JPWO2009145238A1

JPWO2009145238A1 - 免疫調節剤及びその利用

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Publication number: JPWO2009145238A1
Application number: JP2010514521A
Authority: JP
Inventors: 鈴木　治彦; 治彦鈴木
Original assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2011-10-13
Anticipated expiration: 2029-05-27
Also published as: WO2009145238A1; JP5549014B2

Abstract

ヒトを含む動物の免疫関連疾患により実用的なCD8陽性制御性T細胞を提供する。【解決手段】免疫調節剤としてCD8陽性CXCR3陽性T細胞を用いる。

Description

本発明は、免疫調節剤及びその利用に関し、詳しくはCD8陽性CXCR3陽性T細胞及びその利用に関する。

ヒトなどの動物における免疫系は、病原菌などの外来抗原やがん細胞などの変異性自己抗原を検知し駆除する生体防御機構である。かかる生体防御は、Ｔ細胞による細胞性免疫及びＢ細胞を主体とする体液性免疫のそれぞれの応答によるものである。

免疫系は活性化と抑制とのバランスを保つ制御システムの上に生体防御機構として成立している。このため、こうした制御系の崩壊が、アレルギー性疾患、自己免疫疾患並びに発癌といった疾患を発症させる場合もありうる。したがって、免疫系を制御する細胞を検出し分離することは、疾患の診断並びに予防及び治療に極めて有用である。

現在、免疫系を正常に機能させるための制御機構は必ずしも明らかになっているわけではない。免疫系の制御システムの基本は、CＤ4陽性細胞やＣＤ８陽性細胞を含めた各種Ｔ細胞が担っていると考えられており、CD25陽性CD4陽性細胞が種々の自己免疫疾患の進展の抑制や臓器移植後の免疫寛容に有効であることが知られている（非特許文献１、２）。また、本発明者らは、CD8陽性キラーT細胞やCD4陽性ヘルパーＴ細胞を制御するCD8陽性制御性Ｔ細胞としてCD8陽性CD122陽性T細胞を既に分離している(特許文献１、非特許文献３及び非特許文献４）。

国際公開ＷＯ２００５／７８０７２号公報

Nat Rev Immunol., 2, 389-400, 2002 Nat Rev Immunol., 3, 199-210, 2003 The Journal of Experimental Mdeicine, 200:1123-1134 The Journal of Immunology, 2008,180:825-832

特許文献２及び非特許文献２に開示されるように、マウスにおいては、CD8陽性制御性Ｔ細胞は、CD122というマーカー分子の発現によって他の通常のエフェクターT細胞等から分離された。しかしながら、ヒトにおいては、CD8陽性T細胞中に、CD122陽性細胞を見出すことができなかった。したがって、ヒトにおいては、CD8陽性制御性T細胞は未だ分離されていない。

本発明は、ヒトを含む動物の免疫関連疾患により実用的なCD8陽性制御性T細胞及びその利用を提供することを一つの目的とする。

本発明者は、マウスのCD8 陽性CD122陽性T細胞に特異的に発現している分子をＤＮＡマイクロアレイ法で検索した結果、いくつかの候補遺伝子を見出し、これらの中にケモカイン受容体の一つであるCXCR3があるという知見を得た。さらに、特異的抗体を用いたフローサイトメトリーにより、CD8陽性細胞集団中のCD122陽性細胞集団は、CXCR3陽性細胞集団と一致しているという知見を得た。本発明者は、さらに、ヒトにおいてCD122陽性細胞集団中にCXCR3陽性細胞集団が存在し、当該細胞集団がCD8陽性制御性T細胞として機能するという知見を得た。本発明はこれらの知見によってなされたものである。本発明によれば以下の手段が提供される。

本発明によれば、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を含有する、免疫調節剤が提供される。本発明の免疫調節剤において、前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞はインターロイキン１０の産生活性を有することができる。また、前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞は霊長類由来とすることもできる。

本発明の免疫調節剤は、免疫抑制がその予防又は治療に有効である免疫関連障害の予防又は治療剤とすることもできる。この態様において、前記免疫関連障害は自己免疫疾患であってもよいし、臓器移植後の拒絶反応であってもよい。

本発明によれば、免疫関連障害の予防又は治療剤であって、上記いずれかの免疫調節剤と、薬学的に許容される担体と、を含有する、予防又は治療剤が提供される。

本発明によれば、活性化されたCD8陽性制御性T細胞の製造方法であって、CD8陽性CXCR3陽性Ｔ細胞を準備する工程と、前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞を、当該細胞のT細胞受容体を介して刺激する物質の存在下で培養する活性化工程と、を備える、製造方法が提供される。本発明の製造方法においては、前記活性化工程は、前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞のインターロイキン１０の産生活性を発現させる工程であることが好ましい。また、前記活性化工程は、前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞を特定の抗原の存在下で培養して当該抗原についての特異性を有するCD8陽性CXCR3陽性T細胞を活性化する工程とすることができる。この態様において、前記抗原は、自己免疫疾患の原因物質、アレルギー疾患の原因物質及び臓器移植時のドナー由来細胞又はその一部からなる群から選択することができる。

本発明の活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞の製造方法においては、さらに、前記活性化したCD8陽性CXCR3陽性T細胞をIL10産生活性を指標として選抜する工程を備えることもできる。また、さらに、活性化された前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞を培養して増殖させる工程を備えることもできる。

本発明によれば、CD8陽性制御性Ｔ細胞の検出又は分離用キットであって、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を検出又は分離する試薬を含む、キットが提供される。

本発明によれば、免疫関連障害の予防又は治療剤の製造方法であって、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を準備する工程と、前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞と薬学的に許容される担体とを混合する工程と、を備える、製造方法が提供される。

本発明によれば、免疫関連障害の予防又は治療手段のスクリーニング方法であって、CD8陽性CXCR3陽性T細胞に１種又は２種以上の被験条件を付与して前記T細胞の免疫抑制活性を検出する工程、を備える、スクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法においては、さらに、前記１種又は２種以上の被験条件中、前記免疫抑制活性を増強する１種又は２種以上の被験条件を免疫抑制が有効な免疫関連障害の予防又は治療手段として選択する工程を備えることもできる。また、さらに、前記１種又は２種以上の被験条件中、前記免疫抑制活性を低下させる１種又は２種以上の被験条件を免疫活性化が有効な免疫関連障害の予防又は治療手段として選択する工程、を備えることもできる。

本発明によれば、免疫関連障害の予防又は治療方法であって、前記免疫関連障害の予防又は治療を要する個体に、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を投与する工程、を備える、方法が提供される。また、本発明によれば、免疫関連障害の予防又は治療方法であって、前記免疫関連障害の予防又は治療を要する個体から、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の少なくとも一部を除去する工程、を備える、方法が提供される。

