Arg Ala Tyr Phe Leu Gln Thr Ser Gln
1130 1135 1140
Gln Leu Lys Gln Leu Glu Ser Glu Gly Arg Ser Pro Ile Phe Thr
1145 1150 1155
His Leu Val Thr Ser Leu Lys Gly Leu Trp Thr Leu Arg Ala Phe
1160 1165 1170
Gly Arg Gln Pro Tyr Phe Glu Thr Leu Phe His Lys Ala Leu Asn
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Leu His Thr Ala Asn Trp Phe Leu Tyr Leu Ser Thr Leu Arg Trp
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Val Thr Phe Ile Ser Ile Leu Thr Thr Gly Glu Gly Glu Gly Arg
1220 1225 1230
Val Gly Ile Ile Leu Thr Leu Ala Met Asn Ile Met Ser Thr Leu
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Gln Trp Ala Val Asn Ser Ser Ile Asp Val Asp Ser Leu Met Arg
1250 1255 1260
Ser Val Ser Arg Val Phe Lys Phe Ile Asp Met Pro Thr Glu Gly
1265 1270 1275
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1280 1285 1290
Lys Val Met Ile Ile Glu Asn Ser His Val Lys Lys Asp Asp Ile
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Trp Pro Ser Gly Gly Gln Met Thr Val Lys Asp Leu Thr Ala Lys
1310 1315 1320
Tyr Thr Glu Gly Gly Asn Ala Ile Leu Glu Asn Ile Ser Phe Ser
1325 1330 1335
Ile Ser Pro Gly Gln Arg Val Gly Leu Leu Gly Arg Thr Gly Ser
1340 1345 1350
Gly Lys Ser Thr Leu Leu Ser Ala Phe Leu Arg Leu Leu Asn Thr
1355 1360 1365
Glu Gly Glu Ile Gln Ile Asp Gly Val Ser Trp Asp Ser Ile Thr
1370 1375 1380
Leu Gln Gln Trp Arg Lys Ala Phe Gly Val Ile Pro Gln Lys Val
1385 1390 1395
Phe Ile Phe Ser Gly Thr Phe Arg Lys Asn Leu Asp Pro Tyr Glu
1400 1405 1410
Gln Trp Ser Asp Gln Glu Ile Trp Lys Val Ala Asp Glu Val Gly
1415 1420 1425
Leu Arg Ser Val Ile Glu Gln Phe Pro Gly Lys Leu Asp Phe Val
1430 1435 1440
Leu Val Asp Gly Gly Cys Val Leu Ser His Gly His Lys Gln Leu
1445 1450 1455
Met Cys Leu Ala Arg Ser Val Leu Ser Lys Ala Lys Ile Leu Leu
1460 1465 1470
Leu Asp Glu Pro Ser Ala His Leu Asp Pro Val Thr Tyr Gln Ile
1475 1480 1485
Ile Arg Arg Thr Leu Lys Gln Ala Phe Ala Asp Cys Thr Val Ile
1490 1495 1500
Leu Cys Glu His Arg Ile Glu Ala Met Leu Glu Cys Gln Gln Phe
1505 1510 1515
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1520 1525 1530
Lys Leu Leu Asn Glu Arg Ser Leu Phe Arg Gln Ala Ile Ser Pro
1535 1540 1545
Ser Asp Arg Val Lys Leu Phe Pro His Arg Asn Ser Ser Lys Cys
1550 1555 1560
Lys Ser Lys Pro Gln Ile Ala Ala Leu Lys Glu Glu Thr Glu Glu
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Glu Val Gln Asp Thr Arg Leu
1580 1585
<210> 222
<211> 378
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 222
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
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50 55 60
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Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
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210 215 220
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Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
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Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
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Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
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Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
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Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
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Ser Lys Lys Gly Thr Gly Ser Glu Phe Asp Ile Ala Ala Ala Leu Glu
340 345 350
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Arg
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Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
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<211> 174
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 223
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
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20 25 30
Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg
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Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro
50 55 60
Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met
65 70 75 80
Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala
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100 105 110
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Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
165 170
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<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 224
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
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Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
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Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
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65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Gly Pro
100 105 110
Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn
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Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu
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Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu
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Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe Asn Leu Glu
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Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser
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Ile Val Ser Pro Lys Cys
245
<210> 225
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 225
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
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Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
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100 105 110
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145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
210 215 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
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Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
290 295 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305 310 315 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
325 330 335
Ser Lys Lys Gly Thr Gly Ser Glu Phe Asp Ile Ala Ala Ala Leu Glu
340 345 350
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Arg
355 360 365
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Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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405 410 415
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
450 455 460
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
485 490 495
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Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
530 535 540
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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565 570 575
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
580 585 590
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595
<210> 226
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 226
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Gly Thr Gly Ser Glu Phe Asp Ile Ala Ala Ala Ala Asp Asn Lys
20 25 30
Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro
35 40 45
Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ser Gln Ala Pro Lys Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
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Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
100 105 110
<210> 227
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 227
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
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50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
100 105 110
Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn
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Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Leu Glu
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Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser
165 170 175
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180
<210> 228
<211> 194
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 228
Met Gly Val Trp Leu Asn Lys Asp Asp Tyr Ile Arg Asp Leu Lys Arg
1 5 10 15
Ile Ile Leu Cys Phe Leu Ile Val Tyr Met Ala Ile Leu Val Gly Thr
20 25 30
Asp Gln Asp Phe Tyr Ser Leu Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Ser Ser
35 40 45
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Asp Lys Asn Pro Asn Asn Pro Asn Ala His Gly Asp Phe Leu Lys Ile
65 70 75 80
Asn Arg Ala Tyr Glu Val Leu Lys Asp Glu Asp Gly Ser Glu Phe Asp
85 90 95
Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ala Ala
100 105 110
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
115 120 125
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
130 135 140
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala
145 150 155 160
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Leu Glu Gly Asp Tyr Lys
