JP6688237B2 - タンパク質発現増強ポリペプチド - Google Patents
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Description
激され、Hsp70タンパク質ではヘリックスの蓋状の部分を閉じる立体構造の変化が起こり、それによってクライアントタンパク質とHsp70‐ADPとの相互作用が安定し、Jタンパク質は遊離されて別のクライアントタンパク質と自由に結合する。Hsp70‐ADPに結合している間、クライアントタンパク質には適切な立体構造に折り畳みまたは再折り畳みできる環境が与えられる。次に、ヌクレオチド交換因子(NEF)がHsp70‐ADPに結合し、その結果ADPが遊離されATPが結合する。次いで、クライアントタンパク質はHsp70‐ATPに対する親和性が低いため(Jタンパク質がない場合)遊離される。クライアントタンパク質が適切な立体構造を得られなかった場合、クライアントタンパク質にJタンパク質が再結合し、再び循環することができる。Kampinga et al., Nat. Rev., 11: 579-592 (2010)を参照のこと。このように、このモデルによれば、Jタンパク質は個々のクライアントタンパク質と結合し、Hsp70シャペロンタンパク質とも結合して橋渡しの機能をすることによってHsp70機構において重要な役割を果たしている。この橋渡しの機能によって多様なクライアントタンパク質の捕捉とHsp70機構への提示が容易になり、適切な立体構造への折り畳みまたは再折り畳みが促される。Hsp70シャペロン機構がタンパク質を適切な機能的立体構造へ折り畳みまたは再折り畳みさせようとしてもできなかった場合、Hsp70シャペロン機構は不適切に折り畳まれたタンパク質がアミノ酸の分解と再利用のために細胞のタンパク質分解系(たとえばプロテアソーム)へ移行されるのを促進することもできる。Jタンパク質の重要な役割を含め、Hsp70シャペロン機構の概説についてはKampinga et al, Nature Rev., 11:
579-592 (2010)およびVoisine et al., Neurobiol. Dis., 40: 12-20 (2010)を参照のこと。
このように、BAGタンパク質はHsp70シャペロン機構の動員に関与するよう設計されたタンパク質に合う形態、結合ドメイン、結合特異性を有する。BAGタンパク質はN
EFとしてHsp70機構に関与できるが、多くの研究では、BAGタンパク質が細胞の増殖、休眠またはアポトーシスの促進、転写複合体の形成の調節、シグナル伝達の調節などの多様な活性を制御する調節メカニズムに主に関与する可能性があることが示唆されている。たとえば、Takayama et al., Nat.Cell. Biol., 3: E237-E241 (2001)による概説
を参照のこと。近年、所望の組換えタンパク質をBAGドメインに連結した場合、得られた融合タンパク質は所望のタンパク質単独の場合よりも高いレベルで発現されることが報告されている。国際公開第2012/087835号(A2)を参照のこと。
(a)Jタンパク質から単離されたJドメイン;
(b)Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片;
(c)Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドアナログであって、該Jドメインアナログポリペプチドは式Iのアミノ酸配列を有する、タンパク質発現増強ポリペプチドアナログ:
(I)X1‐X2‐X3‐X4‐X5‐X6‐X7‐X8‐X9(配列番号47):
(式中、X1はイソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、またはメチオニン(M)であり、
X2およびX3はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がKまたはRであり、
X4は任意のアミノ酸であるか;X1〜X3が存在しX5〜X9が存在する場合、X4は存在しなくてもよく、
X5はチロシン(Y)、トリプトファン(W)、またはフェニルアラニン(F)であり、X6およびX7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン(K)またはアルギニン(R)であるか;X6およびX7のいずれか一方がKまたはRであり、X1〜X5が存在しX8およびX9が存在する場合、X6およびX7の他方は存在しなくてもよく、
X8およびX9は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン(L)またはアラニン(A)であるか;X8およびX9の一方がLまたはAでありX1〜X7が存在する場合、X8およびX9の他方は存在しなくてもよい);および
(d)以下からなるデカペプチド群から選択される単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド:
IKKAYKLALQ(配列番号49)、
IKKAYRLALQ(配列番号50)、
IKKAYRKALQ(配列番号51)、および
IKKAYRKLLQ(配列番号52)。
I‐K‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A(配列番号48)、
I‐R‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐S‐L‐T‐L(配列番号83)、
I‐K‐K‐Q‐Y‐R‐L‐L‐S‐L‐K‐Y(配列番号84)、
I‐K‐K‐A‐F‐H‐K‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号85)、
I‐R‐Q‐A‐F‐K‐K‐L‐A‐L‐K‐L(配列番号86)、
I‐I‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐Q‐W(配列番号87)、
I‐A‐R‐A‐Y‐R‐Q‐L‐A‐R‐R‐Y(配列番号88)、
I‐K‐R‐A‐Y‐R‐R‐Q‐A‐L‐R‐Y(配列番号89)、
I‐K‐K‐S‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐K‐Y(配列番号90)および
I‐K‐K‐A‐Y‐K‐R‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号91)。
X1はI、L、V、AまたはMであり、
ジペプチドX2〜X3はKR、KK、RK、RR、AK、AR、KA、IK、NK、KQ、RQ、RDからなる群から選択され、
X4はA、S、T、R、S、Q、E、F、C、またはIであり、
X5はYまたはFであり、
ジペプチドX6‐X7はKR、KK、RK、RR、RQ、FR、RL、KL、HK、LK、QK、KVからなる群から選択され、
ジペプチドX8‐X9はLA、LL、AL、AA、LC、LV、QA、KA、LS、LI、LY、およびRAからなる群から選択される。
胞外位置での発現の増強の標的とするタンパク質は、可溶性タンパク質、膜結合タンパク質、または分泌タンパク質であり得る。
下したり、あるいは標的タンパク質の発現および/または配置のレベルに所望される増強が許容できないほど低下したりしなければ、リンカーはなくてもよい。
グ、Flagエピトープタグ、HA(ヒトインフルエンザ血球凝集素(human influenza hemagglutinin))エピトープタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
る上記タンパク質発現増強ポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。
ro細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓(human embryonic kidney(HEK293))細胞、ベビーハムスター腎臓(baby hamster kidney(BHK))
細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、CV‐1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞、またはMDCK細胞であることが好ましい。好ましい真菌宿主細胞としては、アスペルギルス(Aspergillus)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、カンジダ(Candida)属が挙げられる。サッカロミセス属宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞であることがより好ましい。
主細胞を該融合タンパク質の産生に十分な条件下で培養することを含む、方法を提供する。
1)該融合タンパク質をコードする組換え遺伝子配列を構築する工程と、
2)該組換え遺伝子配列を発現ベクターに挿入し、該組換え遺伝子配列が転写プロモーター配列に作動可能に連結された組換え発現ベクターを形成する工程と、
3)該プロモーター配列と適合する宿主細胞に該組換え発現ベクターを形質移入する工程と、
4)形質移入された該宿主細胞を、該融合タンパク質を発現可能な条件下で培養する工程とを含む方法を提供する。
1)タンパク質発現増強ポリペプチドを標的結合ドメインに連結させた融合タンパク質をコードする組換え遺伝子配列を構築する工程と、
2)該組換え遺伝子配列を発現ベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製する工程であって、該組換え遺伝子配列は転写プロモーター配列に作動可能に連結されている、工程と、
3)該プロモーター配列と適合する適切な宿主細胞を該組換え発現ベクターで形質移入する工程と、
4)形質移入した該宿主細胞を、該融合タンパク質の発現を生じる条件下で培養する工程。
Jタンパク質から単離されたJドメイン;
Jドメインのタンパク質発現増強ポリペプチド断片;または
以下の式を有するタンパク質発現増強Jドメインアナログポリペプチド:
式:X1‐X2‐X3‐X4‐X5‐X6‐X7‐X8‐X9(配列番号47)
(式中、X1はイソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、
またはメチオニン(M)であり、
X2およびX3はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし少なくとも一方リジン(K)またはアルギニン(R)であり、
X4は任意のアミノ酸であるか;X1〜X3が存在しX5〜X9が存在する場合、X4は存在しなくてもよく、
X5はチロシン(Y)、トリプトファン(W)、またはフェニルアラニン(F)であり、X6およびX7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし少なくとも一方がリジン(K)またはアルギニン(R)であるか;X6およびX7のいずれか一方がKまたはRであり、X1〜X5が存在しX8およびX9が存在する場合、X6およびX7の他方は存在しなくてもよく、
X8およびX9は任意のアミノ酸であり、ただし少なくとも一方がロイシン(L)またはアラニン(A)であるか;X8およびX9の一方がLまたはAでありX1〜X7が存在する場合、X8およびX9の他方は存在しなくてもよい)。
)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
分子生物学、遺伝学、微生物学、生化学、プロテオミクス、薬理学、薬科学に関連して用いる用語やこれらに関する技術は、一般的に当技術分野において周知であり一般に使用されるものである。本発明の方法および技術は、当技術分野の従来の方法に従い、また、当技術分野で入手可能な様々な一般的参考文献や詳細な参考文献に記載されたとおりに一般に実施される。分析および精製の技術は、実験技術の説明書や製造者による仕様書など、当技術分野で入手可能な手順書に従い、当技術分野で一般に遂行されているとおりに、または本明細書に記載したとおりに実施される。
ような位置関係に並べられていることを意味する。コード配列と「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合する条件でコード配列が発現するように連結されている。「作動可能に連結された」配列には、目的の遺伝子に隣接した発現制御配列と、トランスで、すなわち離れて目的の遺伝子を制御する働きをする発現制御配列とが含まれる。「発現制御配列」とは、その配列と連結されたコード配列の発現やプロセシングに作用するために必要なポリヌクレオチド配列である。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列;スプライシングシグナルやポリアデニル化シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル;細胞質mRNAを安定させる配列;翻訳効率を増強する配列(たとえばコザックコンセンサス配列);タンパク質の安定性を高める配列;望ましい場合にはタンパク質の分泌を増強する配列などが挙げられる。このような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物の場合、このような制御配列としては一般的にプロモーター配列、リボソーム結合部位配列、および転写終結配列が挙げられ、真核生物の場合は、このような制御配列としては一般的にプロモーター配列および転写終結配列が挙げられる。「制御配列」という用語は、発現およびプロセシングに必須である構成要素を包含することが意図され、リーダー配列や融合パートナー配列など、存在すれば有利である追加的な構成要素も包含し得る。特に指定しない限り、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクターに挿入することについて本明細書に説明または記載したときは、挿入された核酸分子を含む発現ベクターを適合する宿主細胞または適合する生物の細胞へ導入した際にコードされた融合タンパク質の発現に必要となる機能性プロモーターやその他の転写制御要素および翻訳制御要素と、挿入された核酸とがベクター内で作動可能に連結されていることを意味する。
、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓(human embryonic kidney(HEK293))細胞、ベビーハムスター腎臓(baby hamster kidney(BH
K))細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、CV‐1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞、またはMDCK細胞であることが好ましい。好ましい真菌宿主細胞としては、アスペルギルス(Aspergillus)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、カンジダ(Candida)属が挙げられる。特に好ましいサッカロミセス属宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である。特に好ましい昆虫宿主細胞はSf9細胞である。
ることも理解される。指定された1つ以上の構成要素または工程「を含む」、または「から実質的になる」と本明細書に記載された任意の組成物または方法は、指定された構成要素または工程「からなり」、指定されていない他のいかなる構成要素または工程も含まない、さらに限定された制限的な対応の組成物または方法も示すということも理解される。
多様なJタンパク質のJドメインが決定されている。たとえばKampinga et al., Nat. Rev., 11: 579-592(2010); Hennessy et al., Protein Science, 14:1697-1709(2005
)を参照のこと。本発明の融合タンパク質を調製するのに有用なJドメインは、Jタンパク質ファミリーに属するいずれかのタンパク質のJドメインを定義する重要な特徴を有する(改変配列の場合も非改変配列の場合も)。したがって、本発明において有用な単離されたJドメインは、4つのαヘリックス(I、II、III、IV)を特徴とし、通常は高度に保存されたヒスチジン、プロリン、アスパラギン酸からなるトリペプチド配列(「HPDモチーフ」という)をヘリックスIIとIIIとの間に有する、Jタンパク質のポリペプチドドメインを含む。一般的には、Jタンパク質のJドメインは50〜70アミノ酸の長さであり、JドメインがHsp70‐ATPシャペロンタンパク質と相互作用(結合)する部位は、ヘリックスII内から始まりHPDモチーフを含む領域であると考えられている。代表的なJドメインとしては、ERdjタンパク質のJドメイン(たとえばERdj3またはERdj5のJドメイン)、SV40ラージT抗原のJドメイン、および哺乳類のシステインストリングタンパク質(CSP‐α)のJドメインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのJドメインや、本発明の融合タンパク質に用いることのできる他のJドメインのアミノ酸配列を表1−1〜表1−4に示す。
