KR102073901B1 - 항 제3자 중심 기억 ｔ 세포, 이의 제조 방법, 및 이식 및 질환 치료에서의 이의 용도 - Google Patents

항 제3자 중심 기억 ｔ 세포, 이의 제조 방법, 및 이식 및 질환 치료에서의 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102073901B1
KR102073901B1 KR1020147009267A KR20147009267A KR102073901B1 KR 102073901 B1 KR102073901 B1 KR 102073901B1 KR 1020147009267 A KR1020147009267 A KR 1020147009267A KR 20147009267 A KR20147009267 A KR 20147009267A KR 102073901 B1 KR102073901 B1 KR 102073901B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
party
tcm
days
Prior art date
Application number
KR1020147009267A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140092298A (ko
Inventor
예어 레이스너
야키 에이델슈테인
에란 오피르
아사프 라스크
란 아피크
노가 오르-지바
에스더 바샤르-루스티그
Original Assignee
예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드 filed Critical 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Publication of KR20140092298A publication Critical patent/KR20140092298A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102073901B1 publication Critical patent/KR102073901B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/26—Lymph; Lymph nodes; Thymus; Spleen; Splenocytes; Thymocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/38—Stomach; Intestine; Goblet cells; Oral mucosa; Saliva
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/42—Respiratory system, e.g. lungs, bronchi or lung cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/001—Preparations to induce tolerance to non-self, e.g. prior to transplantation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells

Abstract

중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물의 제조 방법으로서, 상기 세포는 관용성-유도성 세포 및/또는 항-질환 활성이 부여된 세포로서 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있는, 방법을 개시한다. 상기 방법은: (a) 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 IL-21의 존재 하에 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계로부터 생성되는 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 배양하여, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포를 증식시키는 단계를 포함한다.

Description

항 제3자 중심 기억 Ｔ 세포, 이의 제조 방법, 및 이식 및 질환 치료에서의 이의 용도{ANTI THIRD PARTY CENTRAL MEMORY T CELLS, METHODS OF PRODUCING SAME AND USE OF SAME IN TRANSPLANTATION AND DISEASE TREATMENT}
본 발명은, 이의 일부 실시 양태에서, 중심 기억 T-림프구 표현형을 가지는, 관용성-유도성 및/또는 이식편대 백혈병 반응성 항-제3자 세포, 보다 특히, 그러나 배제적이지 않게, 이의 제조 방법, 및 이식 및 질환 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
골수(BM) 이식은 혈액 악성 종양 및 기타 혈액 질환을 가진 많은 환자들을 위한 치료법을 제공한다. 그러나, BM 이식물은, 숙주의 항원(Ag)에 반응하여, 다중-기관계 대숙주성이식편병(graft-versus-host disease, GVHD)을 야기하는 공여자의 T 세포를 포함한다. 80년대 초기에, GVHD의 유해한 효과 없이, 동일단배체(haploidentical)의 (3종의 HLA 유전자 좌가 미스매칭됨) 설정에서, 중증 복합형 면역 부전증(severe combined immunodeficiency, SCID) 환자에서, 골수 이식(BMT)이 언급되었다. 이러한 설정에서 대체로 한결같이 치명적인 GVHD의 문제점은, T 세포 제거에 의해 완벽하게 예방되었다.
그러나, 백혈병 환자에서, GVHD 예방의 이득은 현저하게 증가한 이식 거부율에 의해 상쇄되었기 때문에, T 세포가 제거된 BM이 가지는 임상적인 결과는 실망스러웠다. 거부반응은 방사선화학요법에 내성인 숙주로부터 유래되는 T 세포에 의해 매개되는 것으로 나타났다 [Reisner et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1986) 83:4012-4015]. 이러한 문제점을 극복하는 일 방식은, 과-치사 조건화(supra-lethal conditioning)를 행한 후 BMT를 수행하고, 면역억제 약물을 사용하여 숙주의 T 세포의 기능을 불활성화시키는 것이다. 그렇지만, 이러한 방법은, 서서히 진행되는 면역 재구성(immune reconstitution)으로 인한 기회 감염(opportunistic infection), 및 면역억제제가 가지는 상당한 독성으로 인해 주저하게 된다.
고위험군 백혈병 환자에서 이러한 이식-관련 사망률이 허용가능할 수 있지만, 기대 수명이 긴(long life expectancy) 환자에게 적용되는 경우에는 관용적이지 않을 것이다. 따라서, GVHD의 위험률이 저하된 것과 관련이 있는 T-제거 BM (T-depleted BM, TDBM) 이식물을 이식할 수 있게 하면서도 중증도가 낮은 면역 제거(immune ablation)와 더불어, 저하된 강도의 조건화(intensity conditioning)의 사용이 보장되어야 한다. 이러한 저하된 조건화 하에 공여자 유형의 키메라 현상(chimerism)의 구축은, 일반적으로 본래의 공여자의 세포 또는 조직에 대한 영속적인 내성(durable resistance)과 연관이 있기 때문에, 이식 생물학에서 가장 요구되는 목적이다. 온화한 준비단계의 요법에서 살아남는 숙주 면역 세포의 양이 아직까지 많은 것이 공여자 세포의 이식 시 대처하기 어려운 장벽이다.
동종 이계의(allogeneic) TDBM의 거부반응을 극복하기 위한 일 방법은 다량의 세포를 사용하는 것이었다. 설치류 동물에서, "메가용량(megadose)"의 TDBM 이식이 T 세포 매개의 이식 거부반응을 극복할 수 있다고 처음으로 언급되었다 [Lapidot et al., Blood (1989) 73:2025-2032; Bachar-Lustig et al., Nat Med. (1995) 1:1268-1273; Uharek et al., Blood (1992) 79:1612-1621]. 그러나, 인간에서 BM 접종량을 상당량 증가시키는 것은 곤란하였다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, BM으로부터의 조혈모 줄기 세포(HSC, 인간에서 CD34+ 세포)의 이동을 촉진하는 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)가 혈액에서 수집된 HSC의 수율을 증가시키는 데 사용되어 왔으며, T 세포 결실된 HSC가 통상적인 TDBM에 보충되었다 [Aversa et al., N Engl J Med. (1998) 339:1186-1193; Aversa et al., J Clin Oncol. (2005) 23:3447-3454; Reisner and Martelli, Immunol Today (1999) 20:343-347; Handgretinger et al., Bone marrow Transplant. (2001) 27:777-783].
"메가투여량"의 CD34 이식은, 숙주의 세포독성 T-림프구 전구체(CTL-p)에 의해 제시되는 장벽을 극복하는 방식에 관한 흥미로운 의문점들을 제시하였다. 이러한 의문점은, CD34 분획의 세포들이 강력한 비토 활성(veto activity)을 부여받는다는 발견에 의해 부분적으로 해결되었다 [Gur et al., Blood (2005) 105:2585-2593; Gur et al., Blood (2002) 99:4174-4181; Rachamim et al., Transplant (1998) 65:1386-1393]. 다른 세포 유형들 또한, T 림프구 (예를 들어, CD8+ CTL), 자연 살해 세포 및 수지상 세포를 수반하는 비토 활성을 매개하는 것으로 보인다. 여러 가지 세포 유형의 비토 반응성을 직접 비교한 결과, CTL이 가장 강력한 비토 효과를 가지는 것으로 확인되었다 [Reich-Zeliger et al., J Immunol. (2004) 173:6654-6659].
GVH 반응성을 동반하지 않는 비토 CTL을 생성하기 위해 개발된 일 방법은 Reisner와 동료들에 의해 기술되었으며, 이 방법에서 CTL은 외인성 IL-2의 부재 하에 제3자(3rd-party)의 자극물질에 대해 자극되었다. 이러한 방법은, 활성화된 CTLp만이 1차 배양액 내 IL-2의 부족 시에 생존할 수 있었다는 관찰을 토대로 하였다. 이러한 방법은, 항-제3자 비토 CTL로부터 GVN 반응성을 없애는 것으로 시험관 내 및 생체 내에서 확인되었다 [PCT 공개 제WO 2001/049243, Bachar-Lustig et al., Blood. 2003;102:1943-1950; Aviner et al., Hum Immunol. (2005) 66:644-652]. 이들 항-제3자 비토 CTL이 (이식물과 함께) 수여자에게 도입되면, GVHD를 유도하지 않으면서도 이식 거부반응을 예방하였다 (PCT 공개 제WO 2001/049243 호).
이식 거부반응 및/또는 이식편대 숙주 질환을 동반하지 않는 이식을 위한 여러 가지 방법들이 고려되었으며, 이들 중 일부가 하기에 요약된다.
PCT 공개 제WO 2007/023491 호는, 대상에서 비-동계 이식물(non-syngeneic transplant)의 이식 거부반응을 저하 또는 예방하기 위한, 면역관용원성(tolerogenic) 세포의 용도를 개시하고 있다. 상기에서 개시된 면역관용원성 세포 (예, CD4+CD25+ 세포)는 대상 및 이식물 ("제3자" 면역관용원성 세포) 모두와 비-동계성인 공여자로부터 유래될 수 있다. 이식물 (예, 골수)은 대상과 동종 이계이거나 또는 이종성(xenogeneic)인 이식 공여자로부터 유래될 수 있다.
PCT 공개 제WO 2002/102971 호는, 공여자로부터 수여자에게 이식된 이식물에 대한 관용성을 유도하기 위한, 비토 활성이 증강된 조혈모 간세포(HPC) 배양액의 용도를 개시하고 있다. 이러한 개시된 면역관용원성 세포는 바람직하게는 CD33를 발현하며, 이식 (예, 세포 또는 장기 이식) 전에, 동시에, 또는 이후에 투여된다.
PCT 공개 제WO 2002/043651 호는, 질환 치료를 위한 면역 효과기 세포의 비-GVHD 유도 집단의 용도를 개시하고 있다. 면역 효과기 세포의 비-GVHD 유도 집단에 도달하기 위해, 제1 세포군 (예, T-림프구)은, IL-2 고갈(starvation)에 이어 IL-2 보충을 포함하는 조건 하에, 대상와 비-동계이며 제1 세포군 (예, EBV-감염된 B-림프구)과 비-동계인 제2 세포군과 공동-배양된다. 생성되는 면역 효과기 세포는 악성 질환, 바이러스 질환 및 자가면역 질환과 같은 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
미국 특허 제6,759,035 호는 실질 장기(solid organ) 이식물 수여자에서 이식 거부반응을 저해하고 T 세포 관용성을 유도하는 방법을 개시하고 있다. 상기 방법은 공여자와 수여자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제거하는 단계, T 세포 억제 활성을 유도하는 화합물 (예, TGF-β, IL-15 및 IL-2)의 존재 하에 공여자의 세포와 수여자의 세포를 함께 배양하는 단계, 및 수여자의 T 세포가 공여자의 세포를 죽이지 못하도록 방지하기 위해 이식물과 함께 수여자에게 수여자 억제성 T 세포를 투여하여, 이식물의 관용성 및 장기간 생존을 유도하는 단계를 포함한다.
미국 특허 제6,803,036 호는 수여자인 환자에서 이식편대 숙주 질환을 완화하기 위해, 공여자의 세포를 처리하는 방법을 개시하고 있다. 개시된 상기 방법은 공여자로부터 PBMC를 제거하는 단계, 및 T 세포 관용성을 유도하기에 충분한 시간 동안 상기 세포를 억제성 조성물 (예, IL-10, IL-2, IL-4, IL-15 및 TGF-β)로 처리하는 단계를 포함한다. 그런 다음, 상기 세포를 수여자인 환자에게 투입한다. 처리된 세포는 환자에게 투입되기 전, 공여자의 줄기 세포에 첨가될 수 있다.
PCT 공개 제WO 2010/049935 호는 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 비-GVHD 유도성 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물을 개시하고 있으며, 상기 세포는 관용성-유도성 세포이며, 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있다.
추가적인 종래 기술: Ofir Eran et al. [Clinical Haematology (2011) vol. 24 (3): 393-401], Ofir Eran et al. [Blood (2010) vol. 115 (10): 2095-2104], Yang Shicheng et al. [Cancer Immunology, Immunotherapy: CII (2011) vol. 60 (5): 739-749], Markley John C. et al. [Blood (2010), vol. 115 (17): pages 3508-3519] and Albrecht Jana et al. [Cancer Immunology, Immunotherapy: CII (2011), vol. 60 (2): 235-248]을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따라, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가진 항-제3자 세포를 포함하는 세포군의 분리물의 제조 방법을 제공하며, 상기 세포는 관용성-유도성 및/또는 항-질환 활성이 부여된 세포로서 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있으며, 상기 방법은: (a) IL-21의 존재 하에, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화(enrichment)시키는 단계; 및 (b) 무-항원(antigen free) 환경에서 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에, 상기 (a) 단계의 세포를 배양하여, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포가 증식되게 함으로써, 세포군 분리물을 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따라, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가진 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물의 제조 방법을 제공하며, 상기 세포는 관용성-유도성 및/또는 이식편대백혈병(GVL) 활성이 부여된 세포로서 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있으며, 상기 방법은: (a) 비-흡착성(non-adherent) 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CD4+ 및/또는 CD56+ 세포 제거 능력이 있는 제제로 처리하여, CD8+ T 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 CD8+ T 세포를 IL-21의 존재 하에 제3자 수지상 세포와 12시간 내지 5일 동안 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화하는 단계; (c) 상기 (b) 단계로부터 생성되는 세포를 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 제3자 수지상 세포와 12시간 내지 3일 동안 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계로부터 생성되는 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 5일 내지 20일 동안 배양하여, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포를 증식시켜, 상기 세포군 분리물을 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따라, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물의 제조 방법을 제공하며, 상기 세포는 항-질환 활성이 부여되며 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있으며, 상기 방법은: (a) 비-흡착성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CD4+ 및/또는 CD56+ 세포 제거 능력이 있는 제제로 처리하여, CD8+ T 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 CD8+ T 세포를 비-동계의 수지상 세포 IL-21의 존재 하에 12시간 내지 5일 동안 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화하는 단계; (c) 상기 (b) 단계로부터 생성되는 세포를 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 12시간 내지 3일 동안 비-동계의 수지상 세포와 함께 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계로부터 생성되는 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 5일 내지 20일 동안 배양하여, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포를 증식시켜, 상기 세포군 분리물을 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따라, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물을 제공하되, 상기 세포군 분리물 중 50% 이상은 CD3+CD8+ 세포이며, 이 중 50% 이상은 CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+ 특징을 가지며, 또한, 상기 세포는 관용성-유도성 세포 및/또는 항-질환 활성이 부여된 세포로서 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따라, 본 발명에 따라 제조되는, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물을 제공하며, 상기 세포는 관용성-유도성 세포 및/또는 항-질환 활성이 부여된 세포로서 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따라, 치료가 필요한 대상에서 질환을 치료하는 방법을 제공하되, 상기 질환은 악성 질환, 바이러스 질환 및 자가면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 방법은 상기 대상에게 본 발명의 세포군 분리물을 치료적 유효량으로 투여하여, 상기 대상을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따라, 세포 또는 조직 이식이 필요한 대상을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) 세포 또는 조직 이식물을 상기 대상에게 이식하는 단계; 및 (b) 상기 대상에게 본 발명의 세포군 분리물을 치료적 유효량으로 투여하여, 상기 대상을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태의 일 측면에 따라, 미성숙 조혈모 세포 이식이 필요한 대상을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) 미성숙 조혈모 세포를 상기 대상에게 이식하는 단계; 및 (b) 상기 대상에게 본 발명의 세포군 분리물을 치료적 유효량으로 투여하여, 상기 대상을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 (a) 단계 전에 PBMC로부터 비-흡착성 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 (a) 단계 전에 PBMC로부터 CD4+ 및/또는 CD56+ 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 (a) 단계 전에 PBMC로부터 CD45RA+ 및/또는 CD45RO- 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 PBMC는 CD8+ T 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은, (a) 단계 후 (b) 단계 전에, (a) 단계로부터 생성되는 세포를 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 제3자의 항원 또는 항원들과 함께 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 제3자의 항원 또는 항원들은 수지상 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 수지상 세포는 방사선 조사된(irradiated) 수지상 세포이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 제3자의 항원 또는 항원들은, 자가 제시 세포, 비-자가 제시 세포에 의해, 또는 인공 비히클 또는 인공 항원 제시 세포 상에서 제시되는, 제3자 세포, 세포 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 단백질 추출물, 정제된 단백질 및 합성 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 제3자 세포는, 말초 혈액 림프구, 비장 또는 림프절로부터 정제된 세포, 사이토카인-동원된(cytokine-mobilized) PBL, 시험관 내에서 증식된(expanded) 항원-제시 세포(APC), 시험관 내에서 증식된 수지상 세포, 및 인공 항원 제시 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 자극성 세포이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 (a) 단계 후 (b) 단계 전에 PBMC로부터 CD45RA+ 및/또는 CD45RO- 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 CD8+ T 세포는 네이브(naive) CD8+ T 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 수지상 세포는 시험관 내에서 증식된 수지상 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 수지상 세포는 방사선 조사된 수지상 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, IL-21의 존재 하에서의 상기 접촉은 12시간 내지 5일 동안 수행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, IL-21의 존재 하에서의 상기 접촉은 2일 내지 3일 동안 수행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, IL-21의 존재 하에서의 상기 접촉은 3일 동안 수행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 (a) 단계 후 (b) 단계 전에, 활성화된 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 (b) 단계 후 (c) 단계 전에, 활성화된 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 활성화된 세포의 상기 선별은 CD137+ 및/또는 CD25+ 세포의 선별에 의해 수행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 활성화된 세포의 상기 선별은 상기 접촉 후 12시간 내지 72시간째에 수행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 제3자의 항원 또는 항원들과의 배양은 12시간 내지 3일 동안 수행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 기간은 5일 내지 20일이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에서의 배양은 7일 내지 11일 동안 수행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 (b) 단계 후에 동종반응성(alloreactive) 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 (d) 단계 후에 동종반응성 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 동종반응성 세포의 제거는, 중심 기억 T-림프구(Tcm)를 포함하는 세포를 숙주 항원 제시 세포 (APC)와 접촉시킨 후, CD137+ 및/또는 CD25+ 세포의 제거에 의해 수행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 대상과 동계(syngeneic)이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 대상에 대해 비-동계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 비-동계의 PBMC는 대상에 대해, 이종성이거나 동종 이계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, T 중심 기억 표현형을 가지는 상기 항-제3자 세포는 CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+ 특징들을 가진다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포군 분리물 중 50% 이상은 CD3+CD8+ 세포이며, 이 중 50% 이상은 상기 특징들을 가진다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 악성 질환은 백혈병 또는 림프종이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포군 분리물은 상기 대상과 동계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포군 분리물은 상기 대상과 비-동계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 이식 전에, 상기 대상을 아치사(sublethal), 치사 또는 과치사(supralethal) 조건 하에 조건화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식물은 상기 대상과 동계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식물은, HLA가 동일한(HLA identical) 동종 이계의 공여자, HLA가 동일하지 않은(HLA non-identical) 동종 이계의 공여자, 및 이종성 공여자로 이루어진 군으로부터 선택되는 공여자로부터 유래된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식물은 미성숙 조혈모 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식물은 간, 췌장, 비장, 신장, 심장, 폐, 피부, 장, 및 림프/조혈모 조직 또는 장기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식물은 몇몇 장기의 공동-이식을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 공동-이식은 미성숙 조혈모 세포 및 실질 장기의 이식을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 미성숙 조혈모 세포 및 상기 실질 장기는 동일한 공여자로부터 수득된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 미성숙 조혈모 세포는 실질 장기의 이식 전에, 동시에, 또는 이후에 이식된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포군 분리물은 세포 또는 조직 이식물의 이식 전에, 동시에, 또는 이후에 이식된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포군 분리물은 상기 대상과 동계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포군 분리물은 상기 대상과 비-동계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식물 및 상기 세포군 분리물은 동일한 공여자로부터 유래된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식물은 상기 대상과 동계이며, 상기 세포군 분리물은 상기 대상과 비-동계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식물은 상기 대상과 동계이며, 상기 세포군 분리물은 상기 대상과 동계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 세포군 분리물은 미성숙 조혈모 세포의 이식 전에, 동시에, 또는 이후에 투여된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 미성숙 조혈모 세포 및 상기 세포군 분리물은 동일한 공여자로부터 유래된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 공여자는 상기 대상과 비-동계이다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 미성숙 조혈모 세포 및 상기 세포군 분리물은 상기 대상으로부터 유래된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 방법은 상기 이식 전에, 상기 대상을 아치사, 치사 또는 과치사 조건 하에 조건화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 상기 대상은 인간이다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적인 용어 및/또는 과학적인 용어는, 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 당업자에게 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 기술되는 것과 유사하거나 또는 동일한 방법이 물질이 본 발명의 실시 양태를 시행 또는 시험하는 데 사용될 수 있더라도, 예시적인 방법 및/또는 물질들이 후술된다. 상충되는 경우, 정의를 비롯하여 본 발명의 특허 명세서가 조정할 것이다. 또한, 본 발명의 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적일 뿐, 본질적으로 한정하려는 의도가 아니다.
본 발명의 일부 실시 양태들은 본원에서 첨부되는 도면을 참조로 예시로만 공개된다. 이제 도면을 구체적으로 참조하되, 도면에서 제시되는 특정 부분들은 예시이며, 본 발명의 실시 양태를 예시적으로 설명하기 위한 것이다. 이러한 면에서, 도면과 더불어 상세한 설명은 당해 기술분야의 당업자가 본 발명의 실시 양태가 실행될 수 있는 방법에 대해 알 수 있도록 한다.
도면에서:
도 1a 내지 1b는 인간 자가 (도 1a) 이식 설정 및 동종 이계 (도 1b) 이식 설정을 도시하는 개략도이다. 주목할 것은, 2가지 설정은, Tcm 생성에 관여하는, 골수 (BM) 공여자 (숙주 대 동종 이계), 반응물질 (숙주 대 동종 이계) 및 자극물질 (동종 이계 대 숙주의 MHC와 교차-반응하지 않는 제3자)의 기원이 서로 상이하다.
도 2a 내지 2b는 동계 마우스 (도 2a) 및 동종 이계 마우스 (도 2b)의 설정을 도시하는 개략도이다. 주목할 것은, 2가지 설정은, Tcm 생성에 관여하는, BM 공여자 (동계 또는 F1 대 동종 이계), 반응물질 (동계 또는 F1 대 동종 이계) 및 자극물질 (동종 이계 대 제3자)의 기원이 서로 상이하다는 점이다.
도 3a 내지 3b는 Tcm의 생성을 위한 자가 인간 프로토콜 (도 3a)을 동계 마우스 프로토콜 (도 3b)과 비교하여 도시한 개략도이다.
도 4a 내지 4c는 항-제3자 중심 기억 생성의 동역학을 도시한 것이다 ("대조군 실험"). 네이브(naive) CD8 T 세포를, IL-21을 포함하는 배지에서 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후, 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 12.5일까지 증식되었다. 7.5일, 10.5일 및 12.5일에, 세포의 표현형 (표면 마커 발현) (도 4a), 및 FACS 분석을 이용해 CD8 T 세포로부터의 Tcm (CD62L+CD45RO+)의 백분율 (도 4b), 및 트립판 블루 배제법(trypan blue exclusion)에 의해 세포수 (도 4c)를 조사하였다. 각 시점에서, 데이터는 독립적인 실험들의 평균±SE를 나타낸다.
도 5a 내지 5c는 동종 이계의 DC를 이용한 프라이밍(priming)의 역할을 나타내는 전형적인 실험을 도시한 것이다. 주목할 것은, DC 프라이밍의 부재 하에, IL-21 단독 또는 IL-7 + IL-15는 네이브 CD8 T 세포에서 중심 기억 표현형을 유도하지 않으며, 이들의 증식 또한 거의 지지하지 못한다. 도 5a는, IL-21을 포함하는 배지에서 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시킨 네이브 CD8 T 세포를 예시한 것이다. 그 후, 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 13일까지 증식시켰으며 ("대조군" d(0-3) IL21+DC d(3-13)IL7+IL15); 도 5b 내지 5c는 각각 10일 또는 13일까지 자극의 부재 하에, IL-21과 함께 배양된 네이브 CD8 T 세포 (도 5b), 또는 IL-7과 IL-15의 조합과 함께 배양된 네이브 CD8 T 세포 (도 5c)를 예시한 것이다.
도 6a 내지 6b는, Tcm 수준 및 폴드 증식(fold expansion)에 미치는 상대적인 영향의 평균(average relative impact)에 의해 제시되는, 동종 이계의 DC를 사용한 프라이밍의 역할을 대조군과 비교하여 도시한 것이다. 네이브 CD8 T 세포는 IL-21을 포함하는 배지에서 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후, 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 13일까지 증식되었다 ("대조군" d(0-3) IL21+DC d(3-13)IL7+IL15). 다르게는, 네이브 CD8 T 세포는 13일까지 자극의 부재 하에, IL-21, 또는 IL-7과 IL-15의 조합과 함께 배양하였다. 상기 세포는, 트립판 블루 배제법에 의해 세포수 (도 6a), 및 FACS 분석을 이용해 CD8 T 세포로부터의 Tcm (CD62L+CD45RO+)의 백분율 (도 6b)을 조사하였다. 각 시점에서, 데이터는 독립적인 실험들의 평균±SE를 나타낸다.
도 7a 내지 7c는 항-제3자 Tcm의 프라이밍기(priming phase) 및 증식기(expansion phase)에서, IL-21의 역할을 나타내는 전형적인 실험을 도시한 것이다. 주목할 것은, 프라이밍기에서 IL-21이 생략됨으로 인해 증식 및 Tcm 유도가 모두 감소하였으며, 한편 배양 전기간 동안에 IL-21이 존재함으로 인해 Tcm 유도가 증가하였다는 점이다. 도 7a는 IL-21을 포함하는 배지에서 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시킨 네이브 CD8 T 세포를 예시한 것이다. 그 후, 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 13일까지 증식되었으며 ("대조군" d(0-3) IL21+DC d(3-13)IL7+IL15); 도 7b 내지 7c는 IL-21의 부재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시킨 네이브 CD8 T 세포를 예시한 것이다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 13일까지 증식시키거나 (도 7b), 또는 프라이밍기 (IL-21 단독) 및 증식기 (IL-7 + IL-15과 병용) 모두에서 IL-21의 지속적인 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 자극시켰다 (도 7c).
도 8a 내지 8b는 최적의 Tcm 수율 (몇 번의 독립적인 실험들의 평균)을 위한 IL-21의 요건을 도시한 것이다. 네이브 CD8 T 세포를 상기와 같이 처리하였으며, 배양액은 트립판 블루 배제법에 의한 세포수에 의한 세포수 (도 8a), 및 FACS 분석을 사용해 CD8 T 세포로부터의 Tcm (CD62L+CD45RO+) 백분율 (도 8b)을 조사하였다. 각 실험의 결과는 별도로 나타내며, 선(line)은 n번의 실험에 대한 평균적인 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 9b는 Tcm 표현형 및 로우버스트 증식(robust expansion)의 유도를 위한 최적의 반응물질/DC 비율을 도시한 것이다. 4 x 105개의 네이브 CD8 T 세포를 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC를 사용하여 그 수를 늘리면서 3일 동안 자극시켰다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 13일까지 증식시켰다 ("대조군" d(0-3) IL21+100,00 DC d(3-13) IL7+IL15). 배양액은 트립판 블루 배제법에 의한 세포수 (도 9a), 및 FACS 분석을 사용해 CD8 T 세포로부터의 Tcm (CD62L+CD45RO+) 백분율 (도 9b)을 조사하였다. 각 실험의 결과는 별도로 나타내며, 선은 n번의 실험에 대한 평균적인 결과를 나타낸다.
도 10은 CD8+ T 세포 및 네이브 CD8+CD45RA+ T 세포의 농화(enrichment)에 대한 서로 다른 GMP 등급 시약의 효과를 평가한 것이다. 공여자 PBMC는, 구체적으로는 흡착성의 골수 세포를 제거하도록 설계된 플레이트에서 밤새 인큐베이션함으로써 흡착성 세포로부터 거둬냈으며 (상부 패널), 0일째에, 비-흡착성 세포를 4개의 시험군으로 나누었고, 각각은 서로 다른 자기 소팅(magnetic sorting) 프로토콜로 처리하였다. 상기 세포는 세포의 조성, 및 FACS 분석에 의해 Tcm 표현형에 대해 조사하였다. 좌측 컬럼 (CD45RO 및 CD45RA)의 결과를 CD3+CD8+ 세포 상에서 게이팅한다. 결과들은 2번의 독립적으로 수행된 실험들로부터의 전형적인 실험을 나타낸다.
도 11은 제3자 DC로 자극시킨 후 7일째에, Tcm 표현형을 가진 CD8+ T 세포의 비율 및 NK 세포와 NKT 세포로 인한 오염에 대한, CD8 T 세포의 분리에 사용되는 서로 다른 GMP 등급 시약의 영향을 보여주는 전형적인 실험을 도시한 것이다. IL-7 단독을 포함하는 배지에서 배양한 비-자극된 세포 (상부 패널)를 대조군으로 사용하였다. 최좌측 컬럼 (CD45RO 및 CD45RA) 및 최우측 컬럼 (CD62L 및 CD45RO)의 결과를 CD3+CD8+ 세포 상에서 게이팅한다.
도 12는 제3자 DC로 자극시킨 후 14일째에, Tcm 표현형을 가진 CD8+ T 세포의 비율, 및 NK 세포와 NKT 세포로 인한 오염에 대한, CD8 T 세포의 분리에 사용되는 서로 다른 GMP 등급 시약의 영향을 보여주는 전형적인 실험을 도시한 것이다. IL-7 단독을 포함하는 배지에서 배양한 비-자극된 세포 (상부 패널)를 대조군으로 사용하였다. 최좌측 컬럼 (CD45RO 및 CD45RA) 및 최우측 컬럼 (CD62L 및 CD45RO)의 결과를 CD3+CD8+ 세포 상에서 게이팅한다.
도 13a 내지 13b는 제3자 DC로 자극시킨 후 7일째에, Tcm 표현형을 가진 CD8 T 세포의 수준에 대한, CD8 T 세포의 분리에 사용되는 서로 다른 GMP 등급 시약의 영향을 도시한 것이다. CD3+CD8+ NKT- T 세포 (도 13a) 및 Tcm (도 13b)의 평균 백분율은, 모두 4개의 시약 (CD4/CD56/CD19/CD45RA)을 사용하는 최적의 대조군에서 수득되는 수준에 대한 백분율로 나타낸다.
도 14a 내지 14c는 제3자 DC로 자극된 후 10일째에, Tcm 표현형을 가진 CD8 T 세포의 최종 수율에 대한, CD8 T 세포의 분리에 사용되는 서로 다른 GMP 등급 시약의 영향을 도시한 것이다. 10일째에 0일로부터의 평균 폴드 증식 (도 14a), 및 자기 소팅 후의 평균 수율 (도 14b)은, 모두 4개의 시약 (CD4/CD56/CD19/CD45RA)을 사용하는 최적의 대조군에서 수득되는 수준에 대한 백분율로 나타낸다. 10일째의 Tcm의 수율 (도 14c)은, 자기 소팅 후의 수율 (0일째)을 0일로부터의 폴드 증식 (10일째)으로 곱하여 계산하였다.
도 15는 동종 이계의 DC 자극물질의 소스를 바꾸는 것이 Tcm 세포의 증식 퍼텐셜(expansion potential)에 대해 최소한의 효과만을 가졌음을 도시한 것이다. CD8 T 세포는 CliniMacs 시스템을 사용하여 CD4+ 및 CD56+ 세포의 제거에 의해, 해동 백혈구분리반출법(thawed leukapheresis)으로부터 농화시켰다. 그런 다음, 농화된 CD8 T 세포를 2개의 시험군으로 나누었으며, 각각은 IL-21을 포함하는 배지가 든 배양 백(culture bag)에서 서로 다른 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC로 6:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후, 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7, IL-15 및 IL-21을 포함하는 배지에서 11일까지 증식시켰다. 배양한 지 5일, 7일, 9일 및 11일째에, 세포수를 트립판 블루 배제법으로 측정하였다.
도 16a 내지 16b는, 동종 이계의 DC 자극물질의 소스를 바꾸는 것이 세포 조성에 최소한의 효과만을 가졌음을 도시한 것이다. CD8 T 세포는 대규모 분리용의 CliniMacs 시스템을 사용하여 CD4+ 및 CD56+ 세포의 제거에 의해, 해동 백혈구분리반출법으로부터 농화시켰다. 그런 다음, 농화된 CD8 T 세포를 2개의 시험군으로 나누었으며, 각각은 IL-21을 포함하는 배지가 든 배양 백에서 서로 다른 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC (각각 도 16a 및 16b)로 6:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후, 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7, IL-15 및 IL-21을 포함하는 배지에서 11일까지 증식시켰다. 배양한 지 0일, 5일, 9일 및 12일째에, 세포는 FACS 분석에 의해 세포 조성을 조사하였다. 모든 결과들은 림포게이트(lymphogate) 및 라이브 게이트(live gate) (7AAD-)로부터 게이팅하였다.
도 17a 내지 17b는, 동종 이계의 DC 자극물질의 소스를 바꾸는 것이 세포 조성에 최소한의 효과만을 가졌음을 도시한 것이다. CD8 T 세포는 CliniMacs 시스템을 사용하여 CD4+ 및 CD56+ 세포의 제거에 의해, 해동 백혈구분리반출법으로부터 농화시켰다. 그런 다음, 농화된 CD8 T 세포를 2개의 시험군으로 나누었으며, 각각은 IL-21을 포함하는 배지가 든 배양 백에서 서로 다른 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC로 6:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후, 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7, IL-15 및 IL-21을 포함하는 배지에서 11일까지 증식시켰다. 배양한 지 0일, 5일, 9일 및 12일째에, 세포는 FACS 분석에 의해 Tcm 표현형 (CD45RO+CD62L+) 조성을 조사하였다. 모든 결과들은 림포게이트 및 라이브 게이트 (7AAD-) 및 CD8 T 세포 (CD3+CD8+CD56-CD16-)로부터 게이팅하였다.
도 17c은 B-세포 림프종 및 혈장 세포 백혈병 세포주를 이용하여 혼합된 림프구 반응(mixed lymphocytes reaction, MLR) 처리를 한 지 22시간째에 세포자멸사하는 세포의 백분율을 도시한 것이다. CalceinAM 예비-표지된(pre-labeled) Daudi, H.My2 C1R HLA A2 K66A 돌연변이체 또는 L363 세포주를 5-배의 과량의 항-제3자 Tcm과 함께 또는 없이 22시간 동안 인큐베이션하였다. Annexin V+ 세포는 FACS로 측정하였다. 데이터는 5회 중복 배양한 값들의 평균±SD로서 표시한다. ***p<0.001 값은, Tcm의 부재 하에 배양된 샘플과 비교해 통계적으로 유의한 변화를 나타낸다.
도 18은, 자기 비드 소팅을 이용해 비-CD8 T 세포 (즉, CD4+ T 세포, γ/δ T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 및 적혈구)를 광범위하게 제거함으로써, 이식편대 백혈병 (GVL) 분석법을 수행하기 전 14일째에 CD8 T 세포의 농화를 보여주는 전형적인 실험을 도시한 것이다.
도 19a 내지 19d는, 세포 살해 시 방출되는 중요한 염료인 CalceinAM으로 표지하고, 항-제3자 Tcm 세포에 대해 1:5의 비율로 항-제3자 Tcm 세포와 함께 또는 없이 22시간 동안 인큐베이션한 H.My C1R ("Neo") 및 H.My C1R HLA A2 K66A 돌연변이체 형질감염체 ("K66A") B-세포 림프아세포 세포주를 도시한 것이다. 22시간 후, 상기 세포를 회수하고, Calcein+로 염색된 세포 중 생존한 세포의 수를 측정함으로써 생존율을 분석하고, FACS에 의해 calcein+ 세포군으로부터 AnnexinV+ 세포에 의해 세포자멸사를 분석하였다. 도 19a 내지 19b 및 도 19c 내지 19d는 각각 2가지의 독립적인 실험을 나타내며; 도 19a 및 19c는 세포 살해를 보여주는 한편, 도 19b 및 19d는 세포자멸사를 보여준다.
B 림프아세포주 세포 살해의 백분율은 하기 식으로 계산하였다:
Figure 112014033479498-pct00001