C57BL/6マウスから採取した細胞を抗CD8及び抗CXCR3抗体で染色し、その後、フローサイトメトリーにより分析した結果を示す図である。ほとんどCD8陽性細胞が存在しない新生仔を除いて、全CD8陽性細胞中のCXCR3陽性細胞の割合は、各週令のC57BL/6を個々のパネルに示す。各週令マウスのフローサイトメトリック解析により得られた全CD8陽性細胞中のCXCR3陽性細胞の割合を示すグラフ図である。各週令につき２匹のマウスの平均値を標準偏差のエラーバーとともに示す。４週令マウスについて、CD8陽性細胞にゲートされた細胞についてのCD122及びCXCR3の発現プロファイル及びCD4陽性細胞にゲートされた細胞についてのCD25及びCXCR3の発現プロファイルをドットプロットとして示す図である。６週令マウスから回収したCD8陽性細胞を構成する３つの細胞集団（#1:CD44弱陽性CD62L強陽性、#2：CD44強陽性CD62L強陽性、#3:CD44強陽性CD62L弱陽性）におけるCD122及びCXCR3の発現プロファイルをドットプロットとして示す図である。マウスから抗CD8抗体コーティングビーズにより抗体コートビーズで回収されたCD8陽性細胞についてのフローサイトメトリーによるCD8及びCXCR3の発現プロファイル及びセルソーティング後のフローサイトメトリー結果を示す図である。それぞれのパネルには、全細胞数に対する当該象限にある細胞の割合を示す。リンパ球を欠くSCIDマウスにCD8陽性CXCR3陰性細胞単独もしくはCD8陽性CXCR3陰性細胞とCD8陽性CXCR3陽性細胞を混合したものを移入し、10週後の脾臓細胞を解析した。脾臓細胞由来のCD8陽性細胞中のCD69発現についての代表的なドットプロットを全CD8陽性細胞数に対するCD69陽性細胞数の割合とともに示す図である。３匹のマウスから得られた全CD8陽性細胞数に対するCD69陽性細胞の割合もグラフとして示す。前記リンパ球移入マウスの脾臓におけるGr-1発現についての代表的なドットプロットを、全脾臓細胞に対するGr-1陽性顆粒球の割合とともに示す図である。３匹のマウスから得られた全脾臓細胞数に対するGr-1細胞の割合もグラフとして示す。前記リンパ球移入マウスの骨髄細胞を赤血球生成細胞（TER-119陽性）及び顆粒球生成細胞（Gr-1陽性）のバランスを確認するためにフローサイトメーターにより分析した結果を示す図である。TER-119陽性細胞数に対するGr-1陽性細胞数の割合を各図に示すとともに、３匹のマウスから得られたデータもグラフとして示す。マウスCD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXCR3陰性T細胞を活性化した。CD8抗体及びCytofix/Cytopem（BDバイオサイエンス）を用いて細胞内IL10を検出した。これらの細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を示す。全CD8陽性細胞におけるIL10の産生活性を示す細胞又は示さない細胞の割合を各パネルに示す。３回の実験から得られた、全CD8陽性細胞中のIL10産生細胞数の平均値を、標準偏差のエラーバーとともに示すグラフ図である。 CD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXCR3陰性T細胞の各培養上清のIL10濃度を、３回の実験から得られた平均値を標準偏差のエラーバーとともに示すグラフ図である。 CD8陽性CXCR3陰性T細胞の単独又はCD8陽性CXCR3陽性T細胞と共培養後のCFSE標識細胞（CD8陽性CXCR3陰性T細胞）のIFN-γの産生活性を調べた結果を示す図である。全CD8陽性細胞中のIFN-γ産生細胞の割合を各パネルに示す。全CFSE陽性CD8陽性細胞中のIFN-γ産生細胞の割合の平均値（３回繰り返し）を標準偏差のエラーバーとともに示すグラフ図である。 CFSE蛍光の減少によってCD8陽性CXCR3陰性T細胞の細胞増殖状態を評価した結果を示す図である。灰色で塗りつぶしたピークは、CD8陽性CXCR3陰性T細胞単独で培養したときのCFSE蛍光を表し、太線のオープンピークは、CD8陽性CXCR3陽性T細胞とともに培養したときのCFDSE蛍光を表す。末梢血から分離したヒト単核球を、抗ヒトCD8抗体、抗ヒトCXCR3抗体及び抗ヒトCD122抗体で染色してフローサイトメトリーにより分析した結果を示す図である。CD8及びCXCR3で展開したドットプロット及びCD8及びCD122で展開したドットプロットをそれぞれ示す。各象限のCD8陽性CXCR3陽性T細胞の割合を各パネル内部に示す。 CD8^hi（強陽性、ほとんどCD8陽性に一致する）にゲートされた細胞集団及びCD8^dimにゲートされた細胞集団につき、CXCR3及びCD122で展開したドットアナリシスを示す図である。各象限における細胞の割合をパネル内部に示す。 CD8陽性CXCR3陰性T細胞及びCD8陽性CXCR3陽性T細胞にゲートされた各細胞集団についてのCD45RA及びCCR7の発現プロファイルを示す。各象限における細胞の割合をパネル内部に示す。ヒト単核球についてCD8及びCXCR3の発現プロファイルを示す図である。全CD8陽性細胞中のCXCR3陽性細胞の割合をパネルに示す。左図は、ヒト末梢血の単核球細胞におけるCD4及びCD25の発現プロファイルをドットプロットとして示す図である。右図は、CD4陽性細胞集団にゲートされたCD25及びCXCR3の発現プロファイルを示す図である。各象限における細胞の割合をパネル内に示す。 CD8及びCXCR3の発現についてのヒト末梢血単核球の代表的染色パターンを示す図である。セルソーターによってCD8陽性CXCR3陰性T細胞及びCD8陽性CXCR3陽性T細胞を取得するためのゲート位置を長方形状の領域として示す。回収したCD8陽性CXCR3陰性T細胞及びCD8陽性CXCR3陽性T細胞の培養上清のELISAによるIL10産生量の測定結果を示すグラフ図である。それぞれについての２回繰り返しの平均値を標準偏差のエラーバーとともに示す。回収したCD8陽性CXCR3陰性T細胞及びCD8陽性CXCR3陽性T細胞の培養細胞についてのCD8及びIL10の発現プロファイルをフローサイトメトリーで分析した結果を示す図である。全CD8陽性細胞におけるIL10の産生活性を示す細胞又は示さない細胞の割合を各パネルに示す。フローサイトメトリーによる全CD8陽性細胞中のIL10の産生活性を示す細胞の割合の平均値（３回繰り返し）を標準偏差のエラーバーとともに示すグラフ図である。 CD8陽性CXCR3陰性T細胞の単独培養及びCD8陽性CXCR3陽性T細胞との共培養の双方につき、CFSE標識細胞（CD8陽性CXCR3陰性T細胞）のIFN-γ産生活性をフローサイトメトリーにより分析した結果を示す図である。全CD8陽性細胞中のIFN-γ産生細胞の割合を各パネルに示す。フローサイトメトリーによるCFSE標識細胞（CD8陽性CXCR3陰性T細胞）のIFN-γの産生活性の測定結果（３回繰り返し）の平均値を標準偏差のエラーバーとともに示すグラフ図である。 CFSE標識細胞（CD8陽性CXCR3陰性T細胞）につき、CFSE蛍光の減少により細胞増殖を評価した結果を示す図である。灰色で塗りつぶしたピークは、CD8陽性CXCR3陰性T細胞単独で培養したときのCFSE蛍光を表し、太線のオープンピークは、CD8陽性CXCR3陽性T細胞とともに培養したときのCFSE蛍光を表す。ＥＡＥマウスに対するCD8陽性CD122陽性T細胞の投与のプロトコールの概要と投与結果を示す図である。 RAGノックアウトIBDモデルマウスに対するCD8⁺CD122⁺制御性T細胞の投与結果を示す図である。

本発明は、DC8陽性制御性T細胞とその利用に関し、具体的には、当該制御性T細胞を含む免疫関連障害の予防又は治療剤及びその製造方法、該制御性T細胞を含む免疫抑制剤、免疫関連障害の予防又は治療手段のスクリーニング方法並びに免疫関連障害の予防又は治療方法等に関する。

本発明は、本発明者らが分離したCD8陽性CXCR3陽性T細胞に基づいている。本発明者らは、マウスにおいてCD8陽性制御細胞として分離したCD8陽性CD122陽性細胞が、ヒトにおいてはCD8陽性CXCR3陽性細胞に相当することを確認した。したがって、CD8陽性CXCR3陽性T細胞は、少なくとも非霊長哺乳類であるマウスと霊長類であるヒトを含む動物、好ましくは哺乳動物において、CD8陽性制御性T細胞として機能することができる。

例えば、CD8陽性CXCR3陽性T細胞は、自身のインターロイキン１０（IL10）の産生活性を有するとき制御性T細胞として機能すると考えられる。したがって、当該産生活性に基づいて、また、標的細胞であるCD8陽性CXCR3陰性T細胞のIFN-γの産生の抑制に基づいて、免疫系の制御に寄与することができる。さらに、CD8陽性CXCR3陽性T細胞は、標的細胞であるCD陽性CD122陰性T細胞又はCD4陽性CD25陰性T細胞のインターフェロンγ（IFN-γ）の産生を抑制するとともにインターロイキン２（IL2）の産生を抑制することにより、免疫系の制御に寄与することができる。

本発明によれば、かかるCD8陽性制御性T細胞及びその前駆細胞を分離同定できたことから、当該制御性Ｔ細胞の過剰又は活性化を伴う免疫関連障害については、これらを除去等することにより当該障害を予防又は改善することが可能であり、また、当該制御性T細胞の減少又は不活性化を伴う免疫関連障害については、これらを補充又は活性化することにより当該障害を改善又は予防することができる。

さらに、本発明によれば、CD8陽性制御性T細胞を分離同定できたことから、当該制御性T細胞の免疫制御活性を促進又は抑制する被験条件を見出すことにより、免疫抑制又は免疫活性化が有効な免疫関連障害の予防又は治療手段をスクリーニングすることができるようになる。