表1−1〜表1−4.代表的な単離されたJドメインのアミノ酸配列
アミノ末端およびカルボキシ末端の欠失解析を含む配列解析を用いてさらにJドメインを研究した結果、Jドメインのうち比較的小さな部分のみがタンパク質発現増強活性の提供に必要であることが明らかになった。解析の結果、意外にも本発明のタンパク質発現増強活性はJドメイン内から単離されたわずか9〜10個のアミノ酸からなるポリペプチド断片によって提供できることが決定された。以下の実施例10および11を参照のこと。単離されたJドメインと同様にこのようなJドメインポリペプチド断片も、本明細書に記載された目的の細胞内(細胞内部および膜結合部位)または細胞外の(分泌された)位置での目的の標的タンパク質の発現を増強するための方法および組成物に使用できる。個々のJドメインポリペプチド断片のアミノ酸配列はすべて同一ではないが、本明細書に記載の改変配列でも非改変配列でもタンパク質発現増強活性を提供するという点の他、いくらかの配列相同性と構造的特徴を共有し得る。
る。したがって、それに応じて、このような融合タンパク質をコードする組換え核酸分子のサイズも、完全なJドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸分子より小さくすることができる。本発明のJドメインポリペプチド断片およびJドメインアナログポリペプチドのサイズが比較的小さいことは、タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結(融合)させて(連結させていない)目的の標的タンパク質の代わりに患者の体内で発現させるか患者に投与する改変(融合)標的タンパク質とした、改変配列の融合タンパク質の免疫原性を低下させるうえで特に有益となり得る。融合タンパク質の免疫原性が低くなればなるほど、融合タンパク質に対する免疫反応によって融合タンパク質が急速に消失したり阻害されたりすることなく、融合タンパク質の有益な特性または効果を患者に提供するべく患者の体内に残留できる可能性が高くなる。
本発明によれば、本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドは、宿主細胞での発現を改善する必要のある目的の標的タンパク質の発現を増強する融合タンパク質の成分として使用される。タンパク質発現増強ポリペプチドは、目的の標的タンパク質の発現を増強するために2種類の配列のいずれかの配列で使用される。2種類の配列とは、発現された目的の標的タンパク質の一次構造(アミノ酸配列)のことである。
PCR))技術などの標準的な組換え核酸技術を細胞培養方法または遺伝子導入方法と組み合わせて、ほとんどの場合はより経済的に本明細書に記載の融合タンパク質を製造できると考えられる。
当技術分野で公知の方法によって、任意のドメインを本発明の融合タンパク質に含まれる別のドメインと連結させることができる。たとえば、本発明の改変配列では、融合タンパク質はタンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させたものである。したがって、発現される融合タンパク質は改変された標的タンパク質であり、発現が不十分な融合されていない目的の標的タンパク質の代わりに用いることができる。タンパク質発現増強ポリペプチドは目的の標的タンパク質と直接連結させてもよく、リンカー分子を介して間接的に連結させてもよい。本発明の非改変配列では、融合タンパク質は、タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質に親和性を有し結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質である。この融合タンパク質を目的の標的タンパク質と共発現させることによって、改変されていない(融合されていない)目的の標的タンパク質の発現レベルは融合タンパク質がない場合の発現レベルに比べて増強される。タンパク質発現増強ポリペプチドは標的タンパク質結合ドメインと直接連結させてもよく、リンカー分子を介して間接的に連結させてもよい。改変配列の場合でも非改変配列の場合でも、その他のドメインを融合タンパク質または融合していないタンパク質と連結させることによって1つ以上の追加的特徴を与えることも可能である。たとえば、エピトープタグを融合タンパク質または融合していないタンパク質と連結させることによって、タグで標識したタンパク質の検出または精製を容易にすることができる。
et al., Protein Eng., 13(5): 309-314 (2000); George et al., Protein Eng., 15(11): 871-879 (2003); Robinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5929-5934 (1998)を参照のこと。タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質または標的タンパク質結合ドメインと連結させるために特定のリンカーを用いることについて一般的に考慮すべき点としては、ある機能性ドメインを別の機能性ドメインと連結させて作製するその他の融合タンパク質の作製の際に考慮すべき点が挙げられる。たとえば、改変された機能性結合タンパク質を作製するために免疫グロブリンの可変ドメインおよび/または定常ドメインを多様な形式で連結する際に考慮するような点が挙げられる。タンパク質発現増強ポリペプチドと連結された目的の標的タンパク質または標的タンパク質結合ドメインの折り畳みをリンカーが妨げてはならないことは明らかである。融合タンパク質にリンカーを用いる場合、リンカーはタンパク質発現増強ポリペプチドを最適に寄与させて改変配列の融合タンパク質または非改変配列の(融合していない)目的の標的タンパク質の発現または産生のレベルが増強されるように選択される。目的の標的タンパク質または標的タンパク質結合ドメインにタンパク質発現増強ポリペプチドを直接結合しても所望の発現レベルの増強が得られる場合には、リンカーはなくてもよい。本発明の融合タンパク質に存在するリンカー分子は、発現ベクターのクローニング部位またはその周辺の核酸のセグメントに存在するヌクレオチド配列によってコードされる1個以上のアミノ酸を含み得る。この発現ベクターには、タンパク質ドメイン(たとえばタンパク質発現増強ポリペプチド、目的のタンパク質、標的タンパク質結合ドメイン)または融合タンパク質全体をコードする核酸セグメントをインフレームで挿入する。
TTPPSVTPLAP(配列番号140);AKTTAP(配列番号141);AKTTAPSVYPLAP(配列番号142);ASTKGP(配列番号143);ASTKGPSVFPLAP(配列番号144);GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号145);GENKVEYAPALMALS(配列番号146);GPAKELTPLKEAKVS(配列番号147);GHEAAAVMQVQYPAS(配列番号148);GGGGGGGP(配列番号149);GGGGGGGGP(配列番号150);PAPNLLGGP(配列番号151);PNLLGGP(配列番号152);GGGGGGP(配列番号153);PAPELLGGP(配列番号154);PTISPAPNLLGGP(配列番号155);TVAADDDDKSVFIVPP(配列番号156);TVDDDDKAAP(配列番号157);LVPRGSAAP(配列番号158);ASTKGPSV(配列番号159);ASTKGPSVFP(配列番号160);TVAAPSV(配列番号161);TVAAPSVFI(配列番号162)など。
GP(配列番号165);ASTDDDDK*SVFPLAP(配列番号166);TVALVPR*GSVFIFPP(配列番号167);ASTLVPR*GSVFPLAP(配列番号168);TVAADDDK*SVFIVPP(配列番号169);ASTDDDK*SVFPLAP(配列番号170);LEVLFQ*GP(配列番号171);TVAALEVLFQ*GPAP(配列番号172);ASTLEVLFQ*GPLAP(配列番号173);PAPLEVLFQ*GP(配列番号174);TAENLYFQ*GAP(配列番号175);AENLYFQ*GA(配列番号176);PGPFGR*SAGGP(配列番号177);PGPFGR*SAGG(配列番号178);PQRGR*SAG(配列番号179);PHYGR*SGG(配列番号180);GPFGR*SAGP(配列番号181);GDDDDK*GGP(配列番号182);AGDDDDK*GGP(配列番号183);GGDDDDK*GGP(配列番号184);ENLYFQ*G(配列番号185);ENLYFQ*S(配列番号186)など。
plasminogen activator(tPA))、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ(matrix metalloproteinase(MMP))、セラリシン、アスタシン、アダマリシン、ディスインテグリン、ADAM、カスパーゼ、カテプシン、カルパインなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
目的の標的タンパク質の発現を増強するために改変配列または非改変配列で使用される融合タンパク質をコードする核酸(一般的にはDNA)分子は、当技術分野で利用可能な標準の方法を用いて構築される。タンパク質の検出および/または精製を容易にするために用いる標準的なエピトープタグのような1つ以上の追加のドメインをタンパク質に組み込むこともできる。所望の融合タンパク質をコードする核酸分子を、その融合タンパク質を発現するための組換え構造遺伝子を複製させるために、当技術分野で入手可能な多様なクローニングベクターのうち任意のベクターに挿入することができる。融合タンパク質を発現させるため、その融合タンパク質をコードする核酸分子を、当技術分野で入手可能な多様なクローニングベクターのうち任意のベクターに挿入することができる。次いで、融合タンパク質をコードする挿入された核酸を含む発現ベクターを、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることのできる適合宿主細胞に導入する。非改変配列については、宿主細胞が目的の標的タンパク質を発現すための機能性遺伝子を有さない場合、ベクターは改変されていない目的の標的タンパク質をコードする機能性構造遺伝子のコピーも含み得る。
タンパク質を作製できる。発現ベクターは複数のクローニング部位を有していてもよい。複数のクローニング部位によって、1つ以上のその他の所望のドメイン(たとえばエピトープタグ、Fc領域など)をコードする1つ以上の追加的核酸セグメントを挿入して所望の融合タンパク質を構築および発現させることが可能になる。所望の融合物をコードする最終的な核酸融合構築物は、発現ベクターのプロモーターと作動可能に連結される。ベクター分子へのクローニング部位の設計や、所望のタンパク質をコードする挿入された核酸セグメントを適合する宿主細胞内でタンパク質を発現させるのに必要なプロモーターやその他のシグナルと作動可能に連結することについては、当分野の技術の範囲内で行うことができる。
))細胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓(human embryonic kidney(HEK293))細胞、ベビーハムスター腎臓(baby hamster kidney(BHK))細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、CV‐1/EBNA細胞
、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞、MDCK細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のJドメイン融合タンパク質を発現するのに有用な真菌宿主細胞としては、アスペルギルス(Aspergillus)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、カンジダ(Candida)属が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましいサッカロミセス属宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である。
質を発現するトランスジェニック植物またはトランスジェニック動物を提供することができる。植物およびヒト以外の動物の場合、そのトランスジェニック生物の子孫もその融合タンパク質を発現できるように、タンパク質をコードする発現可能な核酸を生殖系列に組み込むための技術が利用可能である。植物またはヒト以外の動物の細胞に核酸を導入するには多様なベクターおよび方法が利用可能であり、ネイキッドDNAを細胞内に注射する方法、弾道を利用する導入(たとえば遺伝子銃を用いる)、リポソーム、ウイルス由来ベクター分子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
に限定されるものではない。
本発明の改変配列の融合タンパク質は、タンパク質発現増強ポリペプチド(PEEP(
本明細書に記載の単離されたJドメイン、Jドメイン活性ポリペプチド断片、およびJドメインアナログポリペプチドが包含される))を目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質である。タンパク質発現増強ポリペプチドは目的の標的タンパク質のアミノ(N)末端またはカルボキシ(C)末端に連結させることが好ましい。タンパク質発現増強ポリペプチドは、目的のタンパク質との間にリンカー、酵素切断部位、エピトープタグなどの1つ以上の介在ポリペプチド配列を挟んで目的のタンパク質と離れていてもよい。タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質に挿入することは可能であるが、実務上の問題として、そのためにはより複雑な組換えDNA操作が必要であり、目的の標的タンパク質の適切な折り畳み、所望の機能またはその他の特性を妨げる可能性が高いため、一般的にはあまり好まれない。本発明の改変配列の融合タンパク質を作製するのに用いることのできる目的の標的タンパク質は、所望の特性を有する任意のタンパク質またはポリペプチドであり、細胞内位置に通常は存在している可溶性タンパク質、膜結合タンパク質(膜貫通タンパク質など)、分泌タンパク質、遺伝子改変した非天然タンパク質が含まれる。遺伝子改変した非天然タンパク質としては、天然の膜結合タンパク質の組換え可溶型タンパク質、たとえば膜貫通タンパク質(たとえばインテグリン、補体調節タンパク質)の細胞外ドメインを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。改変配列の融合タンパク質の標的タンパク質成分として用いることができる改変した非天然タンパク質の別の例は、組換え可溶受容体分子を含む組換え融合タンパク質であり、このような融合タンパク質では細胞表面受容体の細胞外結合ドメインが免疫グロブリンFcドメインまたは免疫グロブリン骨格に融合されている。このような非天然の融合タンパク質としてはエタネルセプトを挙げることができるが、これに限定されるものではない。エタネルセプトではp75ヒトTNFα受容体分子の細胞外ドメインがIgG1免疫グロブリンのヒンジおよびFcドメインと連結されている。本発明の改変配列の融合タンパク質に目的の標的タンパク質として用いることのできるその他のタンパク質としては、抗体およびその抗原結合部分、サイトカイン、ペプチドホルモン、酵素(たとえばトロンビン、ラクターゼ、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼなど)、形態形成タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質発現増強ポリペプチド(本明細書に記載の単離されたJドメイン、Jドメイン活性ポリペプチド断片およびJドメインアナログポリペプチドが包含される)は、目的位置での目的の標的タンパク質の発現を増強するために非改変配列で使用することもできる。本発明の非改変配列では、融合タンパク質はタンパク質発現増強ポリペプチドを標的タンパク質に親和性を有し結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質である。したがって、本発明の非改変配列では、目的の標的タンパク質は融合タンパク質の成分ではないため、その一次構造(アミノ酸配列)は変化しない。特定の機序に拘束されるものではないが、融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインに目的の標的タンパク質が結合すると目的の標的タンパク質がタンパク質発現増強ポリペプチド(同じく融合タンパク質に含まれる)と比較的接近するため、目的の細胞内位置または細胞外位置での標的タンパク質の発現レベルが、融合タンパク質が存在しない場合の発現レベルに比べて増強されると考えられる。タンパク質の折り畳み、区画化または分泌に関与する、シャペロンタンパク質またはその他の翻訳後の細胞機構の動員が増加することがこのことと関係しているかもしれないし、あるいは細胞内の分解経路からの回避が改善することが関係しているかもしれない。所望の細胞内位置または細胞外位置で見られる発現タンパク質が有意に増加することからもこの効果が証明される。