음의 값은 Tcm의 존재 하에 증식되는 B-세포 림프아세포 세포주를 의미한다.
특이적인 세포자멸사를 수행하는 B 림프아세포주 세포의 백분율은 하기 식으로 계산하였다: = (시험 웰 내 Calcein+AnnexinV+ B 림프아세포주 세포의 %) - (대조군 웰 내 Calcein+AnnexinV+ B 림프아세포주 세포의 %).
도 20은 K66A 살해의 수준에 대한, CD8 T 세포 분리에 사용되는 서로 다른 GMP 등급 시약의 영향을 도시한 것이다. H.My C1R HLA A2 K66A 돌연변이체 형질감염체 세포주는, 항-제3자 Tcm 세포에 대해 1:5의 비율로 항-제3자 Tcm 세포와 함께 또는 없이 22시간 동안 인큐베이션하였다. 22시간 후, 세포를 회수하고, 생존한 Calcein+ 염색된 세포의 수를 FACS (2개의 독립적인 실험들의 평균)로 측정함으로써 생존율을 분석하였다. H.My C1R HLA A2 K66A 돌연변이체 세포의 살해의 평균 백분율은, 4개의 시약 (CD4/CD56/CD19/CD45RA)을 모두 사용하여 분리한 최적의 대조군에 의해 수득되는 수준에 대한 백분율로서 표시한다.
도 21 내지 도 22는 자가 (도 21) 이식 및 동종 이계 (도 22) 이식에서 Tcm 생성을 위한 프로토콜을 도시하는 도식이다.
도 23a 내지 도 23d는 동종 이계의 제3자 단핵구-유래의 성숙 DC에 의해 자극된 CD8 T 세포에서 Tcm 표현형의 유도에 대한, 사이토카인의 첨가 시기의 역할을 나타내는 전형적인 실험을 도시한 것이다. 도 23a는 IL-21을 포함하는 배지에서 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시킨 네이브 CD8 T 세포를 예시한 것이다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 13일까지 증식시켰으며 ("대조군" d(0-3) IL21+DC d(3-13)IL7+IL15); 도 23b는 IL-21을 포함하는 배지에서 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 7일 동안 자극한 네이브 CD8 T 세포를 예시한 것이다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 13일까지 증식시켰으며; 도 23c는 프라이밍기 (IL21 단독) 및 증식기 (IL-15과 병용)에서 IL-21의 지속적인 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 자극시킨 CD8 T 세포를 예시한 것이며; 도 23d는 사이토카인 결핍 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 7일 동안 자극시킨 CD8 T 세포를 예시한 것이다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, 13일까지 IL-15 단독 하에 증식시켰다.
도 24a 내지 24b는 인간 동종 이계 모델에서 사이토카인의 첨가 시기의 역할을 도시한 것으로; 실험의 요약을 제시하고 있다. 네이브 CD8 T 세포는 IL-21을 포함하는 배지에서 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 13일까지 증식시켰다 ("대조군" d(0-3) IL21 → d(3-13)IL7+IL15). 다른 군들은 그래프 아래에 표시한 대로 처리하였다. 배양액은, 트립판 블루 배제법에 의해 세포수 (도 24a), 및 FACS 분석에 의해 CD8 T 세포로부터의 Tcm (CD62L+CD45RO+)의 백분율 (도 24b)을 조사하였다. 각 시점에서 데이터는 지시된 수 (n)의 독립적인 실험들의 평균±SE이다.
도 25는 CD137+ 세포의 양성 선별에 의한 항-제3자 특이적 CD8 T 세포의 농화를 도시한 것이다. 네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC (5.7:1의 비율로)로 자극시켰다. 활성화 후 14시간째에, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 양성 선별하였다. CD8 T 세포 상에서의 CD137의 발현은 FACS로 조사하였다.
도 26은 CD137+ 세포의 양성 선별에 의한 항-제3자 특이적 CD8 T 세포의 농화가 Tcm 표현형의 획득을 감소시키지 않음을 도시한 것이다. 네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 10일까지 증식시켰다 ("대조군"). 다르게는, 네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 5.7:1의 비율로 자극시켰다. 활성화 후 14시간째에, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 양성 선별하였다. CD137+ 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일까지 재-자극시켰다. 그 후 상기 세포는 IL-7 및 IL-15과 함께 10일까지 증식시켰다. 세포는 FACS 분석에 의해 CD8 T 세포로부터의 Tcm (CD62L+CD45RO+)의 백분율을 조사하였다.
도 27은 증식 동역학의 비교를 도시한 것이다. 네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 14일까지 증식시켰다 ("대조군"). 다르게는, 네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 5.7:1의 비율로 자극시켰다. 활성화 후 14시간째에, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 양성 선별하였다. CD137+ 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일까지 재-자극시켰다. 그 후 상기 세포를 IL-7 및 IL-15과 함께 10일까지 증식시켰다. 10일째에, 세포를 2개의 시험군으로 나누었다. 제1 군에서, 세포는 IL-7 및 IL-15 하에 14일까지 계속 증식하였으며 ("항 제3자 CD137+"), 한편 제2 시험군의 세포는 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 방사선 조사된 숙주 PBMC와 (1:2의 비율로) 활성화되었다. 24시간 후, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 양성 선별하였다. CD137 제거된 세포를 IL-7 및 IL-15과 함께 재-평판배양하고, 14일까지 배양하였다 ("항 제3자 CD137+ 및 항 숙주 CD137-"). 지시된 날짜에, 세포를 트립판 블루 배제법으로 계수하였다.
도 28은 방사선 조사된 숙주 PBMC로 활성화된 후, CD137+ 세포의 제거에 의한 항-숙주 특이적 클론의 제거를 도시한 것이다. 배양 10일째, 항-제3자 특이적 클론의 양성 선별 후 9일째에, 세포를 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 방사선 조사된 숙주 PBMC (숙주 PBMC에 대해 1:2의 비율로)로 활성화시켰다. 24시간 후, 세포에서 CD137+ 세포를 제거하였다. CD8 T 세포 상에서의 CD137의 발현을 FACS 분석으로 조사하였다.
도 29는, CD8 T 세포의 항원 특이적 활성화로 항-숙주 클론을 성공적으로 제거하고 제3자 항원에 특이적인 세포의 백분율을 증가시킨 후, CD137 상향조절을 토대로 하는 2단계 자기 소팅 기술을 도시한 것이다. 네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 14일까지 증식시켰다 ("대조군"). 다르게는, 네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 5.7:1의 비율로 자극시켰다. 활성화 후 14시간째에, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 양성 선별하였다. CD137+ 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일까지 재-자극시켰다. 그 후 상기 세포를 IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 10일까지 증식시켰다. 10일째에, 세포를 2개의 시험군으로 나누었다. 제1 군에서, 세포는 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 14일째까지 계속 증식하였으며 ("항 제3자 CD137+"), 한편 제2 시험군의 세포는 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 방사선 조사된 숙주 PBMC로 (1:2의 비율로) 활성화시켰다. 24시간 후, CD137+ 세포를 자기 소팅으로 제거하였다. CD137 제거된 세포는 IL-7 및 IL-15와 함께 재-평판배양하고, 14일째까지 배양하였다 ("항 제3자 CD137+ 및 항 숙주 CD137-"). 14일째에, 항 제3자 및 항-숙주 동종반응성은 제3자 또는 방사선 조사된 숙주 PBMC에 대한 CFSE 분석법으로 조사하였다. CFSE 분석법의 경우, 1 x 106개의 CFSE+ 반응물질은 IL-7의 존재 하에 2 x 106개의 방사선 조사된 (20 gy) PBMC 자극물질과 함께 또는 없이 84시간 동안 인큐베이션하였다. 84시간 후, 세포를 회수하고, CFSE 저 염색 CD8 T 세포 (CD3+CD8+CD56-)의 수를 FACS로 측정함으로써 세포 분열을 분석하였다. 세포의 절대값을 수득하기 위해, 샘플을 일정 부피에 현탁하고, 각 샘플의 유세포분석 계수를 일정한 예정된 기간 동안 수득하였다. 특이적인 분열중인 세포의 수 = (APC의 존재 하에 분열중인 세포의 수) - (APC의 부재 하에 분열중인 세포의 수). 음의 값은, 숙주 PBMC를 이용한 활성화에 반응하여 분열중인 세포의 수가 활성화를 동반하지 않은 채 분열중인 세포의 수보다 훨씬 더 낮음을 의미한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명은 중심 기억 T-림프구 표현형을 가지는 관용성-유도성 및/또는 이식편대 백혈병 반응성 항-제3자 세포, 보다 특히, 그러나 배제적이지 않게, 이의 생성 방법, 및 이식 및 질환 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 원리 및 조작은 도면 및 첨부하는 상세한 설명을 참조로 보다 잘 이해할 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시 양태를 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명은 이의 적용이 본질적으로 하기 상세한 설명에 나타나거나 또는 실시예에 의해 예시되는 세부사항으로 한정되지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 기타 실시 양태를 수행할 수 있거나 또는 여러 가지 방식으로 시행 또는 실시할 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 어법 및 용어는 설명을 위한 것이며 한정하는 것으로 간주해서는 안됨을 이해해야 한다.
본 발명을 실시하는 동안, 본 발명자들은 이식 후 림프절로 회귀하여 이식편대 숙주 (GVH) 반응 없이 관용성 및 항-질환 활성 (예, 이식편대 백혈병 (GVL) 활성)을 유도하는, 개선된 항-제3자 중심 기억 T (Tcm) 세포군을 발견하였다.
이하 후속하는 실시예 부문에서 나타내는 바와 같이, 본 발명자들은 동종 이계 및 자가 적용을 위한 Tcm 세포를 생성하는 새로운 방법을 제공하였다. 도 1a 및 21에 나타낸 바와 같이, 항-질환 활성 (예, 항-종양 활성)이 부여된 자가 Tcm 세포는, 먼저 IL-21의 존재 하에 CD8+ T 세포를 동종 이계의 자극물질 (예, 수지상 세포)에 3일 동안 노출시킨 후, 이어서 1일 내지 2일 동안 IL-15 및 IL-7를 항원성 자극물질과 함께 상기 세포에 첨가함으로써 생성하였다. 다음, 생성되는 세포는 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 6일 내지 8일 더 배양하였다.
도 1b 및 22에 도시하는 바와 같이, 관용성-유도 세포이며 GVL 활성이 부여된 동종 이계의 Tcm 세포는, 먼저 IL-21의 존재 하에 CD8+ T 세포를 제3자의 자극물질 (예, 수지상 세포)에 3일 동안 노출시켰다. 배양 시작 후 약 14시간째에, 활성화된 세포를 CD137+의 양성 선별로 선별하였으며, 이들 세포를 IL-21과 함께 재-배양하였다. 이어서, IL-15 및 IL-7을 항원성 자극물질과 함께 IL-21 배양액에 1일 내지 2일 동안 첨가하였다. 다음, 생성되는 세포는 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 6일 내지 8일 더 배양하였다. 배양 종료 시, Tcm 세포는, 상기 Tcm 세포를 숙주형 항원 제시 세포 (예, 수지상 세포)와 접촉시킨 후 CD137+ 세포의 제거에 의해, 동종반응성 세포로부터 제거되었다.
본 발명자들에 의해 생성되는 세포는 50% 초과의 CD3+CD8+ 세포로 이루어졌으며, 이 중 50% 초과가 Tcm 세포 (즉, CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+ 특징을 가지며, 하기 실시예 부문의 실시예 1을 참조)이며, TCR 독립적인 항-백혈병 활성을 가졌다 (실시예 2 참조).
종합하면, 이들 결과는 이식 촉진 세포로서와, 동종 이계의 이식 (예, 조혈모 줄기 세포 이식 또는 실질 장기 이식)이 보장되는 상황에서 질환 치료를 위한, 항-제3자 Tcm 세포의 용도를 입증한다. 더욱이, 이들 결과는 혈액 악성 종양과 같이 자가 이식이 필요한 상황에서의 질환 치료를 위한 항-제3자 Tcm 세포의 용도를 입증한다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 따라, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 비-GVHD 유도성 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물을 제공하며, 상기 세포는 관용성-유도성 세포이며 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있다.
본원에서 "세포군 분리물"이라는 문구는 본래의 환경 (예를 들어, 인체)으로부터 분리된 세포를 지칭한다.
본원에서, 용어 "비-GVHD"는 이식편대 숙주 유도성 반응성이 실질적으로 저하되었거나 또는 존재하지 않음을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 세포는 이식 후 100일째에, 이식된 대상의 생존율, 체중 및 전반적인 외양으로 확인되는 바와 같이 이식편대 숙주 질환(GVHD)을 유의하게 유발하지 않도록 생성된다.
본원에서, 용어 "동계"는 대상과 본질적으로 유전적으로 동일한 개체로부터 유래되는 세포 또는 조직을 지칭한다. 전형적으로, 본질적으로 완전히 동계 교배한 포유류, 포유류 클론, 또는 동형접합성 쌍둥이 포유류가 동계이다.
동계 세포 또는 조직의 예로는, 상기 대상, 상기 대상의 클론, 또는 상기 대상의 동형접합성 쌍둥이로부터 유래되는 세포 또는 조직을 지칭한다 (당해 기술분야에서 "자가"로 지칭되기도 함).
본원에서, 용어 "비-동계"는 대상의 림프구와 동종 이계 또는 이종성인 개체로부터 유래되는 세포 또는 조직을 지칭한다.
본원에서, 용어 "동종 이계"는 대상과 동일한 종(species)으로부터 유래되지만 상기 대상과 실질적으로 비-클론성인 세포 또는 조직을 지칭한다. 전형적으로, 동일한 종의 이계 교배된, 비-접합성 쌍둥이 포유류는 서로 동종 이계이다. 동종 이계의 공여자는 상기 대상에 대해 HLA가 동일하거나 또는 HLA가 동일하지 않음을 알게 될 것이다.
본원에서, 용어 "이종"은 대상의 림프구의 실질적인 비율의 종에 대해 서로 다른 종의 항원을 실질적으로 발현하는 세포 또는 조직을 지칭한다. 전형적으로, 서로 다른 종의 이계 교배된 포유류는 서로 이종성이다.
본 발명은, 이종성 세포 또는 조직이 소과 (예를 들어, 암소), 말과 (예를 들어, 말), 돼지과 (예, 돼지), 오비드과(ovid) (예를 들어, 염소, 양), 고양이과 (예를 들어, 펠리스 도메스티카(Felis domestica)), 개과 (예를 들어, 캐니스 도메스티카(Canis domestica)), 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 게르빌루스쥐(gerbil), 햄스터) 또는 영장류 (예를 들어, 침팬지, 붉은털 원숭이, 짧은꼬리 원숭이, 마모셋)와 같은 다양한 종으로부터 유래되는 것으로 파악한다.
이종성 기원 (예, 돼지과 기원)의 세포 또는 조직은 바람직하게는, 돼지과 내인성 레트로바이러스와 같은 인축공통전염병(zoonoses)에 걸리지 않는 것으로 알려진 소스로부터 수득된다. 유사하게는, 인간-유래의 세포 또는 조직은 바람직하게는 실질적으로 무-병원체 소스로부터 수득될 수 있다.
본원에서, 문구 "항-제3자 세포"는 제3자의 항원 또는 항원들에 대한 (예, T 세포 인지에 의한) 림프구 (예, T 림프구)를 지칭한다.
본원에서, 문구 "제3자의 항원 또는 항원들"은, 후술하는 바와 같이 공여자 또는 수여자에게 존재하지 않는 가용성 또는 비-가용성인 (예컨대, 막에 결합된) 항원 또는 항원들을 지칭한다.
예를 들어, 제3자의 항원은 제3자 세포, 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus; EBV) 또는 사이토-메갈로 바이러스(cyto-megalo virus, CMV)와 같은 바이러스 항원, 또는 플라젤린과 같은 박테리아 항원이다. 바이러스 또는 박테리아 항원은 바이러스/박테리아 단백질로 감염되거나 또는 이를 발현하도록 제조된 세포 (예를 들어, 세포주)에 의해 제시될 수 있다. 자가 또는 비-자가 항원 제시 세포는 이러한 세포에 융합 또는 로딩된 짧은 합성 펩타이드를 제시하도록 사용될 수 있다. 이러한 짧은 펩타이드는 바이러스 유래의 펩타이드 또는 다른 항원을 나타내는 펩타이드이다.
면역원성의 짧은 펩타이드, 즉 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC의 맥락에서 제시가능한 펩타이드를 식별하기 위해, 전담 소프트웨어(dedicated software)가 사용되어 바이러스 또는 기타 서열을 분석할 수 있다.
제3자 세포는 수여자에 대해 동종 이계 또는 이종성일 수 있다 (보다 상세히 후술함). 동종 이계의 제3자 세포의 경우, 이러한 세포는 공여자와 상이하지만 수여자 HLA 항원과 교차 반응하지 않는 HLA 항원을 가지며, 이로써 상기 세포에 대해 생성되는 항-제3자 세포는 이식물 또는 수여자 항원에 대해 반응성이지 않다.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 동종 이계 또는 이종성 제3자 세포는 말초 혈액 림프구(PBL), 비장 또는 림프절로부터 정제된 세포, 사이토카인-동원된 PBL, 시험관 내에서 증식된 항원-제시 세포(APC), 시험관 내에서 증식된 수지상 세포(DC) 및 인공 항원 제시 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 자극성 세포이다.
본 발명의 인공 APC는 외인성 펩타이드로 감작(pulsed)되지 않고도 제3자 펩타이드 또는 제3자 MHC를 제시하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일 실시 양태에 따르면, 상기 인공 APC는 제3자 MHC 결정인자 및 공동-자극성 분자로 형질감염된 K562 종양 세포 [예를 들어, Suhoski MM et al., Mol Ther. (2007) 15(5): 981-8에서 전술한 바와 같음], 또는 이로 형질감염된 섬유아세포를 포함한다.
제3자의 항원은 세포, 바이러스 또는 박테리아 표면 상에 제시되거나, 또는 이로부터 유래 및/또는 정제될 수 있다. 부가적으로는, 바이러스 또는 박테리아 항원은 감염된 세포 상에 제시될 수 있으며, 세포성 항원은 리포좀과 같은 인공 비히클 또는 인공 항원 제시 세포 (예, 제3자의 항원 또는 항원들로 형질감염된 섬유아세포 세포주 또는 백혈병 세포주) 상에 제시될 수 있다.
상기 제3자의 항원은 자가 제시 세포, 비-자가 제시 세포에 의해 제시되거나, 또는 인공 비히클 또는 인공 항원 제시 세포 상에 존재하는 합성 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 제3자의 항원은, 예를 들어, 다양한 소스로부터 추출 또는 정제된 단백질일 수 있다. 본 발명에 따라 제3자의 항원으로 작용할 수 있는 정제된 단백질의 일례는 오브알부민이다. 다른 예들도 파악된다.
세포, 바이러스, 박테리아, 바이러스성 감염, 박테리아 감염, 바이러스 펩타이드 또는 박테리아 펩타이드 제시 세포를 제3자의 항원으로서 이용하는 것은, 이러한 제3자의 항원이 항원성 결정인자의 다양한 어레이를 포함하기 때문에 특히 유리하며, 이와 같이 예를 들어, 치사 또는 아치사량의 방사선 조사 또는 화학치료법 처치 후, 보다 빠른 T-세포 재구성이 요구되는 경우, 이러한 재구성에 추가로 작용할 수 있는 다양한 항-제3자 세포군의 형성을 지시한다.
더욱이, 항-제3자 세포가 제3자의 항원에 관한 것인 경우, 상기 세포에 항-질환 활성이 부여된다. 용어 "항-질환 활성"은 질병에 걸린 세포 (예, 암 세포, 예컨대 이식편대 백혈병, GVL, 활성)에 대한 Tcm 세포의 활성 (예, 살해능)을 지칭한다. 이러한 활성은 전형적으로, LFA1-I/CAM1 결합에 의해 매개되는 TCR 독립적인 살해로 인한 것이다 [Arditti et al., Blood (2005) 105(8):3365-71. Epub 2004 Jul 6].
일 실시 양태에 따르면, 상기 제3자 세포는 수지상 세포를 포함한다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 제3자 세포는 성숙 수지상 세포를 포함한다.
유도성 Tcm 세포에 대한 자극성 세포로서 사용될 수 있는 제3자 수지상 세포의 생성 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 즉, 비-한정적 예로서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 제3자 비-동계의 세포 공여자로부터 수득될 수 있다 [예를 들어, Tcm 세포가 동계, 예를 들어, 자가인 경우, 수지상 수지(DC)는 상기 대상에 대해 비-동계, 예를 들어, 동종 이계일 수 있으며; 반면, Tcm 세포가 비-동계, 예를 들어, 동종 이계인 경우, DC는 비-동계, 예를 들어, 동종 이계인 공여자로부터 선별되며, HLA는 상기 대상과 상기 Tcm 세포 모두와 미스매칭됨]. 그 후, 단핵구는 플라스틱 흡착에 의해 분리된 다음, 인간 혈청 (예, 1% 인간 혈청), 페니실린/스트렙토마이신 및 GM-CSF (800 IU/㎖) 및 IL-4 (20 ng/㎖) (예를 들어, Peprotech, Hamburg, Germany로부터 입수가능함)가 보충된 DC 세포 배지 (예, Cellgro DC 배지)를 사용해 (예를 들어, 세포 배양 플레이트에서) 배양될 수 있다. 배양한 지 약 48시간 후에, GM-CSF (1600 IU/㎖) 및 IL-4 (20 ng/㎖)가 DC 배지에 첨가되어 포함될 수 있다. 약 24시간 후, 비-흡착성 세포가 수집될 수 있으며, 대세포(large cell) (대부분 미성숙 DC)는 GM-CSF (800 IU/㎖), IL-4 (20 ng/㎖), LPS (예, E.coli O55:B5 유래이며, 10 ng/㎖) 및 IFNγ (100 IU/㎖) (예를 들어, Peprotech, Hamburg, Germany로부터 입수가능함)를 포함하는 새 배지에 현탁화되고, 평판배양된 후, 밤새 인큐베이션될 수 있다. 이튿날, 비-흡착성 세포는 폐기될 수 있으며, 흡착성 DC는, 예를 들어, 20분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후의 냉각 PBS/1% HS를 사용해 부드럽게 거둬질 수 있으며, 이로써, 성숙 DC로 이루어진 대세포들이 수득될 수 있다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 제3자 세포는 방사선 조사된 수지상 세포를 포함한다.
즉, 일 실시 양태에 따르면, DC는 약 5-10 Gy, 약 10-20 Gy, 약 20-30 Gy, 약 20-40 Gy, 약 20-50 Gy, 약 10-50 Gy 선량의 방사선으로 조사된다. 구체적인 실시 양태에 따르면, DC는 약 10-50 Gy (예, 30 Gy) 선량의 방사선으로 조사된다.
일부 실시 양태에 따르면, 본 발명의 항-제3자 세포는 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가진다.
본원에서, 문구 "중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형"은 림프절로 회귀하는 세포독성 T 세포의 서브셋(subset)을 지칭한다. 인간에서, Tcm 표현형을 가진 세포는 전형적으로 CD3+/CD8+/CD62L+/CD45RO+/CD45RA- 특징을 가진다. Tcm 세포는 단일 세포 상에 특징적인 마커들을 모두 발현할 수 있거나, 또는 단일 세포 상의 특징적인 마커들 중 일부만 발현할 수 있는 것으로 알아야 할 것이다.
세포군 분리물 중 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 또는 심지어 100%가 CD3+CD8+ 세포임을 알아야 할 것이다. 구체적인 실시 양태에 따르면, 세포군 분리물은 CD3+CD8+ 세포를 약 70% 내지 약 90%로 포함한다.
CD3+CD8+ 세포 중 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 또는 심지어 100%가 Tcm 세포 특징을 가짐을 알아야 할 것이다. 구체적인 실시 양태에 따르면, CD3+CD8+ 세포 중 약 30% 내지 약 80% (예, 40% 내지 50%)는 Tcm 세포 특징을 가진다.
일 실시 양태에 따르면, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물을 제공하며, 여기서 상기 세포군 분리물 중 50%는 CD3+CD8+ 세포이며, 이 중 50% 이상은 CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+ 특징을 가지며, 또한 상기 세포는 관용성-유도성 세포 및/또는 항-질환 활성 (예, 이식편대백혈병(GVL) 활성)이 부여된 세포이며 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있다.
언급된 바와 같이, Tcm 세포는 전형적으로, 이식 후에 림프절로 회귀한다. 일부 실시 양태에 따르면, 본 발명의 항-제3자 Tcm 세포는 이식 후에 말초 림프절 및 장간막성(mesenteric) 림프절과 같은 림프절로 회귀할 수 있다. 이들 세포의 회귀성으로 인해, 이들은 신속하고도 효율적인 방식으로 관용성 효과를 발휘할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항-제3자 Tcm 세포는 관용성-유도성 세포이다.
본원에서, 문구 "관용성-유도성 세포"는, 관용성-유도성 세포가 투여되지 않은 경우의 수여자 세포의 반응성과 비교해, 수여자 세포 (예, 수여자의 T 세포)가 관용성-유도성 세포와 접촉된 경우 상기 수여자 세포의 반응성 저하를 유도하는 세포를 지칭한다. 관용성-유도성 세포로는, PCT 공개 번호 WO 2001/049243 및 WO 2002/102971에 기술된 바와 같은, 비토 세포 (즉, 접촉 시 숙주 T 세포의 세포자멸사를 유도하는 T 세포)가 포함된다.
일부 실시 양태에 따르면, 본 발명의 Tcm 세포는 비-유전적으로 변형된 세포 또는 유전적으로 변형된 세포 (예, 특정 유전자, 마커 또는 펩타이드를 발현 또는 무-발현하거나, 또는 특정 사이토카인을 분비 또는 무-분비하도록 유전자 조작된 세포)일 수 있다. 관련 유전자(들)의 불활성화 또는 폴리펩타이드 발현을 방해하는 안티센스 RNA의 삽입 등과 같은 당해 기술분야에 공지된 기술이 세포의 유전자 조작에 사용될 수 있다 (예를 들어, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된 WO/2000/039294 참조).
