JP6902018B2 - キメラ抗原受容体及び他の受容体の発現に対するｔ細胞 - Google Patents

Description

本発明は、一般に、Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団に関し、特に、Ｔ細胞が、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ Ｔ ｃｅｌｌｓ）及びナイーブＴ細胞を含み、Ｔ細胞のうち４０％を超えるＴ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、Ｔ細胞のうち７０％を超えるＴ細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、単離されたヒト細胞の集団に関する。

Ｅｘ ｖｉｖｏで増殖された自己由来のＴ細胞及び同種異系のＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、ウイルス感染、癌及び自己免疫疾患を治療するための魅力的な治療のアプローチである。多数の治療用Ｔ細胞の迅速な生成を可能にする方法は、ＡＣＴの効力及び安全性に重大な意味を持つ。規定されたＴ細胞サブセットの選択並びに増殖の方法を含む様々なＴ細胞濃縮方法がＡＣＴに使用されてきた。

ＷＯ２０１６／０４４８１１ ＷＯ２１０４／１４４６２２ ＷＯ２００２／０７７０２９ ＷＯ／ＵＳ２０１４／０２８８９６１

Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１８：４８１７ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｂｌｏｏｄ １１７：１８８８ Ｗａｎｇ Ｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１２；３５：６８９。 Ｇｒａｅｆ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１：１１６ Ｇａｔｔｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１：７

Ｉｎ ｖｉｖｏで比較的高い活性を可能にし且つ比較的高い増殖能を可能にするＴ細胞集団を使用することが望ましい。

本明細書において記載されているのは、ＡＣＴのためにキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するのに有用なＴ細胞集団を調製する方法である。Ｔ細胞集団は、非常に活性で寿命の長いＴ細胞集団を必要とする様々な他の目的にも有用である。本明細書において記載される方法によって調製されたＴ細胞集団は：ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）、幹細胞様メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）（Ｔ_ＳＣＭ）及びセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）に対して濃縮される。従って、そのような細胞集団は、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団として記載することができる。これらの細胞集団は：１）ＣＤ１４発現骨髄細胞及びＣＤ２５発現細胞等の望ましくない細胞集団を枯渇させること；及び、２）ＣＤ６２Ｌ発現メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を濃縮させること；の両方によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得ることができる。従って、結果として得られる細胞の集団には、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌを発現するナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）及び幹細胞様メモリーＴ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）が含まれ、また、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌを発現するセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）の集団も含まれる。Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団は、その調製がＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞の枯渇を伴わないという点で、以前に記載されたＴ_ＣＭ細胞の集団とは異なる。Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団は、調製時に、エフェクターメモリー細胞（Ｔ_ＥＭ）及びエフェクター細胞（Ｔ_Ｅ）を比較的含まない。当然ながら、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団が増殖を経るに従い、分化が起こり、例えばＴ_Ｅ細胞が生じる。

患者特異的な自己由来のＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞及び同種異系のＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞（又は同種異系のＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞）を操作して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現させることができ、さらに、操作した細胞を増殖し、ＡＣＴにおいて使用することができる。

本明細書において記載されているのは、Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含む単離されたヒト細胞の集団であり、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞；幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、Ｔ細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、Ｔ細胞のうち７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ６２Ｌ＋である。様々な実施形態において：Ｔ細胞のうち１５％未満（１２％、１０％、８％又は６％未満）がＣＤ１４＋であり、Ｔ細胞のうち５％未満（４％、３％又は２％未満）がＣＤ２５＋であり；Ｔ細胞のうち１０％を超える（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）Ｔ細胞が、組換え核酸分子（例えば、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体をコードする組換え核酸分子；例えば、Ｔ細胞ベクター等のウイルスベクター）を宿し；Ｔ細胞のうち少なくとも４０％の（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋、又は、ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも１０％の（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち６０％未満（５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２４％、２０％又は１５％未満）がＣＤ４５ＲＯ＋であり；さらに、Ｔ細胞を含む単離された細胞集団における細胞のうち少なくとも８０％の（８５％、９０％、９５％又は９８％を超える）細胞がＴ細胞である。

また、本明細書において記載されているのは、ヒトＴ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含む単離された細胞の集団であり、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞及び幹細胞様メモリーＴ細胞を含み、Ｔ細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、Ｔ細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、Ｔ細胞のうち７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ９５＋であり、Ｔ細胞のうち１０％を超える（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）Ｔ細胞が、組換え核酸分子（例えばキメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体をコードする組換え核酸分子（例えばウイルスベクター等））を宿す。様々な実施形態において：Ｔ細胞のうち１５％未満（１２％、１０％、８％、６％未満）がＣＤ１４＋であり、Ｔ細胞のうち５％未満（４％、３％又は２％未満）のＴ細胞がＣＤ２５＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも４０％の（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞が、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋、又は、ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも１０％の（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）がＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち６０％未満（５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２４％、２０％又は１５％未満）がＣＤ４５ＲＯ＋であり；Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団における細胞のうち少なくとも８０％の（８５％、９０％、９５％又は９８％を超える）細胞がＴ細胞である。

本明細書において記載されているのは、組換え核酸分子を宿すＴ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含むヒト細胞の集団を調製する方法であり：（ａ）Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料を提供するステップであって、Ｔ細胞は：セントラルメモリーＴ細胞；幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、Ｔ細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、Ｔ細胞のうち７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、ステップ；（ｂ）Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を活性化するステップ；及び（ｃ）Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団における細胞に、組換え核酸分子を形質導入又は遺伝子導入して、組換え核酸分子を宿すＴ細胞を含むヒト細胞の集団を提供するステップを含み、当該方法は、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を枯渇させるステップを含まない。種々の実施形態において：組換え核酸分子は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、ＣＡＲをコードするウイルスベクター、Ｔ細胞受容体をコードするウイルスベクター）であり；当該方法は、組換え核酸分子を宿すＴ細胞を含むヒト細胞の集団を培養するステップをさらに含み；培養するステップは、外来性ＩＬ−２及び外来性ＩＬ−１５の添加を含み；さらに、活性化するステップは、細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体に曝露するステップを含み；さらに、Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団における細胞の少なくとも８０％の（８５％、９０％、９５％又は９８％を超える）細胞がＴ細胞である。

本明細書において記載されているのは、Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含むヒト細胞の集団を調製する方法であり、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞；幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、当該方法は：（ａ）Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団を提供するステップ；（ｂ）枯渇した細胞集団を調製するために、ＣＤ２５を発現する細胞及びＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させるようにＴ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団を処理するステップ；及び（ｃ）ＣＤ６２Ｌを発現する細胞を濃縮するように、枯渇した細胞集団を処理し、その結果、Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を調製するステップであって、Ｔ細胞はセントラルメモリーＴ細胞；幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、７０％を超える細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、ステップを含み、当該方法は、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を枯渇させるステップを含まない。種々の実施形態において：当該方法は、Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を活性化するステップ、及び、活性化された細胞に、組換え核酸分子を形質導入又は遺伝子導入して、組換え核酸分子を宿すＴ細胞を含むＴ細胞の集団を提供するステップをさらに含み；Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団は、ＰＢＭＣを含むＴ細胞を含み；さらに、Ｔ細胞を含む単離された細胞の集団における細胞のうち少なくとも８０％の（８５％、９０％、９５％又は９８％を超える）細胞がＴ細胞である。

また、本明細書において記載されているのは、Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ３又はＣＤ３＋細胞を発現する細胞）を含むヒト細胞の集団であり、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞；幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、集団は：Ｔ細胞（例えば、ドナー由来のＰＢＭＣ）を含む単離されたヒト細胞の集団を提供するステップ；枯渇した細胞集団を調製するために、ＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させ、ＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させるように、Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団を処理するステップ；及び、ＣＤ６２Ｌを発現する細胞を濃縮するように枯渇した細胞集団を処理し、その結果、Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を調製するステップであって、Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞；幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、細胞のうち４０％を超える（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、７０％を超える（７５％、８０％、８５％又は９０％を超える）細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、ステップを含む方法によって調製され、当該方法は、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を枯渇させるステップを含まない。様々な実施形態において、ヒト細胞の集団におけるＴ細胞のうち１５％未満（１２％、１０％、８％、６％未満）がＣＤ１４＋であり、さらに、Ｔ細胞のうち５％未満（４％、３％又は２％未満）がＣＤ２５＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも４０％の（４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％を超える）Ｔ細胞はＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋、又は、ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち少なくとも１０％の（１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％を超える）Ｔ細胞がＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；Ｔ細胞のうち６０％未満（５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２４％、２０％又は１５％未満）がＣＤ４５ＲＯ＋である。