165 170 175
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro
180 185 190
Lys Cys
<210> 229
<211> 471
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 229
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
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Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
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Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
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Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
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Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
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Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Arg
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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435 440 445
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450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 230
<211> 678
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 230
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
20 25 30
Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn
35 40 45
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65 70 75 80
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130 135 140
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Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu
165 170 175
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180 185 190
Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu
195 200 205
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210 215 220
Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val
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245 250 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
450 455 460
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675
<210> 231
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 231
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Gly Thr Gly Ser Glu Phe Asp Ile Ala Ala Ala Val Thr Ile Lys
20 25 30
Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys
35 40 45
Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu
50 55 60
Leu Ala Lys Glu Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala Lys Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu
85 90 95
Glu Pro Lys Glu Glu Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
100 105 110
Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
115 120 125
<210> 232
<211> 197
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 232
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly
100 105 110
Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala
115 120 125
Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Glu Tyr
130 135 140
Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala
145 150 155 160
Lys Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Leu Glu Gly
165 170 175
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile
180 185 190
Val Ser Pro Lys Cys
195
<210> 233
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 233
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Gly Thr Gly Ser Glu Phe Asp Ile Ala Ala Ala Ser Ala Lys Glu
20 25 30
Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys
35 40 45
Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn
50 55 60
Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp
65 70 75 80
Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg
85 90 95
Ala Glu Asn Ser Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
115 120
<210> 234
<211> 196
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 234
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr
100 105 110
Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile
115 120 125
Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser
130 135 140
Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg
145 150 155 160
Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser Leu Glu Gly Asp
165 170 175
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val
180 185 190
Ser Pro Lys Cys
195
<210> 235
<211> 194
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 235
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys
100 105 110
Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val
115 120 125
Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr
130 135 140
Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile
145 150 155 160
Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Leu Glu Gly Asp Tyr Lys
165 170 175
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro
180 185 190
Lys Cys
<210> 236
<211> 276
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 236
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Val
100 105 110
Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu Pro
115 120 125
Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln Thr
130 135 140
Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser Gly
145 150 155 160
Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile Gln
165 170 175
Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg Val
180 185 190
Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys Asp
195 200 205
Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe Lys
210 215 220
Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile Ser
225 230 235 240
His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys Leu Glu Gly Asp
245 250 255
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val
260 265 270
Ser Pro Lys Cys
275
<210> 237
<211> 279
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 237
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Ala Lys Leu Thr Ser Val Pro Thr Trp Cys Pro Pro
100 105 110
His Pro Gly Asp Thr Tyr Leu Leu Thr Cys Arg Gly Thr Ser Thr Ala
115 120 125
Arg Asp Gln Arg Ser Thr Gln Trp Phe Arg Asn Asn Thr Leu Met Arg
130 135 140
Gly Ser Asn Phe Tyr Gly Arg Leu Val Ser Val Thr Pro Asn Ala Thr
145 150 155 160
Ile Ser Asp Arg Tyr Ala Cys Gln Thr Lys Thr Thr Thr Arg Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Asp Phe Arg Val Ser Ser Ser Arg Leu Thr Leu Gln Glu Arg
180 185 190
Cys Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Tyr Ala Asn Asn Thr Arg Val Leu Arg
195 200 205
Cys Tyr Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Arg Asn Val Val Phe His Leu
210 215 220
Asn Gly Thr Ala Val Ile Asn Gly Thr Thr Thr Asn Ile His Thr Phe
225 230 235 240
Val Leu Thr Glu Lys Thr Gly Gly Thr Tyr Phe Cys Ser Ala Phe Leu
245 250 255
Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr
260 265 270
Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
275
<210> 238
<211> 336
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 238
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Leu Val Val Arg Gly Pro Thr Val Ser Leu Val Ser
100 105 110
Asn Ser Phe Val Asp Ala Gly Ala Leu Gly Pro Asp Gly Val Val Glu
115 120 125
Glu Asp Leu Leu Ile Leu Gly Glu Leu Arg Phe Val Gly Asp Gln Val
130 135 140
Pro His Thr Thr Tyr Tyr Asp Gly Val Val Glu Leu Trp His Tyr Pro
145 150 155 160
Met Gly His Lys Cys Pro Arg Val Val His Val Val Thr Val Thr Ala
165 170 175
Cys Pro Arg Arg Pro Ala Val Ala Phe Ala Leu Cys Arg Ala Thr Asp
180 185 190
Ser Thr His Ser Pro Ala Tyr Pro Thr Leu Glu Leu Asn Leu Ala Gln
195 200 205
Gln Pro Leu Leu Arg Val Arg Arg Ala Thr Arg Asp Tyr Ala Gly Val
210 215 220
Tyr Val Leu Arg Val Trp Val Gly Asp Ala Pro Asn Ala Ser Leu Phe
225 230 235 240
Val Leu Gly Met Ala Ile Ala Ala Glu Gly Thr Leu Ala Tyr Asn Gly
245 250 255
Ser Ala His Gly Ser Cys Asp Pro Lys Leu Leu Pro Tyr Ser Ala Pro
260 265 270
Arg Leu Ala Pro Ala Ser Val Tyr Gln Pro Ala Pro Asn Pro Ala Ser
275 280 285
Thr Pro Ser Thr Thr Ile Pro Ala Pro Gln Ala Ser Thr Thr Pro Phe
290 295 300
Pro Thr Gly Asp Pro Lys Pro Gln Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp
305 310 315 320
Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
325 330 335
<210> 239
<211> 503
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 239
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Gly Thr Pro Lys Thr Ser Trp Arg Arg Val Ser Val
100 105 110
Gly Glu Asp Val Ser Leu Leu Pro Ala Pro Gly Pro Thr Gly Arg Gly
115 120 125
Pro Thr Gln Lys Leu Leu Trp Ala Val Glu Pro Leu Asp Gly Cys Gly
130 135 140
Pro Leu His Pro Ser Trp Val Ser Leu Met Pro Pro Lys Gln Val Pro
145 150 155 160
Glu Thr Val Val Asp Ala Ala Cys Met Arg Ala Pro Val Pro Leu Ala
165 170 175
Met Ala Tyr Ala Pro Pro Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gly Leu Arg Thr
180 185 190
Asp Phe Val Trp Gln Glu Arg Ala Ala Val Val Asn Arg Ser Leu Val
195 200 205
Ile His Gly Val Arg Glu Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Val
210 215 220
Gly Asp Ile Lys Asp Pro Ala Arg Gln Val Ala Ser Val Val Leu Val
225 230 235 240
Val Gln Pro Ala Pro Val Pro Thr Pro Pro Pro Thr Pro Ala Asp Tyr
245 250 255
Asp Glu Asp Asp Asn Asp Glu Gly Glu Asp Glu Ser Leu Ala Gly Thr
