BR112020018670A2 - Receptor de antígeno quimérico de receptor alfa 2 da il-13 (il13ra2) para imunoterapia com células t específicas para tumor - Google Patents

Receptor de antígeno quimérico de receptor alfa 2 da il-13 (il13ra2) para imunoterapia com células t específicas para tumor Download PDF

Info

Publication number
BR112020018670A2
BR112020018670A2 BR112020018670-8A BR112020018670A BR112020018670A2 BR 112020018670 A2 BR112020018670 A2 BR 112020018670A2 BR 112020018670 A BR112020018670 A BR 112020018670A BR 112020018670 A2 BR112020018670 A2 BR 112020018670A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
nucleic acid
cells
cell
spacer
Prior art date
Application number
BR112020018670-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Giacomo Tampella
Michael C. Jensen
Original Assignee
Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) filed Critical Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute)
Publication of BR112020018670A2 publication Critical patent/BR112020018670A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464419—Receptors for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/47—Brain; Nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Physiology (AREA)

Abstract

algumas modalidades dos métodos e das composições fornecido(a)s nesse documento referem-se a receptores de antígenos quiméricos (cars) que se ligam especificamente a domínios extracelulares humanos do receptor alfa 2 da il-13 (il13ra2), células contendo esses cars, e métodos de imunoterapia com base em células que tem como alvo células cancerígenas, tais como células de tumores sólidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO DE RECEPTOR ALFA 2 DA IL-13 (IL13RA2) PARA IMUNOTERAPIA COM CÉLULAS T ESPECÍFICAS PARA TUMOR”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. n° 62/643055 depositado em 14 de março de 2018, intitulada "IL-13 RECEPTOR ALPHA 2 (IL13RA2) CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR TUMOR SPECIFIC T CELL IMMUNOTHERAPY” que é nesse documento expressamente incorporado por referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido é depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida como um arquivo intitulado SCRI169WOSEQLIST, criado em 12 de março de 2019, que tem aproximadamente 62 Kb de tamanho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequências é aqui expressamente incorporada por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] Algumas modalidades dos métodos e das composições fornecido(a)s nesse documento referem-se a receptores de antígenos quiméricos (CARs) que se ligam especificamente a domínios extracelulares humanos do receptor alfa 2 da IL-13 (IL13Ra2), células contendo esses CARs, e métodos de imunoterapia com base em células que tem como alvo células cancerígenas, tais como células de tumores sólidos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] Apesar de avanços significativos no entendimento do câncer do cérebro, durante a última década, a taxa de mortalidade tem permanecido consistente e novas terapias inovadoras são urgentemente necessárias. Até agora, a imunoterapia de células T emergiu como uma terapia para câncer promissora suportada por dados clínicos notáveis relatando a remissão completa em pacientes com malignidades de células B após a administração de células CAR-T que tem como alvo CD19. Entretanto, permanece uma necessidade de imunoterapias de células T adicionais e melhoradas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico, o receptor de antígeno quimérico compreendendo: um domínio de ligação de ligante que se liga a e/ou interage com um receptor de IL-13 alfa 2 (IL3Ra2); um espaçador de polipeptídeo entre o domínio de ligação de ligante e um domínio transmembranar; o domínio transmembranar; e a região de sinalização intracelular.
[006] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante compreende: uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (CDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, ou variações conservativas da mesma; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2l, ou variações conservativas da mesma; e/ou uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, ou variações conservativas da mesma.
[007] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante compreende: uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, ou variações conservativas da mesma; uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDR2) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, ou variações conservativas da mesma; e/ou uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDR3) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, ou variações conservativas da mesma.
[008] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante compreende um domínio variável da cadeia pesada
(VH) que compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18.
[009] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19.
[0010] Em algumas modalidades, em que o domínio de ligação de ligante compreende: uma CDR1 da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; uma CDR2 da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e/ou uma CDR3 da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
[0011] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligando compreende: uma CDR1 da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; uma CDR2 da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; e/ou uma CDR3 da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
[0012] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligando compreende um domínio VH compreendendo um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
18.
[0013] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligando compreende um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
[0014] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligando é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento de ligação de antígeno.
[0015] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de ligante é um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas modalidades, o scFv compreende uma orientação VL- VH. Em algumas modalidades, o fragmento variável de cadeia única (scFv) compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:61. Em algumas modalidades, o fragmento variável de cadeia única scFv) compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:6l.
[0016] Em algumas modalidades, o espaçador compreende uma sequência de aminoácidos de X1PPX2P.
[0017] Em algumas modalidades, a região espaçadora compreende uma porção de uma região de dobradiça de um anticorpo humano ou uma variante modificada do mesmo.
[0018] Em algumas modalidades, o espaçador tem 15 aminoácidos ou menos, mas não menos que 1 ou 2 aminoácido(s).
[0019] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 09. Em algumas modalidades o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 09 ou substituições conservativas da mesma.
[0020] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4 (S).
[0021] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4-CH3 (M).
[0022] Em algumas modalidades, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4-CH2 (L234D, N297A)-CHE (L).
[0023] Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende domínios de sinalização primários e coestimuladores, opcionalmente compreendendo todos ou uma porção de um CD3 zeta em combinação com um domínio coestimulador selecionado do grupo que consiste em domínios de sinalização de CD27, CD28, 4-1BB, OX-40, CD30, CD40, PD- 1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, NKG2C, e B7-H3 e combinações dos mesmos.
[0024] Em algumas formas de realização, a região de sinalização intracelular compreende uma porção de sinalização de um CD3 zeta e uma porção de sinalização de um 4-1BB.
[0025] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar de CD28 (CD28tm).
[0026] Algumas modalidades compreendem adicionalmente um ácido nucleico que codifica uma sequência marcadora. Em algumas modalidades, a sequência marcadora é um receptor truncado e, opcionalmente, é um EGFRt, um HER2t ou um CD19t.
[0027] Algumas modalidades compreendem adicionalmente um transgene de di-hidrofolato redutase configurado para seleção de metotrexato. Em algumas modalidades, o transgene de di-hidrofolato redutase é um mutante duplo de di- hidrofolato redutase (DHFRdm). Em algumas modalidades, o mutante duplo de di-hidrofolato redutase compreende mutações de aminoácidos de L22F e F31S.
[0028] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui fornecidas incluem um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral ou adenoviral.
[0029] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui fornecidos incluem um polipeptídeo receptor de antígeno quimérico (CAR) codificado pelo ácido nucleico de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento.
[0030] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui fornecidos incluem uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico de qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento.
[0031] Em algumas modalidades a célula hospedeira é uma célula de linfócito T citotóxica CD8+ selecionada do grupo que consiste em células T CD8+ naïve, células T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetora e células T CD8+ em massa. Em algumas modalidades, a célula de linfócito T citotóxica CD8+ é uma célula T de memória central e, em que a célula T de memória central é positiva para CD45RO+, CD62L+, e CD8+.
[0032] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de linfócito T auxiliar CD4+ selecionada do grupo que consiste em células T CD4+ naïve, células T CD4+ de memória central, células T CD4+ de memória efetora e células T CD4+ em massa. Em algumas modalidades, a célula de linfócito auxiliar CD4+ é uma célula T CD4+ naïve e, em que a célula T CD4+ naïve é positiva para CD45RA+, CD62L+ e CD4+ e negativa para CD45RO.
[0033] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula T precursora.
[0034] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula-tronco hematopoiética.
[0035] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui fornecidos incluem uma composição farmacêutica que compreende a célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das modalidades fornecidas nesse documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0036] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui fornecidos incluem um método para preparar a célula hospedeira conforme definido em qualquer uma das modalidades desse documento, compreendendo: introduzir o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das modalidades desse documento em uma célula; cultivar a célula na presença de anticorpo anti-CD3 e/ou anticorpo anti-CD28, e pelo menos uma citocina homeostática em condições suficientes para as células se expandirem; e selecionar a célula com um reagente de seleção; em que o reagente de seleção é configurado para enriquecer seletivamente as células transduzidas com o ácido nucleico ou vetor.
[0037] Em algumas modalidades, a célula é um linfócito. Em algumas modalidades, o linfócito tem um fenótipo CD45RA-, CD45RO+, e CD62L+. Em algumas modalidades, o linfócito é CD8+ ou CD4+.
[0038] Em algumas modalidades, o reagente de seleção é metotrexato.
[0039] Em algumas modalidades, a citocina é IL-15, I1- 7 e/ou I1-21.
[0040] Algumas modalidades compreendem adicionalmente a introdução de um segundo ácido nucleico na célula hospedeira, em que o segundo ácido nucleico codifica uma proteína marcadora. Em algumas modalidades, a proteína marcadora é EGFRt.
[0041] Algumas modalidades dos métodos e composições desse documento incluem uma célula hospedeira de qualquer uma das modalidades desse documento para uso em um medicamento ou para uso no tratamento ou na inibição de um câncer ou tumor sólido que expressa um receptor da IL- 13a2. Em algumas modalidades, o câncer compreende um câncer cerebral. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor glioma ou de glioblastoma. Em algumas modalidades, o câncer é glioblastoma multiforme (GBM). Em algumas modalidades, o câncer é um glioma.
[0042] Algumas modalidades dos métodos e composições desse documento incluem um método para tratar, inibir ou melhorar um câncer em um indivíduo, que compreende: administrar a célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das modalidades desse documento ao indivíduo em necessidade da mesma. Em algumas modalidades, câncer é uma malignidade positiva para IL13Ra. Em algumas modalidades, o câncer é câncer cerebral. Em algumas modalidades, câncer é um tumor de glioma ou glioblastoma.
Em algumas modalidades, o câncer é um glioma. Em algumas modalidades, o câncer é glioblastoma multiforme (GBM). Em algumas modalidades, o indivíduo é mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo é humano.
[0043] Algumas modalidades compreendem adicionalmente a administração de uma terapia adicional selecionada de quimioterapia e radioterapia. Em algumas modalidades, o fármaco quimioterápico compreende eletoquimioterapia, agente alquilante, antimetabólito (por exemplo, 5- fluorouracila (5-FU), 6-mercaptopurina (6-MP), Capecitabina (Xeloda®), Cladribina, Clofarabina, Citarabina (Ara-C®), Floxuridina, Fludarabina, Gemcitabina (Gemzar®), Hidroxiureia, Metotrexato, Pemetrexede (Alimta®), Pentostatina e Tioguanina), antibiótico antitumoral, inibidor da topoisomerase, inibidor mitótico, corticosteroide, agente intercalante do DNA, ou inibidor de ponto de verificação (ponto de verificação quinase CHK1, CHK2).
Breve Descrição dos Desenhos
[0044] A Figura 1 ilustra um esquema de certas modalidades CARs que tem como alvo IL-l3Ra2 e componentes usados para a construção de modalidades CARs que tem como alvo IL-l3Ra2. CAR específicos de IL-l3Ra2 incluíram: um de um número de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) que reconhecem especificamente um epítopo extracelular de receptor alfa 2 da IL -13 (IL-l3Ra2) derivado de um dos dois anticorpos ‘hu08’ (Ab0l) ou ‘hu07' (Ab02) e incluiu domínios VH E VL com um ligante entre os mesmos; um dos vários domínios espaçadores (marcados "S", “M” e “L”); um domínio transmembranar derivado de um CD28 humano (CD28tm); um domínio coestimulador 4-1BB derivado de humano; um domínio de sinalização derivado de CD3zeta; uma sequência de salto ribossômico T2A; e um marcador de transdução de EGFR truncado (EG FRt); e opcionalmente uma sequência de salto ribossômico T2A adicional e um transgene de mutante duplo de di-hidrofolato redutase (DHFRdm) configurado para seleção de metotrexato.
[0045] A Figura 2A ilustra uma análise de citometria de fluxo de expressão de EGFRt em células T CD8+ (painel superior) ou células T CD4+ (painel inferior) transduzidas com vários CARs descritos na Figura 1. A partir da fileira superior para a fileira inferior de cada painel: célula T simulada; célula CAR-T com IL-l3Ra2 Ab01 VL-VH Espaçador S; célula CAR-T com IL-l3Ra2 Ab01 VH-VL Espaçador S; célula CAR-T com IL-13Ra2 Ab02 VL-VH Espaçador S; e célula CAR-T com IL-l3Ra2 Ab02 VH-VL Espaçador S.
[0046] A Figura 2B ilustra gráficos de produção de citocina (IL-2, IFN-gama, TNF-alfa) de células T CD8+ transduzidas com vários CARs e incubados com células alvo indicadas. A chave corresponde à de células T; célula CAR-T com IL-l3Ra2 Ab01 VL-VH Espaçador S; célula CAR-T com IL- l3Ra2 Ab01 VH-VL Espaçador S; célula CAR-T com IL-l3Ra2 Ab02 VL-VH Espaçador S; e célula CAR-T com IL-l3Ra2 Ab02 VH-VL Espaçador S.
[0047] A Figura 2C ilustra gráficos de produção de citocina (IL-2, IFN-gama, TNF-alfa) de células T CD4+ transduzidas com vários CARs e incubadas com as células alvo indicadas. A chave corresponde a células T simulada; célula CAR-T com IL-l3Ra2 Ab01 VL-VH Espaçador S; célula CAR-T com IL-l3Ra2 Ab01 VH-VL Espaçador S; célula CAR-T com IL-l3Ra2 Ab02 VL-VH Espaçador S; e célula CAR-T com IL- l3Ra2 Ab02 VH-VL Espaçador S.
[0048] A Figura 3A ilustra uma análise de fluxo de multiparâmetros de citometria de células T derivadas de doador saudável e transduzidas com IL-l3Ra2 hu08 com histogramas quadrantes definidos que tiveram como base coloração controlada (painéis superior e inferior); e uma análise de fluxo de citometria de expressão de EGFRt em células T CD8+ transduzidas com um CAR (painel inferior).
Os CARs indicados incluíram: simulado; CAR IL-l3Ra2 Ab01 VL-VH Espaçador S; CAR IL-l3Ra2 Ab01 VL-VH Espaçador M; CAR IL-l3Ra2 Ab01 VL-VH Espaçador L; CAR IL-l3Ra2 Ab01 VH-VL
Espaçador S; CAR IL-l3Ra2 Ab01 VH-VL Espaçador M; e CAR IL- l3Ra2 Ab01 VH-VL Espaçador L.
[0049] A Figura 3B ilustra uma análise para a produção de citocinas e a atividade citolítica de células T CD8+ contendo um CAR, após a co-cultura com certas células alvo indicadas. Os CARs indicados incluíram: simulado; CAR IL- l3Ra2 Ab01 VL-VH Espaçador S; CAR IL-l3Ra2 Ab01 VL-VH Espaçador M; CAR IL-l3Ra2 Ab01 VL-VH Espaçador L; CAR IL- l3Ra2 Ab01 VH-VL Espaçador S; CAR IL-l3Ra2 Ab01 VH-VL Espaçador M; e CAR IL-l3Ra2 Ab01 VH-VL Espaçador L.
[0050] A Figura 4A descreve gráficos de fluxo total (fótons/segundo) como uma medida da carga tumoral (eixo y) com o tempo (dias pós inoculação do tumor, eixo x), para camundongos tratados com: veículo, células simuladas, 2x106 células T contendo um CAR anti-IL-l3Ra2; 1x106 células T contendo um CAR anti-IL-13Ra2; ou 0,5x106 células T contendo um CAR anti-IL-13Ra2. O CAR anti-IL-l3Ra2 foi CAR IL-l3Ra2 Ab0l VL-VH Espaçador S.
[0051] A Figura 4B ilustra uma curva Kaplan-Meier de sobrevivência para camundongos tratados com doses crescentes de células T que expressam um anti-IL-l3Ra2 CAR (CAR IL-l3Ra2 Ab0l VL-VH espaçador S).
[0052] A Figura 5A ilustra gráficos de fluxo total (fótons/segundo) como uma medida da carga tumoral (eixo y)
ao longo do tempo (dias pós inoculação do tumor, eixo x), para camundongos tratados com: células simuladas; 2 x 106 células T contendo um CAR anti-IL-l3Ra2 contendo um espaçador curto; 2 x 106 células T contendo um CAR anti-IL- l3Ra2 contendo um espaçador médio; 2 X 106 T contendo um CAR anti-IL-l3Ra2 contendo um espaçador longo.
[0053] A Figura 5B ilustra uma curva Kaplan-Meier de sobrevivência para camundongos tratados com células T que expressam um CAR anti-IL-l3Ra2 contendo um espaçador longo, um espaçador médio ou um espaçador curto.