本発明の非改変配列の融合タンパク質は、適切な細胞内位置または細胞外位置での発現の増強が所望される目的の標的タンパク質に結合する標的タンパク質結合ドメインを含む
。本発明の標的タンパク質結合性融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインには、標的タンパク質に結合することが知られている任意のタンパク質またはその結合ドメインを用いてよい。標的タンパク質に対するタンパク質またはその結合ドメインの結合親和特異性が高いほど、目的の標的タンパク質に対して所望された発現レベルの増強をその他のタンパク質が妨げる可能性は低くなる。
こと。
ない。また、Fcドメインに結合する多数の合成ペプチドが同定されている。たとえば、DeLano et al., Science, 287:1279-1283 (2000)およびYang et al., J. Peptide Res., 66(Suppl. 1): 120-137 (2006)を参照のこと。以下の実施例に示すように、このようなFc結合性のタンパク質およびペプチドはFcドメインを含む目的の標的タンパク質を対象とした本発明の融合タンパク質の標的結合ドメインとして容易に採用される。
ドメインには、BAGタンパク質ファミリーに属する任意のタンパク質のBAGドメインを定義する重要な特徴がある。つまり、BAGドメインはBAGタンパク質のポリペプチドドメインからなり、一般的には85〜124アミノ酸の長さであり、Hsp70シャペロンタンパク質のATPaseドメインに結合し、αヘリックス(I、II、III、IV)の逆平行配置が3か所あることを特徴とする。ここで、ヘリックスIIIとIVはHsp70シャペロンタンパク質のATPaseドメインと相互作用する。近年、所望の組換えタンパク質をBAGドメインと連結させて得られた融合タンパク質はそのタンパク質単独の発現レベルよりも高いレベルで発現されることが報告された。国際公開第2012/087835号(A2)を参照のこと。
嚢胞性線維症(CF)とは、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR))タンパク質、cAMP調節性塩素イオン
チャネルおよびチャネル調節因子をコードする遺伝子の変異を原因とする常染色体劣性遺伝疾患である。CFTRの508位のフェニルアラニン残基の欠失(Δ508F)が、CFTRタンパク質の立体構造を変化させる最も一般的な変異である。この変異が起きると
、CFTRタンパク質は小胞体(endoplasmic reticulum(ER))の品質システムによ
って急速に分解される。野生型CFTRタンパク質機能の一部を回復させることさえできればCF患者に有益な治療を提供できるというのが一般的な統一見解である。そのため、CFTRを用いた多数の遺伝子治療試験が試みられてきたが、CFTRを発現させるための遺伝子の送達が非効率的であることや、媒介物(たとえばウイルスベクター)に対する免疫原性が理由で未だに成功していない。野生型CFTRの適切なタンパク質折り畳みは難しいことが知られていることから、CFTRタンパク質のタンパク質折り畳みが改善できれば非常に有用であろう。
る概説を参照のこと。このような臨床試験によって、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御(CFTR)タンパク質の補充についての概念実証は既に確立されたが、ヒト患者の細胞内で補充CFTRタンパク質の有効な発現レベルを維持できるようにすることが、CFを治療するための有効な遺伝子治療の開発における根強い課題のひとつとして残っている。野生型CFTRタンパク質は不安定なことでよく知られるタンパク質である。CF患者の90%以上は、変異型CFTRの遺伝子(CFTRΔ508F)のコピーを少なくとも1つ有する。この変異型CFTRは、508位のフェニルアラニン残基が欠失しているために細胞内で急速に分解される非常に不安定なタンパク質である。このことから、CF患者のCFTR機能の改善または回復につながるようなCF治療のための融合遺伝子治療法が示唆される。このような遺伝子治療は、本発明の改変配列または非改変配列の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
メインは、CFTRΔ508Fおよび野生型CFTRタンパク質のいずれか一方または両方を標的とするよう設計された融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインとして、本発明の遺伝子治療に特に有用となり得る。
本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドと連結した目的の標的タンパク質を発現するための発現ベクタープラスミドを構築した。この融合タンパク質は、標準のエピトープタグとさらに連結させてもよい。エピトープタグは、それに対応する抗タグ抗体と標準の免疫ブロット分析によって容易に認識または単離できるように、通常はタンパク質構築物のカルボキシ(C)末端またはアミノ(N)末端に結合させる。
AGCTTGGTACCGGATCCGAATTCGATATCGCGGCCGCTCTCGAGTCTAGAGGGCC(配列番号187);および
CTCTAGACTCGAGAGCGGCCGCGATATCGAATTCGGATCCGGTACCA(配列番号188)。
ATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACG(配列番号189)を有する二本鎖DNA分子を、XhoIおよびXbaIで消化したpcDNA’に挿入し、プラスミドV5(C)‐pcDNA’を得た。また、HindIIIおよびKpnIで消化したpcDNA’に挿入し、プラスミドV5(N)‐pcDNA’を得た。
GATTACAAGGATGACGATGACAAG(配列番号190)を有するDNA分子を、XhoIおよびXbaIで消化したプラスミドpcDNA’に挿入し、プラスミドFlag(N)‐pcDNA’を得た。
ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction(PCR))、遺伝子合成、また
は相補的DNA分子のアニーリングによって、タンパク質配列をコードするDNA分子を標準的な手順で得た。免疫グロブリンFc領域のアミノ酸配列をコードするDNA分子を
標準のオリゴヌクレオチド合成によって作製した。グリシンとセリンからなるリンカー配列GGGSGGSGGSGG(配列番号121)をコードするDNA配列GGAGGCGGAAGTGGTGGGAGCGGTGGAAGCGGAGGC(配列番号191)を有するDNA分子を、標準の方法で合成した相補一本鎖をアニーリングすることによって作製した。
C末端にV5タグを付加したIL13Rα2受容体タンパク質(図1A参照)を発現させるため、IL13Rα2受容体タンパク質をコードするDNA分子を、HindIIIおよびKpnIで消化したプラスミドV5(C)‐pcDNA’に挿入した。
はΔ508F変異型)をコードするDNA分子を、上記の1個以上の発現ベクターにJドメイン(場合によってはBAGドメイン)配列とインフレームで挿入し、融合タンパク質を発現させた。この融合タンパク質はさらに、コードされたタンパク質を認識しやすくするため、N末端またはC末端にV5エピトープタグを有している。
多様なタンパク質構築物をコードする発現ベクタープラスミドを、X-tremeGENE HP形質移入試薬(カタログ番号06365752001、Roche)を用いてHEK293細胞に形質移入した。以下の実施例に示すように、形質移入の効率を確認するため、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する別のプラスミドを、本発明の融合タンパク質をコードする各発現ベクタープラスミドと共に形質移入した。形質移入細胞の培養液を2日間インキュベートし、培地および/または細胞可溶化物の発現タンパク質について、ドットブロット分析またはウェスタンブロット分析を用いて分析した。分析の前に、培養液のサンプルを遠心分離し、細胞片を除去した。細胞可溶化物を得るため、2mMのPMSFを含有する溶解緩衝液(10mM Tris-HCl、pH8.0、150mM NaCl、10mM EDTA、2%SDS)に細胞を溶解した。超音波処理を短時間行った後、サンプルの発現タンパク質について、ドットブロット分析またはウェスタン免疫ブロット分析を用いて分析した。ウェスタンブロット分析のため、サンプルをSDS‐サンプルの緩衝液中で煮沸し、ポリアクリルアミド電気泳動に供し、続いて、分離されたタンパク質バンドを膜(PVDF膜)に転写した。
本明細書に記載のJドメイン融合タンパク質の作製に用いた目的のタンパク質の活性を検出するには、標準的な分析を利用できる。
分IL13受容体α2鎖のジロイシン内部移行モチーフとチロシン内部移行モチーフの異なる役割の認識)"J. Biol. Chem., 276(27): 25114-25120(2001)に記載されている。
TNFβに対する結合とTNF活性阻害に関する化学量論)"J. Biol. Chem., 266(27): 18324-18329 (1991)に記載されている。
Respir. Crit. Care Med., 157(1): 246-255(1998)に記載されている。
p53 activity in cell death and viral replication(インフルエンザウイルス感染は
p53活性を高める:細胞死とウイルス複製におけるp53活性の役割)", J. Virol., 79(14): 8802-8811 (2005)に記載されている。
R塩素イオンチャネル活性の薬理作用)", Physiol. Rev., 79(1 Suppl.): S109-S144 (1999)に記載されている。
図1Aは、C末端にV5エピトープを付加した全長のIL13Rα2タンパク質(「IL13Rα2WT」)を発現させるための構築物と、IL13Rα2をBAGまたはJドメインと融合しC末端にV5エピトープを付加した融合タンパク質を発現させるための構築物の全体図を示す。
表2.V5タグで標識したIL13Rα2WTタンパク質のアミノ酸配列
表3.IL13Rα2WT‐BAG3ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
表5.IL13Rα2WT‐BAG5ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
表6.IL13Rα2WT‐BAG6ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
(N)末端側が全長のIL13Rα2タンパク質のアミノ酸配列であり、そこにHsp40タンパク質のJドメインを連結させ、さらにV5エピトープタグを連結させ、そのC末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する12個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。IL13Rα2WT‐Hsp40 Jドメイン融合タンパク質のア
ミノ酸配列を下の表に示す。
表7.IL13Rα2WT‐Hsp40 Jドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
表8.IL13Rα2WT‐SV40 Jドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
N)末端側が全長のIL13Rα2タンパク質のアミノ酸配列であり、そこにCSPタンパク質のJドメインを連結させ、さらにV5エピトープタグを連結させ、そのC末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する12個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。IL13Rα2WT‐CSP Jドメイン融合タンパク質のアミノ酸配
列を下の表に示す。
表9.IL13Rα2WT‐CSP Jドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
なかった。このバンドを野生型(WT)IL13Rα2タンパク質の発現を表すのに用いた。バンドは発現が不十分であったことを示している。IL13Rα2とBAGドメイン(BAG3、BAG4、BAG5、BAG6)とを含む融合タンパク質は、それよりもわずかに高いレベルで発現された。対照的に、IL13Rα2といずれかのJドメインとを含む融合タンパク質はすべて、V5タグで標識したIL13Rα2またはIL13Rα2とBAGドメインとを含む融合タンパク質よりも著しく高いレベルで発現された。図1Bのシグナルを濃度測定分析した結果を図1Cに示す。IL13Rα2といずれかのJドメインとを含む融合タンパク質は、V5エピトープタグで標識したIL13Rα2の発現量(100%とする)の25倍のレベルで発現された。図1Cの棒グラフを参照のこと。
IL13Rα2は、インターロイキン‐13(interleukin‐13(IL13))に結合しアレルギー性炎症を媒介する膜受容体タンパク質である。IL13が膜結合受容体であるIL13Rα2受容体と結合すると、炎症反応を誘発するシグナルが細胞質へ伝達される。このような反応は喘息の場合には特に有害である。発現された膜結合性IL13Rα2分子の一部分は細胞表面で切断され、可溶性の切断型IL13Rα2(IL13Rα2TF)を細胞外空間へ遊離する。切断型IL13Rα2はIL13結合能を保持しているが、全長の膜結合性タンパク質に見られる膜貫通領域および細胞質領域がないため、シグナルを細胞に送ることはできない。このため、切断型IL13Rα2は炎症反応を誘発するシグナルを細胞へ伝達することなくIL13分子に結合することによって喘息を治療するために囮受容体として採用されてきた。このような治療用途のため、遺伝子改変した切断型IL13Rα2が哺乳類細胞で発現され、その培養液をもとに分泌タンパク質として精製されてきた。しかし、切断型IL13Rα2は発現や分泌が難しいため、生成が非効率的である。
表10.V5タグで標識したIL13Rα2TF融合タンパク質のアミノ酸配列
表12.V5タグで標識したBAGドメイン‐IL13Rα2TF融合タンパク質のアミノ酸配列
照のこと。Jドメインを切断型IL13Rα2のC末端に結合させた場合にも同様の効果が見られた(データは示さず)。
α1アンチトリプシン(α1AT)タンパク質は肝臓から分泌され血管内を循環する。α1ATの機能は組織(特に肺組織)を過剰なプロテアーゼから保護することである。α1アンチトリプシン欠損症と呼ばれる疾患では、プロテアーゼによって肺が損傷される。α1アンチトリプシン欠損症の患者は、肺気腫、喘息、および/または慢性閉塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease(COPD))を発症する可能性がある。現
在、α1AT(ヒト血清から精製される)がα1アンチトリプシン欠損症の患者の治療に用いられているが、この治療は高価であり、ヒト血清治療を受ける患者にはヒト血清中に存在する病原体に感染する危険性がある。
表13.V5タグで標識したα1ATタンパク質のアミノ酸配列
表14.α1AT‐BAG融合タンパク質のアミノ酸配列
のアミノ酸配列を下の表に示す。
表15.α1AT‐Jドメインタンパク質のアミノ酸配列
BのドットブロットのシグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図4Cに示す。図4Cの棒グラフは、分泌されたα1AT‐Jドメイン融合タンパク質(棒グラフ4)の発現レベルが、α1AT(棒グラフ2)タンパク質とα1AT‐BAGドメイン融合タンパク質(棒グラフ3)のいずれの発現レベルと比較しても有意に高かったことを明確に示している。Jドメイン融合物を用いた結果、形質転換細胞が分泌したIL13Rα2TFの量は、α1ATを単独で発現するよう形質転換した細胞またはα1AT‐BAG融合タンパク質を発現するよう形質転換した細胞による発現レベルと比較して1.5倍を超えた。
治療に有効な融合タンパク質を設計するための形態の1つでは、所望の標的分子に特異的に結合する結合ドメインを免疫グロブリンのFc領域と連結させたものを組み合わせ、それによって融合タンパク質の生体内半減期を延長する。この種類の薬物の一例は、多くの自己免疫疾患に関与する重要な免疫系タンパク質である腫瘍壊死因子(TNFα)に結合してその作用を阻害するエタネルセプト(分子標的治療薬の一つ)である。たとえば、エタネルセプトでは切断型の腫瘍壊死因子α受容体(TNFR1TF)が免疫グロブリンのFcドメインと連結されている。エタネルセプトのTNFR1TF部分が薬物標的(TNFα)に対する特異性を付与し、Fcドメインが生体内での薬物の安定性と送達可能性を加えると考えられている。しかし、Fcドメインは一部の疾患の治療計画には望ましくないかもしれない何らかのエフェクター機能を有することも知られている。
表16.V5タグで標識したTNFR1TFタンパク質のアミノ酸配列