以下、本発明の各種実施形態について詳細に説明する。

（免疫調節剤）
（CD8陽性CXCR3陽性Ｔ細胞）
本発明の免疫調節剤は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を含有している。当該T細胞は、CD8陽性及びCXCR3陽性の表現型を有しており、CD8陽性CXCR3陽性細胞集団に属している。当該T細胞は、in vitro及びin vivoにて活性化されると、CD8陽性制御性T細胞として機能することができる。このため、本発明の免疫調節剤は、CD8陽性制御性T細胞の免疫抑制能に基づき、免疫調節剤、特に免疫抑制剤として利用できる。

本明細書において、「制御性T細胞」とは、抗原等によりT細胞受容体を介する刺激を受けたとき、当該制御性T細胞の標的細胞の活性化（増殖、サイトカイン産生等）を抑制する能力（免疫抑制能）を有するT細胞を意味している。

本発明で用いるCD8陽性CXCR3陽性T細胞が標的とする標的細胞は、例えば全CD8陽性T細胞、CD8陽性CXCR3陰性細胞が挙げられる。

本発明で用いるCD8陽性CXCR3陽性T細胞は、T細胞受容体を介する刺激を受けたとき、効果（免疫抑制能）発揮因子としてインターロイキン１０(IL10)を自己産生することができる。これにより、標的細胞のIFN-γの産生を抑制できる。IL10の生産能は、例えば、IL10に特異的な抗体を用いてフローサイトメトリーやELISA等により検出・解析することができる。また、本発明で用いるCD8陽性CXCR3陽性T細胞は、標的細胞であるCD8陽性CXCR3陰性細胞等の増殖を抑制することができる。

なお、本明細書において、細胞の表現型がマーカー分子（抗原）発現の有無や強弱で表される場合、特に断りのない限り、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合の有無や強弱で表記される。マーカー分子の発現の有無や強弱による細胞の表現型の決定は、通常、当該マーカー分子に対する特異的抗体等を用いたフローサイトメトリー解析等により行われる。マーカー分子の発現が「陽性」とは、該マーカー分子が細胞表面上（或いは細胞内）に発現しており、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合が確認できることをいう。

本発明で用いるT細胞は、哺乳動物由来であることが好ましい。哺乳動物としては、上記した特定の表現型細胞集団が本発明のCD8陽性制御性T細胞として利用できる限り特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オラウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくは霊長類であり、より好ましくはヒトである。

本発明で用いるT細胞は、胸腺、臍帯血及び抹消組織のいずれかのCD8陽性CXCR3陽性T細胞である。したがって、本発明で用いるCD8陽性制御性T細胞は、末梢組織（胸腺及び臍帯血以外の組織：例えば末梢血液、脾臓、リンパ節、腸管、肝臓等）に存在している細胞であってもよい。調製操作の容易性を考慮すると、末梢血液又は脾臓中の細胞が好ましく用いられる。

CD8陽性CXCR3陽性T細胞は、単離・精製されていることが好ましい。当該T細胞の単離・精製は、哺乳動物等の各種組織から表現型等に基づき、公知の方法により行うことができる。例えば、ヒトのCD8陽性CXCR3陽性T細胞を有する末梢T細胞を単離・精製するには、まず、末梢組織（例えば末梢血液等）より、単核球分画が調製される。単核球分画の調製は、例えば、密度勾配遠心等により行われる。次に、蛍光色素や磁気ビーズ等により標識された、CD8及び／又はCXCR3に対する特異的抗体により単核球分画を染色し、セルソーターや磁性カラム等を用いて目的とする分画を単離・精製する。高い精製度を達成するため、好ましくは、セルソーターが用いられる。

CD8陽性CXCR3陽性T細胞は、ex vivoで適切な刺激を付与してIL10を産生する活性化した状態としてもよい。こうすることで、投与後、速やかにin vivoにおいて制御性T細胞として機能させることができる。このような活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞は、IL10の産生の有無にて検出し分離することができる。以下、活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞の製造について説明する。

（活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞の製造方法）
本発明の活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞の製造方法は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を準備する工程と、前記T細胞をT細胞受容体を介した刺激が可能な物質等の存在下、培養して活性化する工程と、を備えることができる。本発明の製造方法によれば、活性化したCD8陽性CXCR3陽性T細胞を得ることができ、この活性化したCD8陽性CXCR3陽性T細胞を投与することで、確実で速やかな効果が期待される。

CD8陽性CXCR3陽性T細胞準備工程は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を、既に説明したように、適切な由来の採取源（例えば、ヒト患者等）の適切な部位から採取することによって実施できる。CD8陽性CXCR3陽性T細胞は、既に説明したように、単離・精製されていることが好ましい。

活性化工程は、T細胞受容体を介した刺激を付与可能なT細胞受容体刺激物質を用いる。例えば、かかる物質としてCD8陽性CXCR3陽性T細胞の活性化に利用できる各種の抗原の１種又は２種以上を用いる。こうしたT細胞受容体刺激物質の存在下、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を培養することによって活性化工程を実施できる。活性化工程における培養条件は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を活性化できればよく、リンパ球の培養において当業者に公知の条件から適宜選択し、あるいはこれらを適宜改変択して用いることができる。

CD8陽性CXCR3陽性T細胞を活性化してIL10産生活性を付与するには、IL2の存在下CD8陽性CXCR3陽性T細胞にT細胞受容体を介した刺激を付与することが好ましい。ここで、「抗原」とは、培養細胞上の抗原受容体（例えばＴ細胞受容体）に認識され、該受容体を介して細胞を刺激し得る物質を包括的に意味する。抗原としては、例えばペプチド、タンパク質、脂質、糖脂質等の抗原分子のみならず、免疫学的非自己細胞、抗原受容体の構成分子（CD3、TCRβ、TCRα等）や補刺激分子（CD28等）を認識する作動性抗体（例えば抗ヒトCD3抗体であるOKT-3等）やスーパー抗原などの抗原ミミックを含んでいてもよい。

活性化工程は、得ようとする活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞の抗原に対する特異性に応じて種々の態様で実施できる。例えば、培養に供される上記CD8陽性CXCR3陽性T細胞の集団が有している抗原受容体のレパートリーの多様性を保持し、当該多様性を反映した制御性Ｔ細胞集団を製造しようとする場合には、CD8陽性CXCR3陽性T細胞が、抗原受容体の構成分子（CD3、TCRβ、TCRα等）を認識する作動性抗体（例えば抗ヒトCD3抗体であるOKT-3等）、補刺激分子（CD28等）を認識する作動性抗体（例えば抗ヒトCD28抗体）、スーパー抗原などの抗原ミミックが選択される（Blood, 104, p. 895-903, 2004、Blood, 104, p. 453-61, 2004）。当該抗原ミミックは複数種類を組合せて用いることも可能であり、例えばCD3を認識する作動性抗体と、CD28を認識する作動性抗体との組み合わせ等が用いられ得る。当該抗原ミミックを使用することで、多様性を有する制御性Ｔ細胞集団が得られる。

また、活性化工程は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を特定の抗原の存在下で培養して抗原特異性を有する活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞を取得するようにしてもよい。後述するように特異的に活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞はIL10産生活性に基づき選抜できる。これにより、特定抗原による免疫系の亢進を抑制するのに好ましい活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞集団を得ることができる。

例えば、ある特定の抗原分子（ペプチド、タンパク質、脂質、糖脂質等）に特異的なCD8陽性CXCR3陽性T細胞を製造しようとする場合は、当該抗原分子が選択される。抗原分子としては、例えば、組織適合抗原など細胞及び組織由来抗原、アレルギー疾患の原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原（食品由来抗原、抗原性を示すことが予想される薬剤若しくは製剤中に共存する物質、又は人工臓器関連物質、又はそれらの変性物（例えば熱変性物等））などが挙げられる。組織適合抗原としては主要組織適合抗原（ＭＨＣ抗原）や非主要組織適合抗原が挙げられる。アレルギーの原因物質には環境・花粉抗原、真菌抗原、食物抗原、人工抗原等が含まれ、例えば、環境・花粉抗原としてはダニ、ハウスダスト、スギ花粉、ブタクサ等、真菌抗原としてはカンジダ、アルテルナリア、アスペルギルス、クラドスポリウム、ペニシリウム等、食物抗原としては卵白、牛乳、大豆、小麦粉、ソバ粉、サバ、イワシ、アジ、エビ、カニ、ブタ肉、牛肉、トリ肉等、人工抗原としては薬剤、人工臓器等が挙げられる。また、自己免疫疾患の原因物質としては、疾患の原因となる自己抗体の対応抗原等が挙げられる。