[0054] A Figura 5C ilustra uma análise de área sob curva (AUC) de dados de bioluminescência para camundongos tratados com células T que expressam um CAR anti-IL-l3Ra2 contendo um espaçador longo, um espaçador médio ou um espaçador curto. As AUCs médias entre as variantes do espaço IL13Ra2 Ab0l células CAR-T ou células T simuladas foram comparadas. *, P<0,05. **, P<0,01. ****, P<0,001.
Descrição Detalhada
[0055] Algumas modalidades dos métodos e composições desse documento incluem os receptores de antígenos quiméricos (CARs) que tem como alvo IL3Ra2, tais como os CARs da segunda geração específicos de IL-l3Ra2, células contendo tais CARs, ácidos nucleicos que codificam tais CARs e métodos terapêuticos relacionados e suas utilizações. Entre os CARS providos estão aqueles que têm combinações particulares de componentes ou domínios, tais como aqueles resultantes da otimização da função de CAR. Em alguns aspectos, os agentes terápicos da célula CAR-T que tem como alvo ILl3Raa2 também podem atuar como uma alternativa ou suplemento aos tratamentos de presente câncer IL-l3Ra2 específico e não específico, tais como terapias de combinação.
[0056] IL-l3Ra2 foi previamente descoberta como abundante em estágio metastático ou avançado de BLBC (Papagorgis et al. Breast Cancer Research, 2015; 17 (1); nesse documento expressamente incorporado por referência em sua totalidade). Com base nos dados publicamente disponíveis, as correlações foram feitas entre a base de probabilidade de sobrevivência livre de progressão e altos níveis de IL-l3Ra2. Foi observado que um subtipo de BLBC que tendeu a se espalhar rapidamente para os pulmões tem altos níveis de IL-l3Ra2. IL-l3Ra2 também foi descoberta como estimulante do crescimento celular de glioma humano e a metástase através da via de sinalização Src/P13K/Akt/mTOR. (Tu et al Tumor Biol. 2016 Nov; 37 (11): 14701-14709; nesse documento expressamente incorporado por referência em sua totalidade). Terapias que tem como alvo IL-13Ra2, tais como terapias baseadas em receptor quiméricos, foram descritas (veja, por exemplo , Brown et al Clin Cancer Res 2015; Brown et al N Engl J Med 2016; Brown et al Mol Ther 2017; WO 2014072888-A1, descrevendo anticorpos anti-IL-l3 de receptor alfa 2 (IL-l3-R2) e conjugados de anticorpos-fármaco para o tratamento de câncer, cada um nesse documento expressamente incorporado por referência em sua totalidade). Entre tais terapias estão aquelas baseadas em, ou incluindo a, ligação baseada em IL13 (por exemplo, El3Y) ou domínios de reconhecimento de antígenos, tais como zetacinas.
[0057] Em algumas modalidades, os CARs providos e métodos e usos associados são baseados em parte em observações aqui descritas mostrando atividade particularmente vantajosa e/ou efeitos anticancerígenos in vivo no contexto de glioblastoma ou modelo dos mesmos, de CARs contendo domínios de ligação específicos em combinação com outros componentes específicos tais como domínios espaçadores específicos curativos. Em alguns aspectos, as composições fornecidas, métodos e usos são empregados no tratamento, inibição, ou prevenção de glioblastoma e/ou outras malignidades de IL-l3Ra2 positivos. Em alguns aspectos, os CARs providos nesse documento diferem de outros CARs em vários aspectos, tal como em uma ou mais características de sua estrutura molecular, tal como o epítopo de IL-l3Ra2 especificamente reconhecido pelo domínio de ligação e visado pelos CARS providos nesse documento.
[0058] As modalidades fornecidas são baseadas em parte em observações nesse documento, tais como aquelas demonstradas nos estudos pré-clínicos descritos nesse documento, demonstrando a atividade antitumoral in vitro de células CAR-T fornecidas, contra linhagens de células glioblastoma e a capacidade de reduzir o crescimento tumoral em modelos de xenoenxerto, em alguns aspectos em maior extensão em comparação com diferentes CARs contendo diferentes estruturas moleculares. Em vista destas descobertas, o uso comercial de composições compreendendo estes CARS em imunoterapia para tumores cerebrais e outros tipos IL-l3Ra2 positivos de câncer é contemplado.
Definições
[0059] Como usado nesse documento, “ácido nucléico” ou “molécula de ácido nucleico” tem seu significado comum e ordinário quando lido à luz do relatório, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, polinucleotídeos, tais como ácido desoxirribonucléico (DNA) ou ácido ribonucléico (RNA), oligonucleotídeos, fragmentos gerados pela reação de cadeia de polimerase (PCR), e fragmentos gerados por qualquer ligação, cisão, ação de endonuclease e ação de exonuclease. As moléculas de ácido nucléico podem ser compostas de monômeros que são nucleotídeos que ocorrem naturalmente (tais como DNA e RNA), ou análogos de nucleotídeos que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas enantioméricas de nucleotídeos de ocorrência natural), ou uma combinação de ambos.
Nucleotídeos modificados podem ter alterações em porções de açúcar e/ou em porções de pirimidina ou de base purina.
As modificações do açúcar incluem, por exemplo, substituição de um ou mais grupos hidroxila com halogênios, grupos alquil, aminas, e grupos azido, ou açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres.
Além disso, a porção inteira de açúcar pode ser substituída por estruturas estericamente e eletronicamente similares, tais como aza-açúcares e análogos de açúcar carbocíclicos.
Exemplos de modificações em uma porção base incluem purinas e pirimidinas alquiladas, purinas ou pirimidinas aciladas, ou outros substitutos heterocíclicos bem conhecidos.
Os monômeros de ácido nucleico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos de tais ligações.
Análogos de ligações de fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato,
fosforotiodisoato, fosforotiootioato, fosforotioato,
fosforamidato e semelhantes.
O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui os chamados ácidos nucleicos de oligopeptídeo, que compreendem bases de ácido nucleico que ocorrem naturalmente ou modificadas ligadas a uma cadeia principal de poliamida.
Os ácidos nucleicos podem ser de fita única ou de fita dupla. Em algumas alternativas, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína é fornecida. Em algumas alternativas, o ácido nucleico é RNA ou DNA.
[0060] Como utilizado nesse documento, o receptor de antígeno quimérico tem seu significado comum e ordinário quando lido à luz do relatório, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, um receptor sinteticamente projetado compreendendo um domínio de ligação de ligante de um anticorpo ou outra sequência de proteína que se liga a uma molécula associada com a doença ou distúrbio e é ligada através de um domínio espaçador a um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma célula, tal como uma célula T, ou outros receptores tal como um domínio coestimulador.
Receptor quimérico também pode ser referido como receptores de células artificiais ou receptores de células T, receptores de antígeno (CARs). Estes receptores podem ser usados para enxertar a especificidade de um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo sobre uma célula, preferivelmente uma célula T com a transferência de sua sequência codificante facilitada por vetores virais, tais como um vetor retroviral ou um vetor lentiviral. CARs podem ser, em alguns casos, receptores de células T geneticamente projetados para redirecionar células T para células alvo que expressam antígenos específicos de superfície celular. Células T podem ser removidas de um indivíduo e modificadas de modo que possam expressar receptores que podem ser específicos para um antígeno por um processo chamado de transferência de células adotivas.
As células T são reintroduzidas no paciente onde elas podem então reconhecer e direcionar um antígeno. CARs são também receptores projetados que podem enxertar uma especificidade arbitrária sobre uma célula receptora imunológica. Os termos receptores de antígenos quiméricos ou “CARs” são considerados por alguns investigadores como tendo incluído o anticorpo ou fragmento de anticorpo, preferencialmente um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo, o espaçador, o domínio de sinalização, e a região transmembranar. Devido aos efeitos surpreendentes de modificação dos diferentes componentes ou domínios do CAR descrito nesse documento, tal como a região de ligação de epítopo (por exemplo, fragmento de anticorpo, scFv, ou porção do mesmo), espaçador, domínio transmembranar, e/ou domínio de sinalização), os componentes do CAR são frequentemente distinguidos por toda esta descrição em termos de elementos independentes. A variação dos diferentes elementos do CAR pode, por exemplo, resultar em afinidade de ligação mais forte para um epítopo ou antígeno específico.
[0061] CARs enxertam a especificidade de um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação do mesmo ou scFv sobre uma célula T, com a transferência de sua sequência codificante facilitada por vetores. A fim de usar CARs como uma terapia para um indivíduo em necessidade, uma técnica chamada de transferência de célula adotiva é usada na qual células T são removidas de um indivíduo e modificadas de modo que elas possam expressar os CARs que são específicos para um antígeno. As células T, que podem então reconhecer e direcionar um antígeno, são reintroduzidas no paciente.
[0062] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é uma região de uma proteína abrangência à membrana que é hidrofóbica que pode residir na bicamada de uma célula para ancorar uma proteína que é embutida na membrana biológica. Sem ser limitante, a topologia do domínio transmembranar pode ser uma alfa hélice transmembranar. Em algumas alternativas para o receptor de antígeno quimérico, o receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência que codifica um domínio transmembranar. Em algumas alternativas, o domínio transmembranar compreende uma sequência CD28 transmembranar ou um fragmento do mesmo que tem um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 aminoácidos ou um comprimento dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos comprimentos mencionados anteriormente. Em algumas alternativas, a sequência de CD28 transmembranar ou fragmento da mesma compreende 28 aminoácidos em comprimento.
[0063] Em algumas modalidades, os domínios de sinalização, tais como domínios de sinalização primária ou domínios coestimuladores, incluem um domínio intracelular ou citoplásmico de uma proteína ou uma proteína receptora que interage com componentes dentro do interior das células e é capaz de retransmitir ou participar na retransmissão de um sinal. Tais interações em alguns aspectos podem ocorrer através do domínio intracelular que se comunica através de interações específicas de proteína-proteína ou proteína- ligante com uma molécula efetora ou uma proteína efetora, que por sua vez pode enviar o sinal ao longo de uma cadeia de sinalização para seu destino. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização inclui um domínio coestimulador. Em alguns aspectos, o domínio coestimulador inclui uma porção de sinalização que fornece às células T um sinal que, além do sinal primário fornecido por, por exemplo, a cadeia CD3 zeta do complexo TCR/CD3, aumenta a resposta tal como uma resposta efetora de células T, tal como, por exemplo, uma resposta imune, ativação, proliferação, diferenciação, secreção de citocina, atividade citolítica, atividade de perperina e/ou granzima e similares. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular e/ou o domínio coestimulador pode incluir todas ou uma porção de CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICOS, antígeno-1 associado à função de linfócito (LFA-1), CD2, CD7, LHT, NKG2C e/ou B7-H3 e/ou um ligante que se liga especificamente com CD83.
[0064] Como usado nesse documento, o termo "anticorpo" tem seu significado comum e ordinário quando lido à luz do relatório e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, uma grande proteína em forma de Y produzida por células plasmáticas que é usada pelo sistema imunológico para identificar e neutralizar objetos estranhos tais como bactérias e vírus. Em alguns contextos, o termo anticorpo refere-se a fragmentos de ligação de antígeno de um anticorpo. A proteína de anticorpo pode compreender quatro cadeias polipeptídicas; duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas conectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia é composta por domínios estruturais denominados domínios de imunoglobulina. Estes domínios podem conter 70-110 aminoácidos e são classificados em categorias diferentes de acordo com seu tamanho e função.
Um receptor de antígeno quimérico pode compreender um domínio de ligação de ligante, que inclui um fragmento de anticorpo, preferencialmente um fragmento de ligação de antígeno. Em algumas alternativas, um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) é fornecido, o ácido nucleico compreendendo: a) um primeiro polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação de ligante, em que o domínio de ligação de ligante se liga a e/ou interage com um receptor alfa 2 da IL-13 (IL13Ra2), b) um segundo polinucleotídeo que codifica um espaçador de polipeptídeo de um comprimento suficiente para permitir que o domínio de ligação de ligante interaja com o receptor alfa 2 da IL-13 (IL13Ra2) , c) um terceiro polinucleotídeo que codifica um domínio transmembranar e d) um quarto polinucleotídeo que codifica um domínio de sinalização intracelular. Em algumas alternativas, o domínio de ligação de ligante é um fragmento de anticorpo.
[0065] Como usado nesse documento, um fragmento variável de cadeia única ou scFv tem seu significado comum e ordinário quando lido à luz do relatório, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, uma proteína de fusão que compreende as regiões variáveis da cadeia pesada (VH) e das cadeias leves (VL) de uma imunoglobulina, que são conectadas entre si com um peptídeo ligante curto. Sem ser limitante, o ligante pode compreender glicina para flexibilidade e aminoácidos hidrófilos, por exemplo serina ou treonina para solubilidade. O ligante pode conectar o N- terminal do VH com o C-terminal do VL ou pode conectar o C- terminal do VH com o N-terminal do VL. Em algumas alternativas, o domínio de ligação de ligante presente em um CAR é um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas alternativas, o domínio scFv presente em um CAR é específico para um receptor alfa 2 da IL-13 (IL13Ra2) presente em uma célula tumoral.
[0066] Em algumas modalidades, as composições, células e vetores incluem sequências marcadoras ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos, que podem incluir, por exemplo, uma proteína que serve como um rótulo para uma célula. Em algumas alternativas das células descritas nesse documento, as células coexpressam uma proteína marcadora para uma proteína antigênica quimérica específica que é expressa. Em algumas alternativas das células fornecidas nesse documento, o receptor de antígeno quimérico é coexpresso com uma proteína marcadora específica. Em algumas alternativas das células fornecidas nesse documento, as células compreendem um ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico. Os marcadores podem incluir uma sequência marcadora selecionável, tal como um gene introduzido em um vetor ou uma célula que confere um traço para a seleção artificial. Uma sequência marcadora selecionável ou sequência marcadora pode ser um marcador configurado para permitir que um pesquisador possa distinguir entre células desejadas e indesejadas ou para enriquecer para um tipo de célula específica. Em algumas alternativas, é provido um vetor onde então o vetor codifica um receptor de antígeno quimérico que compreende uma sequência marcadora, em que a dita sequência marcadora codifica um marcador selecionável na superfície celular.
Nas alternativas descritas nesse documento, a proteína de fusão fornecida pode compreender uma sequência marcadora que pode ser selecionada em experimentos, tais como citometria de fluxo. Em algumas alternativas, o marcador é a proteína Her2tG ou EGFRt.
[0067] O metotrexato (MTX) pode incluir, mas não é limitado a, por exemplo, um antimetabólitos e um fármaco antifolato. Em alguns aspectos, ele atua inibindo o metabolismo do ácido fólico. Em algumas alternativas, é provido um método de gerar células T multiplexadas geneticamente para imunoterapia de células T adotivas. No sentido mais amplo, o método pode compreender a provisão do polinucleotídeo de entrega de genes de qualquer uma das alternativas descritas nesse documento, a seleção das células compreendendo o polinucleotídeo de entrega de genes, em que a seleção compreende a adição de um reagente de seleção. Em algumas alternativas descritas nesse documento, o reagente de seleção compreende um agente para a seleção. Em algumas alternativas, o reagente de seleção é MTX.
[0068] Como usado nesse documento, “hidrofolato reductase”, ou DHFR, como descrito nesse documento, tem seu significado comum e ordinário quando lido à luz do relatório, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, uma enzima que reduz o ácido di-hidrofólico em ácido tetra-hidrofólico, Utilizando NADPH como doador de elétrons, que pode ser convertido em tipos de cofatores de tetra-hidrofolato usados na química de transferência de 1- carbono. Em algumas alternativas descritas nesse documento, é fornecido um polinucleotídeo de entrega de genes. Em algumas alternativas, o polinucleotídeo de entrega de gene compreende pelo menos um cassete de marcador selecionável que codifica para um mutante duplo de di-hidrofolato reductase (DHFRdm).
[0069] Em algumas modalidades, as construções e sequências fornecidas são modificadas ou otimizadas, tal como por otimização de códon, que pode incluir, mas não está limitada a, por exemplo, o design do processo de alterar códons para códons conhecidos para aumentar a eficiência de expressão de proteína em uma célula desejada, preferivelmente em uma célula humana. Em algumas alternativas, a otimização do códon é descrita, em que a otimização do códon pode ser realizada utilizando algoritmos que são conhecidos por aqueles versados na técnica para criar transcritos genéticos sintéticos otimizados para rendimento elevado de proteína. Programas contendo algoritmos para otimização de códon são conhecidos por aqueles versados na técnica. Os programas podem incluir, por exemplo, algoritmos OptimumFGeneTM, GeneGPS®.