パク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表17.V5タグで標識したTNFR1TF‐Erdj3 Jドメイン融合タンパク質のアミノ
酸配列
分泌された切断型TNFR1の発現レベルがJドメインを結合させることによって増強された(図5Bおよび図5C)ことを示す以上の結果からみて、免疫グロブリンのFcドメインと融合したTNF1TF‐Fc融合タンパク質などの目的のタンパク質の発現がJドメインによって増強されるかを調べることは興味深い。このようなFc融合分子は、薬物であるエタネルセプト(ENBREL(登録商標)として市販されている)を例とする薬物形態の種類である。エタネルセプトは重症の関節リウマチ、多関節型若年性特発性関
節炎(juvenile idiopathic arthritis(JIA))、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、尋
常性乾癬などの多くの自己免疫疾患の治療用に認可されているTNF1TF‐Fc融合タンパク質である。
表18.V5タグで標識したTNFR1TF‐Fc融合タンパク質のアミノ酸配列
表19.V5タグで標識したTNFR1TF‐Erdj3 Jドメイン‐Fcタンパク質のアミ
ノ酸配列
表20.V5タグで標識したIL13Rα2TF‐Fc融合タンパク質のアミノ酸配列
表21.V5タグで標識したIL13Rα2TF‐Erdj3 Jドメイン‐Fcタンパク質の
アミノ酸配列
表22.V5タグで標識したα1AT‐Fcタンパク質のアミノ酸配列
表23.V5タグで標識したα1AT‐Erdj3 Jドメイン‐Fcタンパク質のアミノ酸配
列
IL13Rα2、TNFR、α1ATのようなタンパク質は、小胞体(endoplasmic reticulum(ER))で合成され、細胞膜へ送達されるか、細胞から分泌される。Jドメイ
ンの存在が細胞質タンパク質の発現に対して与える効果を測定するために、p53タンパク質とJドメインとの融合物の発現について試験した。p53タンパク質はゲノム安定性において中心的役割を果たす転写因子である。がん患者の過半数はp53を含む経路に何らかの異常を有している。このため、がん患者の体内でp53を大量に発現させることが、がん治療として試みられてきた。
表24.V5タグで標識したp53タンパク質のアミノ酸配列
表25.V5タグで標識したSV40 Jドメイン‐p53融合タンパク質のアミノ酸配列
嚢胞性線維症(CF)は、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR))タンパク質、cAMP調節性塩素イオンチ
ャネルおよびチャネル調節因子をコードする遺伝子の変異を原因とする常染色体劣性遺伝疾患である。CFTRの508位のフェニルアラニン残基の欠失(Δ508F)が、CFTRタンパク質の立体構造を変化させる最も一般的な変異である。この変異が起きると、CFTRタンパク質はERの品質システムによって急速に分解される。野生型CFTRタンパク質機能の一部を回復させることさえできればCF患者に有益な治療を提供できるというのが一般的な統一見解である。そのため、CFTRを用いた多数の遺伝子治療試験が試みられてきたが、CFTRを発現させるための遺伝子の送達が非効率的であることや、媒介物(たとえばウイルスベクター)に対する免疫原性が理由で未だに成功していない。野生型CFTRの適切なタンパク質折り畳みは難しいことが知られていることから、CFTRタンパク質のタンパク質折り畳みが改善できれば非常に有用であろう。
表26−1〜表26−2.V5タグで標識したCFTRタンパク質のアミノ酸配列
示す。
表27−1〜表27−2.V5タグで標識したBAGドメイン‐CFTRタンパク質のアミノ酸配列
表28−1〜表28−2.V5タグで標識したSV40 Jドメイン‐CFTRタンパク質のアミノ酸配列
表29−1〜表29−2.V5タグで標識したCFTR(Δ508F)タンパク質のアミノ酸配列
表30−1〜表30−2.V5タグで標識したBAGドメイン‐CFTR(Δ508F)融合タンパク質のアミノ酸配列
表31−1〜表31−2.V5タグで標識したSV40 Jドメイン‐CFTR(Δ508F)融合タンパク質のアミノ酸配列
メインとの融合物(J-CFTR WT、J‐CFTRΔ508F)は、野生型および変異型タン
パク質の両方の発現レベルを有意に増強した。図8Bを参照のこと。
上記の実験の結果は、Jドメインと融合することによって治療に有用なタンパク質などの目的のタンパク質の発現レベルが有意に増強されることを明確に示している。
特定のタンパク質(標的タンパク質)の発現を増強するための融合タンパク質を発現させるための発現ベクタープラスミドを構築した。以下に記載するように、融合タンパク質は通常、対応する抗タグ抗体および標準の免疫ブロット(ドットブロット、ウェスタンブロットなど)分析を用いて容易に認識または単離するため、標準のエピトープタグと連結させた。
AGCTTGGTACCGGATCCGAATTCGATATCGCGGCCGCTCTCGAGTCTAGAGGGCC(配列番号187);および
CTCTAGACTCGAGAGCGGCCGCGATATCGAATTCGGATCCGGTACCA(配列番号188)。
ATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACG(配列番号189)を有する二本鎖DNA分子を、XhoIおよびXbaIで消化したpcDNA’に挿入し、プラスミドV5‐pcDNA’を得た。
GATTACAAGGATGACGATGACAAG(配列番号190)を有するDNA分子を、XhoIおよびXbaIで消化したプラスミドpcDNA’に挿入し、プラスミドFlag‐pcDNA’を得た。
pcDNA’に挿入した。
また、同じDNA分子をKpnIおよびBamHIで消化したプラスミドFlag‐pcDNA’にクローニングし、Erdj5 Jタンパク質のJドメインをコードするDNAセグメ
ントを挿入してプラスミド(Jドメイン)‐Flag‐pcDNA’を得た。ここで、「(Jドメイン)」とは、以下の実施例に明記するタンパク質発現増強ポリペプチドを指す。
多様なタンパク質構築物をコードする発現ベクタープラスミドを、X-tremeGENE HP形質移入試薬(カタログ番号06365752001、Roche)を用いてHEK293細胞に形質移入した。以下の実施例に示すように、形質移入の効率を確認するため、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する別のプラスミドを、本発明の融合タンパク質をコードする各発現ベクタープラスミドと共に形質移入した。形質移入細胞の培養液を2日間インキュベートし、細胞を2mMのPMSFを含有する溶解緩衝液(10mM Tris-HCl、pH8.0、150mM NaCl、10mM EDTA、2%SDS)に溶解した。超音波処理を短時間行った後、サンプルの発現タンパク質について、ドットブロット分析またはウェスタン免疫ブロット分析を用いて分析した。ウェスタンブロット分析のため、サンプルをSDS‐サンプルの緩衝液中で煮沸し、ポリアクリルアミド電気泳動に供し、続いて、分離されたタンパク質バンドを膜(PVDF膜)に転写した。形質移入の内部管理としてのGFPの発現を、抗GFP抗体を用いて検出した。
タログ番号CRL‐12444)とプラスミドp6G425V11N35A.choSD(カタログ番号209552)はAmerican Type Culture Collection(バージニア州、マナナス)から購入した。
IL13受容体であるIL13Rα2は、インターロイキン13(IL13)に結合してアレルギー性炎症を媒介する膜タンパク質である。IL13Rα2受容体タンパク質はタンパク質折り畳みが難しいため、哺乳動物細胞では不安定なタンパク質であることが知られている(Genetic Engineering & Biotechnology News, 28(5)(2008))。発現された
IL13Rα2タンパク質の一部は細胞表面で消化されて細胞外空間に排出される。この切断型IL13Rα2(「IL13Rα2TF」ともいう)になってもIL13結合能は有しているが、全長IL13Rα2タンパク質の膜貫通領域および細胞質領域がないため、細胞にシグナルを伝達することはできない。このため、切断型IL13Rα2は、炎症反応を誘発するシグナルを細胞に伝達することなくIL13分子を結合することによって喘息を治療するための一種の囮受容体として使用されてきた(Zhang, et al., J. Biol. Chem., 272(14): 9474-80 (1997))。遺伝子改変した切断型IL13Rα2が細菌で発現されたが、そのタンパク質は凝集して封入体となり、そこからタンパク質が精製された(Tang et al., Molec. Immunol. 39:719-727(2003))。しかし、形質移入細胞によるIL
13Rα2TFタンパク質の発現に対する制限の1つは、適切な機能性立体構造への折り畳みの効率の悪さが原因だと考えられてきたことがわかっている。タンパク質は、適切な立体構造に折り畳みできない場合、アミノ酸の分解と除去のためにプロテアソームへ誘導される。したがって、形質移入細胞内でIL13Rα2TF分子を産生するには、タンパク質の発現と分泌という制限が伴うことが認識されている(Lee et al., Cell Technol. for Cell Products, 29-39 (2007))。
的結合ドメインとしてのIL13タンパク質と連結させた融合タンパク質とした。
表32.V5タグで標識したIL13Rα2TFタンパク質のアミノ酸配列
表33.Flagタグで標識したIL13タンパク質のアミノ酸配列
gエピトープタグが含まれていた。
表34.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐IL13融合タンパク質のアミノ酸
配列
しかし、IL13Rα2TFを本発明のJドメイン‐IL13融合タンパク質と共発現させたところ、細胞内でのIL13Rα2TFの発現レベルがさらに増強され(中央図、左から4番目のレーン)、分泌されたIL13Rα2TFタンパク質の発現レベルは、IL13Rα2TFを単独で発現させた場合(上図、左から2番目のレーン)またはIL13Rα2TFとIL13リガンドとを共発現させた場合(上図、左から3番目のレーン)と比較して著しく増加した(上図、左から4番目のレーン)。結果は、本発明のJドメイン‐IL13融合タンパク質と共発現させることによってIL13Rα2TFタンパク質の安定性も分泌も改善されたことを示している。
先に述べたとおり、切断型IL13Rα2(IL13Rα2TF)はIL13Rα2受容体タンパク質のうちIL13リガンドに結合する機能性ドメインを含む細胞外ドメインを含む。しかし、IL13Rα2TFの生成もタンパク質の発現および分泌が難しいため非効率的である。治療的に重要なタンパク質、特に受容体タンパク質のより安定な形態を生成するために採用されてきた戦略の1つは、目的のタンパク質の機能性部分の全部または一部を免疫グロブリンのFcドメインの定常ドメインと連結させた融合タンパク質を作製することである。このようなFc融合タンパク質形態は、治療に重要な所望の活性が得られ、Fcドメインによって生体内での血清半減期が長くなり投薬頻度も減るような、役立つ可能性のある薬物群を設計するために用いられてきた。このようなFc融合タンパク質では、「目的のタンパク質」ドメイン(たとえば受容体タンパク質の細胞外のリガンド結合ドメイン)は所望の機能的特性(たとえばリガンド結合性)を保持する。
表35.V5タグで標識したIL13Rα2TF‐Fc融合タンパク質のアミノ酸配列
表36.Flagタグで標識したタンパク質Aのアミノ酸配列
ノ酸配列
のアミノ酸配列を下の表に示す。
表38.Flagタグで標識したErdj5 Jドメイン‐タンパク質A融合タンパク質のアミ
ノ酸配列
J‐タンパク質A」)、Erdj5 Jドメイン‐タンパク質A融合タンパク質と共発現させた
場合(「J2‐タンパク質A」)の、培地でのIL13Rα2TF‐Fc融合タンパク質の発現レベルを比較した。形質移入細胞を2日間培養し、細胞培地のサンプルを回収し、V5タグで標識したIL13Rα2TF‐Fc融合タンパク質の分泌を検出するために、抗V5抗体を用いたウェスタンブロット(免疫ブロット)分析によって分析した。図12Aは、培地のウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのX線フィルム画像を示す。図12Aのレーン1は、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクター(空のベクター)を用いて形質移入した細胞を含む「疑似」培養液の培地である。単独で発現させた場合(レーン2)、多少のIL13Rα2TF‐Fc融合タンパク質が培地で検出された。図12Aのレーン3に示すように、タンパク質Aと共発現させた場合(タンパク質Aのみ)、培地に分泌されたIL13Rα2TF‐Fc融合タンパク質のレベルの有意な増強は得られなかった。しかし、いずれかのJドメイン‐タンパク質A融合タンパク質と共発現させることによって培地に分泌されたIL13Rα2TF‐Fc融合タンパク質の発現レベルは有意に増強された(図12Aのレーン4およびレーン5)。重要なことに、IL13Rα2TF‐Fcをタンパク質Aのみと共発現させてもIL13Rα2TF‐Fcの分泌には影響しなかった(レーン3)という事実から、以下のことがわかる:(1)分泌されるIL13Rα2TF‐Fcの発現レベルを増強するにはJドメイン‐タンパク質A融合タンパク質のJドメインが必須である;(2)分泌されるIL13Rα2TF‐Fc標的タンパク質の発現レベルを増強するための標的特異性を得るにはJドメイン‐タンパク質A融合タンパク質のタンパク質Aドメインが必須である。
定分析した結果を図12Bの各棒グラフに示す。図12Bの棒グラフは、IL13Rα2TF‐FcをいずれかのJドメイン‐タンパク質A融合タンパク質と共発現させた(棒グラフ4および5)ことによって、分泌されたIL13Rα2TF‐Fcの発現レベルが、IL13Rα2TF‐Fcを単独で発現させた場合(棒グラフ2)またはIL13Rα2TF‐Fcをタンパク質Aのみと共発現させた場合(棒グラフ3)と比較して有意に増強されたことを明確に示している。
数種類の異なるFc融合タンパク質の増強について本発明のJドメイン‐タンパク質A融合タンパク質の有効性を試験し比較するために、一連の実験を実施した。形質移入細胞の培養液から採取した培地のウェスタンブロット分析の結果を図13に示す。
上記の実施例5の結果と一致して、形質移入細胞内でIL13Rα2TF‐Fcタンパク質をErdj3 Jドメイン-タンパク質A融合タンパク質と共発現させることによって、培地に分泌されたIL13Rα2TF‐Fcタンパク質の発現レベル(図13Aの左図のレーン2参照)が、IL13Rα2TF‐Fcタンパク質を単独で発現する形質移入細胞に見られたレベル(図13Aの左図のレーン1参照)と比較して有意に増強された。分泌されたIL13Rα2TF‐Fcタンパク質の発現レベルが有意に増強したことは、図13Aの左図の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した図13Aの右図の各棒グラフに示す結果からも明らかである。
腫瘍壊死因子α(TNF‐α)は、TNF‐α受容体(TNFR1)に結合して炎症反応を誘発する主要なサイトカインである。この炎症反応は、関節リウマチ、クローン病、乾癬などの多くの自己免疫疾患に関与する。切断型TNF‐α受容体(TNFR1TF)タンパク質は、TNF‐αに結合することによってTNF‐αの活性を阻害するための囮受容体として用いられる。エタネルセプト(ENBREL(登録商標)として市販されている(Amgen))は、切断型TNFRをFcドメインと融合した(TNFR1TF‐Fc)TNF‐α阻害薬である。その分子のうちTNFR1TFドメインが所望のTNF‐α結合特異性を付与し、免疫グロブリンFcドメインが患者の体内を循環する薬物の生体内安定性を加えると考えられている。
表39.TNFR1TF‐Fcタンパク質のアミノ酸配列
ドメイン‐タンパク質A融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地(レーン2)を示す。結果は、TNFR1TF‐Fc融合タンパク質とErdj3 Jドメイン‐タンパク質
A融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞内で分泌されたTNFR1TF‐Fc融合タンパク質の発現レベルが、Jドメイン‐タンパク質A融合タンパク質の非存在下で発現されたTNFR1TF‐Fc融合タンパク質のレベルと比較して有意に増強されたことを示している。分泌されたTNFR1TF‐Fc融合タンパク質の発現レベルが有意に増強したことは、図13Bの左図のレーンのシグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した図13Bの右図の各棒グラフに示す結果からも明らかである。