なお、採取源からのCD8陽性CXCR3陽性T細胞の採取に先立って、個体にCD8陽性CXCR3陽性T細胞を形成させる程度に特定の抗原を供給しておき、当該抗原に特異的なCD8陽性CXCR3陽性T細胞を採取しやすい状態にしておいてもよい。こうすることで、将来的に暴露される可能性のある抗原による免疫系の亢進を抑制可能な活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞を採取できる。

このような手法は、臓器移植の拒絶反応抑制に有用である。例えば、臓器移植など、採取源である個体の免疫系が暴露される可能性のある特定の免疫学的非自己細胞又はその一部を予め個体に供給しておくことで、免疫学的非自己細胞に特異的なCD8陽性CXCR3陽性T細胞を当該個体から採取することが可能である。免疫学的非自己細胞は、公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。また、免疫学的非自己細胞の種類は特に限定されず、所望の組織由来の細胞（例えば末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）等）を使用することが可能である。例えば、同種異系のドナーからの移植に先立ち、当該ドナー由来細胞に特異的なレシピエントの制御性Ｔ細胞の製造が意図されている場合にはドナー由来の細胞が選択される。この場合、該ドナー由来の細胞は、移植されうる臓器と同一臓器由来の細胞であっても、異なる組織由来の細胞であってもよい。

抗原提示を確実に達成するには、抗原提示細胞が選択されてもよい。抗原提示細胞としては、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、通常は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞と同種同系の抗原提示細胞（例えば、該T細胞が由来する個体から得られた抗原提示細胞）が用いられる。また、抗原提示細胞の種類は、抗原提示能を有し、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、例えばPBMC、樹状細胞等が用いられる。抗原提示細胞は、自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。

なお、抗原としては、複数種類の抗原を組合せて用いることも可能であり、例えば免疫学的非自己細胞と抗原受容体の構成分子を認識する作動性抗体との組み合わせ（同種異系細胞と抗ＣＤ３抗体との組み合わせ等）を用いることが可能である。

活性化工程によって活性化したCD8陽性CXCR3陽性T細胞をIL10産生活性を指標として選抜する工程を備えることができる。こうすることで、活性化したCD8陽性CXCR3陽性T細胞を選択的に含む高活性なCD8陽性CXCR3陽性T細胞集団を得ることができる。また、特定抗原で活性化した場合には、抗原特異性につき選択的である活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞を含む抗原特異的かつ高活性なCD8陽性CXCR3陽性T細胞集団を得ることができる。IL10産生活性を指標としてCD8陽性CXCR3陽性T細胞を選択するには、セルソーター等などが用いられる。なお、選抜工程は、必要に応じて実施される。

活性化工程後又は選択工程後において、活性化後のCD8陽性CXCR3陽性T細胞を培養して増殖させる工程を備えることができる。増殖工程は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の活性化状態を維持できるよう条件設定されるが、抗原などT細胞受容体刺激物質の非存在下でありかつIL2等の存在下で実施することが好ましい。増殖工程によって活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞を増殖させることができれば、個体の負担を抑制して必要量のCD8陽性CXCR3陽性T細胞を得ることができるため好ましい。また、抗原特異的かつ高活性のCD8陽性CXCR3陽性T細胞集団を増殖させることでより高い免疫調節効果の高い細胞集団を得ることができる。

以上説明したように、活性化工程、さらには必要に応じて選択工程及び／又は増殖工程を実施することで、所望の活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞集団を得ることができる。得られたCD8陽性CXCR3陽性T細胞集団は、IL10産生活性を有し、標的細胞であるCD8陽性CXCR3陰性T細胞の増殖やIFN-γ産生活性を抑制できる。

活性化されたCD8陽性CXCR3陽性T細胞も、活性化前のCD8陽性CXCR3陽性T細胞と同様に単離・精製されていることが好ましい。

（免疫関連障害の予防又は治療剤及びその製造方法並びに免疫関連障害の予防又は治療方法）
本発明の免疫関連障害の予防又は治療剤は、本発明の免疫調節剤、すなわち、CD8陽性CXCR3陽性T細胞（活性化されたものを含む。以下同じ。）を有効成分として含有している。また、本発明の免疫関連障害の予防又は治療方法は、免疫関連障害の予防又は治療を要する個体に、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を投与する工程を備えることができる。

本発明の予防又は治療剤、すなわち、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を免疫関連当該T細胞を免疫関連障害の予防又は治療を要する個体に投与することで、免疫系における当該T細胞量又は比率を増大させて、CD8陽性制御性T細胞の免疫抑制効果等に基づく予防又は治療効果を得ることができる。すなわち、生体内で免疫反応が異常に亢進している場合、生体内で望ましくない免疫反応が起こっている場合、あるいは望ましくない免疫応答が起こることが将来的に予測される場合等に、当該個体にCD8陽性CXCR3陽性細胞を投与することなどにより、異常に亢進した免疫反応を抑制し、望ましくない免疫反応を抑制し、あるいは望ましくない免疫反応を回避することができる。

本発明の予防又は治療剤並びに予防又は治療方法は、免疫抑制がその予防又は治療に有効である障害に有効である。こうした免疫関連障害としては、自己免疫疾患（多発性筋炎、慢性リュウマチ、全身性エリテマトーシス、全身性硬化症、水ほう症、皮膚エリテマトーシス、乾癬症、クローンズ病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、１型糖尿病、再生不良性貧血等）、臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患（花粉症、食品アレルギー、薬剤アレルギー、喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、食物過敏症、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。

例えば、上記各種疾患の予防又は治療として、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を投与しておくことで、上記疾患によりあるいはそれに伴って発生する可能性のある免疫亢進状態を回避又は抑制することができる。

また、上記各種疾患の予防又は治療として、当該患者由来のCD8陽性CXCR3陽性T細胞からこれらの予防又は治療に有効な抗原を用いて刺激して活性化した抗原特異的CD8陽性CXCR3陽性T細胞を投与してもよい。例えば、同種異系のドナーからの臓器移植に先立ち、まず、レシピエントにドナー由来の細胞又はその一部を投与して当該ドナー由来細胞に特異的なCD8陽性CXCR3陽性T細胞を生体内において取得し、こうして得られたT細胞を採取し、必要に応じて活性化し増殖させた後レシピエントに投与することで、移植片に対する免疫寛容を誘導し、移植片に対する拒絶反応を回避し、移植片の生着を促進することができる。

また、例えば、自己免疫疾患の患者において、当該患者由来のCD8陽性CXCR3陽性T細胞を、当該自己免疫疾患の原因抗原の存在下で培養することで、当該原因抗原に特異的に活性化された制御性Ｔ細胞を取得し、このＴ細胞を患者に投与することで、自己免疫反応を抑制することができる。

さらに、アレルギー疾患の患者において、当該患者由来のCD8陽性CXCR3陽性T細胞を、アレルギーの原因抗原の存在下で培養することで、当該原因抗原に特異的なCD8陽性CXCR3陽性T細胞を取得し、このＴ細胞を患者に投与することで、アレルギー反応を抑制することができる。

さらに、例えば、不妊症の患者においては、当該患者由来のCD8陽性CXCR3陽性T細胞を、パートナー由来の細胞の存在下で培養することで、当該パートナー由来細胞（又は抗原）に特異的なCD8陽性CXCR3陽性T細胞を取得し、このＴ細胞を患者に投与することで、パートナー由来細胞（又は抗原）或いは、当該パートナー由来抗原を保持する胎児に対する免疫寛容を誘導し、胎児に対する拒絶反応を回避し、妊娠の維持を促進することができる。

なお、本発明の予防又は治療剤は、当業者に周知の手法に従って、有効量のCD8陽性CXCR3陽性T細胞を準備、当該T細胞と薬学的に許容される担体とを混合する等して、経口／非経口製剤として製造することが出来る。本発明の免疫調節剤は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることが出来る。本発明の免疫調節剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト等の上述の哺乳動物に対して投与することができる。

本発明の予防又は治療剤の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、例えば、ヒト成人の患者（体重６０Ｋｇとして）においては、例えば非経口投与の場合、約１０⁹個程度／日を上限として有効量を投与することができる。