Adicionalmente, sequências otimizadas de códon sintético podem ser obtidas comercialmente, por exemplo, a partir de “Integrated DNA Technologies” e outros serviços de sequenciamento de DNA comercialmente disponíveis. Em algumas alternativas, os ácidos nucleicos são descritos, onde então os genes do ácido nucleico para a completa transcrição genética são otimizados por códon para a expressão em seres humanos. Em algumas alternativas, os genes são otimizados para ter códons selecionados para expressão de proteína máxima em células humanas, que podem aumentar a concentração de proteínas ou CARs de uma célula T.
[0070] A otimização do códon pode ser realizada para reduzir a ocorrência de estrutura secundária em um polinucleotídeo. Em algumas alternativas, a otimização do códon também pode ser realizada para reduzir a proporção total de GC/AT. A otimização estrita do códon também pode levar a uma estrutura secundária indesejada ou um teor de GC indesejável que leva à estrutura secundária. Como tais, as estruturas secundárias afetam a eficiência de transcrição. Programas como o GeneOptimizer, podem ser usados após utilização da otimização de códon, para evitar a estrutura secundária e otimizar de conteúdo do GC. Estes programas adicionais podem ser usados para otimização adicional e recuperação de defeitos após uma otimização inicial do códon para limitar as estruturas secundárias que podem ocorrer após a primeira rodada de otimização.
Programas alternativos para otimização são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas alternativas, o ácido nucleico compreende sequências com códon otimizado para expressão em humanos e/ou para remover a estrutura secundária e/ou reduzir a relação de GC/AT total. Em algumas alternativas, as sequências são otimizadas para evitar estrutura secundária. Em algumas alternativas, as sequências são otimizadas para reduzir a proporção total de GC/AT.
[0071] Como usado nesse documento, “vetor”, “vetor de expressão” ou “construção”, tem seu significado comum e ordinário quando lido à luz do relatório, e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, um ácido nucleico usado para introduzir ácidos nucleicos heterólogos em uma célula que tem elementos reguladores para fornecer a expressão dos ácidos nucleicos heterólogos na célula. Os vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeo, minicírculos, leveduras e genomas virais. Em algumas alternativas, os vetores são plasmídeo, minicírculos ou genomas virais. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor viral. Em algumas alternativas, o vetor viral é um lentiviral. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor viral espumoso, vetores adenovirais, vetores retrovirais ou vetores lentiviral.
[0072] Células T ou linfócitos T em algumas modalidades podem incluir células T de qualquer espécie de mamífero, preferivelmente primata, incluindo macacos, cães e seres humanos. Em algumas alternativas, as células T são alogênicas (da mesma espécie mas doador diferente) à medida que o indivíduo receptor que recebe ou está para receber as células, tal como na forma de uma composição terapêutica; em algumas alternativas, as células T são autólogas (o doador e o receptor são os mesmos); em algumas alternativas, as células T são singênicas (o doador e os receptores são diferentes, mas são duplas idênticas).
[0073] Como aqui usado, uma sequência de salto ribossômico, como descrito nesse documento, refere-se a uma sequência que, durante a tradução, força o ribossomo a “saltar” a sequência de salto ribossômico e traduzir a região após a sequência de salto ribossômico sem formação de uma ligação peptídica. Vários vírus, por exemplo, têm sequências de salto ribossômico que permitem a tradução sequencial de várias proteínas em um único ácido nucleico sem ter as proteínas ligadas através de uma ligação peptídica. Como descrito nesse documento, esta é a sequência do “ligante”. Em algumas alternativas dos ácidos nucleicos providos nesse documento, os ácidos nucleicos compreendem uma sequência de salto ribossômico entre a sequência para o receptor de antígeno quimérico e a sequência da proteína marcadora, tal que as proteínas são coexpressas e não ligadas por uma ligação peptídica. Em algumas alternativas, a sequência de salto ribossômico é uma sequência P2A, T2A, E2A ou F2A. Em algumas alternativas, a sequência de salto ribossômico é uma sequência T2A.
[0074] Células T maduras expressam a proteína de superfície CD4 e são referidas como células T CD4+. Células T CD4+ são geralmente tratadas como tendo um papel pré- definido como células T auxiliares dentro do sistema imunológico. Por exemplo, quando uma célula apresentando antígeno expressa um antígeno sobre MHC classe II, uma célula CD4+ auxiliará aquelas células através de uma combinação de interações célula a célula (por exemplo, CD40 e CD40F) e através de citocinas. Não obstante, existem exceções raras; por exemplo, subgrupos de células T reguladoras, células exterminadoras naturais e células T citotóxicas expressam CD4. Todos os últimos grupos de células T que expressam CD4+ não são considerados células T auxiliares.
[0075] Como usado nesse documento, a célula de “memória central” (ou TCM) tem seu significado comum e ordinário quando lida à luz do relatório e pode incluir, mas não está limitada a, por exemplo, um antígeno experimentado CTF que expressa CD62F ou CCR-7 e CD45RO em sua superfície e não expressa ou tem expressão diminuída de CD45RA em comparação com células naïve. Em algumas alternativas, as células de memória central são positivas para a expressão de CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO e/ou CD95, e possuem expressão diminuída de CD54RA em comparação com células naïve.
[0076] Como usado nesse documento, as células “efetoras” T “TE” tem seu significado comum e ordinário quando lidas à luz do relatório e podem incluir, mas não estão limitadas a, por exemplo, células de linfócitos T citotóxicas experimentadas por antígeno que não expressam ou têm diminuída expressão de CD6L, CCR7 ou CD28, ou são positivas para granzima B e/ou perforina, em comparação com células de “memória central” ou células T naïve.
[0077] Como usado nesse documento, um “excipiente farmacêutico” ou um veículo farmacêutico tem seu significado comum e ordinário quando lido à luz do relatório e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, um transportador ou meio inerte usado como um solvente no qual o agente biologicamente ativo ou células T para tratamento ou terapia é formulada e ou administrada.
Os veículos podem incluir micelas poliméricas, lipossomos, transportadores a base de lipoproteínas, transportadores de nanopartícula, dendrímeros e/ou outros veículos para células T que são conhecidas por aqueles versados na técnica. Um veículo ou excipiente ideal pode ser não tóxico, biocompatível, não imunogênico, biodegradável e pode evitar reconhecimento pelos mecanismos de defesa do hospedeiro.
[0078] Como usado nesse documento, os “precursores de células T” apresentam seu significado comum e ordinário quando lidos à luz do relatório e podem incluir, mas não estão limitados a, por exemplo, células precursoras linfóides que podem migrar para o timo e tornar-se precursoras de células T, que não expressam um receptor de células T. Todas as células T se originam de células tronco hematopoiéticas na medula óssea. Progenitores hematopoiéticos (células progenitoras linfóides) de células tronco hematopoiéticas povoam o timo e se expandem por divisão celular para gerar uma grande população de timócitos imaturos. Os timócitos mais antigos não expressam nem CD4 nem CD8 e são, portanto, classificados como células dupla-negativas (CD4-CD8-). Conforme elas avançam em seu desenvolvimento, tornam-se timócitos duplamente positivos (CD4+CD8+) e finalmente amadurecem até os timócitos unicamente positivos (CD4+CD8- ou CD4-CD8+) que são então liberados do timo para os tecidos periféricos.
[0079] Glioblastoma multiforme (GBM), geralmente é considerado o câncer mais agressivo que começa com o cérebro. Sintomas iniciais de glioblastoma geralmente não são específicos. Eles podem incluir dores de cabeça, mudanças de personalidade, náusea e sintomas similares àqueles de um acidente vascular cerebral.
[0080] Como usado nesse documento, uma “sequência líder” também conhecida como região não traduzida 5' (RNT 5'), é a região de mRNA que está localizada a montante do códon de iniciação e é importante para regular a tradução de uma transcrição de mRNA. Em algumas alternativas do método de produção de células T geneticamente modificadas, que possuem um receptor de antígeno quimérico (CAR), o vetor que codifica o receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência que codifica uma sequência líder.
[0081] Como descrito nas alternativas desse documento encontram-se os ligantes. O “ligante” tem seu significado comum e ordinário quando lido à luz do relatório e pode incluir, mas não está limitado a, por exemplo, uma substância que pode formar um complexo com uma biomolécula.
A título de exemplo e não de limitação, os ligantes podem incluir substratos, proteínas, pequenas moléculas, inibidores, ativadores, ácidos nucleicos ou neurotransmissores. A ligação pode ocorrer através de forças intermoleculares, por exemplo, ligações iônicas, ligações de hidrogênio ou interações de Van der Waals. A ligação de ligante a uma proteína receptora pode alterar a estrutura tridimensional e determinar seu estado funcional.
A resistência da ligação de um ligante é referida como afinidade de ligação e pode ser determinada por interações diretas e efeitos de solventes. Um ligante pode ser ligado por um domínio de ligação de dupla ligação. Um domínio de ligação de ligante, por exemplo, pode se referir a uma sequência conservada em uma estrutura que pode ligar um ligante específico ou um epítopo específico em uma proteína. O domínio de ligação de ligante ou porção de ligação de ligante pode compreender um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo ou scFv, um ligante receptor ou mutantes do mesmo, peptídeo e/ou molécula de afinidade de polipeptídeo ou parceiro de ligação. Sem ser limitante, um domínio de ligação de ligante pode ser um domínio de proteína específico ou um epítopo em uma proteína que é específica para um ligante ou ligantes.
[0082] Como descrito nas alternativas desse documento, está a subunidade alfa 2 (IL13Ra2). “Subunidade alfa 2 (IL13Ra2) receptora de interleucina 13”, também conhecida como CD213A2 (cluster de diferenciação 213A2), tem seu significado comum e ordinário quando lida à luz do relatório e pode incluir, mas não está limitada a, por exemplo, uma proteína ligada à membrana que, em seres humanos, é codificada pelo gene IL-13RA2. A IL-l3Ra2 está intimamente relacionada à IL-l3Ra1, uma subunidade do complexo receptor de interleucina 13. A IL-l3Ra2 geralmente se liga a IL-13 com alta afinidade, mas carece de domínio citoplásmico significativo, e não parece funcionar como um mediador de sinal. Entretanto, é capaz de regular os efeitos tanto de IL-13 quanto de IL-4, apesar do fato de que ele é incapaz de se ligar diretamente ao último. Tal também é reportado por desempenhar um papel na internalização de IL-13.
[0083] Em algumas alternativas, o espaçador peptídico contém 15 aminoácidos ou menos, mas não menos que 1 ou 2 aminoácidos. Em algumas modalidades, o espaçador é uma cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, o espaçador é uma cadeia polipeptídica. Em alguns aspectos, a cadeia de polipeptídeo pode variar de comprimento, tal como de 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,
85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,
100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,
112, 113, 114, 115, 116, 117,
118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129,
130, 131, 132, 133, 134, 135,
136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147,
148, 149, 150, 151, 152, 153,
154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165,
166, 167, 168, 169, 170, 171,
172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183,
184, 185, 186, 187, 188, 189,
190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201,
202, 203, 204, 205, 206, 207,
208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219,
220, 221, 222, 223, 224, 225,
226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237,
238, 239 ou 240 aminoácidos ou um comprimento dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos comprimentos acima mencionados.
Um espaçador pode compreender quaisquer 20 aminoácidos, por exemplo, em qualquer ordem para criar um comprimento desejável de cadeia de polipeptídeos em um receptor de antígeno quimérico, que inclui os aminoácidos arginina, histidina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina, asparagina, glutamina,
cisteína, glicina, prolina, alanina, valina, isoleucina,
metionina, fenilalanina, tirosina e/ou triptofano.
Uma sequência espaçadora pode ser um ligante entre o scFv (ou domínio de ligação do ligante) e o domínio transmembranar do receptor de antígeno quimérico.
Em algumas alternativas do receptor de antígeno quimérico, o receptor de antígeno quimérico compreende ainda uma sequência que codifica um espaçador.
Em algumas alternativas, o espaçador compreende uma sequência com um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14,15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,
40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,
85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,
100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,
112, 113, 114, 115, 116, 117,
118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129,
130, 131, 132, 133, 134, 135,
136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147,
148, 149, 150, 151, 152, 153,
154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165,
166, 167, 168, 169, 170, 171,
172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183,
184, 185, 186, 187, 188, 189,
190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239 ou 240 aminoácidos ou um comprimento dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos comprimentos acima mencionados. Em algumas alternativas, o espaçador reside entre o scFv e a região transmembranar do receptor de antígeno quimérico. Em algumas alternativas, o espaçador reside entre o domínio de ligação de ligante do receptor de antígeno quimérico e a região transmembranar do receptor de antígeno quimérico.
[0084] Um espaçador também pode ser personalizado, selecionado ou otimizado para um comprimento desejado de modo a melhorar a ligação do domínio scFv à célula alvo, que pode aumentar a eficácia citotóxica. Em algumas alternativas, o ligante ou espaçador entre o domínio scFv ou domínio de ligação do ligante e a transmembrana pode ser de 25 a 55 aminoácidos em comprimento (por exemplo, pelo menos, igual a 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55 aminoácidos ou um comprimento dentro de uma faixa definida por quaisquer dois dos comprimentos mencionados acima).
[0085] Algumas modalidades incluem sequências de polipeptídeos ou suas variações conservadoras, tais como substituições conservadoras em uma sequência de polipeptídeo. Em algumas modalidades, a “substituição de aminoácidos conservativa” se refere a substituições de aminoácidos que substituem aminoácidos funcionalmente equivalentes. As alterações de aminoácidos conservativas resultam em mudanças silenciosas na sequência de aminoácidos do peptídeo resultante. Por exemplo, um ou mais aminoácidos de polaridade similar atuam como equivalentes funcionais e resultam em uma alteração silenciosa dentro da sequência de aminoácidos do peptídeo. Substituições que são neutras de carga e que substituem um resíduo com um resíduo menor também podem ser consideradas substituições conservadoras, mesmo se os resíduos estão em grupos diferentes (por exemplo, substituição de fenilalanina com isoleucina menor). Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Diversas famílias de substituições conservativas de aminoácidos são mostradas na Tabela 1.
Família Aminoácidos apolar Trp, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala, Pro polar sem carga Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys carga negativa/ácida Asp, Glu carga positiva/básica Arg, Lys, His Beta-ramificada Thr, Val, Ile resíduos que influenciam Gly, Pro orientação de cadeia aromática Trp, Tyr, Phe, His Tabela 1
[0086] Altos níveis de receptor alfa 2 de interleucina 13 (IL-13RA2) são encontrados em um número de células cancerígenas incluindo cânceres pancreático, de mama e ovariano ou gliomas malignos, tais como glioblastoma. A IL- 13RA2 também mostrou ser supraexpressa em uma vasta maioria de pacientes humanos com astrocitomas de alto grau (Veja PLoS One. 2013 Oct 16; 8(l0):e777l9; nesse documento expressamente incorporado por referência em sua totalidade). Adicionalmente, pesquisa prévia mostrou que a redução da quantidade de expressão de IL13RA2 em células câncerígenas reduziu significativamente o crescimento de tumor em modelos (Breast Cancer Research, 2015; 17(1); nesse documento expressamente incorporado por referência em sua totalidade). Contempla-se que poucos tipos de tecidos normais expressam IL-13-RA2 e somente em baixos níveis.
[0087] No caso de glioblastoma multiforme (GBM), a alta expressão de Il3Ra2 pode ser um marcador prognóstico de progressão tumoral e baixa sobrevivência do paciente.
São providos receptores de antígenos quiméricos (CARs), e células e terapias contendo ou utilizando o mesmo, que seletivamente tem como alvo IL13Ra2. Os CARs providos compreendem geralmente um domínio extracelular ligado a uma região transmembranar e uma região de sinalização intracelular incluindo um ou mais domínios de sinalização, geralmente incluindo domínios de sinalização primário e coestimulador.