260 265 270
Pro Ala Ser Gly Thr Pro Arg Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Arg
275 280 285
Ser Trp Pro Ser Ala Pro Glu Val Ser His Val Arg Gly Val Thr Val
290 295 300
Arg Met Glu Thr Pro Glu Ala Ile Leu Phe Ser Pro Gly Glu Thr Phe
305 310 315 320
Ser Thr Asn Val Ser Ile His Ala Ile Ala His Asp Asp Gln Thr Tyr
325 330 335
Ser Met Asp Val Val Trp Leu Arg Phe Asp Val Pro Thr Ser Cys Ala
340 345 350
Glu Met Arg Ile Tyr Glu Ser Cys Leu Tyr His Pro Gln Leu Pro Glu
355 360 365
Cys Leu Ser Pro Ala Asp Ala Pro Cys Ala Ala Ser Thr Trp Thr Ser
370 375 380
Arg Leu Ala Val Arg Ser Tyr Ala Gly Cys Ser Arg Thr Asn Pro Pro
385 390 395 400
Pro Arg Cys Ser Ala Glu Ala His Met Glu Pro Val Pro Gly Leu Ala
405 410 415
Trp Gln Ala Ala Ser Val Asn Leu Glu Phe Arg Asp Ala Ser Pro Gln
420 425 430
His Ser Gly Leu Tyr Leu Cys Val Val Tyr Val Asn Asp His Ile His
435 440 445
Ala Trp Gly His Ile Thr Ile Ser Thr Ala Ala Gln Tyr Arg Asn Ala
450 455 460
Val Val Glu Gln Pro Leu Pro Gln Arg Gly Ala Asp Leu Ala Glu Leu
465 470 475 480
Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr
485 490 495
Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
500
<210> 240
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 240
Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 241
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 241
His Trp Arg Gly Trp Val
1 5
<210> 242
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 242
His Val His Tyr Tyr Trp
1 5
<210> 243
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 243
Tyr Tyr Trp Leu His His
1 5
<210> 244
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 244
His Val His Tyr Tyr
1 5
<210> 245
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 245
Tyr Tyr Trp Leu
1
<210> 246
<211> 137
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 246
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys
100 105 110
Thr Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly
115 120 125
Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
130 135
<210> 247
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 247
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala His Trp Arg Gly Trp Val Leu Glu Gly Asp Tyr Lys
100 105 110
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro
115 120 125
Lys Cys
130
<210> 248
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 248
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala His Val His Tyr Tyr Trp Leu Glu Gly Asp Tyr Lys
100 105 110
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro
115 120 125
Lys Cys
130
<210> 249
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 249
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Trp Leu His His Leu Glu Gly Asp Tyr Lys
100 105 110
Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro
115 120 125
Lys Cys
130
<210> 250
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 250
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala His Val His Tyr Tyr Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp
100 105 110
Asp Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys
115 120 125
Cys
<210> 251
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 251
Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val
20 25 30
Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
35 40 45
Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln
50 55 60
Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp
100 105 110
Asp Asp Lys Gly Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys
115 120 125
<210> 252
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 252
Gly Thr Gly Ser Gly Glu Phe
1 5
<210> 253
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 253
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 254
<211> 58
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 254
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 255
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 255
Leu Glu Gly
1
<210> 256
<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 256
Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro
20 25 30
Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu
35 40 45
Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys Arg
50 55 60
<210> 257
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 257
Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala
1 5 10 15
Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp
20 25 30
Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val
35 40 45
Leu Ser Asp Ser Glu Lys Arg
50 55
<210> 258
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 258
Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys
20 25 30
Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys
35 40 45
Arg
<210> 259
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 259
Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro
20 25 30
Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu
35 40 45
Gly
<210> 260
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 260
Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala
1 5 10 15
Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp
20 25 30
Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly
35 40
<210> 261
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 261
Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys
20 25 30
Phe Gln Asp Leu Gly
35
<210> 262
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 262
Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro
1 5 10 15
Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly
20 25
<210> 263
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 263
Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro
1 5 10 15
Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr
20 25 30
Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys Arg
35 40
<210> 264
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 264
Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
1 5 10 15
Lys Phe Gln Asp Leu Gly
20
<210> 265
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 265
Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
1 5 10 15
Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu
20 25 30
Lys Arg
<210> 266
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 266
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His
1 5 10 15
Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp
20 25 30
Leu Gly
<210> 267
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 267
Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
20 25 30
<210> 268
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 268
Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gln Leu His Pro
20
<210> 269
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 269
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His
1 5 10 15
Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
20 25
<210> 270
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 270
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His
1 5 10 15
Pro Asp Arg Asn
20
<210> 271
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 271
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro Asp
1 5 10 15
Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu
20 25
<210> 272
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 272
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His
1 5 10 15
Pro Asp
<210> 273
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 273
Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu
1 5 10 15
<210> 274
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 274
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu
1 5 10
<210> 275
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 275
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln
1 5 10
<210> 276
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 276
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10
<210> 277
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 277
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5 10
<210> 278
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 278
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
1 5
<210> 279
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 279
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys
1 5
<210> 280
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 280
Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg
1 5
<210> 281
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 281
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu
1 5 10
<210> 282
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 282
Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu
1 5 10
<210> 283
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 283
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln
1 5 10
<210> 284
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 284
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5 10
<210> 285