また、本明細書において記載されているのは、癌、自己免疫又は感染症を治療する方法であり、当該方法は、その必要がある患者に、本明細書において記載されるヒト細胞集団を含む医薬組成物を投与するステップを含む。場合によっては、細胞は、治療されている患者に対して自己由来であり、場合によっては、治療されている患者に対して同種異系である。

細胞集団は、特定のマーカー（例えば受容体等）を発現する細胞について、細胞の集団からそのマーカーを発現する細胞の一部、大部分又はほぼ全てを（例えば、選択的抗体及び細胞選別法を使用して）除去することによって枯渇させることができるため、そのマーカーを発現する集団における細胞の相対的比率が減少する。細胞集団は、特定のマーカー（例えば受容体等）を発現する細胞について、細胞の集団からそのマーカーを発現する細胞の一部、大部分又はほぼ全てを（例えば、選択的抗体及び細胞選別法を使用して）集め、さらに、そのマーカーを発現しない細胞を捨てることによって濃縮することができるため、そのマーカーを発現する集団における細胞の相対的比率が減少する。

種々のＴ細胞のサブセットに対する特定のマーカーの発現パターン、特に、Ｔ_ＮからＴ_ＳＣＭを区別する発現パターンを描いた図である。 種々のＴ細胞のサブセットに対する特定のマーカーの発現データを描いた図である。 ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯの発現に基づき、特定のＴ細胞のサブセット間の関係を描いた図である。 Ｔ_ＣＭ細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞に対するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）による濃縮後の細胞の表面表現型分析の結果を描いた図である。示された生成物からの細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ３及びＣＤ８、セントラルメモリーＴ細胞マーカーＣＤ６２Ｌ及びナイーブＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＡだけでなく、単核球マーカーＣＤ１４及び制御性Ｔ細胞マーカーＣＤ２４に特異的な蛍光色素結合抗体を用いて染色した。アイソタイプ対照染色（黒線）を越える免疫反応性細胞の割合（陰影がつけられたヒストグラム）が、各ヒストグラムにおいて示されている。 Ｔ_ＣＭ細胞集団及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞集団の増殖における研究の結果を描いた図である。レンチウイルス形質導入の日の開始時の生細胞数が、５人のドナーのうち４人から製造された細胞生成物について描かれており、Ｔ_ＣＭ由来の生成物は黒い丸で表され、さらに、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の生成物は、白い四角で表されている。培養液中の細胞の倍加時間をよりよく描くために、Ｌｏｇ２スケールをＹ軸に対して使用した。 Ｔ_ＣＭ細胞集団及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞集団の表面表現型分析の結果を描いた図である。Ｔ_ＣＭが濃縮された細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}が濃縮された細胞をビーズで刺激し、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７又はＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７で形質導入し、さらに、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させた。次に、細胞を、ＥＧＦＲｔ又はＣＤ１９ｔ形質導入マーカーに特異的な、又は、Ｔ細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８、セントラルメモリーＴ細胞マーカーＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌ、及び、ナイーブＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＡに特異的な蛍光色素結合試薬で染色した後、フローサイトメトリーによって分析した（灰色のヒストグラム）。対照の染色（オープンヒストグラム）を超える免疫反応性細胞の割合が、代表的なＴ_ＣＭ／Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の対の各ヒストグラムにおいて示されている（Ａ）か、又は、（Ｂ）において各細胞株に対するデータポイントとして示されており、白い記号は、Ｔ_ＣＭ由来の生成物に対するものであり、灰色の記号は、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の生成物に対するものである。赤い棒は各群に対する平均値を描いており、さらに、Ｔ_ＣＭ由来の細胞生成物対Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の細胞生成物の対応スチューデントｔ検定比較に対するｐ値が、各表面のマーカーに対して示されている。*，Ｐ値は、少な過ぎる値のため、ＣＤ２７に対して計算しなかった。重複のため、（Ｂ）においてＣＤ３染色に対しては、細胞株特異的記号ではなく陰影のみが示されていることに留意されたい。 Ｓｕｐ−Ｂ１５腫瘍細胞を投与した場合のＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}前処置の治療効果を評価する研究の結果を描いた図である。ＮＳＧマウスに照射を行った１日後に、マウスを群に分け（ｎ＝４）、未処置のままにしたか、又は、２．５ｘ１０^６ニセの（ｍｏｃｋ）形質導入ＰＢＭＣ（ＣＡＲなし）、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}（約０．５ｘ１０^６ＣＡＲ＋細胞）のいずれかを用いて静脈内処置した。２日目に、マウスに、ｆｆＬｕｃ＋Ｓｕｐ−Ｂ１５腫瘍細胞０．７〜１．０×１０^６Ｍ，ｍｉｌｌｉｏｎを静脈内投与した。 Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅを使用して、各郡からの代表的なマウスが、相対的な腫瘍の負荷量を示している。 Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングによってモニターされた時間の経過に伴うマウスの各郡における平均的なＳｕｐ−Ｂ１５腫瘍増殖及びｆｆＬｕｘ ｆｌｕｘ（光子／秒）の定量化が示されている。 ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}を用いた静脈内前処置の４１日後の血液中のヒトＴ細胞の存在を調べる研究の結果を描いた図である。ＮＳＧマウスに照射を行った１日後に、マウスを群に分け（ｎ＝４）、未処置のままにしたか、又は、２．５ｘ１０^６ニセの形質導入ＰＢＭＣ（ＣＡＲなし）、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}（約０．５ｘ１０^６ＣＡＲ＋細胞）のいずれかを用いて静脈内処置した。２日目に、マウスに、腫瘍ＧＦＰ＋Ｓｕｐ−Ｂ１５腫瘍細胞０．７〜１．０×１０^６を静脈内投与した。４１日目に、各マウスの血液を、フローサイトメトリーによってヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞（すなわちヒトＴ細胞）の存在について評価した。各マウスの代表的なフローサイトメトリーの分析が描かれている（マウス１及びマウス２）。ここでｈｕＣＤ４５依存性細胞を、ＣＤ３Ｔ細胞マーカー及びＥＧＦＲｔ形質導入マーカーの発現についてさらに分析した（右上象限（ｕｐｐｅｒ ｒｉｇｈｔ ｑｕａｄｒａｎｔ）に基づく％ＣＡＲ＋）。金のボックスは、ＧＦＰ＋ＳｕｐＢ１５集団を強調するために使用されている。 ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}を用いた静脈内前処置の４１日後の血液中のヒトＴ細胞の存在を調べる研究の結果を描いた図である。ＮＳＧマウスに照射を行った１日後に、マウスを群に分け（ｎ＝４）、未処置のままにしたか、又は、２．５ｘ１０^６ニセの形質導入ＰＢＭＣ（ＣＡＲなし）、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}（約０．５ｘ１０^６ＣＡＲ＋細胞）のいずれかを用いて静脈内処置した。２日目に、マウスに、腫瘍ＧＦＰ＋Ｓｕｐ−Ｂ１５腫瘍細胞０．７〜１．０×１０^６を静脈内投与した。４１日目に、各マウスの血液を、フローサイトメトリーによってヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋細胞（すなわちヒトＴ細胞）の存在について評価した。各マウスの代表的なフローサイトメトリーの分析が描かれている（マウス３及びマウス４）。ここでｈｕＣＤ４５依存性細胞を、ＣＤ３Ｔ細胞マーカー及びＥＧＦＲｔ形質導入マーカーの発現についてさらに分析した（右上象限（ｕｐｐｅｒ ｒｉｇｈｔ ｑｕａｄｒａｎｔ）に基づく％ＣＡＲ＋）。金のボックスは、ＧＦＰ＋ＳｕｐＢ１５集団を強調するために使用されている。 エフェクターとしてＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８ＺＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨ１Ｖ７、及び、標的としてＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞（白いバー）又はＣＤ１９＋ＳｕｐＢ１５細胞（黒いバー）で形質導入又はニセの形質導入が行われたＴ_ＣＭ細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を用いて行われた長期の死滅アッセイの結果を描いた図である。１００％に正規化された、ニセのエフェクター共培養と比較した場合の７２時間後に残存する生存可能な標的細胞（ＣＤ４５陰性、ＦＳＣ高）の割合が描かれている。 エフェクターとしてＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８ＺＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨ１Ｖ７、及び、刺激物質としてＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞（白いバー）又はＣＤ１９＋ＳｕｐＢ１５細胞（黒いバー）で形質導入又はニセの形質導入が行われたＴ_ＣＭ細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を用いて行われた５時間の脱顆粒アッセイの結果を描いた図である。ＣＤ１０７ａに対して免疫反応性であったＣＤ４５／ＣＤ８／ＥＧＦＲｔ依存性細胞の割合が示されている。 ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８ＺＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨ１Ｖ７で形質導入又はニセの形質導入が行われたＴ_ＣＭ細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞によるＩＦＮγ生成の分析の結果を描いた図である。エフェクターとしてＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８ＺＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨ１Ｖ７、及び、刺激物質としてＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞（白いバー）又はＣＤ１９＋ＳｕｐＢ１５細胞（黒いバー）で形質導入又はニセの形質導入が行われたＴ_ＣＭ由来又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の細胞生成物を用いて５時間の共培養を行った。ＩＦＮγに対して免疫反応性であったＣＤ４５／ＣＤ８／ＥＧＦＲｔ依存性細胞の割合が示されている。 様々なＴ細胞集団によって発現されるＩＬ１３ ＣＡＲの有効性の研究の結果を描いた図である。