[0088] O domínio extracelular inclui um motivo de ligação de antígeno, que em alguns aspectos é ou inclui um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno tal como um scFv. Em alguns aspectos, o domínio de ligação, tal como o scFv, é derivado de um anticorpo específico de interleucina l3Ra2. Em algumas modalidades, o CAR inclui uma região espaçadora que conecta o domínio de ligação extracelular ao domínio transmembranar. Em alguns aspectos, uma ou mais propriedades do espaçador são projetadas para otimizar as características do CAR tal como a função CAR, por exemplo, pela provisão de uma distância apropriada entre o contato do epítopo e região de ligação e a(s) membrana(s) celular(es) e/ou pela provisão de flexibilidade. Em alguns aspectos, o espaçador contém menos ou não mais do que 20 aminoácidos em comprimento, tal como menos ou não mais do que 15 aminoácidos em comprimento, menos ou não mais do que 14 aminoácidos em comprimento, menos ou não mais do que 13 aminoácidos em comprimento, ou não mais do que 12 aminoácidos em comprimento. Em alguns aspectos, contém pelo menos 12 ou 15 aminoácidos de comprimento. Em alguns aspectos, o espaçador compreende toda ou uma porção de uma região de articulação de imunoglobulina (tal como uma região de articulação de IgG humana, tal como uma região de articulação de IgG4 humana) ou uma versão modificada da mesma.
[0089] Em algumas alternativas, o espaçador compreende uma região de articulação de um anticorpo humano. Em algumas alternativas do método, o espaçador compreende uma articulação de IgG4. Em algumas alternativas, a região de articulação de IgG4 É uma articulação de IgG4 modificada.
Uma região de articulação de IgG4 modificada como descrita nesse documento pode se referir a uma região de articulação que pode ter pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência ou uma identidade de sequência dentro de uma faixa definida por qualquer duas das porcentagens acima mencionadas, com uma sequência de aminoácidos da região de articulação como apresentada em SEQ ID NO:0l, SEQ ID NO:02, SEQ ID NO:03, SEQ ID NO:04, SEQ ID NO:05, SEQ ID NO:06, SEQ ID NO:07 ou SEQ ID NO:08.
[0090] Em algumas alternativas, o CAR compreende um espaçador S, espaçador M ou espaçador L. O espaçador S compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:09. O espaçador M compreende uma sequência apresentada em SEQ ID
NO:10. O Espaçador L compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:11.
[0091] Em algumas modalidades, a porção de transmembrana inclui ou é um domínio transmembranar CD28 (CD28tm) tal como um domínio transmembranar CD28 humano. O CD28tm é codificado por uma sequência apresentada em SEQ ID NO:12. O CD28tm compreende os aminoácidos apresentados em SEQ ID NO:13. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é ligado a uma região de sinalização intracelular contendo um ou mais domínios coestimuladores, tal como um domínio coestimulador derivado do segmento intracelular de humano 4-1 BB (CD 137) e um domínio de sinalização de CD3-zeta (CD3 z) tal como de CD3z humano. Em algumas alternativas, o projeto de CAR se baseia em diferentes combinações de duas moléculas scFv, que visam epítopos extracelulares diferentes da ILl3Ra2, com diferentes Orientações VH-VL e três comprimentos possíveis de espaçador CAR. O restante da cadeia principal CAR, a transmembrana e os domínios coestimuladores são compartilhados entre os CARs. Em mais alternativas, uma versão truncada do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFRt) é também incluída, que é coexpressa com os CARs na superfície da célula T. Alternativas adicionais podem incluir um transgene mutante duplo de di-hidrofolato redutase (DHFRdm), que permite a seleção de metotrexato de produtos de células T. Como descrito nesse documento, ambas as células CAR-T CD8 e CD4 IL13Ra2 exibem citotoxicidade de tumor in vitro potente e eficácia específica in vivo contra modelos de tumor de glioblastoma.
[0092] Algumas alternativas incluem um CAR contendo um scFv incluindo domínios VL e VH de um anticorpo referido como Il3Ra2 AbOl, na orientação VL-ligante-VH. Em alguns aspectos, tais CARs incluem, ainda, combinação(ões) particular(es) de domínios de espaçador, transmembranar e/ou de sinalização. Por exemplo, em alguns aspectos, tais CARs incluem um espaçador que consiste ou que consiste essencialmente em não mais do que 15 ou não mais do que 12 aminoácidos e/ou contendo ou que consiste ou que consiste essencialmente em uma região de articulação de imunoglobulina ou variante modificada do mesmo, tal como uma região de articulação de um IgG4 ou variante modificada do mesmo. Em alguns aspectos, os domínios de CAR também incluem um domínio de sinalização coestimulador e primário, tal como domínios de sinalização 41BB e CD3zeta. Em alguns aspectos, alternativas preferenciais podem ser vantajosas em sua capacidade de aumentar funções efetoras de células T, tais como levando a maior citotoxicidade e secreção de citocina in vitro e/ou melhorar a função in vivo, tal como no contexto de glioblastoma humano, em comparação com CARs alternativos, tais como aqueles contendo diferentes domínios de ligação (por exemplo, com diferentes regiões VH e/ou VL e/ou nas quais as regiões VH e VL estão presentes em uma orientação diferente) e/ou aquelas contendo o mesmo domínio de ligação mas com uma ou mais diferenças em outra(s) região(ões) do CAR, tal como com um espaçador alternativo, tal como um espaçador com um comprimento aumentado. As modalidades aqui fornecidas, em alguns aspectos, são baseadas em observações aqui, demonstrando a capacidade de controlar o crescimento tumoral e/ou aumentar a sobrevivência média dos indivíduos portadores dos tumores que expressam IL-l3Ra2, tal como em um modelo de camundongo envolvendo camundongos carregando GBM humano intracranialmente, tratado com uma unica injeção de células CAR-T que tem como alvo IL13Ra2.
Certos ácidos nucleicos
[0093] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidos nesse documento incluem ácidos nucleicos que codificam um receptor de antígeno quimérico, o receptor de antígeno quimérico compreendendo: a) um domínio de ligação de ligante que se liga a e/ou interage com um receptor de IL-13 alfa 2 (IL3Ra2) e/ou que compreende um CDR3, e opcionalmente um CDR1 e um CDR2, de uma região VH de SEQ ID NO:18 e um CDR3, e opcionalmente um CDR1 e um CDR2, de uma região VL De SEQ ID NO:19; b) um espaçador de polipeptídeo entre o domínio de ligação de ligante e um domínio transmembranar; c) o domínio transmembranar; e d) região de sinalização intracelular.
Em algumas alternativas, o domínio de ligação de ligante é um fragmento de anticorpo,
tal como um fragmento de ligação de antígeno.
Em algumas alternativas, o domínio de ligação de ligante é um fragmento variável e cadeia única (scFv). Em algumas alternativas, o espaçador contém 15 aminoácidos ou menos,
mas não menos que 1 ou 2 aminoácidos.
Em algumas alternativas, o espaçador compreende uma sequência de aminoácidos de X1PPX2P.
Em algumas alternativas, a região espaçadora compreende uma porção de uma região de articulação de um anticorpo humano ou variante modificada do mesmo.
Em algumas alternativas, a região de sinalização intracelular compreende domínios de sinalização primários e secundários, opcionalmente compreendendo todas ou uma porção de um CD3 zeta em combinação com um domínio coestimulador selecionado do grupo consistindo em domínios de sinalização de CD27, CD28, 4-1BB , OX-40, CD30, CD40,
PD-l, ICOS, LFA-l, CD2, CD7, NKG2C e B7-H3 e combinações das mesmas.
Em algumas alternativas, a região de sinalização intracelular compreende uma porção de sinalização de um CD3 zeta e uma porção de sinalização de
4-1BB.
Em algumas alternativas, o domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar CD28 (CD28tm). Em algumas alternativas, o espaçador compreende, consiste, ou consiste essencialmente em um espaçador de articulação IgG4 (S). Em algumas alternativas, o espaçador compreende, consiste, ou consiste essencialmente em um espaçador de articulação-CH3 de IgG4 (M). Em algumas alternativas, o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em um espaçador de articulação IgG4-CH2 (L234D, N297A0)-CHE (L). Em algumas alternativas, o scFv compreende uma orientação VL-VH e espaçador S. Em algumas alternativas, scFv compreende uma orientação VH-VL e um espaçador, em que o espaçador é espaçador M ou espaçador L.
Em algumas alternativas, o fragmento variável de cadeia única (scFv) compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:61 ou SEQ ID NO:62. Em algumas alternativas, o fragmento variável de cadeia única (scFv) compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:63 ou SEQ ID NO:64. Em algumas alternativas, o ácido nucleico compreende ainda um ácido nucleico que codifica uma sequência marcadora. Em algumas alternativas, a sequência marcadora é um receptor truncado e opcionalmente é um EGFRt, um HER2t ou um CD 19t. Em algumas alternativas, o ácido nucleico ainda compreende um transgene de di-hidrofolato reductase configurado para a seleção do metotrexato. Em algumas alternativas, o transgene de di-hidrofolato reductase é um mutante Duplo de di-hidrofolato reductase (DHFRdm). Em algumas alternativas,
o primeiro, segundo, terceiro e/ou quarto polinucleotídeo é o códon otimizado para reduzir a proporção total de GC/AT do ácido nucleico. Em algumas alternativas, o primeiro, segundo, terceiro e/ou quarto polinucleotideo e o códon otimizado para a expressão em humanos. Em algumas alternativas, o mutante duplo de di-hidrofolato reductase compreende mutações de aminoácidos de L22F e F31S.
[0094] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidos nesse documento incluem vetores de expressão compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma das alternativas desse documento. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor viral. Em algumas alternativas, o vetor é um vetor lentiviral ou adenoviral.
Certos receptores quiméricos
[0095] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem polipeptídeos de receptor quiméricos, codificados pelo ácido nucleico de qualquer uma das alternativas desse documento ou pelo vetor de qualquer uma das alternativas desse documento.
Certas células hospedeiras
[0096] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem células hospedeiras compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma das alternativas desse documento ou o vetor de expressão de qualquer uma das alternativas desse documento ou expressa o receptor quimérico de qualquer uma das alternativas desse documento.
Em algumas modalidades, uma célula hospedeira compreende uma célula geneticamente modificada.
Em algumas alternativas, o receptor de antígeno quimérico é codificado pelo ácido nucleico de qualquer uma das alternativas desse documento ou pelo vetor de qualquer uma das alternativas desse documento.
Em algumas alternativas, o vetor de expressão compreende o ácido nucleico de qualquer uma das alternativas desse documento.
Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula de linfócito citotóxico CD8+
T selecionada do grupo consistindo em células T CD8+ naïve,
células T CD8+ de memória central, células T CD8 + de memória efetora e células T CD8+ de volume.
Em algumas alternativas, a célula de linfócitos T CD8+ é uma célula T de memória central e, em que a célula T de memória central é positiva para CD45RO+, CD62L+ e CD8+. Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula de linfócitos T CD4+ auxiliar selecionada do grupo consistindo em células T CD4+ naïve, células T CD4+ de memória central,
células T CD4+ T de memória efetora e células T CD4+ de volume.
Em algumas alternativas, a célula de linfócito CD4+ é uma célula T CD4+ naïve e, em que a célula CD4+ T simples é positiva para CD45RA+, CD6L+ e CD4+ e negativo para
CD45RO.
Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula T precursora. Em algumas alternativas, a célula hospedeira é uma célula tronco hematopoiética.
[0097] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem uma célula hospedeira de qualquer uma das alternativas desse documento ou a composição de qualquer uma das alternativas desse documento para uso no tratamento ou inibição de um câncer ou um tumor sólido que expressa um receptor IL-l3a2 é fornecido. A composição compreende a célula hospedeira de qualquer uma das alternativas desse documento e um excipiente farmacêutico. Em algumas alternativas, o câncer é um tumor de glioblastoma. Em algumas alternativas, o câncer é glioblastoma multiforme (GBM). Em algumas alternativas, o câncer é uma malignidade ILl3Ra positiva. Em algumas alternativas, o câncer é câncer cerebral ou tumores cerebrais.
Certas composições
[0098] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem composições compreendendo uma célula hospedeira de qualquer uma das alternativas desse documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Certos métodos de preparação de células hospedeiras
[0099] Algumas modalidades dos métodos e composições fornecidas nesse documento incluem métodos para a preparação de uma célula hospedeira de qualquer uma das alternativas fornecidas nesse documento compreendendo: a) introdução de um ácido nucleico de qualquer uma das alternativas desse documento ou um vetor de expressão de qualquer uma das alternativas desse documento em linfócitos; e b) cultivar os linfócitos na presença de anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28, e pelo menos uma citocina homeostática até que as células se expandam ; e c) selecionar os linfócitos com um reagente de seleção; em que o reagente de seleção é configurado para enriquecer seletivamente as células transduzidas com o ácido nucleico ou vetor. Em algumas alternativas, o reagente de seleção é metotrexato. Em algumas alternativas, os linfócitos têm um fenótipo CD45RA-, CD45RO+ e CD6L+. Em algumas alternativas, os linfócitos são CD8+ ou CD4+. Em algumas alternativas, a citocina é IL-15, I1-7 e/ou I1-21 Em algumas alternativas, o método compreende ainda a introdução de um segundo ácido nucleico na célula hospedeira, o segundo ácido nucleico codificando uma proteína marcadora. Em algumas alternativas, a proteína marcadora é EGFRt.
Certos métodos de terapia
[00100] Algumas modalidades dos métodos e composições aqui fornecidas incluem métodos para realizar imunoterapia celular em um indivíduo tendo um câncer ou um tumor compreendendo: administrar a célula hospedeira de qualquer uma das alternativas desse documento ou a composição das alternativas desse documento é fornecida ao indivíduo. A composição compreende uma célula hospedeira de qualquer uma das alternativas desse documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável é fornecido. Em algumas alternativas, o câncer é um tumor de glioblastoma.
Em algumas alternativas, o câncer é um glioblastoma multiforme (GBM). Em algumas alternativas, o câncer é uma malignidade IL13Ra positiva. Em algumas alternativas, o câncer é um câncer cerebral. Em algumas alternativas, o indivíduo é selecionado para receber terapia de combinação.
Em algumas alternativas, a terapia de combinação compreende a administração de um fármaco quimioterapêutico. Em algumas alternativas, a terapia de combinação compreende a administração da terapia de radiação. Em algumas alternativas, o fármaco quimioterapêutico compreende eletoquimioterapia, agentes de alquilação, antimetabólitos (por exemplo, 5-fluorouracila (5-FU), 6-mercaptopurina (6- MP), Capecitabina (Xeloda®), Cladribina, Clofarabina, Citarabina (Ara-C®), Floxuridina, Fludarabina, Gemcitabina (Gemzar®), Hidroxiureia, Metotrexato, Pemetrexede (Alimta®), Pentostatina e Tioguanina), antibiótico antitumoral, inibidor da topoisomerase, inibidor mitótico,
corticosteroide, agente intercalante do DNA, ou inibidor de ponto de verificação (ponto de verificação quinase CHK1, CHK2). Em algumas alternativas, o câncer é um glioma.
Desenvolvimento de certos CARs ILl3Ra2
[00101] São mostradas na Figura 1 representações esquemáticas dos ácidos nucleicos que codificam a estrutura de vários CARs IL-l3Ra2 que foram criados, cada um tendo um dos vários domínios de ligação, uma das várias regiões espaçadoras, junto com um domínio transmembranar e um domínio de sinalização(ões) intracelular(s). A sequência de ácido nucleico de cada um desses novos CARs IL-l3Rl3Ra2 inclui uma sequência líder, que pode ser usada, por exemplo, para permitir a tradução da transcrição de mRNA que codifica o CAR. Cada um dos CARs exemplares também compreendiam um scFv de IL-l3Ra2, especificamente um scFv anti-ILl3Ra2 tendo domínios VH e VL estabelecidos em SEQ ID NOs:l4 e 16, respectivamente ou tendo domínios VH E VL estabelecidos em SEQ ID NOs:l5 e 17, respectivamente. Cada um dos CARs gerados e testados foram gerados com quatro domínios de ligação scFv diferentes. Os quatro domínios de ligação incluíram cada um dos pares anti-ILl3rRa VH/VL, em cada uma das orientações VL-VH e VH-VL, individualmente.
[00102] Os três espaçadores diferentes, individualmente presentes nos CARs exemplares, são mostrados na Figura 1, posicionados entre o scFv e o domínio transmembranar. Os espaçadores testados variaram de comprimento e foram derivados de regiões constantes de imunoglobulina. O espaçador com o comprimento de sequência de aminoácidos mais curto foi uma região de articulação IgG4 humana modificada, um espaçador com um comprimento intermediário (médio) incluiu a região de articulação humana modificada e ainda incluiu um domínio CH3 (IgG4- CH3); o espaçador mais longo testado incluiu a região de articulação IgG4 modificada, uma região CH2 modificada e a região CH3 (IgG4-CH2 (L235D, N297Q)-CH3 (L)). Cada um dos CARs exemplares gerados adicionalmente incluiu uma transmembrana derivada de CD28 humano (domínio CD28tm) e domínios de sinalização humano 4-1BB humano e CD3zeta (domínio 4-1BB, domínio CD3zeta).