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 285
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
1 5
<210> 286
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 286
Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln
1 5 10
<210> 287
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 287
Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu
1 5
<210> 288
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 288
Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 289
Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln
1 5
<210> 290
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 290
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys
1 5
<210> 291
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 291
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg
1 5
<210> 292
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 292
Ile Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln
1 5 10
<210> 293
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 293
Ile Lys Lys Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln
1 5 10
<210> 294
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 294
Ile Lys Lys Ala Arg Lys Leu Ala Leu Gln
1 5 10
<210> 295
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 295
Ile Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 296
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 296
Ser Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 297
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 297
Phe Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 298
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 298
Ile Ala Gln Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 299
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 299
Ile Leu Ala Ala Tyr Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 300
Ile Lys Lys Ala His Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 301
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 301
Ile Lys Lys Ala Ile Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 302
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 302
Ile Lys Lys Ala Ala Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 303
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 303
Ile Lys Lys Ala Ser Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 304
Ile Lys Lys Ala Tyr His Gln Leu Ala
1 5
<210> 305
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 305
Ile Lys Lys Ala Tyr Tyr Gln Leu Ala
1 5
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 306
Ile Lys Lys Ala Tyr Phe Ser Leu Ala
1 5
<210> 307
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 307
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Gln Ser
1 5
<210> 308
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 308
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Gln Cys
1 5
<210> 309
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 309
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Asp Ile
1 5
<210> 310
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 310
Met Arg Lys Ala Tyr Leu Lys Lys Cys
1 5
<210> 311
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 311
Ile Leu Ala Glu Phe Lys Val Arg Ala Leu
1 5 10
<210> 312
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 312
Ile Lys Lys Ala Arg Lys Leu Ala
1 5
<210> 313
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 313
Ile Lys Lys Ala Tyr Lys Leu Ala
1 5
<210> 314
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 314
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Leu Ala
1 5
<210> 315
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 315
Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
1 5
<210> 316
<211> 387
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 316
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
85 90 95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
100 105 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
115 120 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
130 135 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
210 215 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
275 280 285
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
290 295 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305 310 315 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
325 330 335
Ser Lys Lys Gly Thr Gly Ser Glu Phe Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys
340 345 350
Leu Ala Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 365
Ala Ala Ala Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
370 375 380
Asp Ser Thr
385
<210> 317
<211> 387
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 317
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
85 90 95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
100 105 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
115 120 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
130 135 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
210 215 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
275 280 285
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
290 295 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305 310 315 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
325 330 335
Ser Lys Lys Gly Thr Gly Ser Glu Phe Ile Ala Gln Ala Tyr Arg Lys
340 345 350
Leu Ala Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 365
Ala Ala Ala Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
370 375 380
Asp Ser Thr
385
<210> 318
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 318
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Gly Thr Gly Ser Gly Glu Phe Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu
20 25 30
Ala Asp Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr
50 55 60
Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe
65 70 75 80
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly
85 90 95
Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Leu Glu Gly Asp
100 105 110
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
115
<210> 319
<211> 715
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 319
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr
20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln
35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe
50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu
65 70 75 80
Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg
85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr
115 120 125
Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His
130 135 140
Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln
145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu
165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu
180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys
195 200 205
Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys
210 215 220
Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly
225 230 235 240
Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp
245 250 255
Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp
260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val
275 280 285
Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala
290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro
305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val
325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala
340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro
450 455 460
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 320
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<210> 321
<211> 710
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 321
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Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
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340 345 350
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435 440 445
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 2600
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 322
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
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Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
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35 40 45
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
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Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
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210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
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Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
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Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
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340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
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Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