Ｔ細胞のコンパートメントは、異なる分化段階にあるＴ細胞のサブセットを含む。これらのサブセットは、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋及びＣＤ９５−であるナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）の分化から生じる。幹細胞様サブセットの中には、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋及びＣＤ９５＋である幹細胞様メモリーＴ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）がある。これらの細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋及びＣＤ９５＋であるセントラルメモリー細胞（Ｔ_ＣＭ）に分化する。Ｔ_ＣＭは、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ２８＋／−及びＣＤ９５＋であるエフェクターメモリー細胞（Ｔ_ＥＭ）に分化する。Ｔ_ＥＭは、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋及びＣＤ９５＋であるエフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）に分化する。

幹細胞様メモリーＴ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）は、Ｔ細胞のコンパートメント内に低レベルで存在するが、有意な自己再生及び増殖の潜在能力を有しているように思われる。幹細胞様メモリーＴ細胞（Ｔ_ＳＣＭ）は、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ６２Ｌ＋を発現する点でナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）に似ているけれども、そのＣＤ９５の発現によってＴ_Ｎから区別され得る（図１）。Ｔ_ＳＣＭは、ＩＬ−７及びＩＬ−１５の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた刺激によってＴ_Ｎから生成され得る。Ｔ_ＳＣＭはまた、Ｗｎｔ／β−カテニン経路活性化の存在下で増殖され得る。

Ｔ_ＳＣＭよりもＰＢＭＣにおいてより豊富であるセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）は、自己再生及び増殖の潜在能力が高い、詳細に明らかにされたメモリーＴ細胞のサブセットである。Ｔ_ＣＭはエフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）よりも次の養子移入の間も持続するという証拠がある（非特許文献１；非特許文献２）。Ｔ_ＣＭは、そのＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋の表現型に基づくＴ細胞治療薬製造のためにＰＢＭＣから濃縮することができる（図２）（非特許文献３）。Ｔ_ＣＭは成体幹細胞のように振る舞うという証拠がいくつかある。Ｔ_ＣＭが、完全な免疫再構築を提供することができるということ、Ｔ_ＣＭが増殖してさらなるＴＣＭを生成するということ、及び、Ｔ_ＣＭが、Ｔ_ＥＭ／Ｔ_Ｅに分化するということを三世代に渡るＴ_ＣＭの単細胞伝達が実証したということがマウスにおける研究によって実証されている（非特許文献４；非特許文献５）。

以下に記載されるＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞集団は、ＣＡＲ−Ｔ治療における有効性を立証したＴ_ＣＭ、及び、Ｔ_ＣＭよりも幹細胞様であるＴ_ＮだけでなくＴ_ＳＣＭも含む。図３は、種々の細胞集団とＰＢＭＣとの関係を描く発現データを示している。

本明細書において記載される細胞集団は、例えば、ＣＡＲ又はＴ細胞受容体を発現するように遺伝子操作することができる。ＣＡＲは、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域及び１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。従って、「抗原」という用語は、抗体に結合する分子に限定されないが、いかなる受容体にも特異的に結合することができるいかなる分子に限定される。従って、「抗原」は、ＣＡＲの認識ドメインを意味する。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメインとも呼ばれるか、又は、単に含有する認識要素によっても言及される）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜内にＣＡＲを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、任意的に、１つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣ制限とは無関係に、抗原に結合することも、Ｔ細胞活性化を伝達することもできる。従って、ＣＡＲは、そのＨＬＡ遺伝子型に無関係に、抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を治療することができる「普遍的な」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を使用した養子免疫療法は、癌の治療のための強力な治療戦略であり得る。

ＣＡＲは、当技術分野において既知のいかなる手段によっても生成することができるが、好ましくは、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される。都合のよい当技術分野において既知の標準的な分子クローニングの技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援のライゲーション、部位特異的変異誘発等）によって、キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸を調製することができ、さらに、完全なコード配列を構築することができる。結果として生じるコード領域は、好ましくは、発現ベクターに挿入され、適した発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を形質転換するために使用される。

Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞による発現に適した種々のＣＡＲとして、例えば、特許文献１；特許文献２；特許文献３；及び特許文献４に記載されたものが含まれる。

Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の調製
様々な方法を使用して、ヒトＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団を生成することができる。例えば、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団を、混合Ｔリンパ球集団から調製することができる。Ｔリンパ球の集団は、細胞を使用して最終的に処置された対象に対して同種異系又は自己由来であり得、さらに、白血球フェレーシス又は採血によって対象から得ることができる。

以下の方法は、白血球フェレーシス又は他の手段によって得られたＴリンパ球からＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団を得るために使用することができる方法の一例である。末梢血は、白血球フェレーシス又は末梢血の採血によって採取される。典型的な製造サイクルの１日目は、フィコール手順が行われる日である。対象の白血球フェレーシスの生成物がＥＤＴＡ／ＰＢＳで希釈され、さらに、その生成物は、最大のブレーキ（ｍａｘｉｍｕｍ ｂｒａｋｅ）をかけて室温で１０分間、１２００ＲＰＭで遠心分離される。遠心分離後、多血小板の上澄みが除去され、さらに、細胞ペレットが穏やかにボルテックスされる。ＥＤＴＡ／ＰＢＳは、各コニカルチューブにおいてボルテックスされた細胞ペレットを再懸濁するために使用される。次に、各チューブの下にフィコールが敷かれ、室温にてブレーキをかけずに２０分間、２０００ＲＰＭで遠心分離される。遠心分離後、各チューブからのＰＢＭＣ層が別のコニカルチューブに移される。細胞は、４℃で最大のブレーキをかけて１５分間、１８００ＲＰＭで遠心分離される。