α1アンチトリプシンタンパク質(α1AT)は肝臓で分泌されて循環器系へ移動する。α1ATの機能は組織(特に肺組織)を過剰なプロテアーゼ活性から保護することである。α1アンチトリプシン欠損症の患者の肺組織はプロテアーゼによって重度の損傷を受ける可能性がある。このような患者は、肺気腫、喘息、および/または慢性閉塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease(COPD))を発症する可能性がある。現
在、α1AT(ヒト血清から精製される)がα1アンチトリプシン欠損症の患者の治療に用いられているが、この治療は高価であり、精製したα1ATを受ける患者にはヒト血清中に存在する病原体に感染する危険性がある。
表40.V5タグで標識したα1AT‐Fc融合タンパク質のアミノ酸配列
ィルム画像であり、α1AT‐Fc融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の培地(レーン1)またはα1AT‐Fc融合タンパク質と上記のErdj3 Jドメイン-タンパク質A融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地(レーン2)を示す。結果は、分泌されたα1AT‐Fc融合タンパク質のレベル(レーン2)が、Jドメイン‐タンパク質A融合タンパク質の非存在下で発現されたα1AT‐Fc融合タンパク質のレベル(レーン1)と比較して有意に増強されたことを示している。分泌されたα1AT‐Fc融合タンパク質の発現レベルが有意に増強したことは、図13Cの左図のレーンのシグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した図13Cの右図の各棒グラフに示す結果からも明らかである。
上記の試験から、Jドメイン‐タンパク質A融合タンパク質を共発現させることによってFc融合タンパク質の発現および分泌が有意に増強されたことがわかった。タンパク質Aは、免疫グロブリンのFc領域に結合する公知のタンパク質の1つである。この試験では、免疫グロブリンドメインに結合することが知られている他のタンパク質をJタンパク質のJドメインと融合することによって、分泌される標的抗体の発現レベルを増強することが可能かを調べた。
表41.Flagタグで標識したタンパク質Lのアミノ酸配列
にはFlagエピトープタグが含まれていた。
表42.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐タンパク質L融合タンパク質のアミ
ノ酸配列
表43.Flagタグで標識したIL8タンパク質のアミノ酸配列
agエピトープタグを含んでいた。
表44.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐IL8融合タンパク質のアミノ酸配
列
A融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞(J‐タンパク質A);抗IL8抗体とタンパク質Lとを共発現する形質移入細胞(タンパク質Lのみ);抗IL8抗体と本発明のErdj3 Jドメイン‐タンパク質L融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞(J‐タン
パク質L);抗IL8抗体とそのIL8リガンドを共発現する形質移入細胞(IL8);本発明のErdj3 Jドメイン‐IL8リガンド融合タンパク質を共発現する形質移入細胞(
J‐IL8);Erdj3 J‐タンパク質A融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞(
J‐タンパク質A);本発明のErdj3 Jドメイン‐タンパク質L融合タンパク質を単独発
現する形質移入細胞(J‐タンパク質L);および本発明のErdj3 Jドメイン‐IL8リ
ガンド融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞(J‐IL8)。培地での抗IL8抗体の発現を、抗ヒトIgG(抗hIgG抗体、カタログ番号AP112P、Millipore)抗体を用いたドットブロット分析によって分析した。
L8融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞(レーン10、J‐IL8)の培地ではシグナルが検出されなかった。このことは、3種すべての融合タンパク質が、共発現された抗IL8抗体標的タンパク質を特異的に標的としてその発現を増強したことを示す。
結合ドメイン(ここではタンパク質A、タンパク質L、またはIL8)と連結させた本発明の融合タンパク質と共発現させることによって、分泌された抗IL8抗体の発現が、融合していない標的タンパク質結合ドメインタンパク質のみ(タンパク質Gのみ、タンパク質Lのみ、またはIL8のみ)と共発現させた場合と比較して有意に増強されたことを明確に示している。
この試験では、商業価値のある確立された産生細胞株で既に安定に産生されている標的タンパク質の発現のレベルを改善するために本発明の融合タンパク質を用いることができるかを調べる。この実験には、American Type Culture Collection(受託番号CRL‐124444、American Type Culture Collection(バージニア州、マナナス))から入手した、ヒト化抗IL8 IgG1抗体を安定に発現するCHO‐DP12細胞株を、抗IL8抗体を発現させるための発現ベクタープラスミド(受託番号209552、ATCC(バージニア州、マナナス))と共に使用した。本発明の融合タンパク質としては、上記のErdj3 Jドメイン‐タンパク質A融合タンパク質を使用した。CHO‐DP12産生細胞株の細
胞を、Erdj3 Jドメイン‐タンパク質A融合タンパク質をコードする構造遺伝子を作動可
能に連結させた発現ベクターで形質移入した。形質移入の効率は、CHO‐DP12細胞ではHEK293細胞ほど高くはなかった。しかし、図15Aのドットブロット分析に示すように、ヒト化抗体をJドメイン‐タンパク質A融合タンパク質と共発現させることによって、培地に分泌された抗体の発現レベル(レーン3)はJドメイン‐タンパク質A融合タンパク質の非存在下で発現された抗体の発現レベル(レーン2、なし)と比較して有意に増強された。
実施例9.1.別のタンパク質種に由来するFc結合ドメインを含む融合タンパク質
本実施例では、Jドメイン(タンパク質発現増強ポリペプチドドメインとして)を抗体分子のFc領域に結合することが報告されている多様なポリペプチドのいずれかと連結させた様々な融合タンパク質について試験する一連の実験を示す。多様なJドメイン融合タンパク質を、形質移入HEK293細胞の培地に分泌されたIL13Rα2TF‐Fc融合タンパク質の発現レベルに対する増強能力について、上記実施例5に記載のとおり試験し比較した。
メインを、ある種の免疫グロブリンのFcドメインに結合することが知られているタンパク質Gと連結させた。実施例5および図11BでJ‐タンパク質A融合タンパク質について示したように、Flagエピトープタグをタンパク質GドメインのC末端に連結させた。Flagタグで標識した本発明のJドメイン‐タンパク質G融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表45.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐タンパク質G融合タンパク質のアミ
ノ酸配列
メインを、ある種の免疫グロブリンのFcドメインに結合する受容体であるヒトFc受容体(hFcR)タンパク質と連結させた。実施例5および図11BでJ‐タンパク質A融合タンパク質について示したように、FlagエピトープタグをhFcRドメインのC末端に連結させた。Flagタグで標識したJドメイン‐hFcR融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表46.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐hFcR融合タンパク質のアミノ酸
配列
メインを、ある種の免疫グロブリンのFcドメインに結合する受容体であるアカゲザル(Macaca mulatta)ラジノウイルスFc受容体(vFcR)タンパク質と連結させた。実施例5および図11BでJ‐タンパク質A融合タンパク質について示したように、FlagエピトープタグをvFcRドメインのC末端に連結させた。Flagタグで標識したJドメイン‐vFcR融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表47.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐vFcR融合タンパク質のアミノ酸
配列
メインを、有意なFc結合活性を有さない単純ヘルペスウイルス1型のgIタンパク質と連結させた。実施例5および図11BでJ‐タンパク質A融合タンパク質について示したように、FlagエピトープタグをgIドメインのC末端に連結させた。Flagタグで標識したJドメイン‐gI融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表48.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐gI融合タンパク質のアミノ酸配列
メインを、免疫グロブリンのFcドメインに対し比較的弱い親和性を有する単純ヘルペスウイルス1型のgEタンパク質と連結させた。実施例5および図11BでJ‐タンパク質A融合タンパク質について示したように、FlagエピトープタグをgEドメインのC末端に連結させた。Flagタグで標識したJドメイン‐gE融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表49.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐gE融合タンパク質のアミノ酸配列
メイン融合タンパク質と共発現させた場合(「J‐gI」);Jドメインを単純純ヘルペスウイルス1型のgEタンパク質と連結させたJドメイン融合タンパク質と共発現させた場合(「J‐gE」);およびJ‐gIとJ‐gE両方と共発現させた場合(「J‐gI+J‐gE」)。形質移入細胞を2日間培養し、細胞培地のサンプルを回収し、V5タグで標識したIL13Rα2TFの分泌を検出するために抗V5抗体を用いたウェスタンブロット(免疫ブロット)分析によって分析した。
ーン2)。IL13Rα2TF‐Fcタンパク質をJドメイン‐タンパク質G融合タンパク質と共発現させた場合にも、分泌されたIL13Rα2TF‐Fcタンパク質の発現レベル(図16Aのレーン4)が、IL13Rα2TFを単独で発現させた場合の発現レベル(図16Aのレーン1)またはIL13Rα2TF‐Fcをタンパク質Aのみと共発現させた場合の発現レベル(図16Aのレーン3)と比較して有意に増強された。
発現を増強できなかった(図16Aのレーン5およびレーン6)うえ、実際にはIL13Rα2TF‐Fcタンパク質を単独で発現する細胞に見られた低レベルの分泌タンパク質(図16Aのレーン1)の発現さえも抑制したようであった。このように基準の分泌量す
らも明らかに抑制したことについて、考えられる説明としては、これらの実験に使用したJドメイン‐FcR融合タンパク質が小胞体(ER)で捕捉されたという可能性がある。Fc領域を有するタンパク質を標的としてその発現を増強するためのFcR領域を含む機能的な構築物を見出すには、さらなる研究が必要である。
免疫グロブリン分子のFcドメインに結合する多様なペプチドが知られている。この実験では、Jドメイン(タンパク質発現増強ポリペプチドとして)を数種類の代表的なFc結合性ペプチドのそれぞれ(標的結合ドメインとして)と連結させた、Fcドメインを有するタンパク質の発現レベルを増強するのに用いるための多様な融合タンパク質を試験した。融合タンパク質を構築するのに用いた6種類のペプチドを下の表に示す。
表50.Fcドメインに結合する代表的なペプチドのアミノ酸配列
P1ペプチドと連結させたJドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Flagエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する13個のアミノ酸残基がC末端に付加された配列であった。
表51.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐FcBP1融合タンパク質のアミノ
酸配列
P2ペプチドと連結させたJドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Flagエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する13個のアミノ酸残基をC末端に付加された配列であった。
表52.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐FcBP2融合タンパク質のアミノ
酸配列
P3ペプチドと連結させたJドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Flagエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する13個のアミノ酸残基をC末端に付加された配列であった。
表53.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐FcBP3融合タンパク質のアミノ
酸配列
P4ペプチドと連結させたJドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Flagエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する13個のアミノ酸残基をC末端に付加された配列であった。
表54.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐FcBP4融合タンパク質のアミノ
酸配列
P5ペプチドと連結させたJドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Flagエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する13個のアミノ酸残基をC末端に付加された配列であった。
表55.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐FcBP5融合タンパク質のアミノ
酸配列
P6ペプチドと連結させたJドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Flagエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する13個のアミノ酸残基をC末端に付加された配列であった。
表56.Flagタグで標識したErdj3 Jドメイン‐FcBP6融合タンパク質のアミノ
酸配列
上記の実験の結果は、目的の標的タンパク質と、タンパク質発現増強ポリペプチドドメインを標的タンパク質に結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質とを共発現させることによって、標的タンパク質の適切な細胞内位置または細胞外位置での発現レベルが、融合タンパク質の非存在下での標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に増強されることを示している。
非改変配列または改変配列で用いた場合に目的の標的タンパク質の発現レベルを増強するのに有効な必要最小限のアミノ酸を決定するためにさらに分析を行った。
シグナル配列−リンカー1−(Jドメイン、断片またはJドメインアナログポリペプチド配列)−リンカー2−タンパク質A−リンカー3−Flagエピトープタグ。
表57.Flagタグで標識した試験タンパク質A融合物のアミノ酸構造
表58−1〜表58−3.タンパク質発現増強活性について試験したポリペプチドのアミノ酸配列
配列番号48)を有することを示している。ポリペプチド3‐29配列はJドメインのαヘリックスIIに位置するが、隣接する(C末端側)ループドメインの残基を全く含まない。
以下はポリペプチド配列の変異データの分析の概要である。この分析によって、Erdj3のJドメインのうちタンパク質発現増強活性をもたらす最小限のポリペプチド断片配列(ポリペプチド3‐29;配列番号48)に加え、以下に示す新規なタンパク質発現増強ポリペプチドのファミリーを定義する構造式も見出すことができた。
表59.変異ポリペプチドのアミノ酸配列およびタンパク質発現増強活性
(a)3‐29:IKKAYRKLA(配列番号48)(1位について、下の解析要約(1)を参
照)
(b)3‐44:IKAYRKLA(配列番号295)(非活性;3位について、下の解析要約(2)を参照)
(c)3‐45:IKK YRKLA(配列番号53)(活性;4位について、下の解析要約(3
)を参照)
(d)3‐39:IKKARKLA(配列番号294)(非活性;5位について、下の解析要約(4)を参照)
(e)3‐46:IKKAYKLA(配列番号54)(活性;6位について、下の解析要約(5)を参照)
(f)3‐47:IKKAYRLA(配列番号55)(活性;7位について、下の解析要約(5)を参照)