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450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
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Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
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Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
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545 550 555 560
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565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
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850 855 860
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Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe
2240 2245 2250
Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys
2255 2260 2265
Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser
2270 2275 2280
Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
2285 2290 2295
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val
2300 2305 2310
Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His
2315 2320 2325
Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu
2330 2335 2340
Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro
2345 2350 2355
Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Arg Pro Lys Ser Cys
2360 2365 2370
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
2375 2380 2385
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
2390 2395 2400
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
2405 2410 2415
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
2420 2425 2430
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
2435 2440 2445
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
2450 2455 2460
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
2465 2470 2475
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
2480 2485 2490
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
2495 2500 2505
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
2510 2515 2520
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
2525 2530 2535
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
2540 2545 2550
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
2555 2560 2565
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
2570 2575 2580
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
2585 2590 2595
Gly Lys
2600
<210> 323
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 323
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr
100 105 110
Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 324
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 324
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Gly Ile
35 40 45
Arg Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg
100 105 110
Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 325
<211> 678
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 325
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
20 25 30
Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn
35 40 45
Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln
50 55 60
Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser
65 70 75 80
Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr
85 90 95
His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro
100 105 110
Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn
115 120 125
Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu
130 135 140
Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys
145 150 155 160
Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu
165 170 175
Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys
180 185 190
Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu
195 200 205
Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val
210 215 220
Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val
225 230 235 240
Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys
245 250 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
260 265 270
Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu
275 280 285
Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp
290 295 300
Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr
305 310 315 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
325 330 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Lys Lys Gly
355 360 365
Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile
370 375 380
Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu
385 390 395 400
Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr
405 410 415
Gln Lys Gly Thr Gly Ser Glu Phe Asp Ile Ala Ala Ala Leu Glu Gly
420 425 430
Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Ser Arg Pro
435 440 445
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
450 455 460
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
465 470 475 480
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
485 490 495
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
500 505 510
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
515 520 525
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
530 535 540
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
545 550 555 560
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
565 570 575
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
580 585 590
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
595 600 605
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
610 615 620
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
625 630 635 640
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
645 650 655
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
660 665 670
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
675
<210> 326
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Ile, Leu, Val, Ala or Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(3)
<223> This region may encompass "Lys Arg," "Lys Lys," "Arg Lys,"
"Arg Arg," "Ala Lys," "Ala Arg," "Lys Ala," "Ile Lys," "Asn
Lys," "Lys Gln," "Arg Gln" or "Arg Asp"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ala, Ser, Thr, Arg, Gln, Glu, Phe, Cys or Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Tyr or Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> This region may encompass "Lys Arg," "Lys Lys," "Arg Lys,"
"Arg Arg," "Arg Gln," "Phe Arg," "Arg Leu," "Lys Leu," "His
Lys," "Leu Lys," "Gln Lys" or "Lys Val"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(9)
<223> This region may encompass "Leu Ala," "Leu Leu," "Ala Leu,"
"Ala Ala," "Leu Cys," "Leu Val," "Gln Ala," "Lys Ala," "Leu
Ser," "Leu Ile," "Leu Tyr" or "Arg Ala"
<220>
<223> See specification as filed for detailed description of
substitutions and preferred embodiments
<400> 326
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 327
<211> 472
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 327
Met Gly Trp Ser Leu Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65 70 75 80
Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145 150 155 160
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
210 215 220
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
225 230 235 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 328
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 328
Met Gly Trp Ser Leu Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 329
<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 329
Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val Pro Arg Ser Ala Ser Ile
1 5 10 15
Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Gln Leu His Pro
20 25 30
Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gln Asp Leu
35 40 45
Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser Glu Lys Arg
50 55 60
Claims (61)
- (a) J 단백질의 단리된 J 도메인;
(b) J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 단편;
(c) J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 유사체(상기 J 도메인 유사체 폴리펩타이드는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다):
[화학식 I]
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (서열번호 47)
(상기 화학식 I에서,
X1은 이소류신(I), 류신(L), 발린(V), 알라닌(A), 또는 메티오닌(M)이고;
X2 및 X3은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 K 또는 R이고;
X4는 임의의 아미노산이거나, X4는, X1 내지 X3이 존재하고 X5 내지 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X5는 티로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F)이고;
X6 및 X7은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이거나; X6 및 X7 중 어느 하나는, 다른 하나가 K 또는 R인 경우 및 X1 내지 X5가 존재하고 X8 및 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X8 및 X9는 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 류신(L) 또는 알라닌(A)이거나; X8 및 X9 중 하나는, 다른 하나가 L 또는 A이고 X1 내지 X7이 존재하는 경우에 부재할 수 있다); 및
(d) IKKAYKLALQ (서열번호 49),
IKKAYRLALQ (서열번호 50),
IKKAYRKALQ (서열번호 51), 또는
IKKAYRKLLQ (서열번호 52)로 이루어진 데카펩타이드 그룹으로부터 선택되는 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드. - 제1항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 J 단백질의 단리된 J 도메인인, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드.