본 발명의 일부 실시 양태에 따라, 세포군 분리물을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 IL-21의 존재 하에 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계로부터 생성되는 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 배양하여, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포를 증식시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 항-제3자 Tcm 세포는 전형적으로, 우선 동계 또는 비-동계의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 IL-21이 보충된 배양액 (그렇지 않은 경우, 사이토카인-무함유 배양액, 즉 부가적인 사이토카인이 첨가되지 않은 배양액)에서, (전술한 바와 같은) 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉시킴으로써 생성된다. 이러한 단계는 전형적으로, 약 12-24시간, 약 12-36시간, 약 12-72시간, 24-48시간, 24-36시간, 약 24-72시간, 약 48-72시간, 1-2일, 2-3일, 1-3일, 2-4일, 1-5일, 2-5일, 2-6일, 1-7일, 5-7일, 2-8일, 8-10일 또는 1-10일간 수행되며, 항원 반응성 세포가 농화되게 한다. 구체적인 실시 양태에 따르면, 동계 또는 비-동계의 PBMC를 (전술한 바와 같은) IL-21이 보충된 배양액 (그렇지 않은 경우, 사이토카인-무함유 배양액)에서 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉시키는 단계는 1-5일 (예, 3일)간 수행된다. 이 단계는 전형적으로, 약 0.001-3000 ng/㎖, 0.001-1000 ng/㎖, 0.01-1000 ng/㎖, 0.1-1000 ng/㎖, 1-1000 ng/㎖, 10-1000 ng/㎖, 10-500 ng/㎖, 10-300 ng/㎖, 10-100 ng/㎖, 100-1000 ng/㎖, 1-100 ng/㎖, 1-50 ng/㎖, 1-30 ng/㎖, 10-50 ng/㎖, 10-30 ng/㎖, 10-20 ng/㎖, 20-30 ng/㎖, 20-50 ng/㎖, 30-50 ng/㎖, 30-100 ng/㎖, 1-10 ng/㎖, 0.1-10 ng/㎖, 0.1-100 ng/㎖, 1 ng/㎖, 10 ng/㎖-100 ng/㎖의 IL-21의 존재 하에 수행된다. 구체적인 실시 양태에 따르면, IL-21의 농도는 10-50 ng/㎖ (예, 30 ng/㎖)이다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 동계 또는 비-동계의 PBMC를 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉시키는 단계는 사이토카인-무함유 배양액 (예, IL-21만 보충된 배양액)에서 수행되며, 이러한 배양 조건은 제3자의 항원 또는 항원들에 의해 자극 및 활성화되는 세포 (즉, 항원 반응성 세포)가 이들의 생존을 가능하게 하는 사이토카인 (예, IL-2)을 분비하므로 (나머지 세포들은 모두 이들 배양 조건 하에 사멸됨), 이들 세포가 생존 및 농화될 수 있게 한다.
제3자의 항원 또는 항원들 (예, 수지상 세포) : PBMC의 비율은 전형적으로 약 1:2 내지 약 1:10, 예컨대 약 1:4, 약 1:6, 약 1:8 또는 약 1:10이다. 구체적인 실시 양태에 따르면, 제3자의 항원 또는 항원들 (예, 수지상 세포) : PBMC의 비율은 약 1:2 내지 약 1:8 (예, 1:4)이다.
이후, 항-제3자 세포는 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 배양되어, Tcm 표현형을 가지는 세포가 증식되게 한다. 이 단계는 전형적으로, 약 12-24시간, 약 12-36시간, 약 12-72시간, 24-48시간, 24-36시간, 약 24-72시간, 약 48-72시간, 1-20일, 1-15일, 1-10일, 1-5일, 5-20일, 5-15일, 5-10일, 1-2일, 2-3일, 1-3일, 2-4일, 2-5일, 2-8일, 2-10일, 4-10일, 4-8일, 6-8일, 8-10일, 7-9일, 7-11일, 7-13일, 7-15일, 10-12일, 10-14일, 12-14일, 14-16일, 14-18일, 16-18일 또는 18-20일간 수행된다. 구체적인 실시 양태에 따르면, 상기 항-제3자 세포는 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 약 7-11일 (예, 8일)간 배양된다.
이 단계는 전형적으로, 약 0.001-3000 ng/㎖, 0.001-1000 ng/㎖, 0.01-1000 ng/㎖, 0.1-1000 ng/㎖, 1-1000 ng/㎖, 10-1000 ng/㎖, 10-500 ng/㎖, 10-300 ng/㎖, 10-100 ng/㎖, 100-1000 ng/㎖, 1-100 ng/㎖, 1-50 ng/㎖, 1-30 ng/㎖, 10-50 ng/㎖, 10-30 ng/㎖, 10-20 ng/㎖, 20-30 ng/㎖, 20-50 ng/㎖, 30-50 ng/㎖, 30-100 ng/㎖, 1-10 ng/㎖, 0.1-10 ng/㎖, 0.1-100 ng/㎖, 1 ng/㎖-100 ng/㎖ IL-21 농도의 IL-21의 존재 하에 수행된다. 구체적인 실시 양태에 따르면, IL-21의 농도는 10-50 ng/㎖ (예, 30 ng/㎖)이다.
이 단계는 또한, 약 0.001-3000 ng/㎖, 0.001-1000 ng/㎖, 0.01-1000 ng/㎖, 0.05-1000 ng/㎖, 0.1-1000 ng/㎖, 0.5-1000 ng/㎖, 0.05-500 ng/㎖, 0.5-500 ng/㎖, 0.1-100 ng/㎖, 0.1-10 ng/㎖, 0.5-100 ng/㎖, 1-100 ng/㎖, 5-100 ng/㎖, 1-50 ng/㎖, 5-50 ng/㎖, 1-10 ng/㎖, 5-10 ng/㎖, 1-5 ng/㎖, 2-3 ng/㎖, 2-5 ng/㎖, 2-7 ng/㎖, 3-5 ng/㎖, 3-7 ng/㎖, 4-5 ng/㎖, 5-6 ng/㎖, 5-7 ng/㎖, 1-8 ng/㎖, 10-100 ng/㎖, 10-1000 ng/㎖, 100-1000 ng/㎖ 농도의 IL-15의 존재 하에 수행된다. 구체적인 실시 양태에 따르면, IL-15의 농도는 1-10 ng/㎖ (예, 5 ng/㎖)이다.
이 단계는 또한, 약 0.001-3000 ng/㎖, 0.001-1000 ng/㎖, 0.01-1000 ng/㎖, 0.05-1000 ng/㎖, 0.1-1000 ng/㎖, 0.5-1000 ng/㎖, 0.05-500 ng/㎖, 0.5-500 ng/㎖, 0.1-100 ng/㎖, 0.1-10 ng/㎖, 0.5-100 ng/㎖, 1-100 ng/㎖, 5-100 ng/㎖, 1-50 ng/㎖, 5-50 ng/㎖, 1-10 ng/㎖, 5-10 ng/㎖, 1-5 ng/㎖, 2-3 ng/㎖, 2-5 ng/㎖, 2-7 ng/㎖, 3-5 ng/㎖, 3-7 ng/㎖, 4-5 ng/㎖, 5-6 ng/㎖, 5-7 ng/㎖, 1-8 ng/㎖, 10-100 ng/㎖, 10-1000 ng/㎖, 100-1000 ng/㎖ 농도의 IL-7의 존재 하에 수행된다. 구체적인 실시 양태에 따르면, IL-7의 농도는 1-10 ng/㎖ (5 ng/㎖)이다.
본 발명자들은 고된 실험 및 스크리닝을 통해, 이식편대 숙주 (GVH) 반응성 세포는 제거되고 및/또는 항-질환 (예, GVL) 반응성 세포는 증강되는, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포의 증식의 개선에 이용될 수 있는 다수의 기준을 수집하였다.
일 실시 양태에 따르면, IL-21의 존재 하에 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉되기 전에, PBMC에서 비-흡착성 세포가 제거된다.
일 실시 양태에 따르면, IL-21의 존재 하에 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉되기 전에, PBMC에서 CD4+ 및/또는 CD56+ 세포가 제거된다.
일 실시 양태에 따르면, IL-21의 존재 하에 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉되기 전에, PBMC에서 CD45RA+ 세포가 제거된다.
CD4+ 및/또는 CD56+ 세포의 제거는 (예, MACS 비드, FACS 소터 및/또는 캡처 ELISA 표지화 등을 이용하는) 친화성-기재 정제(affinity based purification)와 같은 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 단계는 배양액 내 CD8+ 세포의 순도를 높이거나 (즉, 세포 배양액 내의 T CD4+ 세포 또는 NK 세포와 같은 다른 림프구를 제거하거나) 또는 CD8+ T 세포의 수를 증가시키는 데 유리할 수 있다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 PBMC는 비-흡착성 세포를 포함한다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 PBMC는 CD8+ T 세포를 포함한다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 PBMC는 네이브 CD8+ T 세포를 포함한다.
네이브 CD8+ T 세포의 선별은 CD45RA+ 발현 세포 및/또는 CD45RO- 발현 세포의 선별에 의해 수행될 수 있으며, (예, MACS 비드, FACS 소터 및/또는 캡처 ELISA 표지화 등을 이용하는) 친화성-기재 정제와 같은 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
일 실시 양태에 따르면, 상기 PBMC는 CD45RA+ 세포를 포함한다.
본 발명의 기술에 따라 수행될 수 있는 추가의 단계로는, IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 PBMC 세포를 제3자의 항원 또는 항원들과 함께 배양한 후, 세포 배양액으로부터 상기 제3자의 항원 또는 항원들을 제거하는 단계 (즉, 무-항원 환경을 생성하는 단계)를 포함한다. 이 단계는 전형적으로, 약 12-24시간, 약 12-36시간, 약 12-72시간, 24-48시간, 24-36시간, 약 24-72시간, 약 48-72시간, 1-2일, 2-3일, 1-3일, 2-4일, 1-5일 또는 2-5일간 수행되며, 전술한 것과 동일한 용량의 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 수행된다. 구체적인 실시 양태에 따르면, IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 PBMC 세포를 제3자의 항원 또는 항원들과 배양하는 단계는 12시간 내지 4일 (예, 1-2일) 동안 수행된다.
부가적으로는 또는 다르게는, 활성화된 세포를 선별 및 분리하는 추가적인 2단계 과정이 수행될 수 있다. 이러한 선별 단계는, PBMC가 대상에 대해 비-동계인 경우 잠재적인 숙주 반응성 T 세포의 제거에 일조한다 (이하 상세히 후술됨).
따라서, 활성화된 세포는 2단계 방법으로 수행될 수 있다. 제1 단계에서, 활성화된 세포는 선별된 후, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 배양된다. 이러한 제1 단계는 전형적으로, PBMC가 IL-21의 존재 하에 제3자의 항원 또는 항원들과 처음으로 접촉된 후 수행된다. 이러한 선별 과정은 제3자의 항원에 의해 활성화된 세포 (예, 후술하는 활성화 마커를 발현하는 세포)만을 골라내며, 전형적으로 PBMC가 제3자의 항원 또는 항원들과 처음으로 접촉된 후 약 12-24시간, 약 24-36시간, 약 12-36시간, 약 36-48시간, 약 12-48시간, 약 48-60시간, 약 12-60시간, 약 60-72시간, 약 12-72시간, 약 72-84시간, 약 12-84시간, 약 84-96시간, 약 12-96시간째에 수행된다. 구체적인 실시 양태에 따르면, 상기 선별 과정은 PBMC가 제3자의 항원 또는 항원들과 처음으로 접촉된 후 약 12-24시간 (예, 14시간)째에 수행된다.
활성화된 세포의 분리는 (예, MACS 비드, FACS 소터 및/또는 캡처 ELISA 표지화 등을 이용하는) 친화성-기재 정제에 의해 수행될 수 있으며, CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137과 같으나 이로 한정되지 않는 세포 표면 마커를 비롯한 활성화 마커, 또는 IFN-γ 및 IL-2와 같으나 이로 한정되지 않는 비-세포 표면 마커에 대해 수행될 수 있다. 활성화된 세포의 분리는 또한, 당해 기술분야에 공지된 방법(예, FACS)을 이용하여 형태학-기재 정제(morphology based purification) (예, 대세포 분리)에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 활성화된 세포는 또한, CD8+ 세포의 발현에 대해 선별되기도 한다. 더욱이, 전술한 방법들의 조합이 이용되어, 활성화된 세포를 효율적으로 분리할 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 활성화된 세포의 선별은 CD137+ 및/또는 CD25+ 세포의 선별에 의해 수행된다.
활성화된 세포의 분리 단계인 제2 단계는 전형적으로 배양 종료 시에 (즉, 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 배양한 후) 수행된다. 이 단계는, 중심 기억 T-림프구(Tcm)를 방사선 조사된 숙주 항원 제시 세포 (수지상 세포와 같은 APC)와 접촉시킨 후 활성화된 세포의 제거에 의해, 동종반응성 세포를 제거한다. 전술한 바와 같이, 활성화된 세포의 분리는 (예, MACS 비드, FACS 소터 및/또는 캡처 ELISA 표지화 등을 이용하는) 친화성-기재 정제에 의해 수행될 수 있으며, CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137과 같으나 이로 한정되지 않는 세포 표면 마커를 비롯한 활성화 마커, 또는 IFN-γ 및 IL-2와 같으나 이로 한정되지 않는 비-세포 표면 마커에 대해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 동종반응성 세포의 제거는 CD137+ 및/또는 CD25+ 세포의 제거에 의해 수행된다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따라 사용될 수 있는 프로토콜의 다수의 비-한정적 예는 하기에 주어진다.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 세포는 관용성-유도성 세포 및/또는 항-질환 활성 (예, 이식편대백혈병(GVL) 활성)이 부여된 세포이며 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있으며, 상기 방법은: (a) 비-흡착성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CD4+ 및/또는 CD56+ 세포 제거 능력이 있는 제제로 처리하여, CD8+ T 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 CD8+ T 세포를 IL-21의 존재 하에 제3자 수지상 세포와 12시간 내지 5일 동안 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화하는 단계; (c) 상기 (b) 단계로부터 생성되는 세포를 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 제3자 수지상 세포와 12시간 내지 3일 동안 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계로부터 생성되는 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 5일 내지 20일 동안 배양하여, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포를 증식시키는 단계를 포함한다.
전술한 프로토콜은 전형적으로 비-동계 이식에 사용되며, 따라서 사용되는 PBMC는 전형적으로 대상에 대해 동종 이계이다 (예, 동종 이계의 공여자로부터 유래됨).
본 발명의 일 실시 양태에 따라, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 세포는 항-질환 활성 (예, 항-종양 세포 활성)이 부여된 세포이며 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있으며, 상기 방법은: (a) 비-흡착성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CD4+ 및/또는 CD56+ 세포 제거 능력이 있는 제제로 처리하여, CD8+ T 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 CD8+ T 세포를 IL-21의 존재 하에 비-동계의 수지상 세포와 12시간 내지 5일 동안 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화하는 단계; (c) 상기 (b) 단계로부터 생성되는 세포를 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 비-동계의 수지상 세포와 12시간 내지 3일 동안 배양하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계로부터 생성되는 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 5일 내지 20일 동안 배양하여, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포를 증식시키는 단계를 포함한다.
전술한 프로토콜은 전형적으로 동계 이식에 사용되며, 따라서 사용되는 PBMC는 전형적으로 대상에 대해 자가성이다 (예, 상기 대상으로부터 유래됨).
즉, 언급된 바와 같이, PBMC는 대상에 대해 동계 또는 비-동계일 수 있다.
본 발명의 일부 실시 양태에 따르면, 본 발명의 비-동계 PBMC는 대상에 대해 동종 이계 또는 이종성일 수 있다 (보다 상세히 후술함).
PBMC의 소스는 세포의 목적하는 용도에 따라 결정될 것이며 (하기의 보다 상세한 내용을 참조), 특히, 본원에서 제공되는 상세한 개시내용을 바탕으로 당해 기술분야의 당업자의 능력에 따라 결정된다.
관용성-유도성 세포의 사용은 특히, 동종 이계 또는 이종성 세포 또는 조직의 이식과 같이, 이식 거부반응을 없애고 이식편대 숙주 질환 (GVHD)을 극복할 필요가 있는 경우에 유리하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따라, 세포 또는 조직 이식이 필요한 대상을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 또는 장기 이식물을 상기 대상에게 이식하고, 세포군 분리물을 치료적 유효량으로 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서, 용어 "~을 치료하는"은 질병의 진행을 없애거나, 실질적으로 저해하거나, 느리게 하거나 또는 역전시키며, 질병의 임상적 또는 미학적(aesthetical)증상을 실질적으로 완화하거나, 또는 실질적으로 질병의 임상적 또는 미학적 증상의 외양을 예방하는 것을 포함한다.
본원에서, 용어 "대상" 또는 "이를 필요로 하는 대상"은 포유류, 바람직하게는 세포 또는 조직 이식이 필요하거나 또는 Tcm 세포로 치료될 수 있는 질환을 앓고 있는 임의의 연령대의 남성 또는 여성인 인간을 지칭한다. 전형적으로, 상기 대상은, 세포 또는 조직 이식을 통해 치료될 수 있는 장애, 또는 병리학적 또는 바람직하지 못한 질병, 상태, 또는 증상, 또는 신체적, 형태학적 또는 생리학적 이상(abnormality)으로 인해, 세포 또는 조직 이식을 필요로 한다 (본원에서 수여자로 지칭되기도 함). 이러한 장애의 예는 추가로 후술한다.
본원에서, 문구 "세포 또는 조직 이식물"은 신체의 세포 (예, 단일 세포 또는 세포군) 또는 조직 (예, 전체 또는 부분적으로 이식될 수 있는 고형 조직/장기 또는 연조직)을 지칭한다. 본 발명의 교시에 따라 이식될 수 있는 조직 또는 장기의 예로는, 간, 췌장, 비장, 신장, 심장, 폐, 피부, 장 및 림프 조직/조혈모 조직 (예, 림프절, 파이어스 패치(Peyer's patches), 흉선 또는 골수)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 본 발명의 교시에 따라 이식될 수 있는 세포의 예로는, 줄기 세포를 비롯한 미성숙 조혈모 세포를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 더욱이, 본 발명은 또한, 신장, 심장, 간 또는 피부와 같은 전장기(whole organ)의 이식을 고려한다.
적용에 따라, 상기 방법은 상기 대상과 동계 또는 비-동계인 세포 또는 조직을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 상기 대상 및 상기 공여자는 모두 인간이다.
적용 및 이용가능한 소스에 따라, 본 발명의 세포 또는 조직은 출생전(prenatal) 개체, 출생후 개체, 성인 또는 카데바 공여자로부터 수득될 수 있다. 더욱이, 필요한 적용에 따라, 세포 또는 조직은 네이브하거나 또는 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 결정은 당해 기술분야의 당업자의 역량에 속한다.
당해 기술분야에 공지된 방법이 적용되어, (예, 이식용) 세포 또는 조직을 수득할 수 있다.
세포 또는 조직을 대상에게 이식하는 단계는, 세포 또는 조직의 유형; 수여자의 질환 (예, 장기 부전)의 유형, 단계(stage) 또는 중증도; 대상에 특이적인 신체적 또는 생리학적 파라미터; 및/또는 목적하는 치료 결과와 같은 여러 가지 파라미터에 따라, 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 세포 또는 조직 이식물을 이식하는 단계는, 적용에 따라, 세포 또는 조직 이식물을 여러 가지 해부학적 위치 중 하나에 이식함으로써 수행될 수 있다. 상기 세포 또는 조직 이식물은 동소성(homotopic) 해부학적 위치 (이식을 위한 정상적인 해부학적 위치), 또는 이소성(ectopic) 해부학적 위치 (이식을 위한 비정상적인 해부학적 위치)에 이식될 수 있다. 적용에 따라, 상기 세포 또는 조직 이식물은 유리하게는, 신피막(renal capsule), 또는 신장, 고환 지방(testicular fat), 피하 조직(sub cutis), 장막, 간문맥, 간, 비장, 심장 강(heart cavity), 심장, 흉강, 폐, 피부, 췌장 및/또는 복부내 공간(intra abdominal space) 하에 이식될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 교시에 따라, 간 조직은 간, 간문맥, 신피막, 피하 조직, 장막, 비장, 및 복부내 공간에 이식될 수 있다. 이와 같은 여러 가지 해부학적 위치에의 간 이식은 보편적으로, 간 이식을 통해 치료될 수 있는 질환 (예, 간부전)을 치료하기 위해 실시된다. 유사하게는, 본 발명에 따른 췌장 조직의 이식은 유리하게는, 상기 조직을 간문맥, 간, 췌장, 고환 지방, 피하 조직, 장막, 창자 고리(intestinal loop) (소장의 U자형 고리의 장막하조직(subserosa)) 및/또는 복부내 공간에 이식함으로써 수행될 수 있다. 췌장 조직의 이식은 췌장 이식을 통해 치료될 수 있는 질환 (예, 당뇨병)을 치료하는 데 이용될 수 있다. 마찬가지로, 신장, 심장, 폐 또는 피부 조직과 같은 조직의 이식은 예를 들어, 신부전, 심부전, 폐부전 또는 피부 손상 (예를 들어, 화상)을 가진 수여자를 치료할 목적으로, 전술한 해부학적 위치에 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 예를 들어, 미성숙 조혈모 세포 이식을 필요로 하는 질환을 앓고 있는 수여자를 치료하기 위해 이용될 수 있다.
후자의 경우, 예를 들어, 공여자의 골수, (예를 들어 백혈구분리반출법에 의해) 동원된 말초 혈액, 태아 간, 난황낭 및/또는 제대혈로부터 유래될 수 있으며 바람직하게는 T-세포 제거된 CD34+ 미성숙 조혈모 세포인 미성숙의 자가, 동종 이계 또는 이종성 조혈모 세포 (줄기 세포 포함)가 질환을 앓고 있는 수여자에게 이식될 수 있다. 이러한 질환으로는, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 비-림프구성 백혈병(ANLL), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수성 백혈병(CML)과 같은 백혈병, 중증 복합형 면역 부전증 증후군(SCID), 아데노신 디아미나제(adenosine deaminase; ADA), 골석화증(osteopetrosis), 재생 불량성 빈혈, 고셰병(Gaucher's disease), 탈라세미아(thalassemia) 및 기타 선천성 또는 유전적으로-결절된 조혈모 이상을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 미성숙 자가, 동종 이계 또는 이종성 조혈모 세포는, 세포 투입 (예, 정맥내) 또는 복강내 경로 등의 그러나 이로 한정되지 않는 당해 기술분야에 공지된 세포 이식 방법을 이용해 수여자에게 이식될 수 있음을 알게 될 것이다.
선택적으로, 본 발명의 세포 또는 조직 이식물을 장기 결손(defective organ)된 대상에게 이식하는 경우, 우선 기능부전의(failed) 장기를 적어도 부분적으로 제거하여, 이식물이 최적으로 발달하고 대상의 해부학/생리학적 상태와 구조적/기능적으로 융합되게 하는 것이 유리할 수 있다.
일 실시 양태에 따르면, 미성숙 조혈모 세포 및 세포군 분리물은 동일한 공여자로부터 유래된다.
일 실시 양태에 따르면, 미성숙 조혈모 세포 및 세포군 분리물은 동일한 공여자로부터 유래된다.
본 발명의 방법은 또한, 대상이 공동-이식 수술에 의해 유리한 효과를 얻을 수 있는 경우, 몇몇 장기 (예, 심장 및 폐 조직)의 공동-이식을 고려한다.
일 실시 양태에 따르면, 공동-이식은 미성숙 조혈모 세포와, 고형 조직/장기 또는 다수의 실질 장기/조직의 이식이다.
일 실시 양태에 따르면, 미성숙 조혈모 세포 및 실질 장기는 동일한 공여자로부터 수득된다.
다른 실시 양태에 따르면, 미성숙 조혈모 세포 및 실질 장기/조직 또는 장기들/조직은 서로 다른 (비-동계의) 공여자로부터 수득된다.
일 실시 양태에 따르면, 미성숙 조혈모 세포는 실질 장기의 이식 전에, 동시에 또는 이후에 이식된다.
일 실시 양태에 따르면, 조혈모 키메라 현상은 미성숙 조혈모 세포를 본 발명의 Tcm 세포와 함께 이식함으로써 대상에서 먼저 유도되어, 동일한 공여자로부터 이식된 다른 조직/장기의 관용성을 유도한다.
일 실시 양태에 따르면, 본 발명의 Tcm 세포는 동일한 공여자로부터 이식된 조직/이식된 장기의 거부반응을 감소시키기 위해 그 자체로 사용된다.
추가의 실시 양태에서, 세포 또는 조직 이식물, 및 세포군 분리물은 동일한 공여자로부터 유래된다.
추가의 실시 양태에서, 세포 또는 조직 이식물은 대상과 동계이며, 세포군 분리물은 상기 대상과 비-동계이다.
추가의 실시 양태에서, 세포 또는 조직 이식물은 대상과 동계이며, 세포군 분리물은 상기 대상과 동계이다.
표준 의료 실시에 따르면, 본 발명에 따라 세포 또는 조직 이식물을 대상에게 이식한 후, 여러 가지 표준 기술 중 하나에 따라 장기의 성장 기능성 및 면역-융화성(immuno-compatability)을 모니터링하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 췌장 조직 이식의 기능성은 이식 후에, 표준 췌장 기능 검사 (예, 혈청 내 인슐린 농도의 분석)에 의해 모니터링될 수 있다. 마찬가지로, 간 조직 이식은 이식 후에, 표준 간 기능 검사 (예, 혈청 내 알부민, 총 단백질, ALT, AST, 및 빌리루빈 농도의 분석, 및 혈액 응고 시간의 분석)에 의해 모니터링될 수 있다. 세포 또는 조직의 구조적인 발달은 컴퓨터 단층촬영법, 또는 초음파 화상 진단을 통해 모니터링될 수 있다.
이식 환경에 따라, 세포 또는 조직 이식물의 융합(engraftment)을 촉진하기 위해, 상기 방법은 유리하게는, 이식 전에, 대상을 아치사, 치사 또는 과치사 조건 하에서 조건화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 대상을 조건화하는 것과 관련하여, 본원에서, 용어 "아치사", "치사", 및 "과치사"는, 대상의 대표적인 집단에 적용되는 경우 정상적인 무균 조건 하에, 전형적으로 각각, 그 집단의 본질적으로 모든 구성원에게 비-치사성; 그 집단의 전부는 아니지만 일부 구성원에게 치사성; 또는 그 집단의 본질적으로 모든 구성원에게 치사성인, 골수 독성 및/또는 림프구 독성 처리를 지칭한다.
일 실시 양태에 따르면, 조건화 단계는 골수소멸(myeloablative)과 같은, 과치사 조건 하에서 대상을 조건화함으로써 수행된다.