遠心分離後、細胞のない上澄みが捨てられ、さらに、細胞ペレットが穏やかにボルテックスされる。細胞は、毎回ＥＤＴＡ／ＰＢＳを使用して２回、ＰＢＳを使用して３回洗浄される。細胞は、４℃にて最大ブレーキをかけて１０分間、１２００ＲＰＭで毎回遠心分離される。最後のＰＢＳ洗浄の後、ボルテックスされた細胞ペレットは、完全なＸ−ＶＩＶＯ１５の培地（１０％ＦＢＳを有するＸ−ＶＩＶＯ（商標）の培地）において再懸濁され、トランスファーバッグに移される。洗浄されたＰＢＭＣを有するバッグは、翌日の免疫磁気選択のためにベンチトップ上において室温にて回転子上で一晩維持される。

次に、選択手順が、特定のマーカーを発現する細胞の細胞集団を枯渇させるためにも、特定の他のマーカーを発現する細胞に対する細胞集団を濃縮するためにも使用される。これらの選択ステップは、好ましくは、製造サイクルの２日目に生じる。細胞集団は、ＣＤ２５及びＣＤ１４を発現する細胞について実質的に枯渇している。重要なことに、細胞集団は、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞について実質的に枯渇していない。簡潔には、細胞は、ラベルバッファ（ＬＢ；０．５％ＨＳＡを有するＥＤＴＡ／ＰＢＳ）において再懸濁され、且つ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）による枯渇に対して抗ＣＤ１４及び抗ＣＤ２５ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗体と共にインキュベートされ、さらに、組成物は穏やかに混合され、次に、ベンチトップの上において室温にて回転子上で３０分間インキュベートされる。

枯渇ステップは、枯渇チューブセットを使用してＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置上で行われる。枯渇ステップ後の回収された細胞は、チューブに移され、さらに、４℃にて最大ブレーキをかけて１５分間１４００ ＲＰＭで遠心分離される。

細胞のない上澄みが除去され、細胞ペレットが穏やかにボルテックスされ、さらに、再懸濁される。ＣＤ６２Ｌを発現する細胞を濃縮するために、細胞懸濁液は、抗ＣＤ６２Ｌ−ビオチン（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓにて作製）で処理され、穏やかに混合され、さらに、ベンチトップ上において室温にて回転子上で３０分間インキュベートされる。

インキュベーション期間の後、ＬＢがチューブに添加され、さらに、細胞は、４℃にて最大ブレーキをかけて１５分間、１４００ＲＰＭで遠心分離される。細胞のない上澄みが除去され、さらに、細胞ペレットが穏やかにボルテックスされる。ＬＢが、チューブ内の細胞ペレットを再懸濁するために添加され、さらに、再懸濁された細胞は、新しいトランスファーバッグに移される。抗ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）試薬が添加され、混合物が穏やかに混合され、さらに、ベンチトップ上において室温にて回転子上で３０分間インキュベートされる。

ＣＤ６２Ｌ濃縮ステップが、チューブセットを使用してＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置上で行われる。この濃縮の生成物は、貯蔵のために凍結させることができ、その後、解凍し、活性化させることができる。

製造における中間の保持ステップを提供するために、選択プロセスに続いて細胞を凍結させるオプションが存在する。細胞は、４℃にて最大ブレーキをかけて１５分間１４００ＲＰＭで遠心分離することによってペレット状にされる。細胞は、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）において再懸濁され、クライオバイアルに等分される。バイアルは、約１℃／分で冷却することができる制御された冷却装置（例えば、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に移されることになり、冷却装置は直ちに−８０℃の冷凍庫に移される。−８０℃の冷凍庫で３日後、細胞は、貯蔵のためにＧＭＰ ＬＮ２フリーザーに移される。

本発明者等は、凍結保存された細胞は良好な回復及び生存率を示し、凍結保存後８．５ヶ月まで解凍させられると適切な細胞表面表現型を維持し、解凍後にｉｎ ｖｉｔｒｏで首尾よく形質導入及び増殖することができるということがわかった。

或いは、新たに濃縮されたＴｃｍ／ｓｃｍ／ｎ細胞は、以下の実施例３に記載されているように、活性化、形質導入又は増殖させることができる。

Ｔ_ＣＭとＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の収率及び回収の比較
１）ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）細胞、及び、２）セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）集団も幹細胞様メモリー（Ｔ_ＳＣＭ）集団も、ナイーブＴ細胞（Ｔ_Ｎ）と共に含むＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞のＴ細胞集団のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ／ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による濃縮を受けたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の収率を評価するために研究を行った。生細胞数のＧｕａｖａ分析及び表現型のフローサイトメトリー分析を使用して評価を行った。

＜実験設計＞：健康なヒトドナーから採取したＰＢＭＣからＴ_ＣＭ及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の細胞株を濃縮した。簡潔には、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を、ＣＤ１４＋単球及びＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ／ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による枯渇後に、ＣＤ６２Ｌ＋メモリー集団のＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による選択を行うことによって生成した。対照的に、Ｔ_ＣＭ細胞を、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブ及び幹細胞様メモリーＴ細胞のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ／ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による枯渇後に、ＣＤ６２Ｌ＋集団のＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による選択を行うことによって生成した。選択プロセスの評価には、以下においてより詳細に記載される、生細胞数の列挙並びにフローサイトメトリー分析が含まれた。次に、細胞を将来の研究のために凍結保存した。

＜濃縮プロセスの概要＞：血液製剤をフィコール処理し、結果として得られたＰＢＭＣにＰＢＳ／ＥＤＴＡにおける一連の洗浄を受けさせた。次に、ＰＢＭＣを完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５の培地において再懸濁させ、場合によっては、３００ｃｃのトランスファーバッグに移し、次に、３−Ｄ回転子上に一晩置いた。次に、ＣＤ１４⁻／ＣＤ２５⁻／ＣＤ４５ＲＡ⁻／ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ_ＣＭ又はＣＤ１４⁻／ＣＤ２５⁻／ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の集団のいずれかを濃縮するために、ＰＢＭＣに、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ／ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による枯渇及び選択の連続するラウンドを受けさせた。最初のステップは、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、及び、Ｔ_ＣＭのためにＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴ細胞を除去するために（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）又はＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）を介した）磁気による枯渇を含んだ。次に、残りの細胞に、抗ＣＤ６２Ｌ−ビオチン（Ｄｒｅｇ ５６）試薬を使用してＣＤ６２Ｌ＋集団に対して（ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）を介した）正の選択を受けさせた。濃縮の両方のラウンドの後の最終的な細胞数を記録した。最終的な選択された細胞集団の試料を、次に、フローサイトメトリーによって分析した。

＜フローサイトメトリーアッセイ及び分析の概要＞：細胞集団のフローサイトメトリー分析を以下のように行った。試料を、テーブルトップ遠心分離機を使用してＦＡＣＳ染色液（ＦＳＳ）において洗浄し、ＦＳＳにおいて再懸濁し、さらに、１つの試料あたり１００μＬを、予め標識した１２×７５ｍｍ ＦＡＣＳチューブ（１つの条件あたり１つのチューブ）に等分した。必要量の抗体をそれぞれのＦＡＣＳチューブに添加し、次に、チューブを４℃の暗所で３０分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、各チューブをＦＳＳにおいて２回洗浄し、さらに、２５０μｌのＦＳＳ又は生死判別色素としてＤＡＰＩを含有するＦＳＳのいずれかにおいて再懸濁させた。次に、試料を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）又はＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）機器に流して分析した。生存可能な免疫反応性細胞の割合を、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を介して計算した。

＜濃縮後の収率＞：細胞生成物のそれぞれからのＣＤ３＋Ｔ細胞の回収が以下の表１において示されている。全体的に見て、ＣＤ１４⁻／ＣＤ２５⁻／ＣＤ４５ＲＡ⁻／ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ３^＋Ｔ_ＣＭの濃縮は２〜６％の回収をもたらし、ＣＤ１４⁻／ＣＤ２５⁻／ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ３^＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の濃縮は、４〜３０％の回収をもたらした。実際、各一致対を比較すると、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞対Ｔ_ＣＭ細胞の１．６乃至１５倍の高い回収率があった。