本発明の免疫関連障害の予防又は治療方法の別の態様として、免疫関連障害の予防又は治療を要する個体から、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の少なくとも一部を除去する工程を備えることができる。過剰にCD8陽性CXCR3陽性T細胞を保持したり過剰に活性化したCD8陽性CXCR3陽性T細胞を保持する個体から、こうしたCD8陽性CXCR3陽性T細胞の少なくとも一部を除去することにより、例えば、免疫系の機能を改善又は活性化することができる。例えば、腫瘍に対する免疫応答を強化して腫瘍の予防又は治療が可能となる。

個体から、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を除去するには、抗CXCR3抗体を静脈投与等することによって可能である。例えば、ヒトに対しては、抗ヒトCXCR3抗体を投与するのが有効である。なお、異種動物で作製された抗体を使用する場合には、免疫応答を抑制又はアナフィラキシーを抑制又は回避するために、抗体のFc部分をヒト抗体のFcに置き換えたヒト型抗体を用いることが好ましい。こうした抗体作製は当業者において周知である。

この態様の免疫関連障害としては、免疫活性化が予防又は治療に有効である疾患が挙げられる。このような疾患としては、ガン全般挙げられる。以上のことから、CXCR3抗体は、免疫活性化剤及び免疫活性化が有効な予防又治療に有効な疾患の予防又は治療剤として用いることができる。

（CD8陽性制御性Ｔ細胞の検出又は分離用キット）
本発明のキットは、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を検出又は分離する試薬を含むことができる。本発明のキットによれば、適当な採取源からCD8陽性制御性T細胞を検出又は分離することができる。本発明のキットは、CD8陽性制御性T細胞を分離又は検出するためにCD8及びCXCR3の分子マーカーに対する標識抗体を含むことができる。さらに、活性化したCD8陽性CXCR3陽性T細胞を選抜するためのIL10に対する標識抗体を含むことができる。さらに、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の活性化及び培養のための各種試薬（培地、IL2など）を含むことができる。このような検出又は分離用キットは、個体から採取した末梢血中等のCD8陽性CXCR3陽性T細胞を検出し、当該細胞の含有量や当該細胞の抗原特異性を評価するのに用いることで、個体の免疫系の状態や自己免疫疾患などの免疫関連障害の診断用キットとしても用いることができる。また、このような検出又は分離用キットは、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を免疫関連障害の予防又は治療剤として用いるためのキットとしても用いることができる。

（免疫関連障害の予防又は治療手段のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞に複数の被験条件を付与して各被験条件につき前記T細胞の免疫抑制活性を検出する工程、を備えることができる。このスクリーニング方法によればCD8陽性CXCR3陽性T細胞の免疫抑制活性を増強又は低下する被験条件を選択することができる。被験条件は、例えば、被験化合物をCD8陽性CXCR3陽性T細胞に接触させることであってもよいし、適当な遺伝子のノックアウト及び／又は発現を含む遺伝子改変を伴う遺伝子導入であってもよいし、温度等の環境条件であってもよい。

このスクリーニング方法において、さらに、前記免疫抑制活性を増強する被験条件を、免疫抑制が有効な免疫関連障害の予防又は治療手段として選択する工程を備えることができる。こうしたスクリーニング方法によれば、免疫抑制剤及び本発明の予防又は治療剤の免疫関連障害に有効な予防又は治療手段が提供される。なお、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の免疫抑制活性の増強は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の増加であってもよいし、CD8陽性CXCR3陽性T細胞自体の活性増強であってもよい。

このスクリーニング方法において、さらに、前記免疫抑制活性が低下する被験条件を、免疫活性化が有効な免疫関連障害の予防又は治療手段として選択する工程、を備えることができる。こうしたスクリーニング方法によれば、免疫活性化剤及び免疫活性化が予防又は治療に有効であるガン全般を始めとする各種疾患に有効な予防又は治療手段が提供される。なお、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の免疫抑制活性の低下は、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の減少であってもよいし、CD8陽性CXCR3陽性T細胞自体の活性低下であってもよい。

以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において特に断りのない限り、以下に示す材料及び方法を用いた。

（マウス）
C57BL/６及びBALB/cマウスは、SLC、ジャパンより購入し、各種週令マウスを準備した。CB-17 SCIDマウスは、Cleaジャパンより購入した。
（ヒト単核球画分の調製）
ヒト単核球画分は健常人ボランティアから採取した末梢血をFicoll-Paque Plus（アマーシャムバイオサイエンス）で遠心分離しＰＢＳにて十分に洗浄することにより回収した。
（抗体）
全ての抗体は、商業的に入手した。
（フローサイトメトリー）
分析用途にはFACSキャリバーフローサイトメーター（BDバイオサイエンス）を用い、セルソーティング用途にはFACSヴァンテージセルソーター（BDバイオサイエンス）を用いた。
（磁性ビーズによる細胞精製）
CD8陽性細胞は、磁性マイクロビーズに結合させた抗CD8抗体及びカラム（ミルテニイバイオテック）を用いてそのプロトコールに従い分離した。
（細胞培養）
マウス及びヒト由来のそれぞれの細胞につき、２×１０⁵個の細胞を９６ウェルプレート上の平坦な底部を有する１ウェル内で、１０ng／.mlのIL2を含有する２００μｌの完全培地（RPMI1640＋１０％FCS及び５０μM 2-ME）中で培養した。
（ELISA）
マウス細胞の培養上清中のIL10濃度については、マウスIL10用のELISAキット（R＆Dシステムズ）を用いた。ヒト細胞の培養上清中のIL10濃度については、SRLに依頼した。
（DNAマイクロアレイ）
それぞれ１×１０⁶個のCD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXCR3陰性T細胞は、C57BL/６マウスの脾臓細胞からEFACSヴァンテージセルソーターを用いて回収した。ｍRNAを回収した細胞から抽出し、DNAマイクロアレイ解析は北海道システムサイエンスに依頼した。

（マウスにおけるCD8陽性CXCR3陽性細胞とCD8陽性CD122陽性細胞の発現の比較解析）
マウスにおけるCD8陽性CXCR3陽性T細胞とCD8陽性CD122陽性T細胞との発現プロファイルを比較するために、まず、DNAマイクロアレイを実施した。セルソーティングによりC57BL/6マウスの脾臓からCD8陽性CD122陽性T細胞及びCD8陽性CD122陰性T細胞のそれぞれをおおよそ100万個程度採取し、これらの細胞集団から抽出したmRNAにつきDNAマイクロアレイ解析を行った。

マイクロアレイの結果、１０個以上の遺伝子がCD8陽性CD122陰性T細胞におけるよりもCD8陽性CD122陽性T細胞において２倍以上の発現レベルを示した。なかでも、CXCR3遺伝子がCD8陽性CD122陰性T細胞よりもCD8陽性CD122陽性T細胞において１０倍以上発現していることがわかった。

次いで、マウス抗CXCR3抗体を用いてマウスの脾臓におけるCXCR3（CD183）遺伝子の発現レベルをフローサイトメトリーで分析した。具体的には、脾臓細胞を異なる週令のC57BL/6マウスから採取し、抗CD8抗体及び抗CXCR3抗体で染色し、その後、フローサイトメトリーにより分析した。結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。

図１Ａ及び図１Ｂに示すように、CD8陽性T細胞のうちの一部がCXCR3を発現していることがわかった。また、CXCR3陽性T細胞の割合は、マウスの個体年齢に依存する傾向があることがわかった。すなわち、新生仔マウスはほとんどCD8陽性細胞を有していなかったが、１週令マウスあたりからCD8陽性細胞が現れはじめた。幼若マウスでは、高い割合でCXCR3陽性細胞を含んでいたが、同様の現象は、CD122陽性細胞にも観察されていた。また、マウスの週令によるCXCR3陽性細胞の割合の変動を解析してみると、CD122陽性細胞におけるのと類似のパターン示すこともわかった。

同時に、CD8陽性細胞群におけるCXCR3及びCD122の発現を解析した。具体的には、４週令マウスについて、CD8陽性細胞にゲートされた細胞についてCD122及びCXCR3の発現プロファイル及びCD4陽性細胞にゲートされた細胞についてCD25及びCXCR3の発現プロファイルをフローサイトメトリーにより分析した。結果を図１Ｃに示す。