다르게는, 조건화 단계는 골수감소(myeloreductive) 조건과 같은 치사 또는 아치사 조건 하에서 대상을 조건화함으로써 수행된다.
대상을 조건화하는 데 사용될 수 있는 조건화 제제(conditioning agent)의 예로는, 한정 없이, 방사선 조사, 약리학 제제, 및 (본원에서 기술되는 바와 같은) 관용성-유도성 세포가 포함된다.
약리학 제제의 예로는, 골수 독성 약물, 림프구 독성 약물 및 면역억제 약물이 포함된다.
골수 독성 약물의 예로는, 한정 없이, 부술판(busulfan), 다이메틸 밀레란(dimethyl mileran), 멜팔란(melphalan) 및 티오테파(thiotepa)가 포함된다.
상기 방법은 유리하게는, 세포 또는 조직 이식물의 이식 전에, 동시에 또는 이후에 면역억제 요법과 함께 대상을 조건화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
면역억제 요법의 적절한 유형의 예로는, 면역억제 약물의 투여, (상세히 후술하는 바와 같은) 관용성-유도성 세포군의 투여, 및/또는 면역억제 방사선 조사가 포함된다.
이식에 적절한 면역억제 요법을 선택 및 투여하기 위한 충분한 지침은 당해 기술분야의 문헌에 나타나 있다 (예를 들어, Kirkpatrick CH. and Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. et al., 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. and Strom TB., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE. et al., 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. et al., 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. et al., 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. et al., 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. et al. 1998. Lancet 351, 623을 참조).
바람직하게는, 면역억제 요법은 1종 이상의 면역억제제를 대상에게 투여하는 것으로 이루어진다.
면역억제제의 예로는, 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 사이클로스포린 A, 클로로퀸(chloroquine), 하이드록시클로로퀸, 설파살라진(sulfasalazine) (설파살라조피린(sulphasalazopyrine)), 금염(gold salt), D-페니실라민(D-penicillamine), 레플루노미드(leflunomide), 아자티오프린(azathioprine), 아나킨라(anakinra), 인플릭시마브(infliximab) (REMICADE), 에타네르셉트(etanercept), TNF.알파.차단제, 염증성 사이토카인을 표적으로 하는 생물학적 제제, 및 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAID)를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. NSAID의 예로는, 아세틸 살리실산, 콜린 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살(diflunisal), 마그네슘 살리실레이트, 살살레이트(salsalate), 소듐 살리실레이트, 다이클로페낙(diclofenac), 에토돌락(etodolac), 페노프로펜(fenoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토프로펜(ketoprofen), 케토롤락(ketorolac), 메클로페나메이트(meclofenamate), 나프록센(naproxen), 나부메톤(nabumetone), 페닐부타존(phenylbutazone), 피록시캄(piroxicam), 설린닥(sulindac), 톨메틴(tolmetin), 아세타미노펜, 이부프로펜, Cox-2 저해제, 트라마돌(tramadol), 라파마이신 (시롤리무스(sirolimus)) 및 라파마이신 유사체 (예컨대 CCI-779, RAD001, AP23573)를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 이들 제제는 개별적으로 또는 조합해서 투여될 수 있다.
이식 유형과는 무관하게, 이식 거부반응 및 이식편대 숙주 질환을 피하기 위해, 본 발명의 방법은 (이하 상세히 후술하는 바와 같이) 신규의 항 제3자 Tcm 세포를 이용한다.
본 발명의 방법에 따르면, 이들 항 제3자 Tcm 세포는 세포 또는 조직 이식물과 동시에, 전에 또는 이후에 투여된다.
항 제3자 Tcm 세포는 세포 투입 (예, 정맥내) 또는 복강내 경로 등과 같으나 이로 한정되지 않는 당해 기술분야에 공지된 세포 이식 방법을 통해 투여될 수 있다.
이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 치료적 유효량은, GVHD의 유도 없이, 관용화, 항-종양 효과 및/또는 면역 재구성에 효율적인 항-제3자 Tcm 세포의 양이다. 본 발명의 Tcm 세포가 이식 후 림프절로 회귀하기 때문에, (기존에 사용되던 세포의 투여량에 비해 (예를 들어 WO 2001/049243를 참조)) 보다 적은 양의 세포가 상기 세포의 유익한 효과(들) (예, 관용화, 항-종양 효과 및/또는 면역 재구성)를 달성하는 데 필요할 수 있다. 본 발명의 Tcm 세포와 함께 보다 낮은 농도의 면역억제 약물이 필요할 수 있음을 알게 될 것이다 (치료 프로토콜로부터 라파마이신의 배제 등).
치료적 유효량의 결정은 특히, 본원에서 제공되는 개시내용을 바탕으로, 당해 기술분야의 당업자의 역량에 속한다.
본 발명의 방법에 사용되는 제제에 대해, 치료적 유효량 또는 투여량은 시험관 내 및 세포 배양액 분석법에서 처음으로 추정될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 바람직한 농도 또는 역가(titer)를 결정하기 위한 동물 모델에서 제형될 수 있다. 이러한 정보를 이용해, 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
예를 들어, 조직 이식의 경우, 수여자에게 투입되는 항-제3자 Tcm 세포의 수는 체중 Kg 당 1 x 104개 (1 x 104 /Kg 체중)가 넘어야 한다. 수여자에게 투입되는 항-제3자 Tcm 세포의 수의 범위는 전형적으로, 1 x 103 /Kg 체중 내지 1 x 104 /Kg 체중, 1 x 104 /Kg 체중 내지 1 x 105 /Kg 체중, 1 x 104 /Kg 체중 내지 1 x 106 /Kg 체중, 1 x 104 /Kg 체중 내지 1 x 107 /Kg 체중, 1 x 104 /Kg 체중 내지 1 x 108 /Kg 체중, 1 x 103 /Kg 체중 내지 1 x 105 /Kg 체중, 1 x 104 /Kg 체중 내지 1 x 106 /Kg 체중, 1 x 106 /Kg 체중 내지 1 x 107 /Kg 체중, 1 x 105 /Kg 체중 내지 1 x 107 /Kg 체중, 1 x 106 /Kg 체중 내지 1 x 108 /Kg 체중이어야 한다. 구체적인 실시 양태에 따르면, 수여자에게 투입되는 항-제3자 Tcm 세포의 수는 1 x 105 /Kg 체중 내지 1 x 107 /Kg 체중이어야 한다.
따라서, 본 발명의 신규 항-제3자 Tcm 세포는 (전술한 바와 같은) 세포 또는 조직 이식물을 위한 보강제 치료법으로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 신규 Tcm 세포는 또한, 항-질환 활성 (예, 보다 상세히 전술한 바와 같은 항-종양 세포 활성)을 부여받으며, 따라서, 질환 치료를 위해 그 자체로 사용될 수 있다.
구체적인 실시 양태에 따르면, 이식편대 질병에 걸린 세포의 활성 (예, 항-백혈병 치료와 같은 항-종양 효과)을 수득하기 위해, 동계 세포 및 비-동계 세포가 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 악성 질환, 이식물의 이식과 관련된 질환, 바이러스 질환이나 박테리아 질환과 같은 감염 질환, 염증성 질환 및/또는 자가면역 질환 등과 같으나 이로 한정되지 않는 질환을 치료하는 데 적용될 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 질환으로는, 백혈병 [예를 들어, 급성 림프성, 급성 림프구성, 급성 림프구성 예비-B 세포, 급성 림프구성 T 세포 백혈병, 급성 - 거핵아세포, 단핵구, 급성 골수, 급성 골수성, 호산백혈구 증가증(eosinophilia)을 동반한 급성 골수성, B 세포, 호염기성, 만성 골수성, 만성, B 세포, 호산성, Friend, 과립구성 또는 골수성, 모발 세포, 림프구성, 거핵아세포, 단핵구, 단핵구-대식 세포, 골수아구성(myeloblastic), 골수성, 골수성단핵구, 혈장 세포, 예비-B 세포, 전골수성, 아급성, T 세포, 림프 신생물, 골수성 악성 종양에 대한 소인, 급성 비-림프구성 백혈병, T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL) 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병(B-CLL)], 림프종 (예를 들어, 호지킨스 병(Hodgkin's disease), 비-호지킨스 림프종, B 세포, 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 피부 T 세포, 조직구, 림프아세포, T 세포, 흉선), 암종, 아세포종(blastoma) 및 육종과 같은 악성 질환; 이식물의 이식과 연관된 질환 (예, 이식 거부반응, 만성 이식 거부반응, 아급성 이식 거부반응, 과급성 이식 거부반응, 급성 이식 거부반응 및 이식편대 숙주 질환); 만성 감염 질환, 아급성 감염 질환, 급성 감염 질환, 바이러스 질환 (예, EBV, CMV, HIV), 박테리아 질환, 원생동물 질환, 기생충 질환, 진균성 질환, 마이코플라즈마 질환 및 프리온 질환을 포함하나, 이로 한정되지 않는 감염 질환; 염증성 질환 (예, 만성 염증성 질환 및 급성 염증성 질환); 및 자가면역 질환 (예, 심혈관 질환, 류마티드 질환, 샘 질환, 위장 질환, 피부 질환, 간 질환, 신경 질환, 근육 질환, 신장 질환, 생식 관련 질환, 결합 조직 질환 및 전신 질환)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명의 방법은 더욱이, 항-제3자 Tcm 세포와 동계인 (예, 세포 또는 조직 이식물과 항-제3자 세포가 동일한 공여자로부터 유래되는 경우) 세포 또는 조직의 이식물의 융합을 동시에 촉진하면서도 대상에서 질환을 치료하기 위해 유리하게 적용될 수 있다.
본원에서 용어 "약"은 ±10%를 지칭한다.
용어 "~을 포함하다", "~을 포함하는", "~을 수반하다", "~을 수반하는", "~을 가지는" 및 이들의 활용형(conjugate)은 "~을 포함하나 이로 한정되지 않는"을 의미한다.
용어 "~로 이루어진"은 "~을 포함하나 이로 한정되지 않는"을 의미한다.
용어 "본질적으로 ~로 이루어진"은, 부가적인 성분, 단계 및/또는 파트가, 청구되는 조성물, 방법 또는 구조의 기본적이고 신규한 특징들을 실질적으로 변경시키지 않는다면, 상기 조성물, 방법 또는 구조가 상기 부가적인 성분, 단계 및/또는 파트를 포함할 수 있음을 의미한다.
본원에서, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 지시되지 않는 한, 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "1종의 화합물" 또는 "1종 이상의 화합물"은 이의 혼합물을 비롯한 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전체에서, 본 발명의 여러 가지 실시 양태들은 범위 포맷(range format)으로 제시될 수 있다. 범위 포맷에서의 설명은 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 불변의 제한으로 간주되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위범위(subrange) 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위단위, 및 그 범위의 개별적인 수, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 이는 상기 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
수치 범위가 본원에서 지시되는 경우에는 항상, 언급된 숫자 (분수 또는 정수)가 상기 지시된 범위 내에 포함되는 것으로 의미된다. 문구 첫번째 지시 수(indicate number)와 두번째 지시 수 "사이의 범위에 이르는/범위", 및 첫번째 지시 수부터 두번째 지시 수까지의 "범위에 이르는/범위"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 첫번째 지시 수와 두번째 지시 수, 및 이 두 수 사이의 분수와 정수를 모두 포함하는 것으로 의미된다.
본원에서 용어 "방법"은, 화학, 약동학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 실시자들에게 공지되어 있거나, 또는 이들에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 용이하게 개발되는 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하나, 이로 한정되지 않는, 해당 과제를 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 지칭한다.
개별 실시 양태들의 맥락에서 명확성을 위해 기술되는 본 발명의 소정의 특징들은 하나의 실시 양태에서도 제공될 수 있음을 알게 된다. 역으로, 하나의 실시 양태의 맥락에서 간결성을 위해 기술되는 본 발명의 여러 가지 특징들은 개별적으로, 또는 적절한 하위 조합으로, 또는 본 발명에서 기술된 다른 실시 양태에서 적절한 대로 제공될 수도 있다. 여러 가지 실시 양태들의 맥락에서 기술되는 소정의 특징들은, 실시 양태가 다른 구성요소 없이 조작불가능하지 않는 한, 이들 실시 양태의 본질적인 특징들로 간주되어서는 안 된다.
전술하였으며 하기 청구항 부문에서 청구되는 바와 같은 본 발명의 여러 가지 실시 양태 및 측면들은 하기 실시예를 통해 실험적인 지지를 얻게 된다.
실시예
이제, 상기 상세한 설명과 함께 비-한정적으로 본 발명을 예시하는 하기 실시예를 참조로 한다.
일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 본 발명에 이용되는 실험 절차는, 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 제4,666,828 호; 제4,683,202 호; 제4,801,531 호; 제5,192,659 호 및 제5,272,057 호에서 나타난 방법들; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)을 참조하며; 이용가능한 면역분석법은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제3,791,932 호; 제3,839,153 호; 제3,850,752 호; 제3,850,578 호; 제3,853,987 호; 제3,867,517 호; 제3,879,262 호; 제3,901,654 호; 제3,935,074 호; 제3,984,533 호; 제3,996,345 호; 제4,034,074 호; 제4,098,876 호; 제4,879,219 호; 제5,011,771 호 및 제5,281,521 호를 참조하며; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Liveney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) 및 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)를 참조하며; 이들은 모두 원용에 의해 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것과 마찬가지로 포함된다. 다른 일반적인 참조문헌은 본 문헌 전체에 제공된다. 그 안의 절차들은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있는 것으로 여겨지며, 독자의 편의를 위해 제공된다. 그 안에 포함된 정보는 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일반적인 재료 및 실험 절차
말초 혈액 단핵 세포( PBMC )
PBMC는 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 환자와 건강한 지원자들의 전혈로부터 분리하였다. 지시되는 경우, 세포는 [Manual of Tissue Typing Techniques. Washington DC, National Institute of Allergy and Infectious Disease, NIH DHEW Publication 76-545, 1976, p 22]에서 이미 기술된 바와 같은 혈청학적 방법으로 클래스 I HLA로 유형화하였다.
종양 세포주
H.My2 C1R HLA A2 K66A 형질감염체 세포 및 H.My2 C1R HLA A2 w.t. 형질감염체 B 세포주를 사용하였다.
[Storkus WJ, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 2361-2364]에서 이미 기술된 바와 같이, 표면 HLA A 및 B 항원이 결여되어 있으며, 감마 방사선 조사와 클래스 I 모노클로날 항체 및 보체에 대한 선별에 의해 Hmy.2 B-LCL로부터 유래되는 인간 B-세포 림프아세포주인 C1R을 사용하였다.
[Grumet FC, et al. Hum. Immunol. (1994) 40: 228-234]에 이미 기술된 바와같이, 변형된, 네오마이신 약물-내성 진핵생물 벡터인 pSP65-Neo (상기 벡터는 삽입체(insert)를 포함하지 않았음)를 C1R 세포주에 전기천공함으로써 1987년에 구축한 안정한 형질감염체 세포주인 C1R-neo를 사용하였다.
수지상 세포 생성
단핵구는 플라스틱 흡착에 의해 분리하고, 1% 인간 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신 + GM-CSF (800 IU/㎖) 및 IL-4 (20 ng/㎖) (Peprotech, Hamburg, Germany)가 보충된 Cellgro DC 배지 3 ㎖을 사용하여 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 48시간 동안 배양한 후, 배지 1.5 ㎖을 첨가하였다 (+ GM-CSF 1600 IU/㎖ 및 IL4 20 ng/㎖). 24시간 후, 비-흡착성 세포를 수집하고, 대세포 (대부분 미성숙 DC)의 수를 계수하고, GM-CSF 800 IU/㎖, IL-4 20 ng/㎖, E.coli O55:B5 유래의 LPS 10 ng/㎖ (Sigma, Deisenhofen, Germany) 및 IFNγ (Peprotech,100 IU/㎖)를 포함하는 새 배지에 현탁하고, 2 ㎖에서 웰 당 약 106개 DC로 평판배양하고, 밤새 인큐베이션하였다. 이튿날, 비-흡착성 세포를 폐기하였고, 흡착성 DC를 20분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후의 냉각 PBS/1% HS를 사용해 부드럽게 거둬냈다. 성숙 DC로 이루어진 대세포들의 수를 계수하였다. 상기 세포는, 잠재적으로 오염시키는 NK-세포 또는 기억 T-세포 소수의 성장을 피하기 위해 30 Gy로 방사선 조사한 다음, T-세포 자극용으로 사용하였다.
PBMC 로부터의 네이브 CD8 T-세포의 분리
네이브 CD8 T 세포는 CD8 음성 선별 키트 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)를 제조업체의 지시에 따라 사용하는 최초의 음성 선별에 의해 분리하였다. 그런 다음, 항원으로 감작된(antigen-experienced) CD8+ T-세포를 CD45RO- 비드 및 LD 컬럼을 사용해 제거하였다.
항-제3자 중심 기억 인간 CD8 T-세포의 생성
네이브 CD8 T 세포를 분리하고, IL-21 (Peprotech, 30 ng/㎖)이 보충된 T-세포 배지에 재현탁화하였다. 방사선 조사된 DC는, 48-웰 플레이트에 웰 당 4 x 105개 T-세포에 대해, 1:4의 DC:T-세포의 비율로 첨가하였다. 각 웰의 총 부피는 500 ㎕이었다.
배양을 시작한 후 72시간째에, 500 ㎕ T-세포 배지를 IL-7 및 IL-15 (Peprotech, 최종 농도 5 ng/㎖)과 함께 첨가한 후, 이어서 세포는 결과 부문에 나타내는 바와 같이 2-3일마다 영양공급을 하였다.
GVL 분석법
H.My C1R ("Neo") 및 H.My C1R HLA A2 K66A 돌연변이체 형질감염체 ("K66A") B 림프아세포주 세포는 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 수득하고, 세포 사멸 시 방출되는 중요한 염료인 0.15 ㎍/㎖ CalceinAM (Molecular Probes, Inc, Eugene, OR)으로 제조업체의 지시에 따라 표지하였다. 다음, Calcein 표지된 B 림프아세포주 세포 2 x 105개는, 24-웰 플레이트에서 항-제3자 Tcm에 대해 1:5의 비율로 항-제3자 Tcm과 함께 또는 없이 22시간 동안 인큐베이션하였다. 공동 배양 전에, 항-제3자 Tcm을 음성 선별 키트 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)에 의해 CD8+ T 세포에 대해 농화시켰다. 외인성 사이토카인은 MLR에 첨가하지 않았다. 세포를 회수하고, Calcein으로 염색된 B 림프아세포주 세포 중 생존한 세포의 수를 FACS에 의해 측정함으로써 생존율을 분석하였다. AnnexinV+에 의해 세포자멸사를 검출하기 위해, 샘플을 5 ㎕ AnnexinV-APC (BD)와 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 비-결합된 AnnexinV를 세척해 내고, 샘플을 FACS로 분석하였다. 세포의 절대값을 수득하기 위해, 샘플을 일정 부피로 현탁하고, 각 샘플에 대한 유세포분석 수를 일정한 예정된 기간 동안 수득하고, 고정된 부피와 고정된 수의 투입 세포를 이용해 수득한 유세포분석 수와 비교하였다. 생존율은 B 림프아세포주 세포 단독의 생존율에 대해 제시한다.
B 림프아세포주 세포 살해의 백분율은 하기 식으로 계산하였다:
Figure 112014033479498-pct00002
특이적인 세포자멸사를 수행하는 B 림프아세포주 세포의 백분율은 하기 식으로 계산하였다: = (시험 웰 내 Calcein+AnnexinV+ B 림프아세포주 세포의 %) - (대조군 웰 내 Calcein+AnnexinV+ B 림프아세포주 세포의 %).
CD137 활성화 마커를 토대로 한, 동종반응성의 제거를 위한 2단계 자기 소팅 방법
네이브 CD8 T 세포는 IL-21 (Peprotech, 30 ng/㎖)의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 6:1의 비율로 자극시켰다. 활성화 후 14시간째에, CD137+ 세포를 자기 소팅 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)에 의해 양성 선별하였다. 그런 다음, CD137+ 세포는 IL-21 (Peprotech, 30 ng/㎖)의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일째까지 재-자극시켰다. 그 후, 상기 세포를 5 ng/㎖ IL-7 및 5 ng/㎖ IL-15 (Peprotech)를 포함하는 배지에서 10일까지 증식시켰다. 10일째에, 세포를 2개의 시험군으로 나누었다. 제1 군에서, 세포는 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 14일째까지 계속 증식하였으며, 한편 제2 시험군의 세포는 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 방사선 조사된 숙주 PBMC (1:2의 비율로)로 활성화시켰다. 24시간 후, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 제거하였다. CD137 제거된 세포는 IL-7 및 IL-15와 함께 재-평판배양하고, 14일째까지 배양하였다 ("항 제3자 CD137+ 및 항 숙주 CD137-"). 14일째에, 항 제3자 및 항-숙주 동종반응성은 제3자 또는 방사선 조사된 숙주 PBMC에 대한 CFSE 분석법으로 조사하였다. CFSE 분석법의 경우, 1 x 106개의 CFSE+ 반응물질은 IL-7의 존재 하에 2 x 106개의 방사선 조사된 (20 gy) PBMC 자극물질과 함께 또는 없이 84시간 동안 인큐베이션하였다. 84시간 후, 세포를 회수하고, CFSE 저 염색 CD8 T 세포 (CD3+CD8+CD56-)의 수를 FACS로 측정함으로써 세포 분열을 분석하였다. 세포의 절대값을 수득하기 위해, 샘플을 일정 부피에 현탁하고, 각 샘플의 유세포분석 계수를 일정한 예정된 기간 동안 수득하였다. 특이적인 분열중인 세포의 수 = (APC의 존재 하에 분열중인 세포의 수) - (APC의 부재 하에 분열중인 세포의 수). 음의 값은, 숙주 PBMC를 이용한 활성화에 반응하여 분열중인 세포의 수가 활성화를 동반하지 않은 채 분열중인 세포의 수보다 훨씬 더 낮음을 의미한다.
실시예 1
인간 항-제3자 T 중심 기억 ( Tcm ) 세포의 생성 및 최적화
이미 제시된 마우스 연구를 임상에 적용하기 위해, 인간 항-제3자 세포독성 T 림프구(CTL)를 생성하기 위해 절차를 최적화하였다. 이를 위해, CD8 반응 세포 분리용의 서로 다른 시약들, 자극물질의 조성물, 및 사이토카인 환경을 비롯한 서로 다른 파라미터를 평가하였다.
잠재적으로, 이미 제시된 마우스 모델에서 확인되는 바와 같이, 중심 기억 T 세포(Tcm)를 이용한 치료는 자가 골수 이식 [Lask A et al., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), (2010) 116: 424] 또는 동종 이계 골수 이식(BMT) [Ophir E et al., Blood. (2010) 115(10): 2095-104; Ophir E., 37th EBMT annual meeting, April 3-6, 2011, Paris, France. Oral Presentation Abstract Nr: 662]의 맥락에서 유익할 수 있다.
인간 자가 이식 설정 (도 1a)에서, 항-제3자 Tcm을 자가 BMT와 함께 투여할 수 있다. 환자 자신의 CD8+ T 세포를 분리하고, 동종 이계의 공여자로부터 유래된 동종 이계의 수지상 세포에 대해 자극시켰다.
인간 동종 이계 이식 설정 (도 1b)에서, 항-제3자 Tcm을 동종 이계의 T-제거된 BM 세포와 함께 이식할 수 있다. 동종 이계의 BM 공여자로부터 기원되는 네이브 CD8+ T 세포는 반응물질로서 기능하며, 제3자의 공여자 수지상 세포는 비-반응성 Tcm을 생성할 수 있게 하는 자극물질로서 사용한다. GVHD를 피하기 위해, 제3자 공여자는, 공여자의 HLA 클래스 I 대립 형질 중 어느 것도 숙주의 HLA 클래스 I 대립 형질과 공유되지 않도록 선택된다.
마우스와 인간 모두에서, 고안된 기본적인 프로토콜이 CD8 T 세포 분리와 제3자 세포에 대한 자극으로 유사하게 이루어진 한편 (도 1a 내지 1b 및 도 2a 내지 2b), 몇몇 다른 파라미터들은 하기 표 1에 나타내는 바와 같이, 인간 프로토콜에서 변형되었다.
자가 Tcm은 GVHD 위험률이 없는 것을 고려하여, 생성 프로토콜의 최적화는 중심 기억 표현형을 가진 항-제3자 CD8 T 세포의 효과적인 증식을 달성하는 데 주로 집중하였다.
도 3a에서 알 수 있듯이, 3가지 주요 단계를 토대로 새로운 프로토콜을 개발하였다: a) PBMC로부터의 CD8 T 세포의 선별; b) IL-21의 존재 하에 동종 이계의 수지상 세포(DC)에 대한 3일간의 자극; 및 c) 무-항원 환경 하에 IL-7, IL-15 및 IL-21 하에서의 추가적인 8일간의 증식.
따라서, 이러한 새로 개발된 프로토콜에서, 몇몇 파라미터들은 마우스 Tcm의 생성에 사용되는 것과 상이하다 (표 1 및 도 3a 내지 3b). 상기 주요 차이들은, 반응물질 및 자극물질이 기원되는 조직 (PBMC 대 비장세포), 자극물질 (수지상 세포 대 비장세포), 및 사이토카인 조성물에 관한 것이다.
표 1: Tcm 생성을 위한 자가 인간 프로토콜 대 동계 마우스 프로토콜의 비교
인간 마우스 파라미터 주요 단계
동결된 PBMC 신선한 비장세포 기원되는 조직