(g)3‐48:IKKAYRKA(配列番号56)(活性;8位について、下の解析要約(6)を参照)
(h)3‐29:IKKAYRKLA(配列番号48)(高活性;9位について、下の解析要約(
6)を参照)
解析要約
(1)IKKAYRKLA(配列番号48)
1位のアミノ酸が活性に必須である。
Jタンパク質メンバー(47種類のJタンパク質)間で1位のアミノ酸を比較した結果、1位のアミノ酸の割合は以下のとおりであった:
I(34例)、L(6例)、V(4例)、M(1例)、A(1例)、R(1例)。
これらのアミノ酸は、Arg(R)を除いてすべて非極性側鎖基を有する。
その他のJタンパク質メンバーに由来する以下の構築物を作製し試験した:
3‐49:LKKAYRKLA(配列番号57)、高活性
3‐50:VKKAYRKLA(配列番号58)、高活性
3‐51:MKKAYRKLA(配列番号59)、高活性
3‐52:AKKAYRKLA(配列番号60)、高活性
3‐53:SKKAYRKLA(配列番号296)、非活性
3‐54:FKKAYRKLA(配列番号297)、非活性。
したがって、1位は非極性アミノ酸側鎖基を有するアミノ酸すなわちI、L、V、A、Mであることが好ましい。
(2)IK AYRKLA(配列番号295)、非活性
このことから2つの可能性が示唆される:
a)この位置には2個のアミノ酸が必要である。
3‐55:IAQAYRKLA(配列番号298)、非活性
3‐56:ILAAYRKLA(配列番号299)、非活性
何らかの特定のアミノ酸が必要であることが示されている。
b)リジンが2個必要であるか、1個で十分である。
これらの2つの位置についてJタンパク質メンバー(47種類のJタンパク質)間で比較したところ、これらの2つの位置は以下の割合によっても示されるように、よく保存されていることがわかった:
KK(26例)、KR(5例)、RK(3例)、AR(3例)、KA(2例)、KQ(2例)、KL(1例)、IK(1例)、NK(1例)、RQ(1例)、RD(1例)、LA(1例)。
これらは1例を除いて、すべて塩基性アミノ酸側鎖を有するアミノ酸を少なくとも1個含む。
そこで、以下の置換変異体を作製し試験した:
3‐57:IAKAYRKLA(配列番号61)、活性
3‐58:IKAAYRKLA(配列番号62)、活性。
したがって、2位と3位のうち少なくとも一方のアミノ酸が塩基性アミノ酸KまたはRであると結論づけられる。
(3)IKK YRKLA(配列番号53)、活性
この結果は、この位置には何らかのアミノ酸が存在する方が良いが必須ではないことを示している。
この位置についてJタンパク質メンバー(47種類のJタンパク質)間で比較したところ、以下の割合にも示されるように、この位置もよく保存されている:
A(36例)、K(2例)、R(2例)、S(2例)、Q(2例)、T(1例)、I(1例)、E(1例)。
以下のポリペプチドを構築し試験した:
3‐59:IKKRYRKLA(配列番号63);塩基性アミノ酸、高活性
3‐60:IKKSYRKLA(配列番号64);極性無電荷アミノ酸、活性
3‐61:IKKQYRKLA(配列番号65);極性無電荷アミノ酸、活性
3‐62:IKKEYRKLA(配列番号66);酸性アミノ酸、活性
3‐63:IKKFYRKLA(配列番号67);芳香族アミノ酸、活性
3‐64:IKKCYRKLA(配列番号68);極性無電荷アミノ酸、活性。
以上の置換変異体から、4位を欠失させても活性は保持されるため、4位は20種類の天然アミノ酸のいずれであってもよいことが結論づけられる。
(4)IKKA RKLA(配列番号312);非活性
この結果は、5位のアミノ酸が必須であることを示す。
この部分をJタンパク質メンバー(47種類のタンパク質)間で比較したところ、アミノ酸の分布は以下のとおりであった:
Y(34例)、F(10例)、H(2例)、I(1例)。
そこで、以下のポリペプチドを作製し試験した:
3‐65:IKKAFRKLA(配列番号69):芳香族アミノ酸、高活性
3‐66:IKKAHRKLA(配列番号300):正電荷アミノ酸、非活性
3‐67:IKKAIRKLA(配列番号301):非極性アミノ酸、非活性
3‐68:IKKAWRKLA(配列番号70):芳香族 アミノ酸、高活性
3‐69:IKKAARKLA(配列番号302):非極性アミノ酸、非活性
3‐70:IKKASRKLA(配列番号303):非極性アミノ酸、非活性。
したがって、5位のアミノ酸は芳香族アミノ酸すなわちY、FまたはWである。
(5)
IKKAY KLA(配列番号313)、活性
IKKAYR LA(配列番号314)、活性
この位置をJタンパク質メンバー(47種類のJタンパク質)間で比較したところ、少なくとも一方のアミノ酸が塩基性アミノ酸である例は47例中43例であった(両方が塩基性アミノ酸である例は23例、一方が塩基性アミノ酸である例は20例)。
以下の変異ポリペプチドは6位と7位の2個のアミノ酸が置換されている:
3‐71:IKKAYHQLA(配列番号304)、非活性
3‐72:IKKAYYQLA(配列番号305)、非活性
3‐73:IKKAYFSLA(配列番号306)、非活性。
したがって、6位と7位のアミノ酸のうち少なくとも一方は塩基性アミノ酸KまたはRである。
(6)
IKKAYRK A(配列番号56)、活性
IKKAYRKL (配列番号315)、活性
これらの位置についてJタンパク質メンバー(47種類のJタンパク質メンバー)間で比較したところ、両方がLおよびAである例は47例中25例であり、そのすべての例でL‐Aであった。これらの位置のアミノ酸のうち少なくとも一方がLまたはAである例は14例、LでもAでもない例は8例であった。
2個のアミノ酸を置換して以下の変異ポリペプチドを作製し、活性を試験した:
3‐74:IKKAYRKQS(配列番号307)、非活性
3‐75:IKKAYRKQC(配列番号308)、非活性
3‐76:IKKAYRKDI(配列番号309)、非活性。
以下の変異ポリペプチドは、記載のとおり8位が置換されている:
3‐77:IKKAYRKQA(配列番号71):極性アミノ酸、高活性
3‐78:IKKAYRKMA(配列番号72):非極性アミノ酸、高活性
3‐79:IKKAYRKIA(配列番号73):非極性アミノ酸、活性
3‐80:IKKAYRKAA(配列番号74):非極性アミノ酸、活性
3‐81:IKKAYRKVA(配列番号75):非極性アミノ酸、活性
3‐82:IKKAYRKRA(配列番号76):塩基性アミノ酸、活性。
3‐83:IKKAYRKLM(配列番号77):非極性アミノ酸、高活性
3‐84:IKKAYRKLI(配列番号78):非極性アミノ酸、高活性
3‐85:IKKAYRKLV(配列番号79):非極性アミノ酸、高活性
3‐86:IKKAYRKLC(配列番号80):極性無電荷アミノ酸、活性
3‐87:IKKAYRKLS(配列番号81):極性無電荷アミノ酸、高活性
3‐88:IKKAYRKLY(配列番号82):芳香族アミノ酸、活性。
その他の変異ポリペプチドの結果は以下のとおりである:
3‐42:IKKAYRKALQ(配列番号51):LとAの置換、高活性
3‐43:IKKAYRKLLQ(配列番号52):両方ともL、高活性
したがって、X8とX9のアミノ酸のうち少なくとも一方はLまたはAである。
X1‐X2‐X3‐X4‐X5‐X6‐X7‐X8‐X9(配列番号47):
(式中、X1はイソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、またはメチオニン(M)であり、
X2およびX3はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン(K)またはアルギニン(R)であり、
X4は任意のアミノ酸であるか;X1〜X3が存在しX5〜X9が存在する場合、X4は存在しなくてもよく、
X5はチロシン(Y)、トリプトファン(W)、またはフェニルアラニン(F)であり、X6およびX7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン(K)またはアルギニン(R)であるか;X6およびX7のいずれか一方がKまたはRであり、X1〜X5が存在しX8およびX9が存在する場合、X6およびX7の他方は存在しなくてもよく、
X8およびX9は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン(L)またはアラニン(A)であるか;X8およびX9の一方がLまたはAでありX1〜X7が存在する場合、X8およびX9の他方は存在しなくてもよい)。
3‐89:IRKAYRKLSLTL(配列番号83)Erdj1、活性
3‐90:IKKQYRLLSLKY(配列番号84)Erdj2、活性
3‐91:IKKAFHKLAMKY(配列番号85)Erdj4、高活性
3‐92:IRQAFKKLALKL(配列番号86)Erdj5、活性
3‐93:IIKAYRKLALQW(配列番号87)Erdj6、活性
3‐94:IARAYRQLARRY(配列番号88)Erdj7、高活性
3‐95:IKRAYRRQALRY(配列番号89)Hsp40、高活性
3‐96:IKKSYRKLALKY(配列番号90)CSP、高活性
3‐97:IKKAYKRLAMKY(配列番号91)DnaJ、高活性
その他のJタンパク質に由来する以下の配列は、上記の式とは一致せず、これらのポリペプチドはタンパク質発現増強活性を有していない:
3‐98:MRKAYLKKC(配列番号310)SV40 Jタンパク質、非活性
3‐99:ILAEFKVRAL(配列番号311)DnajホモログサブファミリーCメンバー12、非活性。
先に説明したとおり、Erdj3のJドメインの変異分析の結果は、Jドメイン内に含まれるポリペプチド配列3‐29(IKKAYRKLA;配列番号48)が、非改変配列で上記の分析を用いた場合にポリペプチドが高いタンパク質発現増強活性をもたらすために最小限必要なJドメインの配列であることを示した。3‐29ポリペプチドのタンパク質発現増強活性を改変配列の場合についても試験した。
表60.V5タグで標識したIL13Rα2TF‐BSC1融合タンパク質のアミノ酸配列
表61.V5タグで標識したIL13Rα2TF‐BSC1MT融合タンパク質のアミノ酸配列
上記のIL13Rα2TF‐V5‐Fc標的タンパク質の発現を増強するためにBSC1‐タンパク質A融合タンパク質を非改変配列で用いることができるかを決定するため、上記Erdj3のJドメインの最小ポリペプチド断片であるBSC1ポリペプチド(IKKAYRKLA;配列番号48)を用いて、下の表に示すBSC1‐タンパク質A融合タンパク質を構成した。
表62.Flagタグで標識したBSC1‐タンパク質A融合タンパク質のアミノ酸配列
第VII因子(FVII)は外因性凝固経路のセリンエステラーゼであり、様々な出血性合併症の治療に広く利用されている。Hedner, Semin. Hematol., 43(suppl 1): S105-S107 (2006)を参照のこと。FVIIと組織因子(tissue factor(TF))との複合体は
、リン脂質とカルシウムの存在下で第X因子と活性化させ第Xa因子にする。
表63.V5タグで標識したFVII‐Fc標的タンパク質のアミノ酸配列
表64.Flagタグで標識したBSC1‐タンパク質G融合タンパク質のアミノ酸配列
第IX因子は血友病Bの治療に広く利用されており、そのFc融合タンパク質(FIX‐Fc)は現在、治験中であり(第III相)、良好な結果が得られている(効果の持続)。
表65.V5タグで標識したFIX‐Fc標的タンパク質のアミノ酸配列
第FVIII因子の生物学的重要性は、血友病Aについて実証されている。血友病Aは主に男性に起こる先天性の出血障害であり、X染色体関連性の第FVIII因子欠損が原因である。標準の治療には、止血に必要な欠けているFVIIIの補充が含まれる。血友病A患者の体内でのFVIII活性の半減期を延長するFVIII‐Fc融合タンパク質が開発された(Powell et al., Blood, 119(13): 3031-3037 (2012))。融合タンパク質
は2013年に米国食品医薬品局(United States Food and Drug Administration)に承認された(ELOCTATE(商標)(Biogen Idec))。
表66−1〜表66−4.V5タグで標識したFVIII‐Fc標的タンパク質のアミノ酸配列
として結果を図24に示す。空のベクターで形質移入しタンパク質を発現しない細胞培地を陰性対照とした(図24の左から1番目の棒グラフ)。ヒト血清を陽性対照として用いた(図24の右側の左から4番目の棒グラフ)。結果は、BSC1‐タンパク質G融合タンパク質とFVIII‐Fc標的タンパク質とを共発現させることによって、培地に分泌されたFVIII‐Fc標的タンパク質の発現レベル(図24の左から3番目の棒グラフ)が、BSC1‐タンパク質G融合タンパク質がない場合の標的タンパク質の発現レベル(図24の左から2番目の棒グラフ)と比較して有意に増強されたことを示している。
この実験では、上記のBSC1‐タンパク質A融合タンパク質を非改変配列で用いてHEK293形質移入細胞での抗IL8抗体標的タンパク質の発現レベルを改善できるかを調べた。
番号は図25Aの列番号と対応している。この一連の実験の結果は、抗IL8抗体標的タンパク質を、BSC1ポリペプチドをタンパク質A(標的タンパク質結合ドメイン)と連結させた本発明の融合タンパク質と共発現させることによって、分泌された抗IL8抗体の発現が有意に増強されたことを明確に示している。
この実験では、上記のBSC1‐タンパク質A融合タンパク質を非改変配列で用いて治療用抗体の発現レベルを改善できるかを調べた。
表67.ベバシズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列
を単独で発現する形質移入細胞の培地(棒グラフ2);または抗VEGF抗体とBSC1‐タンパク質A融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地(棒グラフ3)。図26Cの棒グラフ1は、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた疑似培養液の培地には有意なVEGF結合活性がなかったことを示している。結果は、BSC1‐タンパク質A融合タンパク質と共発現させた場合により高レベルで発現され分泌された抗VEGF抗体がヒトVEGF‐A結合活性を保持することを明確に示している。
この実験では、上記のBSC1‐タンパク質A融合タンパク質を非改変配列で用いて治療用TNFα抗体(アダリムマブ;Humira(登録商標)、AbbVie)の発現レベルを改善できるかを調べた。
表68.アダリムマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列
胞で発現された抗体のレベル(中央列)と比較して有意に増強されたことがわかる。
この実験では、上記の実施例8と同様の設計で、商業価値のある確立されたCHO‐DP12細胞株(American Type Culture Collection受託番号CRL‐124444、American Type Culture Collection(バージニア州、マナナス))で既に安定に産生されている抗IL8抗体の発現レベルを、BSC1‐タンパク質A融合タンパク質によって増強することができるかを調べた。
させた場合により高レベルで発現され分泌された抗IL8抗体がIL8結合活性を保持していたことを明確に示している。
この実験は、本発明によるタンパク質発現の増強が、重要なタンパク質の立体構造が不適切であるために起こる疾患を治療するのに有効であることを示す。
表69.V5タグで標識したα1AATZ‐Fc標的タンパク質のアミノ酸配列
本発明のその他の変更および態様が当業者に明らかである。
以下に、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
[請求項1]
以下の(a)〜(d)からなる群から選択される、単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド:
(a)Jタンパク質から単離されたJドメイン;
(b)Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片;
(c)Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドアナログであって、Jドメインポリペプチドアナログは式Iのアミノ酸配列を含む、タンパク質発現増強ポリペプチドアナログ:
(I)X1‐X2‐X3‐X4‐X5‐X6‐X7‐X8‐X9(配列番号47):
(式中、X1はイソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、またはメチオニン(M)であり、
X2およびX3はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がKまたはRであり、
X4は任意のアミノ酸であるか;X1〜X3が存在しX5〜X9が存在する場合、X4は存在しなくてもよく、
X5はチロシン(Y)、トリプトファン(W)、またはフェニルアラニン(F)であり、
X6およびX7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン(K)またはアルギニン(R)であるか;X6およびX7のいずれか一方がKまたはRであり、X1〜X5が存在しX8およびX9が存在する場合、X6およびX7の他方は存在しなくてもよく、