[00103] Cada um dos ácidos nucleicos que codificam e usado para expressar os CARs também incluiu uma sequência que codifica uma sequência de salto de T2A e um ácido nucleico que codifica um marcador de expressão truncado da expressão de CAR.
[00104] Em algumas alternativas, o domínio de ligação de ligante das modalidades dos CARs providos compreende uma região variável de cadeia pesada que tem ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18, ou consiste em uma sequência que tem pelo menos 90, 91, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:18, ou que compreende um CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de, tipicamente pelo menos um CDR3 de, uma região VH tendo a sequência de SEQ ID NO:18.
[00105] Em algumas alternativas, o domínio de ligação de ligante das modalidades dos CARs providos compreende uma região variável de cadeia leve que tem ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19, ou consiste em uma sequência que tem pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:19, ou que compreende uma CDR1, CDR2 e CDR3 de uma Região VL tendo a sequência de SEQ ID NO:19. As sequências foram descritas em WO2014072888, incluída nesse documento por referência em sua totalidade.
[00106] Em algumas alternativas, a região de ligação de ligante que se liga especificamente à IL-l3-Ra2 humana compreende: (a) uma cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO:20; (b) uma cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO:21; (c) uma cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO:22; e/ou compreende (d) uma cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO:23; (e) uma cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:24; e/ou (f) uma cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO:25.
[00107] Em algumas alternativas, a região de ligação de ligante compreende a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO:18 e a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO:19.
[00108] Em algumas alternativas, o domínio de ligação de ligante compreende uma cadeia pesada CDR2 (CDRH2) compreendendo SEQ ID NO:28; (c) uma cadeia pesada CDR3 (CDRH3) compreendendo SEQ ID NO:29; (d) uma cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO:30; (e) uma cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:3l; e/ou (F) uma cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO:32.
[00109] Em algumas alternativas, o domínio de ligação do ligante compreende uma cadeia pesada CDR1 (CDR- H1) que compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 ou SEQ ID NO:36. Em algumas alternativas, a CDR-H2 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 ou SEQ ID NO:40. Em algumas alternativas, CDRH3 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:4.
[00110] Em algumas modalidades, o CAR compreende um espaçador interposto entre o domínio de ligação e o domínio transmembranar. Em algumas alternativas, o espaçador compreende ou consiste em ou consiste essencialmente em pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, tal como toda ou uma porção de uma região de articulação de imunoglobulina, tal como uma região de articulação de IgG4, ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, a constante de imunoglobulina e/ou região de articulação é uma região de IgG humana, tal como IgG4 ou IgG1, ou uma variante da mesma. O espaçador pode ser de um comprimento que proporciona maior sensibilidade da célula após a ligação ao antígeno, em comparação com a ausência do espaçador. Espaçadores exemplares incluem aqueles descritos no pedido de patente internacional número WO2014031687, nesse documento expressamente incorporado por referência em sua totalidade. Em alguns exemplos, o espaçador é ou é de cerca de 12 aminoácidos de comprimento ou não é mais do que 12 aminoácidos em comprimento ou é ou é cerca de 15 aminoácidos em comprimento ou é de cerca de não mais do que 15 aminoácidos em comprimento.
[00111] Exemplos de espaçadores incluem aqueles tendo pelo menos 10 a 229 aminoácidos, 10 a 200 aminoácidos, 10 a 175 aminoácidos, 10 a 150 aminoácidos, 10 a 125 aminoácidos, 10 a 100 aminoácidos, 10 a 75 aminoácidos, 10 a 50 aminoácidos, 10 a 40 aminoácidos, 10 a 30 aminoácidos, 10 a 20 aminoácidos, ou 10 a 15 aminoácidos, e incluindo qualquer número inteiro entre os pontos finais de qualquer uma das faixas listadas. Em algumas modalidades, uma região espaçadora tem 12 aminoácidos ou menos, mas não zero, 119 aminoácidos ou menos, mas não zero, ou 229 aminoácidos ou menos, mas não zero.
Em algumas modalidades, o espaçador é menor do que
250 aminoácidos em comprimento mas não zero, menor do que
200 aminoácidos em comprimento mas não zero, menor do que
150 aminoácidos em comprimento mas não zero, menor do que
100 aminoácidos em comprimento mas não zero, menor do que
75 aminoácidos em comprimento mas não zero, menor do que 50 aminoácidos em comprimento mas não zero, menor de 25 aminoácidos em comprimento, mas não zero, menos de 20 aminoácidos em comprimento, mas não zero, menos de 15 aminoácidos em comprimento, mas não zero, menos de 12 aminoácidos em comprimento, mas não zero, ou menos que 10 aminoácidos em comprimento, mas não zero.
Em algumas modalidades, o espaçador é de 10 a 250 aminoácidos em comprimento, 10 a 150 aminoácidos em comprimento, 10 a 100 aminoácidos em comprimento, 10 a 50 aminoácidos em comprimento, 10 a 25 aminoácidos em comprimento, 10 a 15 aminoácidos em comprimento, 15 a 250 aminoácidos em comprimento, 15 a 150 aminoácidos em comprimento, 15 a 100 aminoácidos de comprimento, 15 a 50 aminoácidos em comprimento, 25 a 250 aminoácidos em comprimento, 25 a 100 aminoácidos em comprimento, 25 a 50 aminoácidos em comprimento, 50 a 250 aminoácidos em comprimento, 50 a 150 aminoácidos em comprimento, 50 a 100 aminoácidos em comprimento, 100 a 250 aminoácidos em comprimento, 100 a
150 aminoácidos em comprimento, ou 150 a 250 aminoácidos em comprimento. Espaçadores exemplares incluem uma articulação de IgG4 sozinha, uma articulação de IgG4 ligada a domínios CH2 e CH3 ou uma articulação de IgG4 ligada ao domínio CH3.
Espaçadores exemplares incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Hudecek et al. Clin. Cancer Res., 19:3153 (2013), publicação de pedido de patente internacional número WO2014031687, Patente U.S. No.
8,822,647 ou pedido publicado No. US2014/0271635 nesse documento expressamente incorporados por referência em suas totalidades.
[00112] Em alguns aspectos, o espaçador do CAR consiste em ou compreende uma articulação de IgG4, uma articulação CH3 de IgG4 ou uma articulação CH2(L235D, N297Q)-CH3 de IgG4.
[00113] Em algumas alternativas, o domínio de ligação de ligante compreende (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VH de SEQ ID NO:18; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VL de SEQ ID NO:19. As sequências podem ser encontradas em WO2014/072888, nesse documento expressamente incorporada por referência em sua totalidade.
[00114] Em algumas alternativas, a orientação das cadeias é o VL-ligante-VH. Em alguns aspectos, a orientação é o VH-ligante VL.
[00115] Em algumas alternativas, a região de ligação de ligante compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência VH mostrada em SEQ ID NO:18; uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 da sequência VL mostrada em SEQ ID NO:19. Em algumas alternativas, é provido um espaçador em que o espaçador compreende uma região constante de imunoglobulina, tal como uma incluindo toda ou parte de uma região Fc que inclui pelo menos um par de substituições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e SEQ ID N0: 43; ou uma região Fc projetada e pelo menos uma região constante de cadeia leve projetada selecionada do grupo consistindo em L443C (SEQ ID NO:44), Q347C (SEQ ID NO:45), kKl83C (SEQ ID NO:46), SEQ ID NO:47, L443C/kKl83C (SEQ ID NO:44 e SEQ ID NO:46), Q347C/kAl11 C (SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:47) e Q347C/kKl83C (SEQ ID NO:45 E SEQ ID NO:46).
[00116] Em algumas alternativas, a região constante ou porção da mesma compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:48.
[00117] Em algumas alternativas, scFv derivado de Ab02 compreende uma sequência apresentada nas SEQ ID NO:49 (LCDR1), SEQ ID NO:50 (LCDR2) e/ou SEQ ID NO:51 (LCDR3). Em algumas alternativas, o anticorpo Ab02 compreende uma sequência como apresentada em SEQ ID NO: 55 (HCDR1), SEQ ID NO: 56 (HCDR2) e/ou SEQ ID NO: 57 (HCDR3).
[00118] Em algumas alternativas, o anticorpo Ab0l compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:52 (LCDR1), SEQ ID NO:53 (LCDR2) e/ou SEQ ID NO:54 (LCDR3). Em algumas alternativas, o anticorpo Ab0l compreende uma sequência como apresentada em SEQ ID NO:58 (HCDR1), SEQ ID NO:59 (HCDR2), e/ou SEQ ID NO:60 (HCDR3).
[00119] Em algumas modalidades, o CAR inclui uma região de ligação de antígeno que é ou compreende um scFv incluindo domínios VH e VL na orientação VL-ligante-VH. Em algumas modalidades, tal como em alguns aspectos de tais modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18, uma CDR3 (e, opcionalmente, CDRs 1 e 2) da sequência VH apresentada em SEQ ID NO:18 e/ou compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com SEQ ID NO:18, ou que compreende uma CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de, tipicamente pelo menos uma CDR3 de, uma região VH tendo a sequência de SEQ ID NO:18; em alguns aspectos, por exemplo, de tais modalidades, o VH é um VH derivado de Ab0l. Em alguns aspectos de tais modalidades, o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19, uma CDR3 (e, opcionalmente, CDRs 1 e 2) da sequência VL apresentada em SEQ ID NO:19 , e/ou compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com SEQ ID NO:19, ou que compreende uma CDR1, CDR2 e/ou CDR3 De, tipicamente pelo menos uma CDR3 da, uma região VL tendo a sequência de SEQ ID NO:19 em alguns aspectos, por exemplo, de tais modalidades, o VH é um VH derivado de Ab0l. Em alguns aspectos de qualquer um destas modalidades, tais como aspectos dos CARs tendo tais domínios de ligação, o CAR inclui uma região espaçadora entre o domínio de ligação e o domínio transmembranar que contém não mais do que em ou cerca de 50, 40, 30 ou 20 aminoácidos em comprimento, tal como não mais do que em ou cerca de 15 ou não mais do que em ou cerca de 12, aminoácidos, e/ou contém ou consiste essencialmente em uma região de articulação de imunoglobulina ou variante da mesma, tal como uma articulação de IgG4 ou variante da mesma.
[00120] Em alguns aspectos, os CARs e/ou células que expressam os mesmos exibem uma ou mais atividade funcional aumentada ou superior em comparação com um CAR de referência. Em alguns aspectos, o CAR de referência é um CAR tendo o mesmo domínio de ligação (e opcionalmente de outro modo idêntico) mas tendo um espaçador diferindo em comprimento e/ou composição, tal como um maior do que em ou cerca de 50, 40, 30, 20, 15 ou 12 aminoácidos em comprimento e/ou um CAR tendo um domínio de ligação com as mesmas regiões variáveis ou similares, mas em uma orientação alternativa. Em algumas modalidades, a função é como observada em um ensaio in vitro tal como um ensaio de co-cultura com células que expressam IL-l3Ra2 (tal como um ensaio medindo a produção de citocina ou atividade citolítica) ou um ensaio in vivo usando um modelo animal com um tumor positivo para IL-l3Ra2, tal como uma avaliação da redução carga tumoral ou sobrevivência ao tumor após a administração de células, tais como células T, que expressam o CAR.
[00121] Nas alternativas aqui, oito CARs tendo várias combinações de domínios de ligação de antígenos e outros domínios como representado na Figura 1 foram testados em vários ensaios.
Certas sequências
[00122] Em algumas alternativas, o Ab0l VH compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:14. Em algumas alternativas, o Ab0l VL compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:16. Em algumas alternativas, o scFv IL13Ra2 Ab0l VLVH é codificado por uma sequência apresentada em SEQ ID NO:61. Em algumas alternativas, o scFv ILl3Ra2 Ab0l VHVL é codificado por uma sequência apresentada em SEQ ID NO:62 que inclui uma sequência Ab0l- VL, uma sequência Ab0l-VH, um códon de iniciação ATG, um local de restrição 5’ Nhel (GCTAGC) e um local de restrição de 3' RsrII (CGGACCG). Em algumas alternativas, a sequência de proteína Ab0l-VH compreende SEQ ID NO:65. Em algumas alternativas, Ab0l HCDR1 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:66. Em algumas alternativas, Ab0l HCDR2 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:67.
Em algumas alternativas, Ab0l HCDR3 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:68. Em algumas alternativas, Ab0l-VL compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:69. Em algumas alternativas, Ab0l LCDR1 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:70. Em algumas alternativas, Ab0l LCDR2 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:71. Em algumas alternativas, Ab0l LCDR3 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:72.
[00123] Em algumas alternativas, o Ab02 VH compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:15. Em algumas alternativas, o Ab02 VL compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:17. Em algumas alternativas, o IL13Ra2 Ab02 VLVH scFv é codificado por uma sequência apresentada em SEQ ID NO:63. Em algumas alternativas, o scFv ILl3Ra2 Ab02 VHVL é codificado por uma sequência apresentada em SEQ ID NO:64, que inclui uma sequência Ab02- VL, uma sequência Ab02-VH, um códon de iniciação ATG, um local de restrição 5' Nhel (GCTAGC), e um local de restrição 3' RsrII (CGGACCG). Em algumas alternativas, a sequência de proteína Ab02-VH compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:73. Em algumas alternativas, Ab02 HCDR1 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:74.
Em algumas alternativas, o Ab02 HCDR2 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO: em algumas alternativas, a sequência de proteína Ab02-VL compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:77. Em algumas alternativas, Ab02 LCDR1 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:78. Em algumas alternativas, Ab02 LCDR2 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:79.
Em algumas alternativas, Ab02 LCDR3 compreende uma sequência apresentada em SEQ ID NO:80.
Exemplos Exemplo 1 - Construção de CARs que tem como alvo IL- l3Ra2
[00124] Vários CARs que tem como alvo IL-l3Ra2 foram construídos. Como mostrado na Figura 1, os CARs específicos de IL-l3Ra2 incluíram: um de um número de fragmento variável de cadeia simples (scFv) que reconheceu especificamente um epítopo extracelular de receptor De IL- 13 alfa 2 (IL-l3Ra2); um dos vários domínios espaçadores (marcados “S”, “M” e “L”), um domínio transmembranar derivado de um CD28 humano (CD28tm); um domínio coestimulador derivado de 4-1BB humano; um domínio de sinalização derivado de CD3z; uma sequência de salto ribossômico T2A; e um marcador de transdução de EGFR (EGFRt) truncado; e opcionalmente uma sequência de salto ribossômico T2A adicional e um transgene mutante duplo de di-hidrofolato reductase (DHFRdm) configurado para a seleção de metotrexato.
[00125] Exemplos de anticorpos ou fragmentos de ligação de epítopo dos quais o fragmento variável de cadeia única (scFv) pode ser derivado incluem anticorpo anti-IL- l3-Ra2 igG1 humanizado (Creative Biolabs, NY) e anticorpo terapêutico anti-IL3RA2 (hu07 vl. 1) (Creative Biolabs, NY).
[00126] O domínio espaçador foi ligado em cada CAR com o scFv e conectou o elemento de ligação extracelular ao domínio transmembranar. Cada um dos CARs foi gerado de modo a incluir um dos três espaçadores diferentes (S, M ou L), cada um com uma sequência de aminoácidos de comprimento diferente (Espaçador S, SEQ ID NO:9; Espaçador M, SEQ ID NO:10; ou um Espaçador L, SEQ ID NO:11). Diferentes configurações scFv usadas individualmente nos vários CARs IL-l3Ra2, incluindo domínios VH e VL derivados de um dos dois anticorpos dirigidos a anti-IL-l3Ra2 (‘Hu08’, Ab0l; e ‘Hu07', Ab02). A porção scFv de cada CAR foi compreendida de uma região VH tendo uma sequência como apresentada em SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:15 e uma região VL tendo uma sequência apresentada em SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:17, presente em uma orientação VL-VH ou VH-VL, conectada por um ligante peptídico flexível.