반응물질
있음 없음 흡착된 세포의 제거
(밤새 플라스틱 상에서의 흡착 + IL-7)
있음 없음 CD4+, CD56+ 세포의 제거
CD 8+ T 세포 전체 비장세포 자극물질과 공동 배양하기 전의 최종 세포 조성
인간 마우스 파라미터 주요 단계
동결된 PBMC 신선한 비장세포 기원되는 조직

제3 자 자극물질
있음 없음 단핵구 유래의 성숙 수지상 세포의 생성
수지상 세포 전체 비장세포 반응물질과 공동 배양하기 전의 최종 세포 조성
인간 마우스 파라미터 주요 단계
CD8+ T 세포 → 방사선 조사된 DC 비장세포 → 방사선 조사된 비장세포 세포 조성


공동 배양:
( 프라이밍 )
3일 2.5일 공동 배양 기간
D0: IL-21을 첨가함 사이토카인 무함유! 사이토카인
비 흡착성 세포를 새 플레이트에 옮김 Ficoll, CD8+ 양성 선별 및 새 플라스크에의 평판배양 공동 배양이 중단되는 원인 :
인간 마우스 파라미터 주요 단계
IL-7, IL-15, IL-21 IL-15 사이토카인
무-항원 증식
없음 있음 배양 종료 시 CD62L+ 세포의 양성 선별
인간 항-제3자 Tcm의 생성을 위한 GMP 등급 프로토콜의 최적화:
항-제3자 Tcm의 생성을 위한 인간 프로토콜을 개발하려는 최초의 시도는, 중심 기억 표현형을 가진 인간 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성 절차를 개시한 Wolfl et al. [Wolfl M et al., Cancer Immunol Immunother (2011) 60(2): 173-186]의 최근의 연구를 토대로 하였다.
본 발명의 방법은, IL-21의 존재 하에 항원-감작된 DC에 대한 3일 동안의 자극, 및 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 추가의 8일간의 증식을 토대로 하였다.
항-제3자 Tcm의 양호한 증식을 초래하고 이어서 추가의 최적화를 위한 참조로서 기능한 이들 최초의 실험들에서, 하기 단계들을 사용하였다: a) 비-CD8+ 세포 (즉, CD4+ T 세포, γ/δ T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구 및 적혈구 세포)의 제거에 의한 PBMC로부터의 CD8 T 세포의 농화; b) CD45RO를 발현하는 활성화된 세포의 제거에 의한 네이브 세포의 농화; 및 c) IL-21의 존재 하에 동종 이계의 수지상 세포에 대한 네이브 CD8 T 세포의 3일 동안의 자극, 및 이어서 무-항원 환경 하에 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 추가의 8일간의 증식.
도 4a 내지 4c에 나타낸 이들 최초의 참조 실험들의 결과를 통해, 각각의 파라미터가 세포 증식 수준 및 Tcm 표현형의 발현 수준에 미치는 영향을 확인함으로써, 프로토콜의 서로 다른 파라미터들의 역할을 조사할 수 있었다 (상세히 후술함).
제3자 DC를 이용한 프라이밍의 역할
자가 Tcm이 정의에 의해 GVHD의 위험이 없는 것을 고려하는 경우, 확인한 제1 파라미터는 제3자 DC에 대한 자극의 역할이었다. 이 단계는 본래, GVHD를 매개하는 항-숙주 클론의 자극의 부재 시 항-제3자 클론의 선별적인 증식에 의해 동종 이계 이식 설정에서 GVHD의 위험률을 감소시키는 것이었다.
도 5a 내지 5c 및 도 6a 내지 6b에 예시되는 바와 같이, 수지상 세포에 의한 동종 이계의 자극의 부재 하에 IL-21과 함께 배양한 네이브 CD8 T 세포는 낮은 증식 수준을 나타내었으며 (대조군의 2.7 ±1.1%), 이는 7일째에 0일로부터의 폴드 증식이 약 0.4이며 (대부분의 세포는 10일전에 사멸하였음), 이들의 네이브 표현형 (CD45RO-CD62L+, 형태학적으로 작은 크기임)을 유지함을 의미한다 (Tcm 수준은 대조군에 비해 단지 10%임). 세포를 수지상 세포에 의한 동종 이계의 자극의 부재 하에 IL-7 및 IL-15과 함께 배양한 경우, 분화 및 증식의 수준은 유사하게 불량한 것으로 확인하였으며; 이들 조건 하에, 세포는, 증식이 어느 정도 유도되었음에도 (대조군 값의 12 ±3.2%, 13일째에 0일로부터의 폴드 증식이 약 6임), 이들의 네이브 표현형 (Tcm 수준은 대조군으로부터 단지 7 ±1.6%였음)을 유지하였다. 따라서, 동종 이계의 제3자 DC의 역할은 Tcm 표현형의 유도 및 폭넓은 세포 증식에 매우 중요하였다.
항-제3자 Tcm의 프라이밍 및 증식에서 IL-21의 역할
일반적으로, 마우스와 인간 모두에서, 종래의 T 세포 증식 프로토콜에서, 증식기는 무-항원 환경에서 수행한다. 그러나, 마우스 프로토콜에서는 IL-15만 첨가하였으며 (도 3b), Wolfl et al. (Wolfl et al. 2011, supra)에 의해 개시된 인간 프로토콜에서 세포 증식은 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 수행하였다. 더욱이, IL-21이 초기 프라이밍기 동안에 첨가되는 경우 유익한 것으로 확인된 것을 고려하여, IL-21의 역할을 조사하였다.
흥미롭게는, 도 7a 내지 7c 및 도 8a 내지 8b에서 알 수 있듯이, IL-21의 존재 또는 부재 하에 동종 이계 DC에 의한 네이브 CD8 T 세포의 프라이밍은 세포 조성물에 미미한 효과만을 발휘한 한편 (데이터는 제시되지 않음), IL-21의 부재 하에서의 프라이밍은 Tcm 표현형 (CD45RO+CD62L+)의 획득을 방해하였으며 (대조군에서 Tcm 수준은 단지 69 ±18%였음), 또한, 증식을 감소시켰다 (대조군에서 증식 수준은 76 ±23%였음) (도 8a-b). 증식이 감소되지 않은 (대조군의 140%), 4회의 실험 중 1회의 실험에서조차, Tcm 표현형은 대조군에서의 Tcm 수준의 단지 35%일뿐이었으며, 이는 IL-21의 존재 하에서의 프라이밍이 네이브 CD8 T 세포군으로부터 Tcm 표현형을 증식 및 유도하는 데 있어 중요함을 시사한다.
흥미롭게는, 프라이밍기 (IL-21 단독) 및 증식기 (IL-7 및 IL-15 하에) 모두에서 IL-21이 지속적으로 존재하는 것은, 중심 기억 표현형을 가지는 세포의 유도를 지속적으로 향상시켰다 (대조군에서의 Tcm 수준의 108 ±1.9%) (도 7a 내지 7c 및 도 8a 내지 8b). IL-21의 지속적인 존재가 세포 증식에 미치는 영향은 평균의 보다 높은 증가를 초래하였지만 (대조군에서 확인된 값의 135 ±47%) 덜 지속적이었는데, 3번의 실험에서 2번은 증식을 약간 감소시켰고 (각각 대조군 값의 95% 및 81%), 세번째 실험에서는 급격한 증식 증가를 나타내었으며 (228%), 따라서 이는 프라이밍기와 증식기 모두에서 IL-21의 첨가가 바람직함을 의미한다 (도 8a 내지 8b).
제3자 자극물질 세포의 조성물
전술한 결과들은, Tcm 표현형의 성공적인 유도 및 폭넓은 세포 증식을 위해서는 IL-21, IL-7, 및 IL-15의 순차적인 첨가가 단핵구 유래의 성숙 DC에 의한 동종 이계의 자극과 함께 수반되어야 함을 제시한다.
절차를 간략화하기 위해, 필수적인 동종 이계의 자극이, 4일이라는 제조 기간을 필요로 하는 단핵구 유래의 성숙 DC 대신에 방사선 조사된 PBMC에 의해 전달될 수 있는지 알아보기 위해 실험을 수행하였다.
하기 표 2에서 알 수 있듯이, 배양 7일째에, 단핵구 유래의 성숙 DC (md-mDC) 자극물질과 비교해 PBMC에 의한 Tcm 표현형의 유도 효율은, 정제된 네이브 CD8 T 세포 (각각 92% vs. 92%) 및 비-분리된 CD8 T 세포 (77% vs. 80%)를 반응물질로서 사용한 두 경우 모두에서 매우 유사하였다. 그러나, PBMC 자극물질은, 반응물질로서 네이브 CD8 T 세포 (각각 6.75 대 20.5) 또는 비-분리된 CD8 T 세포 (1.8 대 16)를 사용한 DC와 비교해 Tcm 증식을 동일한 수준으로 유도하지 못하였다.
자극물질로서의 DC의 중요한 역할
Tcm %
(CD3+CD8+CD62L+CD45RA-)		 0일로부터의 폴드 증식
(7일째)		 군
92 20.5 네이브 CD8 T 세포 → (md-mDC)
92 6.75 네이브 CD8 T 세포 → PBMC
80 16 비-분리된 CD8 T 세포 → (md-mDC)
77 1.8 비-분리된 CD8 T 세포 → PBMC
MLR은, 동일한 동종 이계의 공여자로부터 유래된 네이브 CD8 T 세포 또는 비-분리된 CD8 T 반응물질을 단핵구-유래의 성숙 DC (8:1의 반응물질/DC 비율) 또는 PBMC (1:1의 반응물질/PBMC 비율)에 대해 IL-21을 포함하는 배지에서 3일 동안 자극시켜 배양한다. 그 후, 세포를 추가의 활성화 없이 7일까지 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 배양하였다. 배양한지 7일째에, 서로 다른 군을 FACS 분석에 의한 Tcm의 백분율, 및 트립판 블루 배제법에 의한 세포 수에 대해 조사하였다.
따라서, 방사선 조사된 비장세포가 증식 유도에 충분했던 마우스 프로토콜과는 달리, 인간 프로토콜에서는, 동종 이계 단핵구 유래의 성숙 DC가 Tcm 세포의 양호한 증식에 중요하며, 동종 이계의 PBMC로 대체될 수 없다.
Tcm 표현형의 유도 및 세포 증식을 위한 최적의 반응물질/ DC 비율의 결정.
최적의 반응물질/DC 비율을 규정하기 위해, 전술한 바와 같이, 서로 다른 반응물질/DC 비율을 시험하는 점을 제외하고는, MLR 시스템을 사용하였다. 도 9a 내지 9B에서 알 수 있듯이, 4 x 105 반응물질을 사용하는 경우, 50-100 x 103 DC를 첨가했을 때 Tcm 표현형이 최적으로 획득되었으며, 한편 증식은 최저의 DC 농도에서 최적이었다. 더 낮은 반응물질/DC 비율에서 다른 실험들을 조사한다.
GMP 등급 시약만을 기재로 하는 최종적인 자가 프로토콜의 규정
항-제3자 Tcm의 생성을 위한 만족할 만한 자가 프로토콜의 구축 시, 인간 환자에서 이러한 방법을 검사할 수 있도록, 현재 시판되는 GMP 등급의 시약만을 기재로 하는 동등한 절차를 개발하기 위한 실험을 수행하였다.
플라스틱 접시 상의 흡착성 세포의 제거
CD8 T 세포 선별 과정을 최적화하기 전에, PBMC에 존재하는 플라스틱 흡착성 세포의 제거에 의해 유의한 초기 농화를 달성하는 실험을 수행하였다. 이 방법은 목적하는 CD8+ T 세포의 농도를 증가시킬 뿐만 아니라, 마우스 모델에서 사용된 신선한 비장세포와는 달리 동결보관된 인간 PBMC를 가공하는 데 유용하다. 이 실험으로, 해동된 세포가 자기 농화 과정에 처리되기 전에, 10% 인간 혈청 및 IL-7의 존재 하에서의 밤새 인큐베이션에 의해 복구될 수 있음을 확인하였다 (데이터는 제시되지 않음).
네이브 CD8 T 세포의 농화
다음, 네이브 CD8 T 세포의 농화를, 가능한 한 소수의 항체를 사용하여 임상 등급의 시약에 맞추는 데에 집중하였다.
전형적인 실험을 나타내는 도 10에서 알 수 있듯이, 바람직한 CD8 T 세포군은 흡착된 세포의 제거 후 0일째에 21%이며, 한편 다른 주요한 "오염원성(contaminating)" 하위세포군은 CD4 T 세포 (61%), B 세포 (7%) 및 NK 세포 (7%)를 포함한다. 즉, CD4 세포는 최대의 오염 집단을 나타내며, CD8 T 세포와 경쟁하는 것으로 나타났으며; 따라서, 이들 세포는 제거되어야 했다. 마찬가지로, IL-15 배양액에서 증식되는 것으로 알려진 NK 세포를 제거하는 것이 중요하였다. 대조적으로, B 세포는 이들 배양 조건 하에 사멸하는 경향이 있다. 따라서, 항-CD4 및 항-CD56 자기 비드를 이용한 잠재적인 제거는 처음에, CD19+ B 세포의 제거와 함께 또는 없이 평가하였다.
또한, B 세포 악성 종양 환자의 PBMC에서, CD8 T 세포의 수준은 건강한 공여자와 비교해 낮기 때문에, CD45RA+ 세포의 양성 선별에 의한 네이브 CD8 T 세포의 농화를 생략하는 가능성을 알아보기 위해 동일한 평가를 수행하였으며, 이는 추가로, 복구된 CD8 T 세포의 수를 감소시킨다.
따라서, -1일에, 먼저 흡착성 골수성 세포를 특이적으로 제거하도록 설계된 greiner-bio-one CELLTAR 조직 배양액 플레이트 (Greiner Bio-One Ltd., Stonehouse UK)에서 밤새 인큐베이션함으로써 공여자 PBMC로부터 흡착성 세포를 제거하였으며, 0일째에 비-흡착성 세포를 4개의 실험군으로 나누었으며, 각각은 서로 다른 자기 소팅 프로토콜로 처리하였다. 배양한 지 0, 7, 10 및 14일째에, 세포는 FACS 분석에 의해 세포 조성 및 Tcm 표현형, 및 트립판 블루 배제법을 기재로 하는 생존한 세포의 계수에 의해 증식에 대해 조사하였다.
도 10에서 알 수 있듯이, 항-CD4 비드 및 항-CD56 비드만을 사용하는 최소의 자기 세포 소팅은 CD4 T 및 NK 세포의 백분율을 각각 61% 및 7%에서 12% 및 1%로 감소시켰으며, CD8 T 세포의 농화는 23%에서 60%로 증가하였다. 그러나, 이러한 절차는 B 세포 수준이 7%로부터 24%로 증가한 것과 관련 있었다. 항-CD19를 제거 칵테일에 첨가하면 B 세포가 완전히 제거되었으며, CD8 T 세포의 농화를 개선하였다 (90%). 항-CD45RA를 가진 네이브 세포의 양성 농화의 제2 단계를 추가하는 것은, 네이브 세포 (CD45RO-CD45RA+, CD3+CD8+ 상에서 게이팅됨)의 백분율을 2개 군 모두에서 자기 소팅 전의 53%로부터 91%로 증가시켰다. 그러나, 이 단계는 CD8 T 세포의 최종 수준에 뚜렷한 영향을 미치지 않았으며, 항-CD4 및 항-CD56을 사용하는 경우 60%에서 66%로 증가시키거나 또는 음성 선별 단계가 항-CD19를 포함한 경우 90%에서 94%로 증가시켰다.
자기 세포 소팅 후, 4개의 군 모두는 IL-21의 존재 하에 동종 이계의 수지상 세포로 3일 동안 프라이밍하였으며, 그 후, 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-7, 및 IL-15의 존재 하에 14일까지 증식시켰다. 비-증식된 세포에 대한 대조군으로서, 항-CD4, 항-CD56, 및 항-CD19를 사용한 제거 단계 및 항-CD45RA를 사용하는 양성 농화 단계에 의해 농화된 네이브 CD8 T 세포를 무-항원 환경 하에 IL-7 단독의 존재 하에 14일까지 배양하였다.
흥미롭게는, 0일째에 항-CD19로 처리 또는 비-처리된 군들은 CD8 T 세포를 현저히 서로 다른 수준으로 나타내었지만, 이러한 차이는 7일쯤에 사라졌으며 (도 11), 또한 14일째에 시험한 경우에도 배양액에서의 B 세포의 선별적인 사멸로 인해 이러한 차이가 사라졌다 (도 12). 유사하게는, 처음 CD8 T 세포의 정제 후의 CD45RA+ 세포의 양성 선별은 Tcm 표현형을 가진 CD8+ T 세포의 최종적인 농화에 미미하게 기여하였다. 따라서, 4개의 군은 모두 목적하는 세포를 유사한 수준으로 나타내었으며, 항 CD45RA에 의해 네이브 세포가 농화된 2개의 군의 경우 최소의 이점만 존재하였다.
전형적인 실험에서 제시된 이러한 초기의 결과는, 최적의 세포 분리 시약 ("CD4- CD56- CD19-, CD45RA+")에 노출된 대조군에서 수득되는 결과의 평균을 항-CD19 또는 항 CD45RA를 사용하여 제거한 다른 군과 비교함으로써, 추가로 분석하였다.
따라서, 최적의 대조군에서 수득되는 수준의 백분율로서 계산되는 경우, 실험군 모두에서 CD8 T 세포의 평균 백분율 (도 13a), 보다 중요하게는 Tcm 백분율 (도 13b)은 매우 유사하였다.
대조적으로, 배양 10일째에 시험한 경우 각각의 세포 제조물의 평균 증식에서 현저한 차이가 확인되었으며, 그 범위는 65.6 ±0.5% 내지 105.2 ±6.8% 였다 (도 14a). 그러나, 증식력의 차이는 제2 정제 단계와 관련된 수율 감소에 의해 상쇄되었다(counteract) (도 14b).
도 14c에서 알 수 있듯이, 10일째에 Tcm의 최종적으로 계산된 수율을 제시하여, 항-CD45RA를 가지는 네이브 세포를 양성 농화하는 제2 단계의 추가는, Tcm 세포의 최종적인 수율을, 항-CD4 및 항-CD56을 사용하여 초기 제거를 이용하는 경우 141%에서 123%로, 또는 음성 선별 단계가 항-CD19를 포함하는 경우 157%에서 100%로 감소시켰다.
이들 결과를 종합하면, CD8 T 세포의 분리, 즉 항-CD4 및 항-CD56을 이용한 음성 선별을 위한 시약의 최소 사용을 토대로 하는 프로토콜이 자가 이식 설정에서의 임상 적용을 충족함을 제시한다.
실시예 2
GMP 등급의 시약을 사용하여 플라스틱 백에서의 인간 항-제3자 Tcm의 대규모 제조
자가 Tcm의 생성을 위해 환자 자신의 PBMC를 사용하는 경우 예상되는 조건을 시뮬레이션하기 위해, 처음에 2가지의 대규모 백혈구분리반출법 절차를 수행하였으며, 2명의 정상적인 공여자로부터 많은 수의 단핵 세포를 동결보관하였다 (몇몇의 배치로 나누어서 보관). 각각의 배치는 대규모 실험용으로만 사용하였다. 제1 실험에서, Wurzburg 프로토콜에 따라 동결된 백으로부터의 DC 생성의 어려움 및 생물학적 활성이 불분명한 새로운 GMP 등급의 IL-15의 소싱(sourcing)과 같은 몇몇의 기술적인 문제점들에 직면하였다. 이들 문제점으로 인해 매우 불량한 CD8 T 세포 증식 (약 3 폴드)을 초래하였으며, (전술한 바와 같이) DC용으로 현재 개시된 프로토콜을 사용하고 적절한 농도 (즉 300 U/㎖)의 IL-15를 사용함으로써 후속적인 실험에서 보정하였다.
도 15에서 알 수 있듯이, 동일한 공여자의 PBMC가 서로 다른 2명의 제3자의 DC에 대해 생성된 경우, 11일째에 유사한 CD8 T 세포 증식이 26.8 내지 31.0 폴드로 수득되었다. 이 날, 세포가 선형 증식을 나타낸 것을 고려하여, 이후의 시점에서 추가의 증식이 이루어질 수 있는 것으로 보인다. 그러나, 이러한 증식 수준은, 체중 Kg 당 3 x 107 이하의 세포를 잠재적으로 투여할 수 있게 하는 점에서 만족할 만하다. 흥미롭게는, 0일째에 백혈구분리반출법 제제가 CD14+ 단핵구 및 CD20 B 세포로 대체로 오염되는 것을 확인하였으며, 이들 세포는 세포 배양 시 사라지며, 12일째의 최종적인 세포 조성물은 CD8+CD3+ T 세포를 각각 94% 및 98%로 포함하였다 (도 16a 내지 16b).
중요하게는, 서로 다른 DC에 대한 2개의 배양액에서 수득되는 Tcm 표현형은 일부 가변성이 발생하였음에도 소규모 실험의 범위에 포함되었다 (도 17a 내지 17b). 따라서, 2가지 실험 모두에서 5일째에 Tcm 표현형이 높은 것을 확인하였지만 (각각 77% 및 71%), 이 수준은 9일째 (65% 대 46%) 및 12일째 (62% 대 35%)에 제2 DC 공여자에 대해 배양한 경우 보다 유의하게 저하되었다. 소규모 실험에서 유의하게 관찰되지 않은 이러한 가변성은, 소규모 실험에서 사용되는 플레이트에 대한 흡착성과 비교해 플라스틱 백에 흡착하는 경향이 덜하므로, 한편으로는 5일째에 DC를 제거하기가 상대적으로 어려운 것을 설명할 수 있었다. 따라서, 장기간의 존재 및 DC를 이용한 자극은 Tcm 표현형에서 Teff 표현형으로 보다 강하게 전환시킬 수 있었다.
실시예 3
구축된 세포주에 대한 인간 항-제3자 Tcm의 GVL 잠재력
자가 이식 설정에서 항-제3자 Tcm의 잠재적인 용도가 단지 잔여의 종양 세포의 제거만을 위한 것임을 고려할 때 (동종 이계 이식 설정에서, 이는 BM 세포의 융합을 증강시키는 작용을 하기도 함), Tcm을 환자에게 투입하기 전에 품질 관리에 사용될 수 있는 생체 외 세포독성 능력에 대한 간단한 분석법을 개발하는 것이 중요하다. 이를 위해, TCR 독립적인 분석법은, HC 돌연변이된 세포주가 이러한 돌연변이로 인해 TCR에 의해 인지되지 않으며 이들의 TCR 독립적인 살해 메커니즘을 통해 항-제3자 CTL 에 의해 살해될 수 있는, Lask et al. [Lask A et al., J Immunol. (2011) 187(4):2006-14]의 개시내용을 토대로 사용하였다. 분명하게는, 인간 Tcm에도 적용가능한 경우, 이러한 살해 양식은 Tcm 살해를 NK 세포에 의한 살해와 구별하도록 작용할 수 있었다.
이러한 질문에 답하기 위해, 혼합된 림프구 반응(MLR)은 B-세포 림프종 및 혈장 세포 백혈병 세포주를 표적으로 하는 항-제3자 Tcm을 이용해 수행하였으며, 및 세포자멸사하는 세포의 백분율은 22시간 후에 측정하였다. 전형적인 실험을 대표하는 도 17에서 알 수 있듯이, 뚜렷한 GVL 반응성이 Tcm에 의해 나타났다.
서로 다른 실험에서, CD8 T 세포는 우선, 비-CD8 T 세포 (즉, CD4+ T 세포, γ/δ T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 단핵구, 과립구, 및 적혈구 세포)를 자기 비드 소팅에 의해 폭넓게 제거함으로써 농후시켰다. 전형적인 실험을 대표하는 도 18에서 알 수 있듯이, 오염원인 NK 및 NKT 세포의 백분율은 시험되는 4개의 모든 군에서 매우 낮았다 (NK 세포의 경우 0.1% 미만, NKT 세포의 경우 1.9% 미만).
그런 다음, 매우 정제된 CD8 T 세포를 2가지 유형의 세포와 함께 인큐베이션하였다: a) TCR 독립적인 살해를 기술하기 위한 H.My C1R HLA-A2 K66A 돌연변이체 세포주 (K66A), 및 b) 표면 HLA A 항원 및 B 항원이 결여되어, 표적 백혈병 세포의 MHC 상의 3개의 도메인과 Tcm 상의 CD8 분자 간의 상호작용을 피룡로 하는 메커니즘을 통해 Tcm에 의한 살해에 둔감한, H.My C1R (Neo), B-세포 림프아세포주.
도 19a 내지 19d에 나타낸 바와 같이, MHC-I-결핍된 H.My C1R (Neo) 세포와 비교해 K66A 돌연변이된 표적 세포의 뚜렷한 살해는 항-제3자 Tcm에 의해 나타났다. 따라서, 인간 항-제3자 CTL과 유사하게 인간 Tcm은, 표적 세포 상에서의 MHC 발현을 필요로 하는 NK 매개의 살해와는 달리, TCR 독립적인 살해 메커니즘을 통해 B 세포 종양 세포를 살해할 수 있다.
가장 중요하게는, 최적의 세포 분리 시약 ("CD4- CD56- CD19-, CD45RA+")에 노출된 대조군에서 수득되는 평균적인 결과를, 항-CD19 또는 항 CD45RA (도 19a-d)의 사용이 줄어든 다른 군들과 비교하여 추가로 분석한 경우, 모든 실험군에서 H.My C1R HLA-A2 K66A 돌연변이체 세포주의 TCR 독립적인 살해 %는 매우 유사한 것으로 나타났다 (최적의 대조군에서 수득되는 수준의 백분율로서 계산됨) (도 20) (3개의 시험군 모두를 대조군과 비교한 경우, P>0.05).
종합하자면, 이들 결과는, CD8 T 세포의 분리를 위한 시약을 최소한으로 사용하여 분리한 세포에 의해 GVL 반응성이 나타났으며, 이는 보다 광범위한 다른 분리 프로토콜보다 불량하지 않음을 제시한다.
생체 내에서 Tcm에 의한 자가 B-CLL 종양 세포의 살해는, 항-제3자 CTL의 B-CLL 살해에 대한 설명을 위해 적용된 Hu/SCID 모델을 사용하여 수행된다.
실시예 4
동종 이계의 인간 항-제3자 Tcm 세포의 비율
동종 이계의 인간 항-제3자 Tcm을 사용하는 경우, GVHD의 위험률을 최소화하기 위한 새로운 GMP 등급의 개시
마우스 모델에서 전술한 바와 같이, 항-제3자 Tcm은 동종 이계 BMT에서의 관용성 유도에 매우 유용할 수 있다 [Ophir E. et al. Blood. (2010) 115(10):2095-104]. 이 경우, 동종 이계의 BM 공여자로부터 기원되는 네이브 CD8+ T 세포는 반응물질로서 작용하며, 제3자 공여자의 수지상 세포(DC)는 숙주 비-반응성 Tcm 세포를 생성할 수 있게 하는 자극물질로서 작용한다. GVHD를 피하기 위해, 제3자 공여자는, 공여자의 HLA 클래스 I 대립 형질 중 어느 것도 숙주의 HLA 클래스 I 대립 형질과 공유되지 않도록 선택된다.
그럼에도 불구하고, 인간 환자가 동계 교배한 마우스보다 GVHD에 보다 취약할 수 있음을 고려하면, 이 방법을 임상으로 전환하는 것은 주의를 요해야 한다. GVHD의 위험률을 추가로 감소시키기 위해, 항-제3자 동종 이계-자극 기간의 종료 시, 광-제거 또는 활성화된 세포의 선별과 같은 부가적인 동종 이계-제거 단계가 필요할 것이다.
(동종 이계의 프로토콜을 위한) 자가 인간 프로토콜 의 변형
도 21 내지 22에서 나타내는 바와 같이, 동종 이계의 설정에서 Tcm을 생성하는 프로토콜은 2가지 주요 단계 면에서 자가 이식 설정을 위한 프로토콜과 상이하다:
a) CD8 T 세포 분리 후에 CD45RA+ 세포의 선별. 기억 T-세포는, 상기 기억 T-세포 분획의 비-특이적 사이토카인-구동의 증식을 유발할 수 있는 네이브 T 세포보다 활성화 역치가 더 낮다. 이들 세포는 숙주의 항원과 교차 반응하여 GVHD 유발 위험률을 증가시키는 클론을 포함할 수 있다. 서로 다른 인간 공여자들 간의 네이브 T 세포의 백분율의 차이에 의해 야기되는 효과를 최소화하고 GVHD의 위험률을 감소시키기 위해, 네이브 CD8 T (CD45RA+CD8+) 세포를 Tcm 세포의 생성을 위한 소스로서 사용하였다.
b) 배양 종료 시, CD137+ 활성화된 CD8 T 세포의 제거에 의한, 잠재적으로 숙주 반응성인 T 세포의 제거.
IL-7 및 IL-15 부족 기간의 연장
자가 배양에 대해 (상기에서) 기술한 바와 같이, 본 발명자들은, IL-7 및 IL-15에 노출된 네이브 CD8 T 세포가 항원 독립적인 방식으로 증식하는 것을 관찰하였다. 한편, 동종 이계의 자극의 부재 하에, IL-21에 노출된 네이브 CD8 T 세포는 증식하지 않았으며, 배양 7일 뒤에도 생존하지 못하였다. 따라서, 3일부터 7일까지 IL-7 및 IL-15의 첨가를 지연하면, 제3자 자극물질에 반응성이지 않은 항-숙주 클론의 선별적인 제거를 잠재적으로 초래할 수 있었다.
동종반응성 제거를 위한 사이토카인을 첨가하는 최적의 시기를 정하기 위해, 네이브 CD8 T 세포를 IL-21의 존재 또는 부재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 7일 동안 자극시켰다. 그 후 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15 (도 23b), IL-15 및 IL-21 (도 23c), 또는 IL-15 단독 (도 23d)를 포함하는 배지에서 13일까지 증식시켰으며; 생성되는 세포군은 조건에 따라 배양된 네이브 CD8 T 세포와 비교하였으며, 자가 이식 설정 (d (0-3)에 IL21 및 DC로 인큐베이션; d(3-13)에 IL7+IL15의 첨가)에 대해 기술한 바와 같이 증식시켰다 (도 23a).
대조군과 동일한 순서로 사이토카인을 첨가하되 단 시기만 다르게 한 경우, 즉, IL-21 첨가를 3일에서 7일로 연장하고, IL-7 및 IL-15를 3일째가 아닌 7일째에 첨가한 경우, 세포의 증식이 방해되었다 (도 24a) (대조군에 의해 나타나는 것의 54 ±7%만의 증식). 그러나, 중심 기억 표현형의 유도는 유사하였다 (도 24b) (대조군에 의해 나타나는 것의 99 ±14.8%).
나타낸 바와 같이, IL-7을 제거하고 IL-21의 첨가를 배양 종료 시까지 연장하면, 세포의 증식을 감소시킬 뿐만 아니라 (도 24a) (대조군에 의해 나타나는 증식의 60 ±13%), 중심 기억 표현형 획득을 감소시켰다 (대조군에 의해 나타나는 Tcm 수준의 82 ±6.8%, 도 24b).
7일간의 사이토카인 결핍을 이용하고 이어서 7일부터 IL-15만을 첨가하여 네이브 CD8 T 세포를 프라이밍하는 것은, 세포의 증식력을 급격하게 저하시켰으며 (대조군에 의해 나타나는 것의 단지 5 ±1.3% 증식), 또한 중심 기억 표현형 획득을 감소시켰다 (도 24b) (대조군에 의해 나타나는 Tcm 수준의 68 ±26%).
가장 중요한 파라미터, 즉 숙주 반응성 클론 (자극에 사용된 상기 제3자 세포로부터 HLA 클래스 I를 완전히 구별하는 적절한 공여자로 시험함)의 제거를 시험하였다. 사이토카인 부족 기간을 최적화하는 추가적인 실험을 또한, 수행한다.
CD137 활성화 마커를 기재로 하는, 동종반응성의 제거를 위한 2단계 자기 소팅 방법
제3자 대상(concept)을 기재로 하는 항-숙주 클론의 명쾌한 제거 방법은 하기 CD137 선별 단계를 포함하는, 2단계 자기 소팅 기술에 의해 달성될 수 있다:
a. 배양 시작 시, 항-제3자 특이적 클론의 양성 선별; 및
b. 배양 종료 즈음, 항-숙주 특이적 클론의 제거.
최근, CD137은, CD137이 휴지기 CD8+　T 세포 상에서는 발현되지 않으며 이의 발현은 자극 후 24시간 후에 안정하게 유도되므로, 인간 CD8+　T 세포의 항원-특이적 활성화에 대한 적절한 마커로서 기술되어 왔다.
이 방법을 평가하기 위해, 네이브 CD8 T 세포를 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC로 자극시켰다. 활성화 후 14시간째에, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 양성 선별하였다. 그런 다음, CD137+ 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일까지 재-자극시켰다. 그 후 상기 세포를 IL-7 및 IL-15과 함께 10일까지 증식시킨 다음, IL-7 및 IL-15의 존재 하에 방사선 조사된 숙주 PBMC로 활성화시켰다. 24시간 후, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 제거하였다. CD137 제거된 세포는 IL-7 및 IL-15와 함께 재-평판배양하고, 14일째까지 배양하였다. 선별된 날짜에, 세포는 트립판 블루 배제법으로 세포 수 및 FACS 분석법으로 CD8 T 세포군 내의 Tcm (CD62L+CD45RO+)의 백분율을 조사하였다. 항-제3자 및 항-숙주 동종반응성 세포의 빈도는 제3자 또는 숙주 방사선 조사된 PBMC에 대한 CFSE 분석법으로 조사하였다. 이들 결과는, IL-21의 존재 하에 3일 동안 자극시킨 다음 IL-7 및 IL-15 하에 증식시킨 대조군 ("참조 대조군")에서 수득되는 것과 비교하였다.
따라서, 도 25에서 알 수 있듯이, 네이브 CD8 T 세포의 농화 직후 (0일), 총 CD8 T 세포 중 0.7%만이 CD137+를 발현하였으며, IL-21의 존재 하에 제3자 DC에 대한 14시간의 활성화 시, 총 CD8 T 세포 분획으로부터 CD137+을 발현하는 CD8 T 세포의 백분율은 DC 자극의 부재 시의 2.5%와 대조적으로 8.3%로 증가하였다. 활성화된 세포의 이러한 하위세포군의 자기 소팅은 CD137+ 세포의 현저한 농화를 초래하였으며 (각각 85%), 총 CD8 T 세포 분획 내 CD62L+ CD8 T 세포의 수준은 84%에 14%로 급격하게 저하되었다 (데이터는 제시되지 않음).
하기 표 3에서 나타내는 바와 같이, 이러한 양성 선별은 세포 회수의 감소와 관련 있었다. 따라서 0일째에, 네이브 CD8 T 세포의 농화 후 흡착성 세포가 제거된 PBMC로부터의 수율은 7.6%였으며, 1일째에 CD137+에 대한 양성 선별 후, 상기 수율은 0.25%로 감소하였다 (7.6%의 3.3%). 배양 7일째에 확인하는 경우, CD137+ 세포의 양성 선별에 처리한 CD8 T 세포 시험군은 Tcm 세포의 백분율 면에서 대조군과 매우 흡사하였으며 (각각 67% 대 70%), Tcm 백분율에서 이들 군들 간의 이러한 유사서은 배양 10일째에도 유지되었다 (각각 54% 대 52%) (도 26).
증식 및 최종 세포수의 비교
e d c b a 군
(7.6) x (61) = 463% 61 7.6% 대조군
(0.25) x (72) = 18% 72 (7.6%로부터 3.3%) =
0.25% 		항-제3자 CD137+ 및 항 숙주 CD137-