X8およびX9は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン(L)またはアラニン(A)であるか;X8およびX9の一方がLまたはAでありX1〜X7が存在する場合、X8およびX9の他方は存在しなくてもよい);および
(d)以下からなるデカペプチド群から選択される単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド:
IKKAYKLALQ(配列番号49)、
IKKAYRLALQ(配列番号50)、
IKKAYRKALQ(配列番号51)、または
IKKAYRKLLQ(配列番号52)。
[請求項2]
タンパク質発現増強ポリペプチドがJタンパク質から単離されたJドメインである、請求項1に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
[請求項3]
単離されたJドメインが、ERdjタンパク質、SV40ラージT抗原、または哺乳類のシステインストリングタンパク質α(CSP‐α)から単離されたJドメインである、請求項2に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
[請求項4]
単離されたJドメインが、Erdj1、Erdj2、Erdj3、Erdj4、Erdj5、Erdj6、Erdj7から選択されるErdjタンパク質から単離されたJドメインである、請求項3に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
[請求項5]
単離されたJドメインがErdj3から単離されたJドメインである、請求項4に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
[請求項6]
タンパク質発現増強ポリペプチドがJドメインから単離されたポリペプチド断片である、請求項1に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
[請求項7]
タンパク質発現増強ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、Jドメインから単離されたポリペプチド断片である、請求項6に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド:
I‐K‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A(配列番号48)、
I‐R‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐S‐L‐T‐L(配列番号83)、
I‐K‐K‐Q‐Y‐R‐L‐L‐S‐L‐K‐Y(配列番号84)、
I‐K‐K‐A‐F‐H‐K‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号85)、
I‐R‐Q‐A‐F‐K‐K‐L‐A‐L‐K‐L(配列番号86)、
I‐I‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐Q‐W(配列番号87)、
I‐A‐R‐A‐Y‐R‐Q‐L‐A‐R‐R‐Y(配列番号88)、
I‐K‐R‐A‐Y‐R‐R‐Q‐A‐L‐R‐Y(配列番号89)、
I‐K‐K‐S‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐K‐Y(配列番号90)および
I‐K‐K‐A‐Y‐K‐R‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号91)。
[請求項8]
タンパク質発現増強ポリペプチドがJドメインアナログポリペプチドであり、該ポリペプチドアナログが式Iのアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
[請求項9]
X1がI、L、V、AまたはMであり、
ジペプチドX2‐X3がKR、KK、RK、RR、AK、AR、KA、IK、NK、KQ、RQ、RDからなる群から選択され、
X4がA、S、T、R、S、Q、E、F、C、またはIであり、
X5がYまたはFであり、
ジペプチドX6‐X7がKR、KK、RK、RR、RQ、FR、RL、KL、HK、LK、QK、KVからなる群から選択され、
ジペプチドX8‐X9がLA、LL、AL、AA、LC、LV、QA、KA、LS、LI、LY、およびRAからなる群から選択される、
請求項8に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
[請求項10]
タンパク質発現増強ポリペプチドが以下のアミノ酸配列の1つを含む、請求項1に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド:
[請求項11]
請求項1〜10のいずれか一項に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
[請求項12]
請求項11に記載の単離された核酸分子を含む核酸ベクター分子。
[請求項13]
請求項12に記載の核酸ベクター分子を含む宿主細胞。
[請求項14]
単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質であって、
単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドは以下の(a)〜(d)からなる群から選択される、前記融合タンパク質:
(a)Jタンパク質から単離されたJドメイン;
(b)Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片;
(c)Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドアナログであって、Jドメインアナログポリペプチドは式Iのアミノ酸配列を含む、タンパク質発現増強ポリペプチドアナログ:
(I)X1‐X2‐X3‐X4‐X5‐X6‐X7‐X8‐X9(配列番号47):
(式中、X1はイソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、またはメチオニン(M)であり、
X2およびX3はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がKまたはRであり、
X4は任意のアミノ酸であるか;X1〜X3が存在しX5〜X9が存在する場合、X4は存在しなくてもよく、
X5はチロシン(Y)、トリプトファン(W)、またはフェニルアラニン(F)であり、
X6およびX7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン(K)またはアルギニン(R)であるか;X6およびX7のいずれか一方がKまたはRであり、X1〜X5が存在しX8およびX9が存在する場合、X6およびX7の他方は存在しなくてもよく、
X8およびX9は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン(L)またはアラニン(A)であるか;X8およびX9の一方がLまたはAでありX1〜X7が存在する場合、X8およびX9の他方は存在しなくてもよい);および
(d)以下からなるデカペプチド群から選択される単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド:
IKKAYKLALQ(配列番号49)、
IKKAYRLALQ(配列番号50)、
IKKAYRKALQ(配列番号51)、または
IKKAYRKLLQ(配列番号52)。
[請求項15]
タンパク質発現増強ポリペプチドが単離されたJドメインである、請求項14に記載の融合タンパク質。
[請求項16]
単離されたJドメインが、ERdjタンパク質、SV40ラージT抗原、または哺乳類のシステインストリングタンパク質α(CSP‐α)から単離されたJドメインである、請求項15に記載の融合タンパク質。
[請求項17]
単離されたJドメインが、Erdj1、Erdj2、Erdj3、Erdj4、Erdj5、Erdj6、Erdj7から選択されるErdjタンパク質から単離されたJドメインである、請求項16に記載の融合タンパク質。
[請求項18]
単離されたJドメインがErdj3から単離されたJドメインである、請求項17に記載の融合タンパク質。
[請求項19]
タンパク質発現増強ポリペプチドがJドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片である、請求項14に記載の融合タンパク質。
[請求項20]
タンパク質発現増強ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片である、請求項19に記載の融合タンパク質:
I‐K‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A(配列番号48)、
I‐R‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐S‐L‐T‐L(配列番号83)、
I‐K‐K‐Q‐Y‐R‐L‐L‐S‐L‐K‐Y(配列番号84)、
I‐K‐K‐A‐F‐H‐K‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号85)、
I‐R‐Q‐A‐F‐K‐K‐L‐A‐L‐K‐L(配列番号86)、
I‐I‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐Q‐W(配列番号87)、
I‐A‐R‐A‐Y‐R‐Q‐L‐A‐R‐R‐Y(配列番号88)、
I‐K‐R‐A‐Y‐R‐R‐Q‐A‐L‐R‐Y(配列番号89)、
I‐K‐K‐S‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐K‐Y(配列番号90)および
I‐K‐K‐A‐Y‐K‐R‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号91)。
[請求項21]
タンパク質発現増強ポリペプチドがJドメインアナログポリペプチドであり、ポリペプチドアナログが式Iのアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の融合タンパク質。
[請求項22]
X1がI、L、V、AまたはMであり、
ジペプチドX2‐X3がKR、KK、RK、RR、AK、AR、KA、IK、NK、KQ、RQ、RDからなる群から選択され、
X4がA、S、T、R、S、Q、E、F、C、またはIであり、
X5がYまたはFであり、
ジペプチドX6‐X7がKR、KK、RK、RR、RQ、FR、RL、KL、HK、LK、QK、KVからなる群から選択され、
ジペプチドX8‐X9がLA、LL、AL、AA、LC、LV、QA、KA、LS、LI、LY、およびRAからなる群から選択される、
請求項21に記載の融合タンパク質。
[請求項23]
タンパク質発現増強ポリペプチドが以下のアミノ酸配列の1つを含む、請求項14に記載の融合タンパク質:
[請求項24]
請求項14〜23のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
[請求項25]
請求項24に記載の単離された核酸分子を含む核酸ベクター分子。
[請求項26]
請求項25に記載の核酸ベクター分子を含む宿主細胞。
[請求項27]
タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質を発現させる方法であって、請求項26に記載の宿主細胞を融合タンパク質を発現させるために十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
[請求項28]
タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質を発現させる方法であって、請求項14に記載の融合タンパク質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に形質移入することと、形質移入された宿主細胞を融合タンパク質の発現を生じる条件下で培養することとを含む、前記方法。
[請求項29]
タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質を発現させる方法であって、下記工程を含む前記方法:
1)請求項14に記載の融合タンパク質をコードする組換え遺伝子配列を構築する工程、
2)組換え遺伝子配列を発現ベクターに挿入し、組換え遺伝子配列が転写プロモーター配列と作動可能に連結された組換え発現ベクターを作製する工程、
3)プロモーター配列と適合する宿主細胞に組換え発現ベクターを形質移入する工程、および
4)形質移入宿主細胞を、融合タンパク質の発現が可能な条件下で培養する工程。
[請求項30]
タンパク質機能を提供する天然の分泌タンパク質の分泌が不足している哺乳類患者細胞にタンパク質機能を回復させる方法であって、請求項1に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドを分泌タンパク質と連結させた融合タンパク質をコードする外因性の核酸分子を患者の細胞に挿入することを含み、融合タンパク質が発現されることによって、外因性核酸の非存在下では患者細胞内での分泌が不足している天然の分泌タンパク質の機能が提供される、前記方法。
[請求項31]
患者が、患者体内での天然の分泌タンパク質の分泌不足に関連した疾患を有する、請求項30に記載の方法。
[請求項32]
疾患が、プリオン関連疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症(CF)、α1アンチトリプシン欠損症からなる群より選択される、請求項31に記載の方法。
[請求項33]
患者が、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の分泌が不足したヒト患者であり、疾患が嚢胞性線維症である、請求項32に記載の方法。
[請求項34]
単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドを標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質であって、
単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドは以下の(a)〜(d)からなる群から選択される、前記融合タンパク質:
(a)Jタンパク質から単離されたJドメイン;
(b)Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片;
(c)Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドアナログであって、Jドメインアナログポリペプチドは式Iのアミノ酸配列を含む、前記タンパク質発現増強ポリペプチドアナログ:
(I)X1‐X2‐X3‐X4‐X5‐X6‐X7‐X8‐X9(配列番号47):
(式中、X1はイソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、またはメチオニン(M)であり、
X2およびX3はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がKまたはRであり、
X4は任意のアミノ酸であるか;X1〜X3が存在しX5〜X9が存在する場合、X4は存在しなくてもよく、
X5はチロシン(Y)、トリプトファン(W)、またはフェニルアラニン(F)であり、
X6およびX7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン(K)またはアルギニン(R)であるか;X6およびX7のいずれか一方がKまたはRであり、X1〜X5が存在しX8およびX9が存在する場合、X6およびX7の他方は存在しなくてもよく、
X8およびX9は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン(L)またはアラニン(A)であるか;X8およびX9の一方がLまたはAでありX1〜X7が存在する場合、X8およびX9の他方は存在しなくてもよい);および
(d)以下からなるデカペプチド群から選択される単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド:
IKKAYKLALQ(配列番号49)、
IKKAYRLALQ(配列番号50)、
IKKAYRKALQ(配列番号51)、または
IKKAYRKLLQ(配列番号52)。
[請求項35]
タンパク質発現増強ポリペプチドが単離されたJタンパク質である、請求項34に記載の融合タンパク質。
[請求項36]
単離されたJドメインが、ERdjタンパク質、SV40ラージT抗原、または哺乳類のシステインストリングタンパク質α(CSP‐α)から単離されたJドメインである、請求項35に記載の融合タンパク質。
[請求項37]