- 제2항에 있어서, 상기 단리된 J 도메인이 Erdj 단백질, SV40의 대형 T 항원, 또는 포유동물 시스테인 스트링 단백질 알파(CSP-α)의 단리된 J 도메인인, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드.
- 제3항에 있어서, 상기 단리된 J 도메인이, Erdj1, Erdj2, Erdj3, Erdj4, Erdj5, Erdj6 및 Erdj7로부터 선택되는 Erdj 단백질의 단리된 J 도메인인, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드.
- 제4항에 있어서, 상기 단리된 J 도메인이 Erdj3의 단리된 J 도메인인, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 J 도메인의 단리된 폴리펩타이드 단편인, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드.
- 제6항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 J 도메인의 단리된 폴리펩타이드 단편인, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드.
I-K-K-A-Y-R-K-L-A (서열번호 48),
I-R-K-A-Y-R-K-L-S-L-T-L (서열번호 83),
I-K-K-Q-Y-R-L-L-S-L-K-Y (서열번호 84),
I-K-K-A-F-H-K-L-A-M-K-Y (서열번호 85),
I-R-Q-A-F-K-K-L-A-L-K-L (서열번호 86),
I-I-K-A-Y-R-K-L-A-L-Q-W (서열번호 87),
I-A-R-A-Y-R-Q-L-A-R-R-Y (서열번호 88),
I-K-R-A-Y-R-R-Q-A-L-R-Y (서열번호 89),
I-K-K-S-Y-R-K-L-A-L-K-Y (서열번호 90), 및
I-K-K-A-Y-K-R-L-A-M-K-Y (서열번호 91). - 제1항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 J 도메인 유사체 폴리펩타이드이고, 상기 폴리펩타이드 유사체가 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드.
- 제8항에 있어서,
X1은 I, L, V, A, 또는 M이고;
디펩타이드 X2-X3은, KR, KK, RK, RR, AK, AR, KA, IK, NK, KQ, RQ, 및 RD로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 A, S, T, R, S, Q, E, F, C, 또는 I이고;
X5는 Y 또는 F이고;
디펩타이드 X6-X7은, KR, KK, RK, RR, RQ, FR, RL, KL, HK, LK, QK, 및 KV로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
디펩타이드 X8-X9는, LA, LL, AL, AA, LC, LV, QA, KA, LS, LI, LY, 및 RA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드. - 제1항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 하기의 아미노산 서열 중 하나를 포함하는, 단백질 발현 증진 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
- 제11항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는, 핵산 벡터 분자.
- 제12항에 따른 핵산 벡터 분자를 포함하는, 숙주 세포.
- 목적하는 표적 단백질에 연결된 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서,
상기 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드는,
(a) J 단백질의 단리된 J 도메인;
(b) J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 단편;
(c) J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 유사체(상기 J 도메인 유사체 폴리펩타이드는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다):
[화학식 I]
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (서열번호 47)
(상기 화학식 I에서,
X1은 이소류신(I), 류신(L), 발린(V), 알라닌(A), 또는 메티오닌(M)이고;
X2 및 X3은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 K 또는 R이고;
X4는 임의의 아미노산이거나, X4는, X1 내지 X3이 존재하고 X5 내지 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X5는 티로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F)이고;
X6 및 X7은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이거나; X6 및 X7 중 어느 하나는, 다른 하나가 K 또는 R인 경우 및 X1 내지 X5가 존재하고 X8 및 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X8 및 X9는 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 류신(L) 또는 알라닌(A)이거나; X8 및 X9 중 하나는, 다른 하나가 L 또는 A이고 X1 내지 X7이 존재하는 경우에 부재할 수 있다); 및
(d) IKKAYKLALQ (서열번호 49),
IKKAYRLALQ (서열번호 50),
IKKAYRKALQ (서열번호 51), 또는
IKKAYRKLLQ (서열번호 52)로 이루어진 데카펩타이드 그룹으로부터 선택되는 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 융합 단백질. - 제14항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가, 단리된 J 도메인인, 융합 단백질.
- 제15항에 있어서, 상기 단리된 J 도메인이 Erdj 단백질, SV40의 대형 T 항원, 또는 포유동물 시스테인 스트링 단백질 알파(CSP-α)의 단리된 J 도메인인, 융합 단백질.
- 제16항에 있어서, 상기 단리된 J 도메인이, Erdj1, Erdj2, Erdj3, Erdj4, Erdj5, Erdj6 및 Erdj7로부터 선택되는 Erdj 단백질의 단리된 J 도메인인, 융합 단백질.
- 제17항에 있어서, 상기 단리된 J 도메인이 Erdj3의 단리된 J 도메인인, 융합 단백질.
- 제14항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 단편인, 융합 단백질.
- 제19항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 단편인, 융합 단백질.