＜濃縮後のフローサイトメトリー分析＞：ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）による濃縮の両方のラウンドの後、濃縮された細胞の表現型をＦＡＣＳ分析によって決定した。３人の代表的なドナーから得られた細胞生成物の結果が図４において示されている。各ドナー由来のＴ_ＣＭ及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の集団は、ＣＤ３＋及びＣＤ６２Ｌ＋細胞の濃縮レベルを示し、Ｔ_ＣＭはＣＤ４５ＲＡが枯渇し、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}は、予想通りにＣＤ４５ＲＡを発現した。ＣＤ１４＋及びＣＤ２５＋の集団の枯渇も、どちらも選択戦略を用いて予想通りに観察された。興味深いことに、ＣＤ８＋の細胞の割合は、そのドナーが一致したＴ_ＣＭの集団と比較した場合に、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の集団においてより高いことが多くあった（図４及び表１）。

＜結果＞：この研究の結果は、臨床的に解釈可能なＧＭＰ製造方法を使用して、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_ＣＭの細胞集団もＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の細胞集団も効率的に単離することができるということを実証している。ＰＢＭＣから始まり、出発集団の２〜６％がＣＤ３＋Ｔ_ＣＭとして回収される。ＣＤ４５ＲＡ枯渇ステップを排除することにより、ＣＤ３＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞として出発集団の４〜３０％の回収が可能になる。Ｔ_ＣＭ細胞と比較して１．６乃至１５倍多いＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を回収する能力は、遺伝子操作の出発集団として使用することができるＴ細胞の数を増加させるであろう。さらに、本発明者等は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇ステップの排除も、濃縮された生成物中のＣＤ８ Ｔ細胞の割合を増加させるようであるということを観察した。

Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞のレンチウイルス形質導入
Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞集団は、関心のある１つ又は複数のタンパク質を発現するように遺伝子操作することができる。例えば、細胞を、関心のある１つ又は複数のタンパク質を発現する能力を持つレンチウイルスで形質導入することができる。以下は、硫酸プロタミン／サイトカイン溶液を用いてレンチウイルスベクターでＴ細胞を形質導入するために使用することができる１つの方法の例である。

細胞が選択プロセスに引き続いて凍結される場合、細胞は製造プロセスの継続時に解凍される必要がある。凍結保存したバイアルは、大部分は液体として残るまで３７℃の水浴において解凍される。バイアルの内容物は、低温のＸ−Ｖｉｖｏ１５培地を含有するコニカルチューブ内に入れられる。細胞は、４℃にて最大ブレーキをかけて１０分間１２００ ＲＰＭで遠心分離される。遠心分離後、細胞のない上澄みがデカントされ、ペレットがボルテックスされ、さらに、ペレットが全て、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地において１本のチューブに混合されてレンチウイルスで形質導入されることになる。細胞数が決定され、さらに、製造プロセスはＤｙｎａｌビーズの活性化と共に続く。

細胞は、２５℃で１０分間、１４００ＲＰＭで遠心分離される。遠心分離後、細胞のない上澄みが除去され、さらに、細胞ペレットは穏やかにボルテックスされ、完全なＸ Ｖｉｖｏ１５培地において再懸濁されて、レンチウイルスで形質導入されることになる。解凍された細胞が使用されている場合、遠心分離のステップは必要ではない。

Ｔｃｍ／ｓｃｍ／ｎ細胞は、１：３の比（Ｔ細胞：ビーズ）でＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴエキスパンダＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激され、次に、５０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ）及び０．５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）の存在下で培養される。

１乃至３日間のインキュベーションの後、Ｔ細胞は、５μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、５０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１５と共に１０％ＦＣＳを含有するＸ Ｖｉｖｏｌ５において典型的には０．１乃至１．５に及ぶＭＯＩにてレンチウイルスベクターで形質導入される。レンチウイルスによる形質導入の翌日に、完全なＸ−ＶＩＶＯ １５培地及びサイトカインを含有する新たに調製された培地／サイトカインのマスターミックスの培地がある量添加される（１０μＬのｒｈｕＩＬ−２及び０．５μＬのｒｈｕＩＬ−１５）。

次に、培養液は、細胞密度を３×１０^５から２×１０^６の生細胞／ｍＬで保つために要求されるＸ−Ｖｉｖｏ１５ １０％ＦＣＳ中５％ＣＯ_２、３７℃にて、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日のサイトカイン補充を有して（５０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１５の最終濃度で）維持された。

ＣＤ３／ＣＤ２８のＤｙｎａｂｅａｄビーズの除去は、ビーズ刺激後の７日目から９日目までに行われる。Ｄｙｎａｌビーズは、ＤｙｎａＭａｇ−５０又はＭＰＣマグネットを使用して除去される。ビーズ除去後、細胞懸濁液の試料が、計数のために得られる。その数に基づいて、濃度が約０．５×１０^６／ｍＬに調整される。

培養液は、十分な数の細胞が達成されるまで増やされ、典型的には８から１８日間行われる。この時間の間、サイトカインの完全な置換がＴ細胞培養液に加えられる。１２日目から開始し、その後、毎週月曜日、水曜日及び金曜日に、約０．５×１０^６細胞／ｍＬの濃度を維持するように計数される。

最終的な収集及び凍結保存は以下のように進む。増殖した細胞が、臨床的な投与又は研究目的に要求される必要な生細胞数に達すると、細胞生成物は凍結保存される。細胞が計数され、培養下の試料が、マイコプラズマ試験のために収集される。残りの細胞は、４℃にて最大ブレーキをかけて２０分間、１８００ ＲＰＭで遠心分離される。細胞のない上澄みが除去され、さらに、細胞ペレット全てが穏やかにボルテックスされ、再懸濁され、Ｉｓｏｌｙｔｅ緩衝液（Ｂｒａｕｎ）に組み合わされる。チューブは、４℃にて最大ブレーキをかけて２０分間、１８００ ＲＰＭで遠心分離される。細胞は、第２の洗浄のためにＩｓｏｌｙｔｅにおいて再懸濁される。

第２のＩｓｏｌｙｔｅでの洗浄後、細胞のない上澄みが除去され、さらに、細胞ペレットが穏やかにボルテックスされ、適切な量の凍結保存培地、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）５（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）において再懸濁されて、細胞を適切な濃度にする。細胞は、約１℃／分で冷却することができる制御された冷却装置（例えば、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）又は制御速度フリーザーシステム（Ｃｕｓｔｏｍ Ｂｉｏｇｅｎｉｃｓ）内に置くことによって凍結保存される。凍結手順の完了時に、１つ又は複数のカセット／バッグ及びクライオバイアルは、貯蔵のためにＬＮ２フリーザー内に直ちに移される。

ビーズ刺激され、レンチウイルスで形質導入され且つ増殖されたＴ_ＣＭ細胞及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の比較
ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_ＣＭの集団又はＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の集団（ナイーブ、セントラルメモリー及び幹細胞様メモリーのＴ細胞を含む）のいずれかについて、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ／ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）による濃縮を受け、その後、臨床的使用のために提案された方法を使用してビーズ刺激、及び、ＣＤ１９Ｒを標的とするＣＡＲを発現するレンチウイルスであるＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７又はＩＬ−１３Ｒａｌｐｌａを標的とするレンチウイルスベクターであるＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７でレンチウイルス形質導入を行ったヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖及び細胞表面表現型を評価するために研究を行った（ベクター及び発現したＣＡＲの詳細については特許文献１及び特許文献３を参照）。生細胞数のモニタリングによって増殖を評価し、さらに、フローサイトメトリー分析によって細胞表面表現型を評価した。

＜実験設計＞：３人の別々のヒトドナーのＰＢＭＣから生じるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞生成物を、臨床的使用に適していると予想される方法論を使用して作製した。簡潔には、（本質的には実施例２において先に記載したように）ＰＢＭＣから濃縮したＴ_ＣＭ細胞及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８のビーズ刺激によって活性化し、さらに、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７又はＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７のレンチウイルスのいずれかで形質導入した。ＣＤ３／ＣＤ２８のビーズを７〜９日後に除去し、次に、細胞増殖に要求される完全なＸ−ＶＩＶＯ１５培地を添加して、Ｔ細胞培養物を応じて増殖させ、さらに、２９日間まで維持した（細胞密度を０．３ｘ１０^６から２×１０^６生細胞／ｍＬに維持した）。サイトカインを、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日に補充した。生細胞数をこの増殖プロセス中にモニターした。次に、最終的な細胞生成物を、例えばＣＤ３等の細胞生成物の放出のために伝統的に使用されている表面マーカー、及び、形質導入マーカーとしての切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）又は切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）、並びに、Ｔ細胞マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌについて評価した。