単離されたJドメインが、Erdj1、Erdj2、Erdj3、Erdj4、Erdj5、Erdj6、Erdj7から選択されるErdjタンパク質から単離されたJドメインである、請求項35に記載の融合タンパク質。
[請求項38]
単離されたJドメインがErdj3から単離されたJドメインである、請求項37に記載の融合タンパク質。
[請求項39]
タンパク質発現増強ポリペプチドがJドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片である、請求項34に記載の融合タンパク質。
[請求項40]
タンパク質発現増強ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、Jドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片である、請求項39に記載の融合タンパク質:
I‐K‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A(配列番号48)、
I‐R‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐S‐L‐T‐L(配列番号83)、
I‐K‐K‐Q‐Y‐R‐L‐L‐S‐L‐K‐Y(配列番号84)、
I‐K‐K‐A‐F‐H‐K‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号85)、
I‐R‐Q‐A‐F‐K‐K‐L‐A‐L‐K‐L(配列番号86)、
I‐I‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐Q‐W(配列番号87)、
I‐A‐R‐A‐Y‐R‐Q‐L‐A‐R‐R‐Y(配列番号88)、
I‐K‐R‐A‐Y‐R‐R‐Q‐A‐L‐R‐Y(配列番号89)、
I‐K‐K‐S‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐K‐Y(配列番号90)および
I‐K‐K‐A‐Y‐K‐R‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号91)。
[請求項41]
タンパク質発現増強ポリペプチドがJドメインアナログポリペプチドであり、Jドメインアナログポリペプチドが式Iのアミノ酸配列を有する、請求項34に記載の融合タンパク質。
[請求項42]
X1がI、L、V、AまたはMであり、
ジペプチドX2‐X3がKR、KK、RK、RR、AK、AR、KA、IK、NK、KQ、RQ、RDからなる群から選択され、
X4がA、S、T、R、S、Q、E、F、C、またはIであり、
X5がYまたはFであり、
ジペプチドX6‐X7がKR、KK、RK、RR、RQ、FR、RL、KL、HK、LK、QK、KVからなる群から選択され、
ジペプチドX8‐X9がLA、LL、AL、AA、LC、LV、QA、KA、LS、LI、LY、およびRAからなる群から選択される、
請求項41に記載の融合タンパク質。
[請求項43]
タンパク質発現増強ポリペプチドが以下のアミノ酸配列の1つを含む、請求項34に記載の融合タンパク質:
[請求項44]
標的タンパク質結合ドメインが抗体またはその抗原結合断片、抗体結合タンパク質、受容体タンパク質のリガンド結合ドメイン、受容体タンパク質のタンパク質リガンド、抗体またはその抗原結合断片が結合するタンパク質抗原、またはPDZドメインである、請求項34に記載の融合タンパク質。
[請求項45]
標的タンパク質結合ドメインが抗体結合タンパク質である、請求項44に記載の融合タンパク質。
[請求項46]
抗体結合タンパク質がFc結合タンパク質である、請求項45に記載の融合タンパク質。
[請求項47]
Fc結合タンパク質がタンパク質Aまたはタンパク質Gである、請求項46に記載の融合タンパク質。
[請求項48]
抗体結合タンパク質がタンパク質Lである、請求項45に記載の融合タンパク質。
[請求項49]
標的タンパク質結合ドメインが受容体タンパク質のリガンド結合ドメインであり、該受容体タンパク質がサイトカイン受容体である、請求項43に記載の融合タンパク質。
[請求項50]
標的タンパク質結合ドメインが受容体タンパク質に対するタンパク質リガンドであり、タンパク質リガンドがサイトカインである、請求項44に記載の融合タンパク質。
[請求項51]
請求項34〜50のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
[請求項52]
請求項51に記載の単離された核酸分子を含む核酸ベクター分子。
[請求項53]
請求項52に記載の核酸ベクター分子を含む宿主細胞。
[請求項54]
融合タンパク質を発現させる方法であって、請求項53に記載の宿主細胞を融合タンパク質を発現させるために十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
[請求項55]
宿主細胞が発現する目的の標的タンパク質の発現を増強する方法であって、タンパク質発現増強ポリペプチドを標的タンパク質結合ドメインと連結させた請求項34に記載の融合タンパク質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に形質移入することと、形質移入宿主細胞を、構造遺伝子にコードされる融合タンパク質と目的の標的タンパク質との共発現を生じる条件下で培養することとを含む、前記方法。
[請求項56]
目的の標的タンパク質の発現を増強する方法であって、下記工程を含む前記方法:
1)請求項1に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドを、目的の標的タンパクに結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質をコードする組換え遺伝子配列を構築する工程、
2)組換え遺伝子配列を発現ベクターに挿入し、組換え遺伝子配列が転写プロモーター配列と作動可能に連結された組換え発現ベクターを作製する工程、
3)プロモーター配列と適合する宿主細胞に組換え発現ベクターを形質移入する工程、および
4)形質移入宿主細胞を、融合タンパク質の発現が可能な条件下で培養する工程。
[請求項57]
分泌タンパク質機能を提供する天然の分泌タンパク質の分泌が不足している哺乳類患者細胞に分泌タンパク質機能を回復させる方法であって、請求項1に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドを天然分泌タンパク質と結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質をコードする、外因性の核酸分子を患者の細胞に挿入することを含み、融合タンパク質と天然分泌タンパク質が細胞内で発現されることによって、天然タンパク質の分泌が増強され、タンパク質機能が患者の細胞に与えられる、前記方法。
[請求項58]
患者が、患者体内での天然の分泌タンパク質の分泌不足に関連した疾患を有する、請求項57に記載の方法。
[請求項59]
疾患が、プリオン関連疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症(CF)、α1アンチトリプシン(AAT)欠損症からなる群より選択される、請求項58に記載の方法。
[請求項60]
患者が、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の分泌が不足したヒト患者であり、疾患が嚢胞性線維症である、請求項59に記載の方法。
[請求項61]
患者が、AATの分泌が不足しているヒト患者であり、疾患がAAT欠損症である、請求項59に記載の方法。
Claims (28)
- 宿主細胞において発現される目的の標的タンパク質の発現レベルを増強させるための融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質が、タンパク質発現増強ポリペプチド(PEEP)を標的タンパク質結合ドメイン(TPB)と連結させた、(PEEP)−(TPB)または(TPB)−(PEEP)の構造を含み、
前記タンパク質発現増強ポリペプチド(PEEP)が、
(a)4つのαヘリックス(I、II、III、およびIV)によって特徴付けられ、ヒスチジン、プロリン、およびアスパラギン酸配列モチーフ(HPDモチーフ)のトリペプチド配列をヘリックスIIとヘリックスIIIとの間に有するJタンパク質のポリペプチドドメインを含むJタンパク質から単離されたJドメイン;または、
(b)式Iのアミノ酸配列を有する、Jドメインアナログポリペプチド:
(I)X1‐X2‐X3‐X4‐X5‐X6‐X7‐X8‐X9(配列番号47):
(式中、X1はイソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、またはメチオニン(M)であり、
ジペプチドX2‐X3がKR、KK、RK、RR、AK、AR、KA、IK、NK、KQ、RQ、およびRDからなる群から選択され、
X4がA、S、T、R、Q、E、F、C、またはIであり、
X5がYまたはFであり、
ジペプチドX6‐X7がKR、KK、RK、RR、RQ、FR、RL、KL、HK、LK、QK、およびKVからなる群から選択され、
ジペプチドX8‐X9がLA、LL、AL、AA、LC、LV、QA、KA、LS、LI、LY、およびRAからなる群から選択されるものである)
;
であって、
前記標的タンパク質結合ドメイン(TPB)が、前記目的の標的タンパク質に結合できるポリペプチドであり、
前記融合タンパク質と前記標的タンパク質の前記宿主細胞内での共発現によって、目的の標的タンパク質の発現レベルを、前記融合タンパク質の共発現の非存在下での前記宿主細胞において発現した前記標的タンパク質の発現レベルに比べて増強させる、前記融合タンパク質。 - 宿主細胞において発現される目的の標的タンパク質が、宿主細胞内で発現される天然のタンパク質である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 宿主細胞において発現される目的の標的タンパク質が、宿主細胞に関する外因性のタンパク質である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 目的の標的タンパク質が、抗体、抗体の抗原結合部分、受容体タンパク質、免疫グロブリンのFc領域と連結されている受容体タンパク質の1以上の結合ドメインを含む融合タンパク質、サイトカイン、ペプチドホルモン、酵素、または形態形成タンパク質である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 目的の標的タンパク質が、IgG Fc領域を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- タンパク質発現増強ポリペプチド(PEEP)がJタンパク質から単離されたJドメインである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 単離されたJドメインが、ERdjタンパク質、SV40ラージT抗原、または哺乳類のシステインストリングタンパク質α(CSP‐α)から単離されたJドメインである、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 単離されたJドメインが、Erdj1、Erdj2、Erdj3、Erdj4、Erdj5、Erdj6、およびErdj7からなる群から選択されるErdjタンパク質から単離されたJドメインである、請求項6に記載の融合タンパク質。
- 単離されたJドメインがErdj3から単離されたJドメインである、請求項8に記載の融合タンパク質。
- タンパク質発現増強ポリペプチド(PEEP)が、式Iのアミノ酸配列を含むJドメインアナログポリペプチドである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- タンパク質発現増強ポリペプチドが、以下からなる群から選択されるJドメインアナログポリペプチドである、請求項10に記載の融合タンパク質:
I‐K‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A(配列番号48)、
I‐R‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐S‐L‐T‐L(配列番号83)、
I‐K‐K‐Q‐Y‐R‐L‐L‐S‐L‐K‐Y(配列番号84)、
I‐K‐K‐A‐F‐H‐K‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号85)、
I‐R‐Q‐A‐F‐K‐K‐L‐A‐L‐K‐L(配列番号86)、
I‐I‐K‐A‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐Q‐W(配列番号87)、
I‐A‐R‐A‐Y‐R‐Q‐L‐A‐R‐R‐Y(配列番号88)、
I‐K‐R‐A‐Y‐R‐R‐Q‐A‐L‐R‐Y(配列番号89)、
I‐K‐K‐S‐Y‐R‐K‐L‐A‐L‐K‐Y(配列番号90)および
I‐K‐K‐A‐Y‐K‐R‐L‐A‐M‐K‐Y(配列番号91)。 - タンパク質発現増強ポリペプチドが以下のアミノ酸配列の1つを含む、請求項10に記載の融合タンパク質:
- 標的タンパク質結合ドメイン(TPB)が、抗体またはその抗原結合断片、抗体結合タンパク質、受容体タンパク質のリガンド結合ドメイン、受容体タンパク質のタンパク質リガンド、抗体またはその抗原結合断片が結合するタンパク質抗原、またはPDZドメインである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 標的タンパク質結合ドメイン(TPB)が、抗体結合タンパク質である、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 抗体結合タンパク質が、Fc結合タンパク質またはそのFc結合断片である、請求項14に記載の融合タンパク質。
- Fc結合タンパク質が、タンパク質Aまたはタンパク質Gである、請求項15に記載の融合タンパク質。
- 抗体結合タンパク質が、タンパク質Lである、請求項14に記載の融合タンパク質。
- 標的タンパク質結合ドメイン(TPB)が受容体タンパク質のリガンド結合ドメインであり、受容体タンパク質がサイトカイン受容体である、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 標的タンパク質結合ドメイン(TPB)が受容体タンパク質に対するタンパク質リガンドであり、タンパク質リガンドがサイトカインである、請求項13に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項20に記載の単離された核酸分子を含む核酸ベクター分子。
- 請求項21に記載の核酸ベクター分子を含む宿主細胞。
- 融合タンパク質を発現させる方法であって、請求項22に記載の宿主細胞を融合タンパク質を発現させるために十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
- 宿主細胞が発現する目的の標的タンパク質の発現を増強する方法であって、請求項1〜19のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に形質移入すること、ここで前記融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメイン(TPB)が目的の標的タンパク質に結合できるものであり;および、形質移入宿主細胞を、前記融合タンパク質と前記目的の標的タンパク質の共発現を生じる条件下で培養することとを含む、前記方法。
- 分泌タンパク質機能を提供する天然の分泌タンパク質の分泌不足に関連した疾患を有する哺乳類対象において前記分泌タンパク質機能を回復させるための細胞製剤の製造方法であって、請求項1〜19のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする外因性の核酸分子を、前記対象から採取した細胞に挿入することを含み、ここで前記融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメイン(TPB)が天然の分泌タンパク質に結合できるものであり、前記融合タンパク質と前記天然分泌タンパク質が該核酸分子を挿入された該細胞内で共発現されることによって、十分な天然分泌タンパク質が分泌され、前記不足が補充される、前記製造方法。
- 疾患が、プリオン関連疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症(CF)、α1アンチトリプシン(AAT)欠損症からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
- 患者が、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の分泌が不足したヒト患者であり、疾患が嚢胞性線維症である、請求項25に記載の方法。
- 患者が、AATの分泌が不足しているヒト患者であり、疾患がAAT欠損症である、請求項25に記載の方法。
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