図１Ｃに示すように、CD122及びCXCR3の双方を発現する明瞭な細胞集団があることがわかった。また、図１Ｃに示すように、CD25及びCXCR3の双方を発現する細胞集団を見出すことはできなかった。以上の結果から、マウスのCD8陽性細胞集団において、CD122及びCXCR3の発現には強い相関関係があることがわかった。一方、マウスのCD4陽性細胞において、CD25及びCXCR3の発現にはなんら相関関係がないことがわかった。

また、CD8陽性細胞をCD44及びCD62L（CD44弱陰性CD62L強陽性、CD44強陽性CD62L弱陽性、CD44強陽性CD62L強陽性）の発現状態に基づき３つの細胞集団に分けて、これらの各集団のCD122及びCXCR3の発現プロファイルを確認した。具体的には、抗CD8抗体でコートしたマグネティックビーズを用いて６週令マウスから回収したCD8陽性細胞を抗CD44抗体、抗CD62L抗体及び抗CD122抗体並びに抗CXCR3抗体で染色した。これらの細胞をフローサイトメトリーで分析して、CD44及びCD62Lの発現パターンで決定される３つの細胞集団（#1:CD44弱陽性CD62L強陽性、#2：CD44強陽性CD62L強陽性、#3:CD44強陽性CD62L弱陽性）におけるCD122及びCXCR3の発現プロファイルを確認した。結果を図１Ｄに示す。

図１Ｄに示すように、CD8陽性CD122陽性T細胞集団（CD44強陽性CD62L強陽性T細胞集団）は、CD122及びCXCR3の双方を発現する細胞を高率で含み、ナイーブT細胞集団（CD44陰性CD62L強陽性T細胞集団）がCD8陽性CXCR3陰性T細胞であることがわかった。さらに、エフェクターメモリー細胞集団（CD44強陽性CD62L弱陽性T細胞集団）は、CXCR3又はCD122を発現する細胞を含むものの、CD44強陽性CD62L強陽性T細胞集団と比べて明確なCD8陽性CXCR3陽性T細胞集団を示すものではなかった。

（マウスCD8陽性CXCR3陽性T細胞の制御性T細胞としてin vivoにおける機能解析）
本実施例では、リンパ球欠損重症複合型免疫不全（SCID）マウスにCD8陽性CXCR3陽性T細胞を伴って又は伴わずにCD8陽性CXCR3陰性T細胞の移植実験を行った。最初に、CD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXCR3陰性T細胞をBALB/cマウスから抗CD8抗体マグネティックビーズ及びセルソーターを用いて回収した。ビーズ処理後であってセルソーティング前のフローサイトメトリー及びセルソーティング後のフローサイトメトリーによる分析結果を図２Ａに示す。

図２Ａに示すように、実験に用いた細胞は、BALB/ｃマウスからセルソーティングにより採取し、純度が確認された。こうして調製されたCD8陽性CXCR3陰性T細胞をCD8陽性CD122陽性T細胞と混合した状態又は混合しない状態で、CB-17 SCIDマウスに移植した。

なお、リンパ球欠損SCIDマウス又はRAG^−/−マウス（データ示さず）にCD8陽性CXCR3陰性T細胞を移植する場合には、このT細胞を受容したマウスは、CD69陽性活性化CD8陽性T細胞及び脾臓における顆粒球の増加を伴って不健康になり、最終的には赤血球生成が抑制される顆粒球優位の造血傾向を示すようになる。このような造血傾向は、CD8陽性CD122陽性制御性T細胞の不足の良好なマーカーになりうる。以上のことから、本実施例では、CD8陽性CXCR3陰性T細胞のCD69発現と脾臓における顆粒球の増大を指標としてT細胞の活性化を測定することとした。

具体的には、３×１０⁵個のCD8陽性CXCR3陰性T細胞のみ、又は１０⁵個のCD8陽性CXCR3陽性T細胞及び３×１０⁵個のCD8陽性CXCR3陰性T細胞との混合物を静脈経由でCB-17 SCIDマウスに移植した。１０週間経過後、脾臓細胞をフローサイトメーターにより分析した。結果を図２Ｂ〜図２Dに示す。

図２Ｂに示すように、CD8陽性CXCR3陰性T細胞のみを受容したSCIDマウスは、CD69陽性活性化CD8陽性T細胞の増加が認められたが、CD8陽性CD122陰性T細胞とCD8陽性CD122陽性T細胞とを受容したマウスでは、このような活性化されたT細胞の増加は認められなかった。図２Ｃに示すように、CD8陽性CXCR3陰性T細胞のみを受容したマウスの脾臓におけるGr-I陽性顆粒球の増加は、双方のT細胞を受容したマウスにおいては観察されなかった。さらに、図２Ｄに示すように、CD8陽性CXCR3陰性T細胞のみを受容したマウスの骨髄においては顆粒球優位でありかつ赤血球生成が抑制された造血状態が認められたが、双方のT細胞を受容したマウスの骨髄においてはこうした状態は改善されていた。

以上の結果から、マウスにおいてはCD122に加えてCXCR3もCD8陽性制御性T細胞のマーカーとして利用できることがわかった。

（マウスCD8陽性CXCR3陽性T細胞の制御性T細胞としてのin vitroでの機能解析）
本実施例では、試験管内におけるマウスのCD8陽性CXCR3陽性T細胞の制御性T細胞の作用を調べた。マウスの脾臓細胞をセルソーティングにかけて、CD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXCR3陰性T細胞をそれぞれ回収した。

それぞれの細胞を、抗マウスCD3抗体+抗マウスCD28抗体コーティングビーズ（Dynabeads MouseCD3/CD28 T Cell Expander）で刺激して培養した。具体的には、CD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXCR3陰性T細胞をC57BL/6マウスからセルソーティングにより回収し、それぞれ抗マウスCD3抗体及び抗マウスCD28抗体でコーティングしたマイクロビーズによる刺激下で培養した。４８時間経過後、まずCD8抗体で染色し、その後、Cytofix/Cytopem（BDバイオサイエンス）を用いて細胞内IL10を検出した。また、同様にして培養して得られた各培養上清のIL10濃度をELISAにより測定した。これらの細胞についてのフローサイトメトリーの結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。また、ELISAによるIL10の測定結果を図３Ｃに示す。

図３Ａ及び図３Ｂに示すように、CD8陽性CXCR3陰性T細胞に比べてより多くのCD8陽性CXCR3陽性T細胞がIL10を産生するようになった。IL10は、CD8陽性CD122陽性制御性T細胞によって産生される最も重要な作用伝達因子である。図３Cに示すように、培養上清についてのELISAにおいても、同様の現象が確認された。

また、先と同様の抗体コーティングビーズを用いて刺激したCD8陽性CXCR3陰性T細胞培養におけるIFN-γ量を測定した。具体的には、セルソーティングによりC57BL/6マウスから採取したCD8陽性CXCR3陰性T細胞をまずCFSEによりラベルし、その後、単独又はCD8陽性CXCR3陽性T細胞と共に培養した。抗CD3抗体及び抗CD28抗体をコートしたマイクロビーズによる刺激下で４８時間培養した後、CFSE細胞（CD8陽性CXCR3陰性T細胞）のIFN-γの産生活性をフローサイトメトリーにより調べた。結果を図３Ｄ及び図３Ｅに示す。また、上記と同様にして細胞培養を行い、CFSE蛍光の減少によって細胞増殖を評価した。結果を図３Ｆに示す。

図３Ｄに示すように、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を伴わないCD8陽性CXCR3陰性T細胞は、IFN-γを産生した。一方、図３Ｅに示すように、このようなIFN-γ産生は、CD8陽性CXCR3陰性T細胞がCD8陽性CXCR3陽性T細胞とともに培養されたときには明らかに抑制され、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の制御活性を呈していた。また、図３Ｆに示すように、CFSE蛍光の減少によって計測されたCD8陽性CXCR3陰性T細胞の増殖状態からは、単独培養時に比較して、CD8陽性CXCR3陽性T細胞と共培養したとき、CD8陽性CXCR3陰性T細胞の増殖が抑制されていることがわかった。すなわち、CD8陽性CXCR3陽性T細胞がCD8陽性CXCR3陰性T細胞に対して増殖抑制能を有していることがわかった。

以上の結果から、CD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXCR3陰性T細胞の関係は、CD8陽性CD122陽性T細胞及びCD8陽性CD122陰性T細胞の関係に極めて類似していることがわかった。