＜刺激、形質導入及び増殖の概要＞：濃縮したＴ_ＣＭ細胞又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８のビーズにより活性化させ、さらに、０．３から３．０感染多重度（ＭＯＩ）にて、ＧＭＰグレードのＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７又はＧＭＰグレード若しくはリサーチグレードのＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７を用いてレンチウイルスで形質導入した。細胞を、５０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１５を有する完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５培地における培養液内に入れた。次に、培養液を、細胞密度を０．３ｘ１０^６から２ｘ１０^６生細胞／ｍＬに保つのに要求される完全なＸ−Ｖｉｖｏｌ５培地を添加し、さらに、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日にサイトカイン補充（ｒｈＩＬ−２及びｒｈＩＬ−１５）を行って維持した。ビーズ刺激の７乃至９日後、ＣＤ３／ＣＤ２８のＤｙｎａｂｅａｄｓを、ＤｙｎａＭａｇ−５０磁石を使用して培養液から除去した。生細胞数をこの増殖プロセス中にモニターし、さらに、培養中及び凍結保存の最終日に生細胞の計数を記録した。様々な生成物が表２において列挙されている。

＜フローサイトメトリー＞：試料を、テーブルトップ遠心分離機を使用してＦＡＣＳ染色溶液（ＦＳＳ）において洗浄し、ＦＳＳにおいて再懸濁させ、さらに、１つのサンプルあたり１００μＬを、予め標識された１２ｘ７５ｍｍＦＡＣＳチューブ（１つの条件あたり１つのチューブ）内に等分した。必要量の抗体をそれぞれのＦＡＣＳチューブに添加し、次に、チューブを４℃の暗所で３０分間インキュベートした。場合によっては、試料を洗浄し、次に、続発の試薬としての蛍光色素結合ストレプトアビジンで染色した。インキュベーションの終わりに、各チューブをＦＳＳにおいて２回洗浄し、さらに、２５０μｌのＦＳＳにおいて、又は、（６．９μＬの保存液を２５ｍＬのＦＳＳと混ぜ合わせることによって作製された）１４０μＬのＦＳＳ及び７０μＬの希釈液のＤＡＰＩにおいて再懸濁させた。次に、試料を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）又はＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）機器に流して分析した。免疫反応性細胞の割合を、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を介して計算した。

＜生細胞数分析の結果＞：ビーズ刺激、及び、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７を用いたレンチウイルス形質導入の後で、細胞生成物を、Ｔ細胞増殖を支持する条件下で増殖させた。増殖曲線が図５において描かれており、さらに、最終的な細胞数、及び、生成物のそれぞれの総生細胞数に基づく増殖倍率（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）が、表３において描かれている。全体として、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の細胞生成物の増殖倍率は、そのＴ_ＣＭ由来の対応物に類似していた。

＜最終生成物のフローサイトメトリー分析＞：ｅｘ ｖｉｖｏでの増殖後の細胞生成物のそれぞれのフローサイトメトリー分析により、最終的な凍結保存された細胞生成物の全てが、同一性については≧８０％ＣＤ３、及び、効力については≧１０％ＥＧＦＲｔ又はＣＤ１９ｔという本発明者等の伝統的な生成物規格を通過するであろう（図６Ａ）ということが明らかになった。実際、各ドナーからのＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の生成物は、ＣＤ３についてもＥＧＦＲｔ／ＣＤ１９ｔについても免疫反応性において、その対応するＴ_ＣＭ由来の生成物と非常に類似していた。

他のＴ細胞マーカーのフローサイトメトリー分析（図６Ａ）により、全ての細胞生成物がＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞サブセットを有するけれども、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来のＣＡＲ Ｔ細胞株は、そのＴ_ＣＭ由来の対応物と比較してＣＤ８細胞の割合が比較的高いということが明らかになった。Ｔ_ＣＭ由来の細胞生成物もＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の細胞生成物も、メモリー関連マーカーＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌを発現した。しかし、ＣＤ２７の発現は、概してＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の生成物において高かった。さらに、ＣＤ４５ＲＡ発現レベルも、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の生成物において有意に高かった。

＜結論＞：まとめると、得られたこれらのデータは、Ｔ_ＣＭ−濃縮集団もＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}−濃縮集団も、ＣＤ３／ＣＤ２８のビーズ刺激、レンチウイルスでの形質導入、及び、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を行うことができるということを示している。Ｔ_ＣＭ及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の対応物間で増殖倍率は類似していたため、より多くのＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の細胞数で開始する能力は、臨床的な使用に対して十分な細胞数に到達するためのより短い増殖時間を可能にし得るということに留意することが重要である。

フローサイトメトリー分析により、Ｔ_ＣＭの細胞集団もＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の細胞集団も、類似の効率で形質導入され、ＥＧＦＲｔ又はＣＤ１９ｔ導入遺伝子を発現したということが明らかになった。フローサイトメトリー分析は、Ｔ_ＣＭの細胞集団もＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の細胞集団も、Ｔ細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８だけでなく、Ｔ細胞メモリーマーカーＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌを発現するということも確認した。Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の集団において観察されたＣＤ４５ＲＡ＋細胞のより高い割合は、選択プロセスにおいてＴ_ＣＭ細胞はＣＤ４５ＲＡを枯渇したため、予想通りであった。

ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７で形質導入した静脈内送達されたＴ_ＣＭの細胞集団及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の細胞集団におけるＩｎ Ｖｉｖｏでの有効性
臨床的使用に適した方法を使用して、ＣＤ１９を標的としたＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター（ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクター）で形質導入し且つ増殖させた選択されていないＰＢＭＣ、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_ＣＭ細胞及びＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を評価するために、研究を行った。静脈内（ｉｖ）投与されたこれらの細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍の有効性を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）レポーター遺伝子を発現するように操作されたＣＤ１９発現ＳＵＰ−Ｂ１５ヒト急性リンパ球性白血病の細胞株を使用して、免疫不全のＮＳＧマウスにおいて調べた（ＰＭＩＤ：２２４０７８２８）。

＜実験設計＞：ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７を用いてレンチウイルスで形質導入され且つ２１日間増殖させたＴ_ＣＭ由来又はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来のＴ細胞株を、この研究において使用した（上記の実施例２及び４を参照）。次に、静脈内投与される新たに解凍したＣＡＲ Ｔ細胞を、静脈内移植されるＳｕｐ−Ｂ１５細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を制御するその能力について評価した。Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングによって測定した腫瘍負荷量も、末梢血のフローサイトメトリー分析によって測定したＴ細胞の残留性も調べた。

＜Ｉｎ Ｖｉｖｏでの異種移植研究の概要＞：０日目に３００ラドで雌のＮＳＧマウス（１０〜１２週齢）に照射を行った。１日目にマウスをグループ（ｎ＝４）に分け、未処置のままにしたか、又は、２．５ｘ１０^６ＨＤ２７０由来のニセ形質導入されたＰＢＭＣ（ＣＡＲなし）、ＨＤ２７０ ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＰＢＭＣ、ＨＤ２７０ ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ又はＨＤ２７０ ＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}のいずれかを用いて静脈内（すなわち、尾静脈を介して）処置した。これは、０．５ｘ１０^６ＣＡＲ＋細胞のＣＤ１９Ｒ／ＥＧＦＲｔ＋Ｔ_ＰＢＭＣ、ＣＤ１９Ｒ／ＥＧＦＲｔ＋Ｔ_ＣＭ又は０．６２５ｘ１０^６のＣＤ１９Ｒ／ＥＧＦＲｔ＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}の平均が各マウスに投与されていると解釈され、ＨＤ２７０ ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の細胞株の表現型分析によって定められる。２日目に、１つのＣＡＲ＋Ｔ細胞ＧＦＰあたり２つの腫瘍細胞：ｆｆＬｕｃ＋Ｓｕｐ−Ｂ１５腫瘍細胞を用いて、マウスに静脈内投与を挑戦させた。次に、このヒト急性リンパ球性白血病の細胞株の増殖を、Ｘｅｎｏｇｅｎイメージング及びホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）フラックスの定量化（光子／秒）によって、時間の経過に伴いモニターした。４１日目に、後眼窩出血を行い、さらに、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ機器及びＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、フローサイトメトリー分析によってヒトＣＤ３発現Ｔ細胞の存在について血液を評価した。