Exemplo 2 - Comparação funcional de CARs derivados de diferentes anticorpos
[00127] Uma comparação funcional de CARs incluindo domínios de ligação scFv derivados de diferentes anticorpos em diferentes orientações foi realizada. A comparação incluiu uma análise de expressão de superfície de EGFRt e um ensaio de libertação de citocina. Neste estudo, cada um dos CARs incluiu o espaçador de DNA (tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9, uma região de articulação de imunoglobulina modificada), bem como os domínios de sinalização transmembranar e coestimulante e primário descritos e mostrados na figura 1, com uma das várias regiões de ligação de scFvs (domínios e orientações VH/VL) mostradas na Figura 1, os CARs incluíram: CAR IL-l3Ra2 Ab0l VLVH Espaçador S; CAR IL-l3Ra2 Ab0l VHVL Espaçador S; CAR IL-l3Ra2 Ab02 VLVH Espaçador S; e CAR IL-l3Ra2 Ab02 VHVL Espaçador S.
[00128] A expressão de CARs em células foi examinada determinando a expressão do marcador EGFRt em células T CD8+ e CD4+ usando citometria de fluxo (figura 2A).
[00129] As células CAR-T foram co-cultivadas, individualmente, com células DAOY (linhagem celular de cérebro/cerebelo humano), células U251T (linhagem celular de gioblastoma humano) e células K562 (células de leucemia mielogena crónica humanas) projetadas para expressar IL3Ra2. Depois de 24 horas de níveis de IL-2, IFN-gama e TNF-alfa foram medidos em sobrenadantes utilizando um ensaio de citocina. Produção aumentada de citocinas após a incubação com células alvo foi observada para células T CD8+ e CD4+ expressando CARs que contêm domínios de ligação tendo domínios VH e VL do anticorpo Ab0l, em ambas as orientações VH/VL (Figura 2B e Figura 2C).
Exemplo 3 - Comparação funcional de CARs incluindo espaçadores diferentes
[00130] Uma comparação funcional de CARs incluindo scFvs derivados do mesmo anticorpo (em diferentes orientações) e diferentes espaçadores de diferentes comprimentos foi realizada. Os quatro CARS representados na Figura 1 foram testados para a expressão de superfície celular em CD 8+ por confinamento da sequência marcadora, EGFRt (Figura 3A). Além disso, as células CD8+ carregando os CARs também foram testadas quanto à sua capacidade de causar “quebra” específica, bem como sua capacidade de liberar citocinas. Neste estudo, cada um dos CARs exemplares incluiu um de dois domínios de ligação diferentes-um scFv tendo domínios VL e VH de Ab0l, tanto na orientação VL-VH como na orientação VH-VL-e um dos vários espaçadores (incluindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11), bem como os domínios de sinalização transmembranar e co-estimuladores e primários descritos e representados na Figura 1.
[00131] Resultados representativos da análise de citometria de fluxo de multi-parâmetros de células T derivadas de doador saudável e transduzidos com os CARs indicados lentivírus são mostrados na Figura 3 (painéis superior e médio) nos quais foram extraídos os quadrantes de histogramas com base na coloração de controlo. Expressão de marcador substituto de superfície (EGFRt) em células CAR-T CD8+ IL-l3Ra2 foi analisada por citometria de fluxo (Figura 3A, painel inferior).
[00132] Os CARS que tem como alvo IL-l3Ra2 expressando células T CD8 foram co-cultivados com diferentes linhagens de células alvo que expressam IL-l3Ra2 em razões de extremidade para alvo indicadas (figura 3B).
Um ensaio de libertação de cromo foi usado para avaliar a atividade citolítica e a produção de citocinas foi avaliada em sobrenadantes. O ensaio de liberação de cromo ocorreu durante um período de co-cultura de 4 horas, enquanto a liberação de citocina foi avaliada após 24 horas de co- cultura (razão efetora-alvo de 2:1). Conforme mostrado na Figura 3C, co-cultura com as várias células T que expressam
CAR levaram à “quebra” específica, cada vez com aumento crescente para razões alvos e níveis de secreção de citocina. Comparado a outros CARs avaliados, observou-se uma atividade citolítica aumentada para células que expressam o CAR com o espaçador “S” e incluindo o scFv com a orientação VL-VH. Em cada um dos CARs avaliados tendo domínios de ligação com a orientação VL-VH, a atividade citolítica específica para o alvo e a produção de citocinas foram observadas. Adicionalmente, em CARs com orientação VL-VH, observou-se que a presença do espaçador “S” resulta em efeitos superiores comparados com os outros espaçadores testados. Em contraste, a atividade citolítica não foi observada neste ensaio para CARs com a orientação VH-VL e o espaçador “S” (considerando que a atividade foi observada para cada um dos CARs de VH-VL que têm os espaçadores “M” e “L”).
[00133] Com relação à produção de citocinas, como mostrado na Figura 3B, célula T com CAR IL-l3Ra2 Ab0l VLVH espaçador S, célula T com CAR IL-l3Ra2 Ab0l VLVH espaçador M, célula T com CAR IL-l3Ra2 Ab0l VLVH espaçador L levou a uma maior expressão de IFN-gama. Célula T com CAR IL-l3Ra2 Ab0l VHVL espaçador M, célula T com CAR IL-l3Ra2 Ab0l VHVL espaçador L mostrou expressão de IFN-gama. Célula T com CAR IL-l3Ra2 Ab0l VLVH espaçador S, célula T com CAR IL-l3Ra2
Ab0l VLVH espaçador M, célula T com CAR IL-l3Ra2 Ab0l VLVH espaçador L levou a “quebra” específica mais elevada.
[00134] Com relação à “quebra” específica, conforme mostrado na Figura 3B, em concentrações aumentadas, as células CD8+ carregando os espaçadores CAR longo IL-l3Ra2 Ab0l VLVH, IL-l3Ra2 AbOl VLVH e IL-l3Ra2 AbOl VLVH causaram uma quantidade significativa de “quebra” específica em altas concentrações de célula. Além disso, estas células levaram à alta produção da citocina IFN-gama.
[00135] Em contraste, as células que expressam CAR IL-l3Ra2 Ab0l VHVL, CAR médio IL-l3Ra2 Ab0l VHVL e CAR longo IL-l3Ra2 Ab0l VHVL Espaçador S tinham quantidades reduzidas de “quebra” específica quando comparadas com CAR IL-l3Ra2 Ab0l VLVH, CAR médio IL-l3Ra2 Ab0l VLVH e CAR longo IL-l3Ra2 Ab0l VLVH Espaçador S. “Quebra” específica não foi vista com CAR IL-l3Ra2 Ab0l VHVL Espaçador S.
Adicionalmente, a expressão de CAR IL-l3Ra2 Ab0l VHVL Espaçador S não conduziu à expressão de IFN-gama, que foi vista com o meio de CAR médio IL-l3Ra2 Ab0l CHCL e CAR longo IL-l3Ra2 Ab0l VHVL.
Exemplo 4-Atividade antitumoral in vivo de um CAR anti-IL13Ra2
[00136] Resultados terapêuticos após a administração de células que expressam um CAR específico ILl3Ra2 contendo um domínio de ligação derivado de anticorpo Ab0l, orientação VLVH, espaçador “S”, foram avaliados em um modelo de glioblastoma de rato. Os CARs usados para os experimentos foram expressos em células CD8+. Para os experimentos, células ffLuc+ U87 de glioblastoma (0,2 x 106) foram injetadas intracranialmente no cérebro anterior de camundongos NSG no dia 0. No dia 7, camundongos (n=3 por grupo) não receberam tratamento (controle de veículo ou simulação) ou receberam tratamento com diferentes doses (2 x 106, 1 x 106 ou 0,5 x 106 células) de células CAR-T CD8+ transduzidas IL-l3Ra2 Ab0l VLVH.
[00137] A Figura 4A e a Figura 4B mostram os resultados de um estudo demonstrando a atividade antitumoral in vivo de um CAR específico de ILl3Ra2 contendo os domínios VH e VL derivados de Ab0l, na orientação VL-VH, e o espaçador “S”, juntamente com os domínios transmembranares e de sinalização como representado na figura 1. Células de glioblastoma humanas que expressam luciferase do vaga-lume (células de glioblastoma ffLuc+ U87) (0,2x106) foram injetadas intracranialmente nos cérebros de camundongos NSG no Dia 0.
No dia 7, camundongos (n=3 por grupo) receberam o controle de Veículo ou administração simulada ou foram administrados com tratamento com diferentes doses (2 x 106, 1 x 106 ou 0,5 x 106 células) de células CD8+ expressando o CAR específico de IL-l3Ra2 (Ab0l VL-VH). A Figura 4A mostra gráficos de fluxo total (fótons/segundo) como uma medida da carga tumoral (eixo y) ao longo do tempo (dias pós inoculação do tumor, eixo x), para animais tratados com veículo ou tratamento simulado (esquerda) e indicam números decrescentes de células CAR+ (lado direito; direita para a esquerda), demonstrando a regressão de tumor após a administração de células que expressam o CAR. Uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier demonstrou sobrevivência crescentemente melhorada para camundongos tratados com doses crescentes de células T que expressam o CAR anti-IL- l3Ra2 (Figura 4B). O controle do veículo teve 0% de taxa de sobrevivência em 25 dias. No entanto, os camundongos que receberam 2 x 106 das células T CD8+ expressando IL13Ra2 Ab0l VLVH tiveram 50% de sobrevivência após 90 dias.
Exemplo 5-Atividade antitumoral in vivo de um CAR anti-IL13Ra2
[00138] Para avaliar o impacto do espaçador IL13Ra2 Ab0l VLVH CAR, um experimento substancialmente similar ao Exemplo 3 foi realizado usando-se camundongos portadores de tumor U251T como modelo de glioblastoma. No dia 0, células tumorais U251T GFP:ffluc foram injetadas intracranialmente seguidas por uma injeção intratumoral de células CAR-T CD8+ ou CAR-T simuladas no dia 7. Camundongos injetados com células T simuladas serviram como controle.
[00139] Todos os camundongos tratados com células CAR-T curtas ILl3Ra2 Ab0l VLVH 2G apresentaram completa regressão de tumor. Apenas um do grupo de CAR médio de camundongos exibiu reincidência de tumor e a eutanásia animal foi necessária no dia 58 após a injeção do tumor.
Três dos camundongos portadores de tumor U251T tratados com injeção intratumoral de células CAR-T ILl3Ra2 de espaçador longo exibiram atividade terapêutica menor e relapso tumoral.
[00140] Juntos, todos estes dados sugerem que o espaçador extracelular de tamanho curto é a configuração ótima para ILl3Ra2 Ab0l VLVH que confere uma potência antitumoral in vivo ótima, suportando seu desenvolvimento clínico.
[00141] A Tabela 2 relaciona certas sequências de aminoácidos e de nucleotídeos para algumas modalidades dos métodos e composições aqui fornecidos.
Tabela 2
SEQ ID Característica(s) Sequência NO: SEQ ID IgG1 Humano EPKSCDKTHTCPPCP NO:01 SEQ ID IgG2 Humano ERKCCVECPPCP NO:02 SEQ ID IgG3 Humano ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP NO:03 EPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP SEQ ID IgG4 Humano ESKYGPPCPSCP NO:04 SEQ ID IgG4 Humano ESKYGPPCPPCP NO:05 Modificado SEQ ID IgG4 Humano YGPPCPPCP NO:06 Modificado SEQ ID IgG4 Humano KYGPPCPPCP NO:07 Modificado SEQ ID IgG4 Humano EVVKYGPPCPPCP NO:08 Modificado SEQ ID Espaçador S ESKYGPPCPPCP NO:09 SEQ ID Espaçador M ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQ NO:10 VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHE
ALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID Espaçador L ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM NO:11 ISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID CD28tm ATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGGC NO:12 GTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGG
CCTTCATCATCTTTTGGGTG SEQ ID CD28tm MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV NO:13 SEQ ID Ab01-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGM NO:14 SWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRF
TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTT
SEQ ID Característica(s) Sequência NO:
ALATRFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID Ab02-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGV NO:15 HWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFT
ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDA
MDYWGQGTLVTVSS SEQ ID Ab01-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVA NO:16 WYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSL
QPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGTKVEIK SEQ ID Ab02-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYL NO:17 HWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGS
GTDFTLTISSL
QPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIK SEQ ID Região VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGM NO:18 SWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRF
TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTT
ALATRFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID Região VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVA NO:19 WYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSA
PWTFGGGTKVEIK SEQ ID CDR1 de cadeia SRNGMS NO:20 pesada SEQ ID CDR2 de cadeia TVSSGGSYIYYADSVKG NO:21 pesada SEQ ID CDR3 de cadeia QGTTALATRFFDV NO:22 pesada SEQ ID CDR1 de cadeia KASQDVGTAVA NO:23 leve SEQ ID CDR2 de cadeia SASYRST NO:24 leve SEQ ID CDR3 de cadeia QHHYSAPWT NO:25 leve SEQ ID Placeholder NO:26 SEQ ID Placeholder NO:27
SEQ ID Característica(s) Sequência NO: SEQ ID CDR2 de cadeia TVSSGGSYIYYADSVKG NO:28 pesada SEQ ID CDR3 de cadeia QGTTALATRFFDV NO:29 pesada SEQ ID CDR1 de cadeia KASQDVGTAVA NO:30 leve SEQ ID CDR2 de cadeia SASYRST NO:31 leve SEQ ID CDR3 de cadeia QHHYSAPWT NO:32 leve SEQ ID CDR1 de cadeia GFTFSRN NO:33 pesada SEQ ID CDR1 de cadeia GFTFSRNGMS NO:34 pesada SEQ ID CDR1 de cadeia RNGMS NO:35 pesada SEQ ID CDR1 de cadeia SRNGMS NO:36 pesada SEQ ID CDR2 de cadeia SSGGSY NO:37 pesada SEQ ID CDR2 de cadeia TVSSGGSYIY NO:38 pesada SEQ ID CDR2 de cadeia TVSSGGSYIY NO:39 pesada SEQ ID CDR2 de cadeia TVSSGGSYIYYADSVKG NO:40 pesada SEQ ID CDR3 de cadeia ARQGTTALATRFFDV NO:41 pesada SEQ ID Região Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGM NO:42 SWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRF
TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTT ALATRFFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
SEQ ID Característica(s) Sequência NO:
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYCTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSCSPGK SEQ ID Região Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGM NO:43 SWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRF
TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTT ALATRFFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNCFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSCSPGK SEQ ID Região Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGM NO:44 SWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRF
TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTT ALATRFFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSCSPGK SEQ ID Região Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGM NO:45 SWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRF
TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTT ALATRFFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT
SEQ ID Característica(s) Sequência NO:
ISKAKGQPREPCVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSL SEQ ID Região Fc DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVA NO:46 WYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSCADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC SEQ ID Região Fc DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVA NO:47 WYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGT KVEIKRTVACPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTKSFNRGEC SEQ ID Região Fc TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR NO:48 EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
STLTLSKAAYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN
RGEC SEQ ID LCDR1 TASLSVSSTYLH NO:49 SEQ ID LCDR2 STSNLAS NO:50 SEQ ID LCDR3 HQYHRSPLT NO:51 SEQ ID LCDR1 KASQDVGTAVA NO:52 SEQ ID LCDR2 SASYRST NO:53 SEQ ID LCDR3 QHHYSAPWT NO:54 SEQ ID HCDR1 TKYGVH NO:55 SEQ ID HCDR2 VKWAGGSTDYNSALMS NO:56
SEQ ID Característica(s) Sequência NO: SEQ ID HCDR3 DHRDAMDY NO:57 SEQ ID HCDR1 SRNGMS NO:58 SEQ ID HCDR2 TVSSGGSYIYYADSVKG NO:59 SEQ ID HCDR3 QGTTALATRFFDV NO:60 SEQ ID IL13Ra2 Ab01 VLVH GCTAGCCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAG NO:61 scFv CCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTC
CTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACCCAGTCCC CCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGT GACCATCACCTGTAAGGCCAGTCAGGATGTAGGT ACTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCA AGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTCGGCATCCTA CCGGTCCACTGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGC TCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCT CCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTA CTGCCAGCACCATTATAGTGCTCCGTGGACGTTT GGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAGGGTGGTG GTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGG TTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGA CTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTT GTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCAGTAGGAATGG CATGTCTTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGC CTGGAGTGGGTGGCCACCGTTAGTAGTGGTGGTA GTTACATCTACTATGCAGACAGTGTGAAGGGGCG GTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCC CTGTACCTCCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGG ATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGACAAGGGAC TACGGCACTAGCTACGAGGTTCTTCGATGTCTGG GGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCTGAAT
CTAAGTACGGACCG SEQ ID IL13Ra2 Ab01 VHVL GCTAGCCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAG NO:62 scFv: CCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTC
CTCCTGATCCCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG Ab01-VL; Ab01-VH; GCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAG códon inicial ATG; ACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCAGT local de restrição AGGAATGGCATGTCTTGGGTGAGGCAGGCCCCTG 5' Nhel (GCTAGC); GCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCGTTAGTAG local de restrição TGGTGGTAGTTACATCTACTATGCAGACAGTGTG 3′ RsrII (CGGACCG) AAGGGGCGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCA
SEQ ID Característica(s) Sequência NO:
AGAACTCCCTGTACCTCCAGATGAACTCCCTGAG GGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGA CAAGGGACTACGGCACTAGCTACGAGGTTCTTCG ATGTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTC CTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCC GGTGGTGGTGGTTCTGACATCCAGATGACCCAGT CCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAG AGTGACCATCACCTGTAAGGCCAGTCAGGATGTA GGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTG GCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTCGGCATC CTACCGGTCCACTGGCGTGCCTTCCAGATTCTCC GGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCA TCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTA CTACTGCCAGCACCATTATAGTGCTCCGTGGACG TTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAGGAAT
CTAAGTACGGACCG SEQ ID IL13Ra2 Ab02 VLVH GCTAGCCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAG NO:63 scFv CCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTC
CTCCTGATCCCAGATATTCAGATGACCCAGAGCC CGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGT GACCATTACCTGCACCGCGAGCCTGAGCGTGAGC AGCACCTATCTGCATTGGTATCAGCAGAAACCGG GCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATAGCACCAG CAACCTGGCGAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGC GGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCA TTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTA TTATTGCCATCAGTATCATCGCAGCCCGCTGACC TTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAAGGTG GTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGG TGGTTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGC GGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGA GCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTACCAAATA TGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAA GGCCTGGAATGGGTGGCGGTGAAATGGGCGGGCG GCAGCACCGATTATAACAGCGCGCTGATGAGCCG CTTTACCATTAGCCGCGATAACGCGAAAAACAGC CTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAG ATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGATCATCG CGATGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTG
GTGACCGTGAGCAGCGAATCTAAGTACGGACCG SEQ ID IL13Ra2 Ab02 VHVL GCTAGCCCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAG NO:64 scFv: CCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTC
CTCCTGATCCCAGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCG Ab02-VL; Ab02-VH; GCGGCGGCCTGGTGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCG
SEQ ID Característica(s) Sequência NO: códon inicial ATG; CCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTACC local de restrição AAATATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGGCGCCGG 5' Nhel (GCTAGC); GCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCGGTGAAATGGGC local de restrição GGGCGGCAGCACCGATTATAACAGCGCGCTGATG 3′ RsrII (CGGACCG) AGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACGCGAAAA
ACAGCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGC GGAAGATACCGCGGTGTATTATTGCGCGCGCGAT CATCGCGATGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGCA CCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGTGGTGGTGGTTC TGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAT ATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCG CGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCAC CGCGAGCCTGAGCGTGAGCAGCACCTATCTGCAT TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAAC TGCTGATTTATAGCACCAGCAACCTGGCGAGCGG CGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGC ACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGC CGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCATCAGTA TCATCGCAGCCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACC
AAAGTGGAAATTAAAGAATCTAAGTACGGACCG SEQ ID Ab01-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNGM NO:65 SWVRQAPGKGLEWVATVSSGGSYIYYADSVKGRF
TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGTT
ALATRFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID Ab01 HCDR1 SRNGMS NO:66 SEQ ID Ab01 HCDR2 TVSSGGSYIYYADSVKG NO:67 SEQ ID Ab01 HCDR3 QGTTALATRFFDV NO:68 SEQ ID Ab01-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTAVA NO:69 WYQQKPGKAPKLLIYSASYRSTGVPSRFSGSGSG
TDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYSAPWTFGGGT
KVEIK SEQ ID Ab01 LCDR1 KASQDVGTAVA NO:70 SEQ ID Ab01 LCDR2 SASYRST NO:71 SEQ ID Ab01 LCDR3 QHHYSAPWT NO:72
SEQ ID Característica(s) Sequência NO: SEQ ID Ab02-VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTKYGV NO:73 HWVRQAPGKGLEWVAVKWAGGSTDYNSALMSRFT
ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDHRDA
MDYWGQGTLVTVSS SEQ ID Ab02 HCDR1 TKYGVH NO:74 SEQ ID Ab02 HCDR2 VKWAGGSTDYNSALMS NO:75 SEQ ID Ab02 HCDR3 DHRDAMDY NO:76 SEQ ID Ab02-VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASLSVSSTYL NO:77 HWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGS
GTDFTLTISSL
QPEDFATYYCHQYHRSPLTFGGGTKVEIK SEQ ID Ab02 LCDR1 TASLSVSSTYLH NO:78 SEQ ID Ab02 LCDR2 STSNLAS NO:79 SEQ ID Ab02 LCDR3 HQYHRSPLT NO:80 SEQ ID DHFRdm MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDFPWPPLRNESRY
FQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPL NO:81 KGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTE
QPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFV TRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDV
QEEKGIKYKFEVYEKND SEQ ID DHFRdm ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGT
CCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTT NO:82 CCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATAT
TTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAG GTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGAC CTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTA AAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAAC TCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTC CAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAA CAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCT GGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGC CATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTG ACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGT TTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACT
SEQ ID Característica(s) Sequência NO:
TCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTC CAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAG
TATATGAGAAGAATGATTAA SEQ ID GMCSFss ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTG Líder AGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCA NO:83 SEQ ID Ab01-VL GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGT
CTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTG NO:84 TAAGGCCAGTCAGGATGTAGGTACTGCTGTAGCC
TGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGC TGCTGATCTACTCGGCATCCTACCGGTCCACTGG CGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGC ACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGC CTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCACCA TTATAGTGCTCCGTGGACGTTTGGCGGCGGAACA
AAGGTGGAGATCAAG SEQ ID Ab01-VH GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGG
TGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGC NO:85 CGCCTCCGGCTTCACCTTCAGTAGGAATGGCATG
TCTTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGG AGTGGGTGGCCACCGTTAGTAGTGGTGGTAGTTA CATCTACTATGCAGACAGTGTGAAGGGGCGGTTC ACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGT ACCTCCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGATAC CGCCGTGTACTACTGTGCCAGACAAGGGACTACG GCACTAGCTACGAGGTTCTTCGATGTCTGGGGCC
AGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCT SEQ ID Ab02-VL GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGA
GCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTG NO:86 CACCGCGAGCCTGAGCGTGAGCAGCACCTATCTG
CATTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGA AACTGCTGATTTATAGCACCAGCAACCTGGCGAG CGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGC AGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCATCA GTATCATCGCAGCCCGCTGACCTTTGGCGGCGGC
ACCAAAGTGGAAATTAAA SEQ ID Ab02-VH GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGG
TGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGC NO:87 GGCGAGCGGCTTTACCTTTACCAAATATGGCGTG
CATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGG
SEQ ID Característica(s) Sequência NO:
AATGGGTGGCGGTGAAATGGGCGGGCGGCAGCAC CGATTATAACAGCGCGCTGATGAGCCGCTTTACC ATTAGCCGCGATAACGCGAAAAACAGCCTGTATC TGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGC GGTGTATTATTGCGCGCGCGATCATCGCGATGCG ATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCG
TGAGCAGC SEQ ID (Gly-Gly-Gly- GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTG Ser)x3 ligante GTGGTGGTTCT NO:88 SEQ ID Ab01 scFv VLVH GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGT
CTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTG NO:89 TAAGGCCAGTCAGGATGTAGGTACTGCTGTAGCC
TGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGC TGCTGATCTACTCGGCATCCTACCGGTCCACTGG CGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGC ACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGC CTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCACCA TTATAGTGCTCCGTGGACGTTTGGCGGCGGAACA AAGGTGGAGATCAAGGGTGGTGGTGGTTCTGGCG GCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAGGTGCA GCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCT GGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCG GCTTCACCTTCAGTAGGAATGGCATGTCTTGGGT GAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTG GCCACCGTTAGTAGTGGTGGTAGTTACATCTACT ATGCAGACAGTGTGAAGGGGCGGTTCACCATCTC CAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTCCAG ATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGT ACTACTGTGCCAGACAAGGGACTACGGCACTAGC TACGAGGTTCTTCGATGTCTGGGGCCAGGGCACC
CTGGTGACCGTGTCCTCT SEQ ID Ab01 scFv VHVL GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGCGGACTGG
TGCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGC NO:90 CGCCTCCGGCTTCACCTTCAGTAGGAATGGCATG
TCTTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGG AGTGGGTGGCCACCGTTAGTAGTGGTGGTAGTTA CATCTACTATGCAGACAGTGTGAAGGGGCGGTTC ACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGT ACCTCCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGATAC CGCCGTGTACTACTGTGCCAGACAAGGGACTACG GCACTAGCTACGAGGTTCTTCGATGTCTGGGGCC AGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCTGGTGGTGG
SEQ ID Característica(s) Sequência NO:
TGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGT TCTGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTC TGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCAC CTGTAAGGCCAGTCAGGATGTAGGTACTGCTGTA GCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCA AGCTGCTGATCTACTCGGCATCCTACCGGTCCAC TGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCT GGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCC AGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCCAGCA CCATTATAGTGCTCCGTGGACGTTTGGCGGCGGA
ACAAAGGTGGAGATCAAG SEQ ID Ab02 scFv VLVH GATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGA
GCGCGAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTG NO:91 CACCGCGAGCCTGAGCGTGAGCAGCACCTATCTG
CATTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGA AACTGCTGATTTATAGCACCAGCAACCTGGCGAG CGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGC GGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGC AGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCATCA GTATCATCGCAGCCCGCTGACCTTTGGCGGCGGC ACCAAAGTGGAAATTAAAGGTGGTGGTGGTTCTG GCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAAGT GCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAG CCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCGGCGA GCGGCTTTACCTTTACCAAATATGGCGTGCATTG GGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGGAATGG GTGGCGGTGAAATGGGCGGGCGGCAGCACCGATT ATAACAGCGCGCTGATGAGCCGCTTTACCATTAG CCGCGATAACGCGAAAAACAGCCTGTATCTGCAG ATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGCGGTGT ATTATTGCGCGCGCGATCATCGCGATGCGATGGA TTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGC
AGC SEQ ID Ab02 scFv VHVL GAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGG
TGCAGCCGGGCGGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCGC NO:92 GGCGAGCGGCTTTACCTTTACCAAATATGGCGTG
CATTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCAAAGGCCTGG AATGGGTGGCGGTGAAATGGGCGGGCGGCAGCAC CGATTATAACAGCGCGCTGATGAGCCGCTTTACC ATTAGCCGCGATAACGCGAAAAACAGCCTGTATC TGCAGATGAACAGCCTGCGCGCGGAAGATACCGC GGTGTATTATTGCGCGCGCGATCATCGCGATGCG ATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCG TGAGCAGCGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGG
SEQ ID Característica(s) Sequência NO:
CTCCGGTGGTGGTGGTTCTGATATTCAGATGACC CAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCG ATCGCGTGACCATTACCTGCACCGCGAGCCTGAG CGTGAGCAGCACCTATCTGCATTGGTATCAGCAG AAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATA GCACCAGCAACCTGGCGAGCGGCGTGCCGAGCCG CTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACC CTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTG CGACCTATTATTGCCATCAGTATCATCGCAGCCC GCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATT
AAA SEQ ID Espaçador S GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCC
CT NO:93 SEQ ID CD28tm ATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGGCGTGC
TGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGGCCTT NO:94 CATCATCTTTTGGGTG SEQ ID 41-BB AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCA
AACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCA NO:95 AGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAA
GAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG SEQ ID CD3ζ CGGGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTG
CCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGA NO:96 GCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTC
CTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGG GCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGG CCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCC GAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGC GGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCA GGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGAC
GCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG SEQ ID T2A CTCGAGGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTC
TAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCC NO:97 TAGG SEQ ID EGFRt CGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAAT
TTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATAT NO:98 TAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGC
GATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTG ACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACA
SEQ ID Característica(s) Sequência NO:
GGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATC ACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAA ACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGA AATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAG TTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACAT CCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGA TGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTG TGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGT TTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAG CAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGC CAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCT GCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTG CCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGAC AAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGT TTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCC AGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGC ACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTG CCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGAC CTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACC CTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGT GCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATG CACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAAT GGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGG TGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCT
GGGGATCGGCCTCTTCATG SEQ ID DHFRdm ATGGTTGGTTCGCTAAACTGCATCGTCGCTGTGT
CCCAGAACATGGGCATCGGCAAGAACGGGGACTT NO:99 CCCCTGGCCACCGCTCAGGAATGAATCCAGATAT
TTCCAGAGAATGACCACAACCTCTTCAGTAGAAG GTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAAGAAGAC CTGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTA AAGGGTAGAATTAATTTAGTTCTCAGCAGAGAAC TCAAGGAACCTCCACAAGGAGCTCATTTTCTTTC CAGAAGTCTAGATGATGCCTTAAAACTTACTGAA CAACCAGAATTAGCAAATAAAGTAGACATGGTCT GGATAGTTGGTGGCAGTTCTGTTTATAAGGAAGC CATGAATCACCCAGGCCATCTTAAACTATTTGTG ACAAGGATCATGCAAGACTTTGAAAGTGACACGT TTTTTCCAGAAATTGATTTGGAGAAATATAAACT TCTGCCAGAATACCCAGGTGTTCTCTCTGATGTC CAGGAGGAGAAAGGCATTAAGTACAAATTTGAAG
TATATGAGAAGAATGATTAA SEQ ID Espaçador M GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCC
CTGGCCAGCCTAGAGAACCCCAGGTGTACACCCT
SEQ ID Característica(s) Sequência NO: NO:100 GCCTCCCAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAG
GTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACC CCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGG CCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCT GTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACT CCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGA AGGCAACGTCTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAG GCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGA
GCCTGAGCCTGGGCAAG SEQ ID Espaçador L ATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT
GCCCCCGAGTTCGACGGCGGACCCAGCGTGTTCC NO:101 TGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGAT
CAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCAGGAAGATCCCGAGGTCCAGTTCA ATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGC CAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCCAGAGC ACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGC ACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTG CAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATC GAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTC GCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCA GGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAA CAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGC GACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCG TGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTT TAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAAC CACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGG GCAAG
[00142] Em respeito ao uso dos termos plurais e/ou singulares aqui, aqueles versados na técnica podem traduzir a partir do plural para o singular e/ou do singular para o plural como é apropriado para o contexto e/ou aplicação. As várias permutações singulares/plurais podem ser nesse documento expressamente apresentadas para fins de clareza.
[00143] Será entendido por aqueles versados na técnica que, em geral, os termos usados aqui, e especialmente nas reivindicações em anexo (por exemplo, corpos das reivindicações anexadas) são geralmente pretendidos como termos de acesso aberto (por exemplo, o termo "incluindo" deve ser interpretado como “incluindo mas não limitado a,” o termo "contendo" deve ser interpretado como sendo interpretado “contendo pelo menos,” o termo “inclue” deve ser interpretado como “inclue mas não está limitado a,” etc). Será ainda entendido por aqueles versados na técnica que se um número específico de uma recitação de reivindicação introduzida é pretendido, tal intenção será explicitamente citada na reivindicação, e na ausência de tal recitação, não está presente tal intenção.
Por exemplo, como um auxílio à compreensão, as seguintes reivindicações anexas podem conter o uso das frases introdutivas "pelo menos um" e "um ou mais" para introduzir recitações de reivindicação. No entanto, o uso de tais frases não deve ser interpretado como significando que a introdução de uma recitação de reivindicação pelo artigo indefinido "um" limita qualquer reivindicação particular contendo tal recitação de reivindicação introduzida em modalidades contendo apenas uma referida recitação, mesmo quando a mesma reivindicação inclui as frases introdutivas "um ou mais" ou "pelo menos um" e artigos indefinidos tais como "um" (por exemplo, “um” deve ser interpretado como
“pelo menos um” ou “um ou mais”); o mesmo é válido para o uso de artigos definidos usados para introduzir recitações de reivindicações.