（ヒトCD8陽性CXCR3陽性T細胞の発現解析）
Ficoll重層遠心分離によってヒト末梢血から単核球を分離し、抗ヒトCD8抗体、抗ヒトCXCR3抗体及び抗ヒトCD122抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。

図４Ａに示すように、ヒト末梢血から採取したリンパ球には、明確にCD8陽性CD122陽性T細胞を確認できなかったが、Low-intermediate レベルのCD8陽性T細胞（CD8^dim）中にCD122陽性細胞を見出した。しかしながら、これらのCD8^dimCD122陽性細胞のほとんどがCD3陰性NK様細胞であった（データ示さず）。これに対して、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、CD8強陽性細胞集団中に明らかにCXCR3陽性細胞が観察された。すなわち、CXCR3の発現プロファイルは、ヒト末梢血リンパ球におけるCD122発現プロファイルとは異なっていた。また、マウスCD8陽性細胞集団におけるCD122及びCXCR3の発現に関しては正の相関関係が認められた（実施例１、図１Ｃ）のに対し、ヒトCD8強陽性細胞集団におけるCD122及びCXCR3の発現には何ら相関関係は見出されなかった（図４Ｂ）。

さらに、CD8陽性CXCR3陽性T細胞がセントラルメモリー細胞やエフェクターメモリ細胞と関連があるかとうかを調べるために、ヒト細胞を抗CD45RA抗体及び抗CCR7抗体で染色し、フローサイトメトリーを行った。結果を図４Ｃに示す。

図４Ｃに示すように、CD8陽性CXCR3陽性T細胞はCD8陽性CXCR3陰性T細胞よりは多くのCD45RA陰性メモリー細胞を含んでいるものの、CD8陽性CXCR3陽性T細胞とセントラルメモリー細胞（CD45RA陰性CCR7陽性）やエフェクターメモリー細胞（CD45RA陰性CCR7陰性）とは明らかな相関関係は認めらなかった。

全てのCD8陽性細胞集団におけるCXCR3陽性細胞の比率を、異なる年齢の健常人ボランティアから採取した末梢血リンパ球（単核球）について、CD8及びCXCR3の発現プロファイルをフローサイトメトリーにより分析した。結果を図４Ｄに示す。また、ヒト末梢血リンパ球についての、CD4及びCD25の発現プロファイルをフローサイトメトリーにより分析するとともに、CD4陽性にゲートされた細胞集団についてのCD25及びCXCR3の発現プロファイルをフローサイトメトリーで分析した。結果を図４Ｅに示す。

図４Ｄに示すように、相対的に多くのCD8陽性CXCR3陽性T細胞が若年層と老年層に存在する傾向がある程度示唆された。しかしながら、全CD8陽性細胞におけるCD8陽性CXCR3陽性T細胞の比率の変化は、マウス（実施例１、図１Ａ及び図１Ｂ）におけるほど明確に観察されなかった。また、図４Ｅに示すように、ヒトにおいては、マウスと同様、CD4陽性細胞集団においてCD25及びCXCR3の相関関係は認められなかった。

（ヒトCD8陽性CXCR3陽性T細胞の制御性Ｔ細胞としてのin vitroでの機能解析）
実施例３においては、CD8陽性CXCR3陽性T細胞は、マウスにおいて制御性T細胞として機能した。本実施例では、CD8陽性CXCR3陽性T細胞がヒトにおいても制御性T細胞として機能するかどうかを確認した。

まず、ヒト末梢血単核球画分を分離し、セルソーティングにかけて、CD8陽性CXCR3陽性T細胞及びCD8陽性CXCR3陰性T細胞をそれぞれ回収した。結果を図５Ａに示す。次に、抗ヒトCD3+抗ヒトCD28抗体コーティングビーズ（Dynabeads MouseCD3/CD28 T Cell Expander）の刺激下で、CD8陽性CXCR3陽性T細胞とCD8陽性CXCR3陰性T細胞とをそれぞれ別々に培養し、培養上清のIL10濃度をELISAで測定した。また、培養細胞をまず抗CD8抗体で染色し、その後、細胞内IL10をCytofix/Cytopemを用いて染色し、これらの細胞をフローサイトメトリーで分析した。これらの結果を図５Ｂ並びに図５Ｃ及び図５Ｄに示す。図５Ｂ〜図５Ｄに示すように、CD8陽性CXCR3陽性T細胞はCD8陽性CXCR3陽性T細胞に比較してより多くのIL10を産生していることがわかった。

また、CD8陽性CXCR3陰性T細胞の単独培養及びCD8陽性CXCR3陽性T細胞との共培養につき、CFSE標識細胞（CD8陽性CXCR3陰性T細胞）のIFN-γ産生活性を調べた。具体的には、セルソーティングによりヒト末梢血から採取したCD8陽性CXCR3陰性T細胞をまずCFSEによりラベルし、その後、単独又はCD8陽性CXCR3陽性T細胞と共に培養した。抗CD3抗体及び抗CD28抗体をコートしたマイクロビーズによる刺激下で９６時間培養した後、抗CD8抗体による染色及び抗ヒトIFN-γ抗体による細胞内染色を行い、IFN-γ産生活性をフローサイトメトリーにより評価した。結果を図５Ｅ及び図５Ｆに示す。

図５Ｅ及び図５Ｆに示すように、CD8陽性CXCR3陰性T細胞のみを培養したときにはIFN-γを産生したが、CD8陽性CXCR3陽性T細胞と共培養したときには、明らかにより少量のIFN-γしか産生しなかった。

さらに、CFSE蛍光の減少に基づく細胞増殖についても調べた。結果は、図５Ｇに示すように、単独培養時に比較して、CD8陽性CXCR3陽性T細胞と共培養したとき、CD8陽性CXCR3陰性T細胞の増殖が抑制されていた。すなわち、CD8陽性CXCR3陽性T細胞は、CD8陽性CXCR3陰性T細胞の増殖を抑制する能力があることがわかった。

以上の結果から、ヒトのin vitro実験系において、CD8陽性CXCR3陽性T細胞は制御性T細胞として機能することがわかった。また、ヒトCD8陽性T細胞では発現されないCD122に代わり、CXCR3は、ヒト制御性T細胞のマーカーとして利用できることがわかった。既に、実施例２及び３において示したように、マウス実験系において、CD8陽性CXCR3陽性T細胞がCD8陽性CD122陽性制御性T細胞として実質的に等しいことを示したが、ヒトCD8陽性CXCR3陽性T細胞がマウスCD8陽性CD122陽性制御性T細胞のヒトにおける対応細胞であることがわかった。

（ヒト多発性硬化症（ＭＳ）モデルマウス（EAEマウス）に対するCD8陽性CD122陽性細胞投与の効果）
ヒトMSの動物モデルとしてマウスEAE（実験的自己免疫性脳脊髄炎）がある。本実施例では、以下のプロトコールに従い、ＥＡＥマウスに対してCD8陽性CD122陽性T細胞を投与してその症状の改善について評価した。

（プロトコール）
（１）抗マウスCD122抗体（クローンTM-b1）は、ハイブリドーマ細胞をヌードマウスの腹腔に植え付けて増殖させた後に、腹水を回収し、硫安沈殿をして精製したものを使用した。マウス１匹あたり25mgの抗体を尾静脈より注射した。
（２）EAEの誘導には、メスのB6マウスを使用し、200mgのMOG_35-55ペプチドを4mg/mlの結核菌死菌を含んだ完全フロイントアジュバントとよく混合し、エマルジョン化したものを尾の付け根の皮内に注射（この時をday0とする）し、同日と２日後の２回にわたりPertussis Toxin 200ngを腹腔内に注射することで行った。
（３）EAE症状の評価は、スコア0：症状なし、スコア1：尾または片側の後肢の脱力、スコア２：尾と後肢の脱力、スコア３：後肢の不完全麻痺、スコア４：後肢の完全麻痺、スコア５：マウス死亡、として行った。
（４）CD8⁺CD122⁺細胞もしくはCD8⁺CD122^-細胞の移入には、マウス脾細胞からCD8⁺細胞を抗CD8抗体の結合した磁気ビーズ（ミルテニー社製）を用いて分離回収し、さらにそれを蛍光標識抗CD8抗体と蛍光標識抗CD122抗体で染色したものをセルソーター（BD社製FACSVantage SE）を用いて99％以上の純度で回収し、その細胞をマウスの尾静脈から注射した。プロトコールの概要とB6マウスにMOGペプチドを免疫してEAEを誘導し、症状をスコア化して追跡した結果を図６に示す。