＜Ｉｎ Ｖｉｖｏでの抗腫瘍の有効性の評価＞：この研究の結果を描いている図７Ａ及び図７Ｂにおいて、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞は、ｆｆＬｕｃ＋Ｓｕｐ−Ｂｌ５腫瘍に対してより強い抗腫瘍活性を示したが、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ細胞の静脈内投与は一過性の治療効果しか示さなかったということが分かる。

＜末梢血におけるＴ細胞の分析＞：これらのマウスにおける末梢血におけるＴ細胞の残留性を評価するために、フローサイトメトリー分析を、静脈内Ｔ細胞投与の４０日後に採取した後眼窩出血に対して行った。図８において描かれているように、ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を受けたマウスにおいてこの時点でのみ検出可能であった。このＣＡＲ＋ヒトＴ細胞の存在は、ＧＦＰ発現ＳｕｐＢ１５腫瘍細胞の非存在と相関していた。

これらの研究によって、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍の有効性を、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ由来の細胞株でもＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}由来の細胞株でも観察することができ、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞処置マウスの抗腫瘍応答が、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ処置マウスの抗腫瘍応答より大きいということが実証されている。この有効性は、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}処置マウスの血液中のＣＡＲ＋Ｔ細胞を検出する能力と部分的に相関した。

ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７で形質導入されたＴ_ＣＭ細胞及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞のエフェクター活性
臨床的使用に適していると予想される方法を使用して、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターで形質導入し且つ増殖させたＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）細胞又はＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞のＣＤ１９特異的な細胞溶解活性、脱顆粒及びサイトカイン生成を評価するために、研究を行った。細胞溶解活性を、フローサイトメトリーに基づく長期の死滅アッセイ及び５時間の脱顆粒アッセイを使用して評価した。サイトカイン生成を、刺激細胞との５時間の共培養後に、Ｔ細胞の細胞内染色によって評価した。

＜実験設計＞：Ｔ_ＣＭ細胞及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞を、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７を用いてレンチウイルスで形質導入し、さらに、２１日間まで増殖させた（実施例２及び４を参照）。これらの細胞生成物のＣＤ１９特異的エフェクター機能を、エフェクターＴ細胞との共インキュベーションの７２時間後の標的細胞の減少を評価する長期の死滅アッセイ、及び、Ｔ細胞の細胞傷害活性のマーカーとしての細胞表面ＣＤ１０７ａ動員を評価する５時間の脱顆粒アッセイによって評価した。次に、５時間のｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激後の新たに解凍した最終細胞生成物によるサイトカイン生成の評価を、ＩＦＮ−γについての細胞内染色のフローサイトメトリー分析によって行った。

＜長期の死滅アッセイの概要＞：各Ｔ細胞生成物の試料を、アッセイの前日に解凍し、５０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１５の存在下で一晩休ませ、次に、７２時間の死滅アッセイを行った。簡潔には、各Ｔ細胞株及び標的細胞株を計数し、さらに、１：１のＣＡＲ＋Ｔ細胞対標的細胞の比で、９６ウェルの組織培養処理した丸底プレート内に、具体的には、１つのウェルあたり１０％ＦＢＳを有するＸ−ＶＩＶＯ１５培地２００μＬにおいて２５，０００：２５，０００で播種した。７２時間の培養後、細胞をトリプシン処理で回収し、低温のＦＡＣＳ緩衝液において洗浄し、次に、抗ヒトＣＤ４５で染色して、生死判別色素としてＤＡＰＩを用いてＴ細胞を検出した。試料をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）機器に流して分析し、生存可能な免疫反応性細胞の数を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を介して計算した。次に、１００％に正規化された、ニセの形質導入されたエフェクター細胞共培養物と比較した場合の培養液中に残っているＣＤ４５陰性の前方散乱高腫瘍細胞の割合として、最終結果をグラフ化した。

＜脱顆粒アッセイ及び細胞内サイトカイン分析の概要＞：各Ｔ細胞生成物の試料を新たに解凍し、次に、５時間の脱顆粒アッセイを行った。Ｔ細胞を計数し、さらに、細胞表面からのＣＤ１０７ａの再吸収を阻止するタンパク質輸送阻害剤であるＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐを含有する培地において再懸濁した。次に、Ｔ細胞を、９６ウェルプレートにおいて（Ｇｏｌｇｉ Ｓｔｏｐと共に）腫瘍細胞と１：１の比で播種した。各ウェルに、ＣＤ１０７ａに対する抗体を添加し、次に、プレートを３７℃にて５時間インキュベートした。次に、各条件にさらなる抗体を添加して、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８及びＥＧＦＲｔ導入遺伝子を染色した。次に、細胞を固定し、さらに、ＩＦＮ−γ又はアイソタイプ対照抗体に特異的な抗体で染色するために透過処理した。試料を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）機器に流して分析し、さらに、免疫反応性細胞の割合を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を介して計算した。

＜長期の死滅アッセイによる細胞溶解活性の決定＞：ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７で形質導入又はニセの形質導入されたＴ_ＣＭ細胞及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞をそれぞれ、７２時間ＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞又はＣＤ１９＋ＳｕｐＢ１５細胞と共に蒔いた。結果が図９において示されており、ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ細胞ともＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞とも培養液における検出可能なＳｕｐＢ１５標的の類似の減少を、そのそれぞれのニセの形質導入された対照と比較して示している。実際、このＳｕｐＢ１５標的の減少は、Ｋ５６２標的で観察されたものよりも有意に大きく、この細胞溶解活性のＣＤ１９特異性をさらに支持している。

＜脱顆粒アッセイによるエフェクター活性の決定＞：ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７で形質導入又はニセの形質導入されたＴ_ＣＭ細胞及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞をそれぞれ、ＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞又はＣＤ１９＋ＳｕｐＢ１５細胞と共に蒔いた。結果が以下（図１０）に示されており、ＣＤ８＋ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ及びＣＤ８＋ＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞は、ＳｕｐＢ１５細胞での刺激後に類似のＣＤ１９特異的脱顆粒（すなわち、ＣＤ１０７ａ発現）を示すということを実証している。この活性の抗原特異性は、ＣＤ１９発現ＳｕｐＢ１５細胞によって脱顆粒するように刺激されていないニセの形質導入された細胞を調べることによってさらに証明されている（図１０）。

＜細胞内サイトカインアッセイによるエフェクター活性の決定＞：ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７で形質導入又はニセの形質導入されたＴ_ＣＭ細胞及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞をそれぞれ、ＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞又はＣＤ１９＋ＳｕｐＢ１５細胞と共に蒔いた。結果が図１１において示されており、ＣＤ８＋ＣＤ１９Ｒ Ｔ_ＣＭ及びＣＤ８＋ＣＤ１９Ｒ Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}は、類似のＣＤ１９特異的細胞内ＩＦＮ−γ特性を示すということを実証している。この活性の抗原特異性は、ＣＤ１９発現ＳｕｐＢ１５細胞によってＩＦＮ−γを発現するように刺激されていないニセの形質導入された細胞を調べることによってさらに証明されている。

これらのデータは、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）Ｃ２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７で形質導入されたＴ_ＣＭ細胞もＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞も、ＣＤ１９−発現標的細胞との共培養の後に細胞溶解活性、脱顆粒及びサイトカイン（すなわちＩＦＮ−γ）生成を示すということを確認した。