I-K-K-A-Y-R-K-L-A (서열번호 48),
I-R-K-A-Y-R-K-L-S-L-T-L (서열번호 83),
I-K-K-Q-Y-R-L-L-S-L-K-Y (서열번호 84),
I-K-K-A-F-H-K-L-A-M-K-Y (서열번호 85),
I-R-Q-A-F-K-K-L-A-L-K-L (서열번호 86),
I-I-K-A-Y-R-K-L-A-L-Q-W (서열번호 87),
I-A-R-A-Y-R-Q-L-A-R-R-Y (서열번호 88),
I-K-R-A-Y-R-R-Q-A-L-R-Y (서열번호 89),
I-K-K-S-Y-R-K-L-A-L-K-Y (서열번호 90), 및
I-K-K-A-Y-K-R-L-A-M-K-Y (서열번호 91). - 제14항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 J 도메인 유사체 폴리펩타이드이고, 상기 폴리펩타이드 유사체가 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제21항에 있어서,
X1은 I, L, V, A, 또는 M이고;
디펩타이드 X2-X3은, KR, KK, RK, RR, AK, AR, KA, IK, NK, KQ, RQ, 및 RD로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 A, S, T, R, S, Q, E, F, C, 또는 I이고;
X5는 Y 또는 F이고;
디펩타이드 X6-X7은, KR, KK, RK, RR, RQ, FR, RL, KL, HK, LK, QK, 및 KV로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
디펩타이드 X8-X9는, LA, LL, AL, AA, LC, LV, QA, KA, LS, LI, LY, 및 RA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 융합 단백질. - 제14항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 하기의 아미노산 서열 중 하나를 포함하는, 융합 단백질.
- 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
- 제24항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는, 핵산 벡터 분자.
- 제25항에 따른 핵산 벡터 분자를 포함하는, 숙주 세포.
- 융합 단백질을 생산하기 위해 충분한 조건 하에서, 제26항에 따른 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 목적하는 표적 단백질에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 방법.
- 제14항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 구조적 유전자를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 및 상기 융합 단백질의 발현을 야기하는 조건 하에서 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적하는 표적 단백질에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 방법.
- 1) 제14항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자 서열을 작제하는 단계;
2) 상기 재조합 유전자 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 형성하는 단계(여기서, 상기 재조합 유전자 서열은 전사 프로모터 서열에 작동적으로 연결된다);
3) 상기 프로모터 서열과 상용성인 숙주 세포를 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염시키는 단계; 및
4) 상기 융합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 목적하는 표적 단백질에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 방법. - 단백질 기능을 제공하는 천연 분비된 단백질의 분비가 결핍된 포유동물 대상체의 세포에서 단백질 기능을 복구시키는 방법으로서, 분비된 단백질에 연결된 제1항에 따른 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산 분자를 대상체의 세포에 삽입함을 포함하고, 여기서, 상기 융합 단백질의 발현이 외인성 핵산의 부재 하에 대상체의 세포에서 이의 분비가 결핍된 천연 분비된 단백질의 기능을 제공하는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 대상체가, 대상체내 천연 분비된 단백질의 결핍된 분비와 관련된 질환을 갖는, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 질환이, 프리온-관련된 질환, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 낭종성 섬유증(CF) 및 α1-항트립신 결핍증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 대상체가, 낭종성 섬유증 막관통 전도도 조절제 단백질의 분비가 결핍된 사람 대상체이고, 상기 질환이 낭종성 섬유증인, 방법.
- 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질로서,
상기 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가,
(a) J 단백질의 단리된 J 도메인;
(b) J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 단편;
(c) J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 유사체(상기 J 도메인 유사체 폴리펩타이드는 화학식 I의 아미노산 서열을 포함한다):
[화학식 I]
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (서열번호 47)
(상기 화학식 I에서,
X1은 이소류신(I), 류신(L), 발린(V), 알라닌(A), 또는 메티오닌(M)이고;
X2 및 X3은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 K 또는 R이고;
X4는 임의의 아미노산이거나, X4는, X1 내지 X3이 존재하고 X5 내지 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X5는 티로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F)이고;
X6 및 X7은 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이거나; X6 및 X7 중 어느 하나는, 다른 하나가 K 또는 R인 경우 및 X1 내지 X5가 존재하고 X8 및 X9가 존재하는 경우에 부재할 수 있고;
X8 및 X9는 임의의 아미노산이고, 단, 하나 또는 둘 다는 류신(L) 또는 알라닌(A)이거나; X8 및 X9 중 하나는, 다른 하나가 L 또는 A이고 X1 내지 X7이 존재하는 경우에 부재할 수 있다); 및
(d) IKKAYKLALQ (서열번호 49),
IKKAYRLALQ (서열번호 50),
IKKAYRKALQ (서열번호 51), 또는
IKKAYRKLLQ (서열번호 52)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 융합 단백질. - 제34항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가, 단리된 J 단백질인, 융합 단백질.
- 제35항에 있어서, 상기 단리된 J 도메인이 Erdj 단백질, SV40의 대형 T 항원, 또는 포유동물 시스테인 스트링 단백질 알파(CSP-α)의 단리된 J 도메인인, 융합 단백질.
- 제35항에 있어서, 상기 단리된 J 도메인이, Erdj1, Erdj2, Erdj3, Erdj4, Erdj5, Erdj6 및 Erdj7로부터 선택되는 Erdj 단백질의 단리된 J 도메인인, 융합 단백질.
- 제37항에 있어서, 상기 단리된 J 도메인이 Erdj3의 단리된 J 도메인인, 융합 단백질.
- 제34항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 단편인, 융합 단백질.
- 제39항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 J 도메인의 단리된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드 단편인, 융합 단백질.