図６に示すように、抗CD122抗体を注射してCD8⁺CD122⁺細胞を除去したマウスにＥＡＥを導入すると、ピークに達した症状が回復せずに重症のまま経過した。これに対して、こうしたマウスに、他の同系マウスから採取したCD8⁺CD122⁺制御性T細胞を移入すると速やかな症状の快復が認められた。CD8⁺CD122⁻制御性T細胞を移入しても症状は回復しなかった。以上のことから、CD8⁺CD122⁺制御性T細胞がEAEの症状快復に必須の役割をしていることがわかった。CD8⁺CD122⁺制御性T細胞は、ヒトのCD8⁺CXCR3⁺制御性T細胞に相当することから、CD8⁺CXCR3⁺制御性T細胞は、ヒトのＭＳの予防又は治療に用いることができることがわかった。

（炎症性腸疾患モデルマウスへに対するCD8陽性CD122陽性T細胞投与の効果）
潰瘍性大腸炎とクローン病を総称して炎症性腸疾患（IBD）というが、これらも免疫応答が関わった自己免疫性疾患の一つである。IBDモデルマウスにもいくつかの種類があるが、よく使われるものとしてリンパ球を欠損するRAGノックアウトマウスにCD4⁺CD45RB⁺細胞を養子移入するという系がある。本実施例では、RAGノックアウトマウスに対してCD8⁺CD122⁺制御性T細胞を投与したときのIBDの症状の変化を観察した。なお、IBDの症状が体重変化に如実に反映されることは、これまでの多くの論文によって証明されている。

（プロトコール）
（１）リンパ球を持たないRAGノックアウトマウス（遺伝的背景はB6）に各種の細胞を移入した後、マウスの体重を暫時計測し、細胞移入前の体重に対する増減を百分率で記録した。
（２）CD4⁺CD45RB⁺細胞、CD4⁺CD45RB^-細胞、CD8⁺CD122⁺細胞、CD8⁺CD122^-細胞はすべてB6マウスの脾細胞から調製した。
（３）第一段階として、抗CD4もしくは抗CD8抗体を結合させた磁気ビーズ（ミルテニー社製）によってCD4⁺細胞もしくはCD8⁺細胞を分離回収し、その後蛍光標識した抗CD4、抗CD45RB、抗CD8、抗CD122抗体で染色して、目的の細胞をセルソーター（BD社製FACSVantage SE）を用いて高純度で分離回収した。
（４）CD4⁺CD45RB⁺細胞はいずれの組み合わせの細胞移入においても4x10⁵個を用い、そこにCD8⁺CD122⁺細胞、CD8⁺CD122^-細胞、CD4⁺CD45RB^-細胞はそれぞれ2x10⁵個を加える形で混ぜ合わせて経静脈的に移入した。
結果を図７に示す。

RAGノックアウトマウスに見られるIBDは、移入したCD4⁺CD45RB⁺細胞がCD4⁺の制御性T細胞（CD4⁺CD25⁺細胞）を含まないために起こってくるものである。CD4⁺CD45RB^-細胞（CD4⁺CD25⁺制御性T細胞を含む）を同時に移入すれば症状（下痢、血便、体重減少）は起こってこない。また、CD4⁺CD45RB^-細胞の代わりに正常マウスから採取したCD8⁺CD122⁺制御性T細胞をCD4⁺CD45RB⁺細胞と同時に移入してもIBD症状は起こってこなかった。この実験結果は、CD8⁺CD122⁺制御性T細胞がIBDの発症抑制に効果的に働くことを示しており、CD8⁺CD122⁺制御性T細胞（ヒトではCD8⁺CXCR3⁺制御性T細胞）がIBDの予防／治療に使えることがわかった。

（CD8⁺CD122⁺制御性T細胞（ヒトCD8⁺CXCR3⁺制御性T細胞）のin vitroでの培養）
ヒト疾患に対する制御性T細胞の有用性を示すには、その制御性T細胞をin vitroで培養増殖させることが必要である。具体的方法としては、末梢血から採取した制御性T細胞を抗CD3抗体などで刺激して活性化状態にし、IL-2添加培地中で培養して増殖させる技術を確立する必要がある。本実施例では、培養増殖させることが簡単なマウスT細胞を用いて実験を行った。

CD8⁺CD122⁺細胞を、セルソーターを用いて純粋に採取し、抗CD3抗体（BDBiocoat、BD社製）で24時間刺激し活性化状態にした。以後は、細胞の維持・増殖にはヒトレコンビナントIL-2（50ng/ml）のみを加えた培地で行い、細胞を100倍以上まで増殖させ得ることがわかった。この増殖させた細胞には、CD8⁺制御性T細胞が抑制作用を発揮するための必須分子であるIL-10を発現することが、培養上清中のIL-10をELISA法（QuantikineマウスIL-10測定キット、R＆D社製を使用）で測定した結果確かめられており、制御性細胞としての機能を保ったままマウスCD8⁺制御性T細胞を培養増殖させることが可能であることがわかった。同様の方法により、ヒトCD8⁺CXCR3⁺制御性T細胞を培養できると考えられる。

Claims

CD8陽性CXCR3陽性T細胞を含有する、免疫調節剤。
前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞はインターロイキン１０の産生活性を有する、請求項１に記載の免疫調節剤。
前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞は霊長類由来である、請求項１又は２に記載の免疫調節剤。
免疫抑制がその予防又は治療に有効である免疫関連障害の予防又は治療用である、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫調節剤。
前記免疫関連障害は自己免疫疾患である、請求項４記載の免疫調節剤。
前記免疫関連障害は臓器移植後の拒絶反応である、請求項４に記載の免疫調節剤。
免疫関連障害の予防又は治療剤であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の免疫調節剤と、
薬学的に許容される担体と、
を含有する、予防又は治療剤。
活性化されたCD8陽性制御性T細胞の製造方法であって、
CD8陽性CXCR3陽性Ｔ細胞を準備する工程と、
前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞を、当該細胞のT細胞受容体を介して刺激する物質の存在下培養する活性化工程と、
を備える、製造方法。
前記活性化工程は、前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞のインターロイキン１０の産生活性を発現させる工程である、請求項８に記載の製造方法。
前記活性化工程は、前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞を特定の抗原の存在下で培養して当該抗原についての特異性を有するCD8陽性CXCR3陽性T細胞を活性化する工程である、請求項８又は９に記載の製造方法。
前記抗原は、自己免疫疾患の原因物質、アレルギー疾患の原因物質及び臓器移植時のドナー由来細胞又はその一部から選択される、請求項１０に記載の製造方法。
さらに、前記活性化したCD8陽性CXCR3陽性T細胞をIL10産生活性を指標として選抜する工程を備える、請求項８〜１１のいずれかに記載の製造方法。
さらに、活性化された前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞を培養して増殖させる工程を備える、請求項８〜１２のいずれかに記載の製造方法。
CD8陽性制御性Ｔ細胞の検出又は分離用キットであって、
CD8陽性CXCR3陽性T細胞を検出又は分離する試薬を含む、キット。
免疫関連障害の予防又は治療用剤の製造方法であって、
CD8陽性CXCR3陽性T細胞を準備する工程と、
前記CD8陽性CXCR3陽性T細胞と薬学的に許容される担体とを混合する工程と、
を備える、製造方法。
免疫関連障害の予防又は治療手段のスクリーニング方法であって、
CD8陽性CXCR3陽性T細胞に１種又は２種以上の被験条件を付与して前記T細胞の免疫抑制活性を検出する工程、
を備える、スクリーニング方法。
さらに、前記１種又は２種以上の被験条件中、前記免疫抑制活性を増強する１種又は２種以上の被験条件を免疫抑制が有効な免疫関連障害の予防又は治療手段として選択する工程を備える、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
さらに、前記１種又は２種以上の被験条件中、前記免疫抑制活性を低下させる１種又は２種以上の被験条件を免疫活性化が有効な免疫関連障害の予防又は治療手段として選択する工程、を備える、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
免疫関連障害の予防又は治療方法であって、
前記免疫関連障害の予防又は治療を要する個体に、CD8陽性CXCR3陽性T細胞を投与する工程、
を備える、方法。
免疫関連障害の予防又は治療方法であって、
前記免疫関連障害の予防又は治療を要する個体から、CD8陽性CXCR3陽性T細胞の少なくとも一部を除去する工程、
を備える、方法。