Além disso, mesmo se um número específico de uma recitação de reivindicação introduzida for explicitamente mencionado, aqueles versados na técnica reconhecerão que tal recitação deve ser interpretada como significando pelo menos o número mencionado (por exemplo, a recitação em aberto de "duas recitações," sem outros modificadores, significa pelo menos duas repetições, ou duas ou mais recitações). Além disso, naqueles casos onde é utilizada uma convenção análoga a “pelo menos um dentre A,
B e C, etc.” é usada, em geral tal construção é pretendida no sentido de que o versado na técnica compreenderia a convenção (por exemplo, “um sistema que tem pelo menos um dentre A, B e C” incluiria mas não se limitaria a sistemas que têm somente A sozinho, B sozinho, C sozinho, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos, e/ou A, B e C juntos,
etc). Naqueles casos onde é utilizada uma convenção análoga a “pelo menos um dentre A, B ou C, etc,” é usada, em geral tal construção é pretendida no sentido de que o versado na técnica compreenderia a convenção (por exemplo, “um sistema que tem pelo menos um dentre A, B ou C” incluiria mas não se limitaria a sistemas que têm somente A sozinho, B sozinho, C sozinho, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos, e/ou a, B e C juntos, etc). Será ainda entendido por aqueles versados na técnica que virtualmente qualquer palavra e/ou frase disjuntiva apresentando dois ou mais termos alternativos, seja na descrição, reivindicações ou desenhos, deve ser entendida de maneira a contemplar as possibilidades de incluir um dos termos, qualquer um dos termos, ou ambos os termos. Por exemplo, deve-se entender que a frase "A ou B" inclui as possibilidades de incluir “A” ou “B” ou “A e B”.
[00144] Além disso, onde características ou aspectos da descrição são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a descrição também é descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.
[00145] Qualquer uma das características de uma modalidade de aspectos desde primeiro até oitavo é aplicável a todos os aspectos e modalidades identificados nesse documento. Em adição, qualquer uma das características de uma modalidade de aspectos desde primeiro até oitavo é, de forma independente, combinável, parcialmente ou totalmente com outras modalidades descritas aqui em qualquer maneira, por exemplo, uma, duas ou três ou mais modalidades podem ser combináveis no todo ou em parte.
Ainda além, qualquer uma das características de uma modalidade de aspectos desde até oitavo pode ser feita opcional a outros aspectos ou modalidades.

Claims (66)

REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica um receptor de antígeno quimérico, o receptor de antígeno quimérico compreendendo: um domínio de ligação de ligante que se liga a, e/ou interage com, um receptor alfa 2 da IL-13 (IL13Ra2); um espaçador de polipeptídeo entre o domínio de ligação de ligante e um domínio transmembranar; o domínio transmembranar; e região de sinalização intracelular.
2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante compreende: uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 1 (CDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, ou variações conservativas da mesma; uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 2 (CDR2) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, ou variações conservativas da mesma; e/ou uma região determinante de complementaridade da cadeia pesada 3 (CDR3) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, ou variações conservativas da mesma.
3. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante compreende:
uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 1 (CDR1) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, ou variações conservativas da mesma; uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 2 (CDR2) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, ou variações conservativas da mesma; e/ou uma região determinante de complementaridade da cadeia leve 3 (CDR3) tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, ou variações conservativas da mesma.
4. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante compreende um domínio variável da cadeia pesada (VH) que compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
5. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
6. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante compreende: uma CDR1 da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; uma CDR2 da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; e/ou uma CDR3 da cadeia pesada tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
7. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante compreende: uma CDR1 da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; uma CDR2 da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; e/ou uma CDR3 da cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
8. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante compreende um domínio VH compreendendo um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
9. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante compreende um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
10. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento de ligação de antígeno.
11. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de ligante é um fragmento variável da cadeia única (scFv).
12. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o scFv compreende uma orientação VL-VH.
13. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o fragmento variável da cadeia única (scFv) compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 61.
14. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o fragmento variável da cadeia única (scFv) compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 61.
15. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende uma sequência de aminoácidos de X1PPX2P.
16. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a região espaçadora compreende uma porção de uma região de dobradiça de um anticorpo humano ou uma variante modificada do mesmo.
17. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o espaçador tem 15 aminoácidos ou menos, mas não menos que 1 ou 2 aminoácido(s).
18. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 09.
19. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 09 ou substituições conservativas da mesma.
20. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4 (S).
21. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4-CH3 (M).
22. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o espaçador compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, um espaçador de dobradiça de IgG4-CH2 (L234D, N297A)-CHE (L).
23. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende domínios de sinalização primários e coestimuladores, opcionalmente compreendendo todos ou uma porção de um CD3 zeta em combinação com um domínio coestimulador selecionado do grupo que consiste em domínios de sinalização de CD27, CD28, 4-1BB, OX-40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, NKG2C, e B7-H3 e combinações dos mesmos.
24. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende uma porção de sinalização de um CD3 zeta e uma porção de sinalização de um 4-1BB.
25. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar de CD28 (CD28tm).
26. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um ácido nucleico que codifica uma sequência marcadora.
27. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a sequência marcadora é um receptor truncado e, opcionalmente, é um EGFRt, um HER2t ou um CD19t.
28. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um transgene de di-hidrofolato redutase configurado para seleção de metotrexato.
29. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o transgene de di- hidrofolato redutase é um mutante duplo de di-hidrofolato redutase (DHFRdm).
30. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o mutante duplo de di- hidrofolato redutase compreende mutações de aminoácidos de L22F e F31S.
31. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
32. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.
33. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor lentiviral ou adenoviral.
34. Polipeptídeo receptor de antígeno quimérico (CAR), caracterizado pelo fato de ser codificado pelo ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
35. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30.
36. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de linfócito T citotóxica CD8+ selecionada do grupo que consiste em células T CD8+ naïve, células T CD8+ de memória central, células T CD8+ de memória efetora e células T CD8+ em massa.
37. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a célula de linfócito T citotóxica CD8+ é uma célula T de memória central e, em que a célula T de memória central é positiva para CD45RO+, CD62L+, e CD8+.
38. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de linfócito T auxiliar CD4+ selecionada do grupo que consiste em células T CD4+ naïve, células T CD4+ de memória central, células T CD4+ de memória efetora e células T CD4+ em massa.
39. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a célula de linfócito auxiliar CD4+ é uma célula T CD4+ naïve e, em que a célula T CD4+ naïve é positiva para CD45RA+, CD62L+ e CD4+ e negativa para CD45RO.
40. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 39, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula T precursora.
41. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 40, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula-tronco hematopoiética.
42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 41, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
43. Método para preparar a célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 41, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 em uma célula; e cultivar a célula na presença de anticorpo anti-CD3 e/ou anticorpo anti-CD28, e pelo menos uma citocina homeostática em condições suficientes para as células se expandirem; e selecionar a célula com um reagente de seleção; em que o reagente de seleção é configurado para enriquecer seletivamente as células transduzidas com o ácido nucleico ou vetor.
44. Método para preparar uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir o ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 em uma célula; e cultivar a célula na presença de anticorpo anti-CD3 e/ou anticorpo anti-CD28, e pelo menos uma citocina homeostática em condições suficientes para as células se expandirem; e selecionar a célula com um reagente de seleção; em que o reagente de seleção é configurado para enriquecer seletivamente as células transduzidas com o ácido nucleico ou vetor.
45. Método, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizado pelo fato de que a célula é um linfócito.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o linfócito tem um fenótipo CD45RA-, CD45RO+, e CD62L+.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que o linfócito é CD8+ ou CD4+.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, caracterizado pelo fato de que o reagente de seleção é metotrexato.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 48, caracterizado pelo fato de que a citocina é IL-15, Il-7 e/ou Il-21.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 49, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a introdução de um segundo ácido nucleico na célula hospedeira, em que o segundo ácido nucleico codifica uma proteína marcadora.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a proteína marcadora é EGFRt.
52. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 41, caracterizada pelo fato de ser para uso em um medicamento ou para uso no tratamento ou na inibição de um câncer ou tumor sólido que expressa um receptor da IL-13a2.
53. Uso, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende um câncer cerebral.
54. Uso, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor glioma ou de glioblastoma.
55. Uso, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o câncer é glioblastoma multiforme (GBM).
56. Uso, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o câncer é um glioma.
57. Método para tratar, inibir ou melhorar um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a célula hospedeira, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 41, ao indivíduo em necessidade da mesma.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o câncer é uma malignidade positiva para IL13Ra.
59. Método, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer cerebral.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 59, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor de glioma ou glioblastoma.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 60, caracterizado pelo fato de que o câncer é um glioma.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 60, caracterizado pelo fato de que o câncer é glioblastoma multiforme (GBM).
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 62, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a administração de uma terapia adicional selecionada de quimioterapia e radioterapia.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o fármaco quimioterápico compreende eletoquimioterapia, agente alquilante, antimetabólito (por exemplo, 5-fluorouracila (5-FU), 6- mercaptopurina (6-MP), Capecitabina (Xeloda®), Cladribina, Clofarabina, Citarabina (Ara-C®), Floxuridina, Fludarabina, Gemcitabina (Gemzar®), Hidroxiureia, Metotrexato, Pemetrexede (Alimta®), Pentostatina e Tioguanina), antibiótico antitumoral, inibidor da topoisomerase, inibidor mitótico, corticosteroide, agente intercalante do DNA, ou inibidor de ponto de verificação (ponto de verificação quinase CHK1, CHK2).
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 64, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é mamífero.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 65, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.
BR112020018670-8A 2018-03-14 2019-03-12 Receptor de antígeno quimérico de receptor alfa 2 da il-13 (il13ra2) para imunoterapia com células t específicas para tumor BR112020018670A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862643055P 2018-03-14 2018-03-14
US62/643,055 2018-03-14
PCT/US2019/021823 WO2019178078A1 (en) 2018-03-14 2019-03-12 Il-13 receptor alpha 2 (il13ra2) chimeric antigen receptor for tumor specific t cell immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020018670A2 true BR112020018670A2 (pt) 2021-01-05

Family

ID=67908477

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020018670-8A BR112020018670A2 (pt) 2018-03-14 2019-03-12 Receptor de antígeno quimérico de receptor alfa 2 da il-13 (il13ra2) para imunoterapia com células t específicas para tumor

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20210000875A1 (pt)
EP (1) EP3765041A4 (pt)
JP (2) JP7438123B2 (pt)
KR (1) KR20200131279A (pt)
CN (1) CN112236151A (pt)
AU (1) AU2019234573A1 (pt)
BR (1) BR112020018670A2 (pt)
CA (1) CA3093810A1 (pt)
EA (1) EA202091982A1 (pt)
IL (2) IL277267B1 (pt)
MX (1) MX2020009463A (pt)
SG (1) SG11202008795SA (pt)
WO (1) WO2019178078A1 (pt)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230022411A (ko) * 2020-05-12 2023-02-15 라이엘 이뮤노파마, 인크. 키메라 항원 수용체 스페이서
CN115246883A (zh) * 2021-02-02 2022-10-28 浙江理工大学 一种抗人源IL13Ra2鲨鱼单域抗体或其抗原结合片段和应用
EP4314069A1 (en) * 2021-04-01 2024-02-07 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Il-13ra2 chimeric antigen receptors and methods of use
EP4364746A1 (en) * 2021-07-01 2024-05-08 Ningbo T-MAXIMUM Biopharmaceuticals Co., Ltd. UNIVERSAL CAR-T CELL TARGETING IL13Ra2, PREPARATION METHOD THEREFOR AND APPLICATION THEREOF
CN114409782B (zh) * 2021-12-29 2023-06-30 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗IL13Ra2的纳米抗体及其应用
CN114014941B (zh) * 2022-01-10 2022-04-12 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体及其用途
CN118574646A (zh) * 2022-01-19 2024-08-30 上海优替济生生物医药有限公司 环状rna及其用途
CN114990069B (zh) * 2022-05-17 2023-09-22 郑州大学第一附属医院 一种过表达slc43a2的嵌合抗原受体t细胞的制备方法和应用
CN114805581B (zh) * 2022-06-29 2022-10-14 上海优替济生生物医药有限公司 靶向il13ra2的抗体、嵌合抗原受体及其用途
WO2024041650A1 (en) * 2022-08-25 2024-02-29 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Chimeric antigen receptors targeting interleukin 13 receptor subunit alpha 2 and methods of use thereof
CN115960257B (zh) * 2022-09-29 2023-10-27 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 靶向IL13Rα2的经优化的嵌合抗原受体及其用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20150891A1 (es) * 2012-11-07 2015-06-11 Pfizer Anticuerpos anti-receptor de il-13 alfa 2 y conjugados de anticuerpo farmaco
JP6345688B2 (ja) * 2012-12-05 2018-06-20 ソラ・バイオサイエンシズ・エルエルシー タンパク質発現増強ポリペプチド
WO2014186469A2 (en) * 2013-05-14 2014-11-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
TWI751102B (zh) * 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
CN113789336A (zh) * 2014-09-19 2021-12-14 希望之城公司 靶向IL13Rα2的共刺激嵌合抗原受体T细胞
JP7264592B2 (ja) * 2015-01-26 2023-04-25 ザ ユニバーシティー オブ シカゴ ＩＬ１３Ｒα２結合剤及び癌治療におけるその使用
JP6902018B2 (ja) * 2015-07-21 2021-07-14 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ キメラ抗原受容体及び他の受容体の発現に対するｔ細胞
KR20230148844A (ko) * 2016-03-29 2023-10-25 유니버시티 오브 써던 캘리포니아 암을 표적하는 키메라 항원 수용체
MA45192A (fr) * 2016-06-07 2019-04-10 Macrogenics Inc Traitement d'association
US12083148B2 (en) * 2017-02-22 2024-09-10 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. IL13Ra2-binding chimeric antigen receptors

Also Published As

Publication number Publication date
CN112236151A (zh) 2021-01-15
JP7438123B2 (ja) 2024-02-26
EP3765041A4 (en) 2021-12-22
EA202091982A1 (ru) 2021-06-10
IL277267A (en) 2020-10-29
IL277267B1 (en) 2024-09-01
AU2019234573A1 (en) 2020-10-08
US20210000875A1 (en) 2021-01-07
EP3765041A1 (en) 2021-01-20
KR20200131279A (ko) 2020-11-23
CA3093810A1 (en) 2019-09-19
MX2020009463A (es) 2021-03-09
WO2019178078A1 (en) 2019-09-19
SG11202008795SA (en) 2020-10-29
IL314877A (en) 2024-10-01
JP2021518108A (ja) 2021-08-02
JP2024026165A (ja) 2024-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020018670A2 (pt) Receptor de antígeno quimérico de receptor alfa 2 da il-13 (il13ra2) para imunoterapia com células t específicas para tumor
ES2891578T3 (es) Antígeno quimérico y receptores de células T y métodos de uso
CN107735407B (zh) 治疗剂
ES2814962T3 (es) Fijación eficaz como objetivo de la leucemia humana primaria utilizando células T modificadas con receptor de antígeno quimérico anti-CD123
ES2869972T3 (es) Sistemas de receptores de antígenos quiméricos dirigidos por mAb para clasificar/agotar células inmunitarias genomanipuladas
ES2805475T3 (es) Tratamiento del cáncer utilizando un receptor antigénico quimérico de CD33
TW202016139A (zh) Bcma 嵌合抗原受體及其用途
AU2013221672B2 (en) Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
CN110267677A (zh) 使用与原m2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗癌症
CN103502438A (zh) 用于细胞免疫治疗的方法和组合物
CN106459990A (zh) 三功能t细胞抗原偶联物及其制备方法和用途
ES2910227T3 (es) Composición y métodos para la estimulación y expansión de células T
WO2021027785A1 (zh) 共表达趋化因子受体的免疫效应细胞
WO2020047257A1 (en) Methods and compositions comprising b7h3 chimeric antigen receptors
CA3117206A1 (en) Chimeric antigen receptor memory-like (carml) nk cells and methods of making and using same
CN118497126A (zh) 针对癌症个体化疗法的制品和方法
JP2023134631A (ja) ゼータカインにより指向性を付与したＩＬ－１３受容体α２標的Ｔ細胞免疫療法
WO2024059733A2 (en) Chimeric antigen receptors binding nectin-4
WO2024215987A1 (en) IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-15/IL-15Rα CONJUGATES
TW202342507A (zh) 抗ｓｔｅａｐ２嵌合抗原受體及其用途
CN118812722A (zh) 嵌合型趋化因子受体的应用

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]