I-K-K-A-Y-R-K-L-A (서열번호 48),
I-R-K-A-Y-R-K-L-S-L-T-L (서열번호 83),
I-K-K-Q-Y-R-L-L-S-L-K-Y (서열번호 84),
I-K-K-A-F-H-K-L-A-M-K-Y (서열번호 85),
I-R-Q-A-F-K-K-L-A-L-K-L (서열번호 86),
I-I-K-A-Y-R-K-L-A-L-Q-W (서열번호 87),
I-A-R-A-Y-R-Q-L-A-R-R-Y (서열번호 88),
I-K-R-A-Y-R-R-Q-A-L-R-Y (서열번호 89),
I-K-K-S-Y-R-K-L-A-L-K-Y (서열번호 90), 및
I-K-K-A-Y-K-R-L-A-M-K-Y (서열번호 91). - 제34항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 J 도메인 유사체 폴리펩타이드이고, 상기 J 도메인 유사체 폴리펩타이드가 화학식 I의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
- 제41항에 있어서,
X1은 I, L, V, A, 또는 M이고;
디펩타이드 X2-X3은, KR, KK, RK, RR, AK, AR, KA, IK, NK, KQ, RQ, 및 RD로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
X4는 A, S, T, R, S, Q, E, F, C, 또는 I이고;
X5는 Y 또는 F이고;
디펩타이드 X6-X7은, KR, KK, RK, RR, RQ, FR, RL, KL, HK, LK, QK, 및 KV로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
디펩타이드 X8-X9는, LA, LL, AL, AA, LC, LV, QA, KA, LS, LI, LY, 및 RA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 융합 단백질. - 제34항에 있어서, 상기 단백질 발현 증진 폴리펩타이드가 하기의 아미노산 서열 중 하나를 포함하는, 융합 단백질.
- 제34항에 있어서, 상기 표적 단백질 결합 도메인이 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항체 결합 단백질, 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인, 수용체 단백질의 단백질 리간드, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 의해 결합된 단백질 항원, 또는 PDZ 도메인인, 융합 단백질.
- 제44항에 있어서, 상기 표적 단백질 결합 도메인이 항체 결합 단백질인, 융합 단백질.
- 제45항에 있어서, 상기 항체 결합 단백질이 Fc 결합 단백질인, 융합 단백질.
- 제46항에 있어서, 상기 Fc 결합 단백질이 단백질 A 또는 단백질 G인, 융합 단백질.
- 제45항에 있어서, 상기 항체 결합 단백질이 단백질 L인, 융합 단백질.
- 제43항에 있어서, 상기 표적 단백질 결합 도메인이 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인이고, 상기 수용체 단백질이 사이토킨 수용체인, 융합 단백질.
- 제44항에 있어서, 상기 표적 단백질 결합 도메인이 수용체 단백질에 대한 단백질 리간드이고, 상기 단백질 리간드가 사이토킨인, 융합 단백질.
- 제34항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
- 제51항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는, 핵산 벡터 분자.
- 제52항에 따른 핵산 벡터 분자를 포함하는, 숙주 세포.
- 융합 단백질을 생산하기 위한 충분한 조건 하에서 제53항에 따른 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 융합 단백질을 발현시키는 방법.
- 제34항에 따른 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 구조적 유전자를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계, 및 상기 구조적 유전자에 의해 암호화된 상기 융합 단백질과 목적하는 상기 표적 단백질의 동시-발현을 야기하는 조건 하에서 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에 의해 발현된 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키는 방법.
- 1) 목적하는 표적 단백질에 결합하는 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 제1항에 따른 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자를 작제하는 단계;
2) 상기 재조합 유전자를 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 형성하는 단계(여기서, 상기 재조합 유전자 서열은 전사 프로모터 서열에 작동적으로 연결된다);
3) 상기 프로모터 서열과 상용성인 숙주 세포를 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염시키는 단계; 및
4) 상기 재조합 유전자에 의해 암호화된 상기 융합 단백질 및 목적하는 상기 표적 단백질의 동시-발현을 허용하는 조건 하에서 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 목적하는 표적 단백질의 발현을 증진시키는 방법. - 분비된 단백질 기능을 제공하는 천연 분비된 단백질의 분비가 결핍된 포유동물 대상체의 세포에서 분비된 단백질 기능을 복구시키는 방법으로서, 천연 분비된 단백질에 결합하는 표적 단백질 결합 도메인에 연결된 제1항에 따른 단백질 발현 증진 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 외인성 핵산 분자를 대상체의 세포에 삽입함을 포함하고, 여기서, 세포내 상기 융합 단백질 및 천연 분비된 단백질의 발현이 상기 천연 단백질의 분비를 증진시켜 대상체의 세포에 상기 단백질의 기능을 제공하는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 대상체가, 상기 대상체내 천연 단백질의 결핍된 분비와 관련된 질환을 갖는, 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 질환이, 프리온-관련된 질환, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 낭종성 섬유증(CF) 및 α1-항트립신(AAT) 결핍증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제59항에 있어서, 상기 대상체가, 낭종성 섬유증 막관통 전도도 조절제 단백질의 분비가 결핍된 사람 대상체이고, 상기 질환이 낭종성 섬유증인, 방법
- 제59항에 있어서, 상기 대상체가, AAT 분비가 결핍된 사람 대상체이고, 상기 질환이 AAT 결핍증인, 방법.
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