네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC로 4:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후, 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 14일까지 증식되었다 ("대조군"). 다르게는, 네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC로 5.7:1의 비율로 자극시켰다. 활성화 후 14시간째에, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 양성 선별하였다. 그런 다음, CD137+ 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일까지 재-자극시켰다. 그 후 상기 세포를 IL-7 및 IL-15과 함께 10일까지 증식시켰다. 10일째에, IL-7 및 IL-15의 존재 하에 방사선 조사된 숙주 PBMC로 (1:2의 비율로) 활성화시켰다. 24시간 후, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 제거하였다. CD137 제거된 세포는 IL-7 및 IL-15와 함께 재-평판배양하고, 14일째까지 배양하였다 ("항 제3자 CD137+ 및 항 숙주 CD137-"). 선별된 날짜에, 세포는 트립판 블루 배제법으로 계수하였다.
a = 네이브 CD8 T 세포의 농화 후의 수율 (PBMC-흡착된 세포의 출발 개수의 백분율로 나타냄).
b = 제3자 DC를 이용한 활성화 및 CD137+ CD8 T 세포의 농화 후의 수율 (PBMC-흡착된 세포의 출발 개수의 백분율로 나타냄).
c = 13일째에, 0일로부터의 폴드 증식.
d = 14일째에, 0일로부터의 폴드 증식.
e = 최종적인 세포 수 = (수율) x (0일로부터의 폴드 증식) (PBMC-흡착된 세포의 출발 개수의 백분율로 나타냄).
더욱이, 세포 조성 (CD8 T 세포 %, NK 세포 % 및 NKT 세포 %)은 배양 7일 및 10일째에 조사하였으며, CD137+ 세포의 양성 선별을 처리한 CD8 T 세포 시험군은 이의 세포 조성에서 대조군과 매우 흡사하였다 (하기 표 4).
CD137+ 세포의 양성 선별에 의한 항-제3자 특이적인 CD8 T 세포의 농화는 세포 조성을 크게 변화시키지 않는다.
7일 (CD8 T 세포) CD3+CD8+ (NK56+) CD3- CD56+ (NK16+) CD3- CD16+ (NKT 56+) CD3+ CD56+ (NKT 16+) CD3+ CD16+
대조군 92.5 2 1.3 5.6 2.6
항-제3자 CD137+ 88 3.2 3.8 7.8 5.2
Day 10 (CD8 T 세포) CD3+CD8+ (NK56+) CD3- CD56+ (NK16+) CD3- CD16+ (NKT 56+) CD3+ CD56+ (NKT 16+) CD3+ CD16+
대조군 91.8 2.1 3.2 8.3 2.8
항-제3자 CD137+ 87 4.1 4 6.3 3.6