＜ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨｌＶ７で形質導入したＴ_ＣＭ細胞及びＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞のエフェクター活性＞
ＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで形質導入したＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_ＣＭ細胞及びＣＤ６２Ｌ＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を評価するために、研究を行った。ＣＡＲは、ヒトＩＬ−１３変異体を含み、レンチウイルスベクター（ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７）によって発現される。このベクターを発現する細胞集団を実施例４において先に記載したように調製し、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）レポーター遺伝子を発現するように操作されたＩＬ１３Ｒα２＋初代低継代ＧＢＭ腫瘍様塊の株ＰＢＴ０３０−２を使用した免疫不全ＮＳＧマウスにおける神経膠芽腫のマウスモデルにおいて評価した。

簡潔には、０日目に、雄ＮＳＧマウス（１０〜１２週齢）に、１×１０^５ｆｆＬｕｃ＋ＰＢＴ０３０−２細胞を左右両側の半球において定位的に注射し、６日間生着させた。次に、マウスの群を未処置のままにしたか、又は、１×１０^６ＣＡＲ＋ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}、ＣＡＲ＋ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋Ｔ_ＣＭ、ニセの形質導入されたＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}又はニセの形質導入されたＴ_ＣＭで処置した。ＰＢＴ０３０−２腫瘍増殖を、Ｘｅｎｏｇｅｎイメージング及びｆｆＬｕｃフラックス（光子／秒）の定量化によって時間の経過に伴いモニターした。

図１２において示されているように、ＩＬ−ＩＬ１３Ｒα２に対して作られたＣＡＲで形質導入されたＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}は、マウスの腫瘍内神経膠芽腫モデルにおける腫瘍増殖の抑制に関して及び生存に関して、同様に形質導入されたＴ_ＣＭよりも優れていた。

Claims (28)

1. Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団であって、前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、前記Ｔ細胞のうち５０％を超えるＴ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、前記Ｔ細胞のうち７０％を超えるＴ細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、前記Ｔ細胞のうち１５％未満がＣＤ１４＋であり、さらに、前記Ｔ細胞のうち５％未満がＣＤ２５＋であり、かつ、前記Ｔ細胞のうち２５％を超えるＴ細胞が組換え核酸分子を宿す、単離されたヒト細胞の集団。
2. 前記組換え核酸分子はウイルスベクターである、請求項１に記載の単離されたヒト細胞の集団。
3. 前記組換え核酸分子はキメラ抗原受容体をコードする、請求項１に記載の単離されたヒト細胞の集団。
4. 前記組換え核酸分子はＴ細胞受容体をコードする、請求項１に記載の単離されたヒト細胞の集団。
5. 前記Ｔ細胞のうち少なくとも７０％が、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋、又は、ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋である、請求項１に記載の単離されたヒト細胞の集団。
6. 前記Ｔ細胞のうち６０％未満がＣＤ４５ＲＯ＋である、請求項１に記載の単離されたヒト細胞の集団。
7. Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団であって、前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞及び幹細胞様メモリーＴ細胞を含み、前記Ｔ細胞のうち５０％を超えるＴ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、前記Ｔ細胞のうち７０％を超えるＴ細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、前記Ｔ細胞のうち８５％を超えるＴ細胞がＣＤ９５＋であり、さらに、前記Ｔ細胞のうち２５％を超えるＴ細胞が組換え核酸分子を宿す、単離されたヒト細胞の集団。
8. 前記組換え核酸分子はウイルスベクターである、請求項７に記載の単離されたヒト細胞の集団。
9. 前記組換え核酸分子はキメラ抗原受容体をコードする、請求項７に記載の単離されたヒト細胞の集団。
10. 前記組換え核酸分子はＴ細胞受容体をコードする、請求項７に記載の単離されたヒト細胞の集団。
11. 前記Ｔ細胞のうち少なくとも７０％が、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋、又は、ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋である、請求項７に記載の単離されたヒト細胞の集団。
12. 前記Ｔ細胞のうち６０％未満がＣＤ４５ＲＯ＋である、請求項７に記載の単離されたヒト細胞の集団。
13. 組換え核酸分子を宿すＴ細胞を含むヒト細胞の集団を調製する方法であって、
    （ａ）Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を提供するステップであり、前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、前記Ｔ細胞のうち５０％を超えるＴ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、前記Ｔ細胞のうち７０％を超えるＴ細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、ステップ、
    （ｂ）前記Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を活性化するステップ、及び、
    （ｃ）前記Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団内の細胞に、組換え核酸分子を形質導入又は遺伝子導入して、組換え核酸分子を宿すＴ細胞を含むヒト細胞の集団を提供するステップ、
    を含み、
    ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を枯渇させるステップを含まない方法。
14. 前記組換え核酸分子はウイルスベクターである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記組換え核酸分子を宿すＴ細胞を含むヒト細胞の集団を培養するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
16. 前記培養するステップは、外来性ＩＬ−２及び外来性ＩＬ−１５の添加を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記活性化するステップは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体に前記細胞を曝露するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
18. 前記ウイルスベクターは、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
19. Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を調製する方法であって、前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、前記細胞のうち５０％を超える細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、前記細胞のうち７０％を超える細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、当該方法は、
    （ａ）Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料を提供するステップ、
    （ｂ）枯渇した細胞集団を調製するために、ＣＤ２５を発現する細胞、及び、ＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させるように前記Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料を処理するステップ、
    及び、
    （ｃ）ＣＤ６２Ｌを発現する細胞を濃縮するように前記枯渇した細胞集団を処理し、その結果、Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を調製するステップであり、前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、前記細胞のうち５０％を超える細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、前記細胞のうち７０％を超える細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、ステップ、
    を含み、
    ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を枯渇させるステップを含まない方法。
20. 前記Ｔ細胞を含むヒト細胞の集団を活性化するステップ、及び、前記活性化された細胞に、組換え核酸分子を形質導入又は遺伝子導入して、組換え核酸分子を宿すＴ細胞を含むＴ細胞の集団を提供するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料はＰＢＭＣを含む、請求項１９に記載の方法。
22. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴ細胞を含む、単離されたヒト細胞の集団を含む、癌、自己免疫又は感染を治療するための医薬組成物。
23. 前記単離されたヒト細胞の単離された集団は、それが必要な患者に対して自己由来である、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. 前記単離されたヒト細胞の単離された集団は、それが必要な患者に対して同種異系である、請求項２２に記載の医薬組成物。
25. Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団であって、前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、前記Ｔ細胞のうち５０％を超えるＴ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋であり、さらに、前記Ｔ細胞のうち７０％を超えるＴ細胞がＣＤ６２Ｌ＋であり、前記集団は、Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料を提供するステップ、
    枯渇した細胞集団を調製するために、前記試料を抗ＣＤ１４抗体及び抗ＣＤ２５抗体に接触させることにより、ＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させ、かつ、ＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させるように前記Ｔ細胞を含むヒト細胞の試料を処理するステップ、及び、ＣＤ６２Ｌを発現する細胞を濃縮するように前記枯渇した細胞集団を処理し、その結果、Ｔ細胞を含む単離されたヒト細胞の集団を調製するステップであり、前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含み、前記細胞のうち４０％を超える細胞がＣＤ４５ＲＯ＋であり、さらに、前記細胞のうち７０％を超える細胞がＣＤ６２Ｌ＋である、ステップを含み、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞を枯渇させるステップを含まない方法によって調製される、単離されたヒト細胞の集団。
26. 前記Ｔ細胞のうち１５％未満がＣＤ１４＋であり、さらに、前記Ｔ細胞のうち５％未満がＣＤ２５＋である、請求項２５に記載の単離されたヒト細胞の集団。
27. 前記Ｔ細胞のうち少なくとも７０％が、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋、又は、ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋である、請求項１に記載の単離されたヒト細胞の集団。
28. 前記Ｔ細胞のうち６０％未満がＣＤ４５ＲＯ＋である、請求項１に記載の単離されたヒト細胞の集団。

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