네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC로 4:1의 비율로 3일 동안 자극시켰다. 그 후, 상기 세포에 더 이상의 활성화 처리를 하지 않았으며, IL-7 및 IL-15를 포함하는 배지에서 10일까지 증식되었다 ("대조군"). 다르게는, 네이브 CD8 T 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC로 5.7:1의 비율로 자극시켰다. 활성화 후 14시간째에, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 양성 선별하였다. 그런 다음, CD137+ 세포는 IL-21의 존재 하에 방사선 조사된 동종 이계의 제3자 DC와 4:1의 비율로 3일까지 재-자극시켰다. 그 후 상기 세포를 IL-7 및 IL-15과 함께 10일까지 증식시켰다. 세포를 FACS 분석으로 세포 조성에 대해 조사하였다.
한편, 도 27에 나타내는 바와 같이, CD137+ 세포의 양성 선별을 처리한 CD8 T 세포 시험군은 두 시점 모두에서 대조군과 비교해 우수한 증식력을 나타내었다 (7일째에, 0일로부터의 폴드 증식이 각각 35 vs. 7이며, 10일째에 0일로부터의 폴드 증식이 각각 119 vs. 34임). 10일째에, CD137+ 세포의 양성 선별을 처리한 CD8 T 세포군을 2개의 시험군으로 나누었다. 제1 군에서, 세포는 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 14일까지 계속 증식하였으며 ("항 제3자 CD137+"), 한편 제2 시험군의 세포는 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 방사선 조사된 숙주 PBMC로 활성화시켰다. 활성화한 지 24시간 후, CD137+ 세포를 자기 소팅에 의해 제거하였다. 그런 다음, CD137 제거된 세포를 IL-7 및 IL-15의 존재 하에 재-평판배양하고, 14일까지 배양하였다 ("항 제3자 CD137+ 및 항- 숙주 CD137-").
13일째에 평가했을 때, CD137+ 세포의 양성 선별을 처리한 시험군의 CD8 T 세포들은 두 시점 모두에서 대조군과 비교해 우수한 증식력을 계속해서 나타내었다 (각각 134 vs. 61 폴드 증식). 이와 달리, CD137+의 항-제3자 양성 선별 및 항-숙주 CD137+ 세포의 제거를 모두 처리한 시험군의 CD8 T 세포는 14일째에 조사했을 때 낮은 증식력을 나타내었으며 (72 폴드 증식) (도 27), 이는 11일과 14일째 사이의 세포 증식이, CD137+ 항-숙주 특이적 동종반응성 T 세포의 제거에 의해 유발되지 않는 세포의 손실을 보상할 수 없음을 의미한다.
도 28에 나타내는 바와 같이, CD137 발현을 10일째에 평가했을 때, CD137+의 항-제3자 양성 선별을 처리한 총 CD8 T 세포 분획 중 0.5%만이 CD137+를 발현하였다. 따라서, 이 군의 CD8 T 세포는 CD137의 발현을 상당히 하향조절하였다 (1일째에 85%에서 10일째에 단지 0.5%).
그러나, (숙주 PBMC에 대해 1:2의 비율로) 방사선 조사된 숙주 PBMC로 활성화한 지 24시간 후, 총 CD8 T 세포 분획 중 CD137+을 발현하는 CD8 T 세포의 백분율은 16%로 증가하였다. 자기 소팅에 의해 이들 CD137+ 세포를 제거하면, 총 CD8 T 세포 분획 중 CD137+을 발현하는 CD8 T 세포의 백분율이 16%에서 3%로 감소하였다.
잔존하는 항-숙주 동종반응성의 최종적인 분석은 14일째에, 숙주 PBMC에 대한 자극 시 CFSE를 유지하는 세포의 수준을 IL-7의 존재 하의 제3자 PBMC와 비교함으로써 수행하였다.
도 29에 나타내는 바와 같이, 제3자 PBMC를 이용한 자극 후에 특이적으로 분열중인 세포의 수는, 대조군과 비교해 CD137 기재의 양성 및 음성 선별을 처리한 군에서 약 3배 더 높았다 (각각 2259 vs.741개의 분열중인 세포). 가장 중요하게는, 배양 종료 시 CD137+ 세포의 제거는 숙주 PBMC에 대해 반응하여 증식을 완전히 방지하였으며, 이와 달리 대조군은 검출가능한 증식을 나타내었다 (134개의 분열중인 세포). 흥미롭게는, 배양 종료 시 항-숙주 클론의 제거 없이 제3자에 대해 활성화된 세포의 양성 선별을 수행하는 군은 대조군과 비교해 숙주 반응성 세포의 수준을 높게 나타내었으며, 이는 (HLA 유형화에 의해 정교하게 미스매칭되었음에도 불구하고) 숙주의 MHC 알로타입(allotype)과 제3자 자극물질 간의 잠재적인 교차 반응성을 의미한다. 따라서, 배양 종료 시 항-숙주 제거 단계의 중요성은 명확하게 확인되며, 항-제3자 활성화된 세포의 제1 양성 선별의 잠재적인 역할을 알아보기 위한 추가적인 연구들이 요구되고 있다.
그러나, 상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, CD137 기재의 2단계 자기 소팅에 의한 항-숙주 특이적 클론의 성공적인 제거는 배양 종료 시 전체적으로 보다 낮은 세포 회수율을 제공한다 (PBMC-흡착성 세포의 투입 수로부터의 백분율로 나타내며, 각각 18% vs. 463%).
종합적으로, 이러한 예비실험은, CD137 활성화 마커를 기재로 하는 2-단계 자기 소팅에 의한 동종반응성의 제거가 실현가능하며, 숙주 비-반응성 동종 이계의 Tcm 세포를 생성하기 위한 현재의 프로토콜에 적용될 수 있음을 의미한다. 고무적인 이유로는 다음과 같다: 1) 양성 선별 시 동종 이계의 활성화에 의해 유도되는 높은 발현 수준이 10째에 완전히 하향조절되었으며, 이로 인해 숙주의 항원에 대한 또 다른 알로-활성화(allo-activation)가 가능하였다. 2) 세포 조성 및 Tcm 세포의 백분율은 CD137 활성화 마커를 기재로 하는 자기 소팅에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 3) 배양 종료 시 CD137+ 세포의 제거는, 검출가능한 증식 (134개의 분열중인 세포)을 나타낸 대조군과 달리, 숙주 PBMC에 반응하는 증식을 완전히 차단하였다. 현재의 연구들은 다음을 포함한다: 1) 양성 선별 단계 전, FcR 차단의 이용. 2) 배양 종료 시, 숙주 반응성 세포의 보다 효과적인 검출을 위해, PBMC 대신 숙주 DC의 사용. 3) CD25 또는 IFN 감마 캡처와 같은 보다 임상적으로 이용가능한 활성화 마커의 제거 단계에의 첨가.
결론 :
Tcm 생성의 종료 시에 CD137 제거를 이용하면, 이들 세포에서 동종반응성을 추가로 제거하는 실현가능한 방법을 제공할 것이다.
GMP 시약으로서 이용가능한 CD25 제거 및 CD137 제거의 사용을 계속 정제하려는 시도를 실험한다.
또한, 하나의 HLA-I 대립 형질만을 가지는 인공 APC를 사용함으로써 잠재적인 교차 반응성을 최소화하기 위해 실험을 수행한다.
본 발명은 이의 구체적인 실시 양태와 함께 기술되었지만, 당해 기술분야의 당업자는 다수의 변경, 변형 및 변화를 알 게될 것이 분명하다. 따라서, 첨부되는 청구항의 사상 및 광범위한 범위에 속하는 이러한 변경, 변형 및 변화를 모두 아우르는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 공개, 특허 또는 특허 출원이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 지시되는 것과 같이, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 본 출원에서 참조문헌의 언급 또는 식별은, 이러한 참조문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용되는 허락으로서 간주해서는 안된다. 섹션 주제(section heading)가 사용되는 한도에서, 이들은 본질적으로 한정하려는 것으로 간주해서는 안된다.

Claims (66)

  1. 중심 기억 T-림프구(central memory T-lymphocyte; Tcm) 표현형을 가지는 비-대숙주성이식편병 (GVHD) 유도성 항-제3자 세포(anti-third party cell)를 포함하는 세포군 분리물의 제조 방법으로서,
    상기 세포는 관용성-유도성 세포(tolerance-inducing cell)로서, 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있으며,
    상기 방법은:
    (a) 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CD4+ 및 CD56+ 세포 제거 능력이 있는 제제로 처리하여, CD8+ T 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 CD8+ T 세포를 IL-21의 존재 하에 제3자의 항원 또는 항원들과 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화하는 단계; 및
    (c) (b) 단계로부터 생성되는 상기 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 배양하여, 상기 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포를 증식시켜, 세포군 분리물을 제조하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    (b) 단계 전에 상기 PBMC로부터 흡착성 세포를 제거하는 단계; 또는
    (a) 단계 후 그리고 (b) 단계 전에 CD45RA+ 또는 CD45RO- 세포를 선택하는 단계;
    를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1 항에 있어서,
    (b) 단계로부터 생성되는 상기 세포를, (b) 단계 후 (c) 단계 전에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에, 제3자의 항원 또는 항원들과 함께 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 비-대숙주성이식편병 (GVHD) 유도성 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물의 제조 방법으로서,
    상기 세포는 관용성-유도성 세포로서, 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있으며,
    상기 방법은:
    (a) 비-흡착성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CD4+ 및 CD56+ 세포 제거 능력이 있는 제제로 처리하여, CD8+ T 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 CD8+ T 세포를 IL-21의 존재 하에 제3자 수지상 세포와 12시간 내지 5일 동안 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화하는 단계;
    (c) (b) 단계로부터 생성되는 상기 세포를 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 상기 제3자 수지상 세포와 함께 12시간 내지 3일 동안 배양하는 단계; 및
    (d) (c) 단계로부터 생성되는 상기 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 5일 내지 20일 동안 배양하여 상기 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포를 증식시킴으로써, 세포군 분리물을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 비-대숙주성이식편병 (GVHD) 유도성 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물의 제조 방법으로서,
    상기 세포는 항-질환 활성이 부여된 세포로서, 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있으며,
    상기 방법은:
    (a) 비-흡착성 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CD4+ 및 CD56+ 세포 제거 능력이 있는 제제로 처리하여, CD8+ T 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 CD8+ T 세포를 IL-21의 존재 하에 비-동계의(non-syngeneic) 수지상 세포와 12시간 내지 5일 동안 접촉시켜, 항원 반응성 세포를 농화하는 단계;
    (c) (b) 단계로부터 생성되는 상기 세포를 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 상기 비-동계의 수지상 세포와 함께 12시간 내지 3일 동안 배양하는 단계; 및
    (d) (c) 단계로부터 생성되는 상기 세포를 무-항원 환경 하에 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에 5일 내지 20일 동안 배양하여 상기 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 세포를 증식시킴으로써, 세포군 분리물을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제11 항 또는 제12 항에 있어서,
    (a) 단계 후 (b) 단계 전에 상기 PBMC로부터 CD45RA+ 또는 CD45RO- 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제1 항에 있어서,
    상기 IL-21의 존재 하에서의 상기 접촉이 12시간 내지 5일 동안 수행되는, 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제1 항에 있어서,
    활성화된 세포를 (b) 단계 후 (c) 단계 전에 선별하는 단계; 또는
    (c) 단계 후 동종반응성 세포를 제거하는 단계;
    를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제11 항에 있어서,
    활성화된 세포를 (b) 단계 후 (c) 단계 전에 선별하는 단계; 또는
    (d) 단계 후 동종반응성 세포를 제거하는 단계;
    를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제20 항 또는 제21 항에 있어서,
    상기 활성화된 세포의 선별이 CD137+ 또는 CD25+ 세포의 선별에 의해 수행되는, 방법.
  23. 제20 항 또는 제21 항에 있어서,
    상기 활성화된 세포의 선별이 상기 접촉 후 12시간 내지 72시간째에 수행되는 방법.
  24. 제6 항에 있어서,
    상기 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에, 상기 제3자의 항원 또는 항원들과의 상기 배양이 12시간 내지 3일 동안 수행되는, 방법.
  25. 제1 항에 있어서,
    상기 무-항원 환경 하에 상기 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에서의 상기 배양이 5일 내지 20일 동안 수행되는, 방법.
  26. 제1 항, 제11 항 또는 제12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무-항원 환경 하에 상기 IL-21, IL-15 및 IL-7의 존재 하에서의 상기 배양이 7일 내지 11일 동안 수행되는, 방법.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 제20 항 또는 제21 항에 있어서,
    상기 동종반응성 세포의 상기 제거가, 상기 중심 기억 T-림프구(Tcm)를 포함하는 상기 세포를 숙주 항원 제시 세포(APC)와 접촉시킨 후, CD137+ 또는 CD25+ 세포의 제거에 의해 수행되는, 방법.
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 제1 항, 제11 항 또는 제12 항에 있어서,
    T 중심 기억 표현형을 가지는 상기 항-제3자 세포가 CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+ 특징을 가지는, 방법.
  34. 제33 항에 있어서,
    상기 세포군 분리물 중 50% 이상이 CD3+CD8+ 세포이며, 이 중 50% 이상이 상기 특징들을 가지는, 방법.
  35. 삭제
  36. 제1 항, 제2 항, 제6 항, 제11 항, 제12 항, 제17 항, 제20 항, 제21 항, 제24 항 또는 제25 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되며, 중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물로서,
    상기 세포는 관용성-유도성 세포로서 이식 후에 림프절로 회귀할 수 있는, 세포군 분리물.
  37. 치료가 필요한 대상에서 질환의 치료에 사용하기 위해, 제1 항, 제2 항, 제6 항, 제11 항, 제12 항, 제17 항, 제20 항, 제21 항, 제24 항 또는 제25 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 중심 기억 T-림프구 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물을 포함하는 약학 조성물로서,
    상기 질환은 악성 질환, 이식물의 이식과 관련된 질환, 감염성 질환, 염증성 질환 및 자가면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  38. 제37 항에 있어서,
    상기 악성 질환이 백혈병 또는 림프종을 포함하는, 약학 조성물.
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 세포 또는 조직 이식이 필요한 대상을 치료에 사용하기 위해, 제1 항, 제2 항, 제6 항, 제11 항, 제12 항, 제17 항, 제20 항, 제21 항, 제24 항 또는 제25 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 중심 기억 T-림프구(central memory T-lymphocyte; Tcm) 표현형을 가지는 항-제3자 세포(anti-third party cell)를 포함하는 세포군 분리물을 포함하는 약학 조성물.
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 제41 항에 있어서,
    상기 세포 또는 조직 이식물이 미성숙 조혈모 세포를 포함하는, 약학 조성물.
  46. 제41 항에 있어서,
    상기 세포 또는 조직 이식물이, 간, 췌장, 비장, 신장, 심장, 폐, 피부, 장 및 림프(lymphoid)/조혈모 조직 또는 장기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  47. 제41 항에 있어서,
    상기 세포 또는 조직 이식물이 몇몇 장기의 공동-이식을 포함하는, 약학 조성물.
  48. 제47 항에 있어서,
    상기 공동-이식이 미성숙 조혈모 세포 및 실질 장기(solid organ)의 이식을 포함하는, 약학 조성물.
  49. 제48 항에 있어서,
    상기 미성숙 조혈모 세포 및 상기 실질 장기가 동일한 공여자로부터 수득되는, 약학 조성물.
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 제41 항에 있어서,
    상기 세포 또는 조직 이식 및 상기 세포군 분리물이 동일한 공여자로부터 유래되는, 약학 조성물.
  55. 제41 항에 있어서,
    상기 세포 또는 조직 이식물이 상기 대상과 동계이며,
    상기 세포군 분리물이 상기 대상과 비-동계인, 약학 조성물.
  56. 제41 항에 있어서,
    상기 세포 또는 조직 이식물이 상기 대상과 동계이며,
    상기 세포군 분리물이 상기 대상과 동계인, 약학 조성물.
  57. 미성숙 조혈모 세포 이식이 필요한 대상을 치료에 사용하기 위해, 제1 항, 제2 항, 제6 항, 제11 항, 제12 항, 제17 항, 제20 항, 제21 항, 제24 항 또는 제25 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 중심 기억 T-림프구 표현형을 가지는 항-제3자 세포를 포함하는 세포군 분리물을 포함하는 약학 조성물.
  58. 삭제
  59. 제57 항에 있어서,
    상기 미성숙 조혈모 세포 및 상기 세포군 분리물이 동일한 공여자로부터 유래되는, 약학 조성물.
  60. 삭제
  61. 제57 항에 있어서,
    상기 미성숙 조혈모 세포 및 상기 세포군 분리물이 상기 대상으로부터 유래되는, 약학 조성물.
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 제1 항에 있어서,
    중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 상기 비-대숙주성이식편병 (GVHD) 유도성 항-제3자 세포에는 항-질환 활성이 부여되는, 방법.
  65. 제11 항에 있어서,
    중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 상기 비-대숙주성이식편병 (GVHD) 유도성 항-제3자 세포에는 이식편대백혈병(graft-versus-leukemia)(GVL) 활성이 부여되는, 방법.
  66. 제36 항에 있어서,
    중심 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 가지는 상기 비-대숙주성이식편병 (GVHD) 유도성 항-제3자 세포에는 항-질환 활성이 부여되는, 세포군 분리물.






KR1020147009267A 2011-09-08 2012-09-06 항 제3자 중심 기억 ｔ 세포, 이의 제조 방법, 및 이식 및 질환 치료에서의 이의 용도 KR102073901B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161532172P 2011-09-08 2011-09-08
US61/532,172 2011-09-08
PCT/IL2012/050354 WO2013035099A1 (en) 2011-09-08 2012-09-06 Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140092298A KR20140092298A (ko) 2014-07-23
KR102073901B1 true KR102073901B1 (ko) 2020-02-05

Family

ID=47003163

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147009267A KR102073901B1 (ko) 2011-09-08 2012-09-06 항 제3자 중심 기억 ｔ 세포, 이의 제조 방법, 및 이식 및 질환 치료에서의 이의 용도

Country Status (15)

Country Link
US (3) US20140212398A1 (ko)
EP (1) EP2753351B1 (ko)
JP (1) JP6196620B2 (ko)
KR (1) KR102073901B1 (ko)
CN (1) CN103930130B (ko)
AU (1) AU2012305931B2 (ko)
BR (1) BR112014005355B1 (ko)
CA (1) CA2848121C (ko)
ES (1) ES2640813T3 (ko)
HK (1) HK1200099A1 (ko)
MX (1) MX351226B (ko)
RU (1) RU2636503C2 (ko)
SG (1) SG11201400513PA (ko)
WO (1) WO2013035099A1 (ko)
ZA (1) ZA201401993B (ko)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2365823B1 (en) * 2008-10-30 2016-11-30 Yeda Research And Development Company Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
CN103282047B (zh) 2010-09-08 2016-08-24 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中枢记忆性t细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途
CN103930130B (zh) 2011-09-08 2016-07-06 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中央型记忆t细胞、其产生方法以及其在移植和疾病治疗中的应用
GB201121308D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Cell Medica Ltd Process
AU2012351347B2 (en) 2011-12-12 2016-05-19 Baylor College Of Medicine Process of expanding T cells
IL302514A (en) * 2012-06-11 2023-07-01 Wilson Wolf Mfg Corporation Improved cell culture methods for stress cell therapy
WO2016168595A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 Barrett David Maxwell Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
CN104946588A (zh) * 2015-07-07 2015-09-30 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 一种抗原特异性t淋巴细胞的分离和高效扩增培养方法
CA2991690A1 (en) * 2015-07-16 2017-01-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified anti-third party central memory t cells and use of same in immunotherapy
JP6999941B2 (ja) 2015-09-18 2022-02-10 ベイラー カレッジ オブ メディスン 病原体からの免疫原性抗原同定および臨床的有効性との相関
US10691773B2 (en) 2015-12-30 2020-06-23 General Electric Company Cell processing techniques
AU2017283480A1 (en) 2016-06-13 2019-01-24 Torque Therapeutics, Inc. Methods and compositions for promoting immune cell function
JP2019524667A (ja) * 2016-06-24 2019-09-05 マックマスター ユニヴァーシティ 養子細胞移入と腫瘍溶解性ウイルスの併用療法
AU2017289879B2 (en) * 2016-06-27 2023-04-20 Yeda Research And Development Co. Ltd. Veto cells generated from memory T cells
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
CN110392736A (zh) * 2017-01-18 2019-10-29 耶达研究及发展有限公司 遗传修饰的反抑细胞及其在免疫治疗中的用途
JP7136454B2 (ja) * 2017-01-20 2022-09-13 国立大学法人京都大学 ＣＤ８α＋β＋細胞傷害性Ｔ細胞の製造方法
TW201834669A (zh) 2017-03-15 2018-10-01 美商歐卡生物系統公司 用於造血幹細胞移植的組合物及方法
EP3678701A4 (en) 2017-09-05 2021-12-01 Torque Therapeutics, Inc. THERAPEUTIC PROTEIN COMPOSITIONS AND METHOD FOR MANUFACTURING AND USING THEREOF
WO2019060558A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 Neximmune, Inc. CELLULAR COMPOSITIONS COMPRISING ANTIGEN-SPECIFIC T CELLS FOR ADOPTIVE THERAPY
CN108165529B (zh) * 2017-12-28 2021-07-16 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 中枢记忆性t细胞体及其外培养方法
AU2019217363A1 (en) * 2018-02-06 2020-08-20 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Closed-system manufacturing process for CAR-T cells
US11925640B2 (en) 2018-06-22 2024-03-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for improving arteriovenous fistula maturation and maintaining arteriovenous fistula functionality
WO2020010259A1 (en) * 2018-07-06 2020-01-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for improving transplant outcomes
EP3834833A4 (en) * 2018-08-10 2022-05-18 Eutilex Co., Ltd. TUMOR ANTIGEN-SPECIFIC CYTOTOXIC T CELLS
CN109628396B (zh) * 2019-01-24 2021-03-26 清华大学 记忆性淋巴细胞群在肝癌治疗中的应用
WO2021024264A2 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-viral central memory cd8+ veto cells in haploidentical stem cell transplantation
EP4055146A4 (en) * 2019-11-05 2023-10-18 Yeda Research and Development Co. Ltd USE OF VETO CELLS TO TREAT T-CELL-MEDIATED AUTOIMMUNE DISEASES
EP4055145A4 (en) * 2019-11-05 2023-10-25 Yeda Research and Development Co. Ltd USE OF VETO CELLS FOR THE TREATMENT OF SICKLE CELL DISEASE
CN115996732A (zh) * 2020-05-13 2023-04-21 Ａｇｃ株式会社 人专职性抗原提呈细胞的制造方法
CN116083359A (zh) * 2021-11-05 2023-05-09 瑞创生物技术有限公司 一种体外大规模扩增富含Tscm和Tcm的双阴性T细胞的方法
US20230288400A1 (en) * 2022-01-20 2023-09-14 3T Biosciences, Inc. T cell receptor (tcr) compositions and methods for optimizing antigen reactive t-cells
WO2023154761A2 (en) * 2022-02-08 2023-08-17 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Modified primary immune cells for induction or enhancement of immunotherapy

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002043651A2 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of utilizing cultured non-gvhd inducing t lymphocytes to treat disease
US6759035B2 (en) 2000-04-11 2004-07-06 University Of Southen California Method to prevent graft rejection using TGF-beta to induce T suppressor cells
WO2007023491A2 (en) 2005-08-24 2007-03-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Universal donor-derived tolerogenic cells for inducing non-syngeneic transplantation tolerance
WO2010049935A1 (en) * 2008-10-30 2010-05-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US6803036B1 (en) 1998-03-03 2004-10-12 University Of Southern California Use of cytokines, cells and mitogens to inhibit graft versus host disease
US6447765B1 (en) 1998-03-03 2002-09-10 University Of Southern California Use of cytokines and mitogens to inhibit graft versus host disease
WO2000039294A1 (en) 1998-12-24 2000-07-06 Novartis Ag Porcine cells incapable of expressing cd40 antigen, for xenotransplantation
US6544506B2 (en) 2000-01-05 2003-04-08 Yeda Research & Development Co. Ltd. Veto cells effective in preventing graft rejection and devoid of graft versus host potential
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
TWI322153B (en) 2000-07-03 2010-03-21 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
EP1241249A1 (en) * 2001-03-12 2002-09-18 Gerold Schuler CD4+CD25+regulatory T cells from human blood
PL204899B1 (pl) 2001-05-23 2010-02-26 Bristol Myers Squibb Co Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4
US20030147859A1 (en) 2001-06-18 2003-08-07 Yair Reisner Methods of utilizing cultured hematopoietic progenitor cells for inducing immunological tolerance
US20040136972A1 (en) 2001-09-07 2004-07-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of treating disease by transplantation of developing allogeneic or xenogeneic organs or tissues
AU2003228768B2 (en) 2002-05-22 2009-02-05 The Cleveland Clinic Foundation Induction and maintenance of tolerance to composite tissue allografts
IL165425A0 (en) 2004-11-28 2006-01-15 Yeda Res & Dev Methods of treating disease by transplantation of developing allogeneic or xenogeneic organs or tissues
BRPI0413326A (pt) 2003-08-04 2006-10-10 Bristol Myers Squibb Co métodos para tratar doença cardiovasculares empregando-se uma molécula ctla4 solúvel
EP1708737A2 (en) 2004-01-15 2006-10-11 Novo Nordisk A/S Use of interleukin-21 for the treatment of autoimmune diseases and allograft rejection
RU2346702C2 (ru) 2004-03-26 2009-02-20 Пфайзер Продактс Инк. Применение антител к ctla-4
WO2006041763A1 (en) 2004-10-04 2006-04-20 Novartis Ag Renin inhibitors for treating transplantation induced diseases
ES2601896T3 (es) * 2004-11-24 2017-02-16 Fred Hutchinson Cancer Research Center Procedimientos de uso de la IL-21 en la inmunoterapia adoptiva y la identificación de antígenos tumorales
MX2007012222A (es) 2005-04-06 2007-12-06 Bristol Myers Squibb Co Metodo para tratamiento de trastornos inmunes asociados con trasplante de injerto con moleculas mutantes ctla4 solubles.
GB0605217D0 (en) 2006-03-15 2006-04-26 Novartis Ag Method and compositions for assessing acute rejection
GB0606776D0 (en) 2006-04-03 2006-05-10 Novartis Pharma Ag Predictive biomarkers for chronic allograft nephropathy
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
WO2009053109A1 (en) 2007-10-24 2009-04-30 Anne Letsch Antigen-specific t-cell preparations from bone marrow
US8200915B2 (en) 2008-08-22 2012-06-12 Cadence Design Systems, Inc. Management of very large streaming data sets for efficient writes and reads to and from persistent storage
KR20120093978A (ko) 2009-10-27 2012-08-23 이뮤니쿰 에이비 항원 특이적 ｔ 세포의 증식 방법
WO2011140170A1 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Immunotherapy using redirected allogeneic cells
CN103282047B (zh) 2010-09-08 2016-08-24 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中枢记忆性t细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途
CA2810631A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. An immunosuppressive drug combination for a stable and long term engraftment
KR101976882B1 (ko) 2011-03-23 2019-05-09 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 세포 면역요법용 방법 및 조성물
EA027410B1 (ru) 2011-04-29 2017-07-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Наноносители, вызывающие иммунную толерантность, для снижения ответной реакции цитотоксических t-лимфоцитов
CN103930130B (zh) 2011-09-08 2016-07-06 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中央型记忆t细胞、其产生方法以及其在移植和疾病治疗中的应用
JP2015500279A (ja) 2011-12-08 2015-01-05 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド 哺乳動物胎児肺細胞および該細胞の治療的使用
CN104470542A (zh) 2011-12-22 2015-03-25 耶达研究及发展有限公司 用于稳定和长期植入的联合疗法
IL293944A (en) 2012-08-20 2022-08-01 Hutchinson Fred Cancer Res Method and preparations for cellular immunotherapy
WO2014039044A1 (en) 2012-09-06 2014-03-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing t memory stem cell populations
ES2824024T3 (es) 2012-10-10 2021-05-11 Sangamo Therapeutics Inc Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos
US9499855B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified T cells
US10238690B2 (en) 2013-03-15 2019-03-26 Celgene Corporation Modified T lymphocytes comprising an inducible caspase and methods of apoptosis
NZ726513A (en) 2014-05-28 2023-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-gitr antibodies and methods of use thereof
CA2991690A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified anti-third party central memory t cells and use of same in immunotherapy
WO2017203520A1 (en) 2016-05-22 2017-11-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of using pulmonary cells for transplantation and induction of tolerance
AU2017289879B2 (en) 2016-06-27 2023-04-20 Yeda Research And Development Co. Ltd. Veto cells generated from memory T cells
CN110392736A (zh) 2017-01-18 2019-10-29 耶达研究及发展有限公司 遗传修饰的反抑细胞及其在免疫治疗中的用途
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6759035B2 (en) 2000-04-11 2004-07-06 University Of Southen California Method to prevent graft rejection using TGF-beta to induce T suppressor cells
WO2002043651A2 (en) 2000-11-30 2002-06-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of utilizing cultured non-gvhd inducing t lymphocytes to treat disease
WO2007023491A2 (en) 2005-08-24 2007-03-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Universal donor-derived tolerogenic cells for inducing non-syngeneic transplantation tolerance
WO2010049935A1 (en) * 2008-10-30 2010-05-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment

Also Published As

Publication number Publication date
BR112014005355B1 (pt) 2022-03-29
EP2753351B1 (en) 2017-06-21
US11324777B2 (en) 2022-05-10
AU2012305931A1 (en) 2014-04-10
RU2014110897A (ru) 2015-10-20
CA2848121C (en) 2022-07-05
HK1200099A1 (en) 2015-07-31
MX351226B (es) 2017-10-05
US20230024587A1 (en) 2023-01-26
RU2636503C2 (ru) 2017-11-23
CN103930130B (zh) 2016-07-06
CN103930130A (zh) 2014-07-16
AU2012305931B2 (en) 2017-09-07
CA2848121A1 (en) 2013-03-14
US20180193384A1 (en) 2018-07-12
ZA201401993B (en) 2017-08-30
NZ622749A (en) 2015-10-30
BR112014005355A2 (pt) 2017-03-28
SG11201400513PA (en) 2014-06-27
EP2753351A1 (en) 2014-07-16
ES2640813T3 (es) 2017-11-06
MX2014002771A (es) 2015-02-04
US20140212398A1 (en) 2014-07-31
JP2014526244A (ja) 2014-10-06
KR20140092298A (ko) 2014-07-23
JP6196620B2 (ja) 2017-09-13
WO2013035099A1 (en) 2013-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102073901B1 (ko) 항 제3자 중심 기억 ｔ 세포, 이의 제조 방법, 및 이식 및 질환 치료에서의 이의 용도
RU2506311C2 (ru) Т-клетки центральной памяти против третьей стороны, способы их получения и их применение в трансплантации и лечении заболеваний
EP2613801B1 (en) Use of anti third party central memory t cells for anti-leukemia/lymphoma treatment
CA3172402A1 (en) Mitochondria-enriched genetically engineered cells and uses thereof
JP5549014B2 (ja) 免疫調節剤及びその利用
US20230149523A1 (en) Treatment of autoimmunity and transplant rejection through establishment and/or promotion of tolerogenic processes by fibroblast-mediated reprogramming of antigen presenting cells
NZ622749B2 (en) Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
A201 Request for examination
AMND Amendment
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant