ES2601896T3

ES2601896T3 - Procedimientos de uso de la IL-21 en la inmunoterapia adoptiva y la identificación de antígenos tumorales

Info

Publication number: ES2601896T3
Application number: ES05852204.6T
Authority: ES
Inventors: Cassian Yee
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 2004-11-24
Filing date: 2005-11-23
Publication date: 2017-02-16
Anticipated expiration: 2025-11-23
Also published as: JP2008521406A; WO2006065495A2; LT1814580T; EP1814580A2; CA2587136A1; PL1814580T3; PT1814580T; EP1814580B1; US20220204933A1; WO2006065495A3; US20100310533A1; US11306289B2; DK1814580T3; US9951310B2; US20190316088A1; US20150023938A1; HUE030210T2; US20060269973A1; CY1122390T1

Abstract

Procedimiento de identificación de un antígeno tumoral que comprende: el cultivo simultáneo de material tumoral aislado de un paciente junto con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en presencia de una composición de IL-21 y de células presentadoras de antígeno (APC); el aislamiento de una población de linfocitos T CD8+ del cultivo, en la cual el número producido de linfocitos T específicos de antígeno tumoral es más de 20 a 30 veces mayor que el número de linfocitos T específicos de antígeno tumoral producidos sin la presencia de la IL-21; la clonación de linfocitos T CD8+ individuales a partir de la población de linfocitos T CD8+; y la identificación del antígeno mediante la caracterización de los clones de linfocitos T por su especificidad antigénica.

Description

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El término “aislado”, cuando se aplica a un polinucleótido, designa que el polinucleótido ha sido eliminado de su medio genético natural y por tanto queda libre de otras secuencias codificantes indeseadas o extrañas, y se halla en una forma adecuada para el uso en sistemas de producción de proteínas genéticamente modificadas. Tales moléculas aisladas son aquellas que se separan de su entorno natural e incluyen el ADNc y los clones genómicos. Las moléculas aisladas de ADN de la presente invención están exentas de otros genes con los que suelen estar vinculadas ordinariamente, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' presentes de forma natural como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para cualquier persona versada en la materia (véase por ejemplo, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

Un polipéptido o proteína “aislado” es un polipéptido o proteína que se halla en un estado distinto al de su entorno original, como apartado de la sangre o de un tejido animal. En una realización preferida, el polipéptido aislado está sustancialmente exento de otros polipéptidos, en particular de otros polipéptidos de origen animal. Es preferible proporcionar los polipéptidos en forma altamente purificada, es decir, una pureza superior al 95% y más preferiblemente superior al 99%. Cuando se usa en este contexto, el término “aislado” no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, como dímeros o como alternativa, formas glucosiladas o derivatizadas.

El término “nivel” cuando se refiere a células inmunitarias, como las células NK, los linfocitos T, en particular los linfocitos T citotóxicos, los linfocitos B y similares, concierne al número de células o a la actividad de estas células. Un nivel elevado consiste en un mayor número de células o en una mayor actividad de la función celular.

El término “nivel” en alusión a las infecciones víricas se refiere a un cambio en el nivel de la infección viral e incluye, sin quedar limitado a ello, a cambios en el nivel de CTL o de células NK (tal y como se han descrito antes), un descenso de la carga viral, un incremento del título de anticuerpos antivíricos, un descenso de los niveles serológicos de alanina aminotransferasa, o una mejora determinada a través del examen histológico de un tejido u órgano de interés. La determinación de si tales cambios de nivel son diferencias o cambios significativos forma parte de las aptitudes del entendido en la materia.

El término “neoplásico”, cuando se refiere a las células, indica células sometidas a una proliferación nueva o anormal, en particular en un tejido en el que la proliferación progresa sin control desembocando en una neoplasia. Las células neoplásicas pueden ser malignas, esto es, invasivas y metastásicas, o benignas.

Un “polinucleótido” es un polímero mono o bicatenario compuesto de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que se lee del extremo 5' al extremo 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados de fuentes naturales, sintetizarse in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. El tamaño de los polinucleótidos se expresa en forma de pares de bases (abreviadas “pb”), nucleótidos (“nt”) o kilobases (“kb”). Cuando el contexto se presta, los dos últimos términos pueden describir polinucleótidos que son monocatenarios o bicatenarios. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias se usa para designar la longitud total y se entiende como equivalente al término “pares de bases”. Las personas versadas en la materia reconocerán que las dos cadenas del polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en su longitud y que los extremos de las mismas pueden quedar escalonados como resultado de la escisión enzimática; así pues, es posible que no todos los nucleótidos de la molécula bicatenaria estén apareados.

Un “polipéptido” es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, que puede ser producido de forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de unos 10 residuos de aminoácidos se denominan habitualmente “péptidos”.

Una “proteína” es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, como grupos de carbohidratos. Los carbohidratos y los otros sustituyentes no peptídicos pueden ser añadidos a la proteína por la célula en que se produce la proteína, y variar según el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente memoria en términos de su estructura primaria de aminoácidos; los sustituyentes como los grupos de carbohidratos en general no se especifican, pese a poder estar presentes.

El término “receptor” designa una proteína asociada a la célula que se une a una molécula bioactiva (un ligando) y media en el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura multipeptídica que comprende un dominio extracelular de unión a ligando y un dominio efector intracelular que normalmente interviene en la transducción de la señal. La unión del ligando al receptor provoca un cambio de conformación en el receptor que propicia la interacción entre el dominio efector y otras moléculas de la célula. Esta interacción a su vez conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los proceso metabólicos que están vinculados a las interacciones del receptor con el ligando incluyen la transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, aumentos de la producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de los lípidos de la membrana, adhesión celular, hidrólisis de los lípidos de inositol e hidrólisis de los fosfolípidos. En general, los receptores pueden estar unidos a la membrana o ser citosólicos o nucleares; monoméricos (p. ej. el receptor de la tirotropina o el receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (p. ej., receptor del PDGF, receptor de la somatotropina, receptor de la IL-3, receptor del GM-CSF, receptor del G-CSF, receptor de la eritropoyetina y receptor de la IL-6).

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que el cultivo contenga linfocitos T CD4+. Los linfocitos T específicos de antígeno se identifican y se analizan para caracterizar su especificidad antigénica (Véanse, van der Bruggen Science 254: 1643, 1991 y Engelhard y col., Mol. Immunol. 39: 127, 2002).

Es sabido que un gran número de linfocitos T específicos de MART-1 forman parte de la población virgen (Pittet et al, J. Exp. Med. 190:705, 1999), pero que también se pueden detectar frecuencias sustanciales de tales linfocitos T en la población de memoria (D'Souza y col., Int. J. Cancer 78:699, 2004), sin que estos se lleguen a multiplicar en presencia de la IL-21. En el caso de los pacientes con melanoma, el encuentro previo con células tumorales portadoras del antígeno puede desencadenar una transducción de la señal defectuosa entre los linfocitos T de memoria, lo cual impide que respondan a la estimulación de la proliferación propiciada por la IL-21 en condiciones in vitro (Zippelius, et al, Cancer Res. 64:2865, 2004; Lee y col., Nature Medicine 5:677, 1999).

Los linfocitos T sensibilizados con el antígeno experimentan una mayor proliferación y menos apoptosis cuando son expuestos a la IL-21 que sus homólogos no tratados, por consiguiente, se dan a conocer procedimientos para potenciar las vacunas basadas en linfocitos T y un adyuvante como tratamientos inmunológicos contra el cáncer. El tratamiento con IL-21 propició la regulación al alza de la expresión de CD28 y enriqueció una población de linfocitos T que expresaban un fenotipo único estable: CD8+, CD45RO+, CD28hi y CCR7-. A este fenotipo se le puede caracterizar como intermedio entre un linfocito T virgen (CD45RO-, CD28+, CCR7+) y uno de memoria (CD45RO+, CD28-, CCR7-/+) (Tomiyama, y col., J. Exp. 198:947, 2003). Los linfocitos T CD8+ CD28+ representan unos CTL potencialmente más eficaces para la inmunoterapia adoptiva, puesto que pueden proporcionar una señal autocrina activada por el antígeno para la proliferación. Tales linfocitos T CD8 independientes de los linfocitos cooperativos no precisarían ninguna ayuda externa en forma de linfocitos T CD4+ o de IL-2 para sobrevivir y multiplicarse (Ho y col., Cancer Cell 3:431. 2003; and Topp y col., J. Exp. Med. 198:947, 2003). Así pues, la presente invención permite tratar una enfermedad inmunomediada facilitándole al paciente una población de linfocitos T CD8+ provista de una actividad citotóxica potenciada sin contar o contar con la escasa presencia de citocinas, como la IL-2, o de linfocitos T CD4+. Los procedimientos son especialmente útiles para la multiplicación en condiciones ex vivo de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno, pero también podría ser útil en condiciones in vivo cuando esas citocinas adicionales provocan efectos secundarios indeseados o cuando las poblaciones de linfocitos CD4+ están comprometidas.

Los ejemplos dados a conocer en la presente memoria demuestran que la exposición a la IL-21 durante la estimulación primaria in vitro también propicia la generación de clones de linfocitos T específicos de antígeno dotados de una afinidad sistemáticamente mayor y mayor avidez por las células diana. Estos clones aparecieron representados por diversos TCR V betas, lo cual sugiere que esto probablemente no era el fruto de una población expandida a partir de un pequeño número de clones con alta afinidad, sino más bien de un efecto general sobre el repertorio de linfocitos T. Estudios precedentes han mostrado que cuando al cultivo se le incorporan citocinas como la IL-10, que regula a la baja la capacidad estimuladora de las APC, la probabilidad de aislar clones de linfocitos T provistos de alta afinidad aumenta (Tsai y col., Critical Rev. Immunol. 18:65, 1998). Se ha comprobado que la IL-21 detiene el proceso de maduración de las células dendríticas de ratón, lo cual reduce la expresión del MHC y disminuye la capacidad estimuladora de la activación de los linfocitos T (Brandt y col., Blood 102:4090, 2003). Con todo, en ese caso, la IL-21 se añadió a células dendríticas humanas que ya habían completado la maduración. En estudios preliminares, la adición de la IL-21 a las células dendríticas maduras no alteró la expresión en su superficie de las moléculas del MHC de clase I HLA-DR, CD80, CD83 y CD86 en comparación con las células dendríticas no tratadas. Sin pretender limitarse a la teoría, los resultados indican que la expresión frustrada de las moléculas estimuladoras en la superficie probablemente no explique la potenciación de la generación de linfocitos T con alta afinidad en condiciones in vitro. La preincubación de las células dendríticas humanas maduras con la IL-21 tampoco tuvo efecto alguno sobre la frecuencia o la afinidad de los linfocitos T CD8+ tetrámero+ que pudieron generarse.

El uso de la IL-21 para aumentar la respuesta por parte de los linfocitos T CD8 específicos de antígeno ha sido estudiada en modelos de ratón y se ha hallado que resulta muy eficaz a la hora de erradicar los tumores agresivos (Ma y col., J. Immunol. 171:608, 2002; Kishida y col., Mol. Ther. 8:552, 2003; Moroz y col., J. lmmunol 173:900, 2003). El efecto selectivo de la IL-21 sobre los linfocitos T vírgenes con respecto a los de memoria parece indicar una mayor influencia durante la sensibilización, y de hecho, los estudios en ratones revelan un potente efecto sensibilizador que se caracteriza por una lenta respuesta de rechazo y la inducción de una dilatada memoria antitumoral. La IL-21 fomenta la supervivencia a largo plazo de los linfocitos T CD8 específicos de antígeno previamente activados como resultado de la disminución de su apoptosis a través de un mecanismo indeterminado, pero en el que posiblemente intervenga la fosforilación de STAT3 o la inducción de un fenotipo central de memoria (Brenne y col., Blood 99:3756, 2002). Algunos de tales efectos pueden ser atribuibles a la regulación al alza del CD28 entre los linfocitos T CD8 tratados con la IL-21.

Los procedimientos basados en el uso de poblaciones de linfocitos T como células adoptivas para el tratamiento de pacientes humanos son conocidos por los médicos versados en la materia. En tales procedimientos se pueden usar poblaciones de linfocitos T preparadas de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente memoria y conocidos en la materia. Por ejemplo, el tratamiento con células adoptivas por medio de linfocitos infiltrados en el tumor, con linfocitos T específicos de un antígeno MART-1 ha sido puesto a prueba en la práctica clínica (Powell y col., Blood 105:241-250, 2005). Se ha vacunado a pacientes de carcinoma de células renales con células tumorales autólogas irradiadas. Las células recolectadas se activaron de forma secundaria con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y con IL-2, y después se volvieron a administrar a los pacientes (Chang y col., J. Clinical Oncology 21: 884-890,

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2003).

La presente descripción da a conocer procedimientos para potenciar la inmunoterapia adoptiva dotando al paciente de un nivel reforzado de inmunidad mediante la estimulación de linfocitos en condiciones ex vivo y su posterior readministración a dicho paciente. Las células son histocompatibles con el paciente y pueden ser alogénicas o autólogas. El procedimiento de preparación comprende el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del paciente, la multiplicación de tales células en cultivo hasta obtener un gran número de ellas en un medio de cultivo que contenga una composición de IL-21, y la posterior reintroducción de dichas células en los pacientes. El crecimiento de tales células efectoras, que incluyen células NK, células LAK y linfocitos T específicos de tumor, puede requerir otras citocinas adicionales como la IL-2 (Dudley y col., J. Immunother. 24:363-73, 2001) o la IL-15 (Marks-Konczalik y col., Proc Natl Acad Sci USA, 97:11445-50 2000; Waldmann TA. Nat Med., 9:269-77, 2003; Fehniger y col., Cytokine Growth Factor Rev., 13: 169-83,2002.) Una vez transferidas de nuevo las células a los pacientes, se recurre a procedimientos para mantener su viabilidad mediante el tratamiento de los pacientes con citocinas que pueden incluir la IL-21 y la IL-2 (Bear y col., Cancer Immunol. Immunother. 50:269-74, 2001; and Schultze y col., Br. J. Haematol.113:455-60, 2001). Como alternativa, una vez que se aíslan las PBMC, se pueden aislar entre ellas los linfocitos a fin de contar con un cultivo más homogéneo de linfocitos CD8+, y tales linfocitos se cultivan en presencia de una composición de IL-21 antes de readministrárselos al paciente. Puesto que la IL-21 puede aumentar la frecuencia de los linfocitos T hasta niveles que sean lo bastante altos para posibilitar la expansión y la transferencia adoptiva sin requerir ningún otro enriquecimiento de linfocitos T específicos de antígeno, la presente invención da a conocer procedimientos que pueden abreviar enormemente el tiempo necesario hasta recibir el tratamiento y obviar la necesidad de ulterior selección y/o clonación.

La presente descripción proporciona un procedimiento para preparar una población de linfocitos T para el uso como inmunoterapia adoptiva, el cual comprende la identificación de PBMC provistas de un fenotipo histocompatible con un paciente oncológico; el cultivo de material tumoral procedente del paciente junto con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en presencia de una composición de IL-21 y de células presentadoras de antígeno (APC), como son células dendríticas autólogas, monocitos, linfocitos B, estirpes de linfocitos B transformadas por EBV, estirpes de linfocitos B transformadas por EBV y alogénicas que expresen el alelo restringido común, células presentadoras de antígeno artificiales (Yee y col., Proc Natl Acad Sci. 99(25):16168. 2002; Oelke y col., Nat Med. 9(5):619-24, 2003; Maus y col., Clin Immunol. 106(1):16-22.2003; Cai y col., lmmunol Rev. 165:249-65, 1998); la expansión de tales células en cultivo; y, por último, la reintroducción de las mismas en el paciente. Las PBMC pueden ser autólogas. El material tumoral puede comprender péptidos, ARN total, células tumorales lisadas o cuerpos apoptóticos.

La presente descripción también proporciona un procedimiento para la preparación de una población de linfocitos T destinada al uso como inmunoterapia adoptiva que comprende la identificación de una población de linfocitos T provistos de un fenotipo histocompatible con un paciente oncológico; el cultivo de material tumoral procedente del paciente junto con la población de linfocitos T en presencia de una composición de IL-21 y de APC; la expansión de esos linfocitos en cultivo, y la reintroducción de los mismos en el paciente. La población de linfocitos T puede ser autóloga (Dudley y col., Science 290:850, 2002).

La presente descripción proporciona un procedimiento para la preparación de una población de linfocitos T destinada al uso como inmunoterapia adoptiva que comprende linfocitos T, mielocitos o PBMC (incluidas células NK) genéticamente modificados (mediante transducción vírica, transfección, electroporación u otros procedimientos para introducir material genético) para que expresen un receptor de linfocitos T o un receptor de linfocitos T quimérico fusionado con moléculas de señalización, que reconozca el antígeno diana; el cultivo en presencia de una composición de IL-21; y por último, la expansión de esos linfocitos en cultivo y la reintroducción de los mismos al paciente (Hughes y col., Hum Gene Ther 16(4):457, 2005; Roszkowski y col., Cancer Res 65(4):1570, 2005; Cooper y col., Blood 101: 1637, 2003; Alajez y col., Blood 105:4583, 2005). La población de linfocitos T puede ser autóloga.

La presente descripción también proporciona procedimientos para mejorar el tratamiento con vacunas antitumorales. Muchos tumores expresan antígenos extraños que podrían servir como dianas para la destrucción por parte del sistema inmunitario (Boon, T., Adv. Cancer Res. 58.177-21 I, 1992). Las vacunas contra el cáncer generan en el paciente una respuesta inmunitaria específica contra el tumor y generalizada que comprende componentes humorales y celulares. La respuesta la desencadena el propio sistema inmunitario del paciente tras administrarle una composición vacunal en un punto alejado del tumor o en el punto de un tumor localizado. Los anticuerpos o las células inmunitarias se unen al antígeno tumoral y lisan las células tumorales. Sin embargo, aún existe la necesidad de aumentar la proliferación de las poblaciones de linfocitos T que sean capaces de producir potentes respuestas inmunitarias en condiciones in vivo.

Se ha recurrido a numerosos procedimientos para inmunizar a los pacientes con antígenos tumorales; en estos momentos se emplean diversas técnicas para amplificar la potencia de la respuesta inmunitaria tras la administración del antígeno (revisado por Rosenberg, SA. (Ed.), Principles and practice of the Biologic Therapy of Cancer., 3ª edición, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2000). Los procedimientos con los que se puede usar la IL-21 combinada con una vacuna antitumoral incluyen, entre otros, la administración de células tumorales autólogas y alogénicas que o bien expresan el gen de la IL-21 o en que la IL-21 es liberada en el contexto de una proteína adyuvante. De modo similar, la IL-21 se puede administrar junto con una inyección de proteína antigénica

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tumoral purificada, de antígeno tumoral expresado a partir de ADN inyectado, o de péptidos del antígeno tumoral que son presentados a las células efectoras mediante tratamientos a base de células dendríticas. Ejemplos de tales tipos de tratamientos incluyen el uso de citocinas como la IL-2 en el contexto de la vacunación con células tumorales modificadas (Antonia y col., J. Urol. 167:1995-2000, 2002; y Schrayer y col., Clin. Exp. Metastasis 19:43-53, 2002), ADN (Niethammer y col., Cancer Res. 61:6178-84, 2001), y células dendríticas (Shimizu y col., Proc. Nat. Acad. Sci USA 96:2268-73, 1999). La IL-21 se puede usar como un adyuvante para vacunas antitumorales.

La determinación de la eficacia de la vacuna resulta difícil de evaluar. La demostración última de la eficacia es el ritmo de regresión del tumor, la duración de la supervivencia sin enfermedad, o como mínimo, el tiempo hasta la progresión, resultados que exigen el seguimiento del paciente durante años. Para proporcionar medios más inmediatos para evaluar la eficacia se encuentra en marcha una investigación con los denominados “marcadores indirectos” que permitirían hacer mediciones tempranas y predecir el resultado clínico. A día de hoy, las mediciones in vitro de las respuestas inmunitarias específicas de la vacuna y/o del tumor no han demostrado ser útiles como marcadores indirectos (véase, Srivastava P., Nat Immunol. 1:363-366, 2000).

En cualquier tratamiento contra el cáncer, cada protocolo puede definir las valoraciones de la respuesta del tumor de un modo distinto, pero se hallarán directrices a modo de ejemplo en el Clinical Research Associates Manual, Southwest Oncology Group, CRAB, Seattle, WA, EE.UU., 6 de octubre de 1998, actualizadas en agosto de 1999. Según el Manual CRA (véase el capítulo 7 “Valoración de la respuesta”), por respuesta del tumor se entiende la reducción o la eliminación de todas las lesiones o metástasis mensurables. La enfermedad se considera en general mensurable si comprende lesiones mensurables bidimensionalmente con márgenes claramente definidos mediante fotografía médica o radiografía, tomografía axial computerizada (TAC), resonancia magnética (RM) o palpación. Enfermedad evaluable significa que la enfermedad comprende lesiones mensurables en una sola dimensión, masas con márgenes difusos, lesión cuyos dos diámetros son inferiores a 0,5 cm, lesiones visibles en las imágenes cuyo diámetro es más pequeño que la distancia entre los cortes, lesiones palpables cuyo diámetro es inferior a 2 cm, o metástasis ósea. Enfermedad no evaluable incluye derrames pleurales, ascitis y enfermedad verificada por evidencias indirectas. Las lesiones previamente irradiadas que no han progresado también se consideran por lo general como no evaluables.

El resultado terapéutico positivo se puede medir con protocolos objetivos del estado para evaluar la respuesta del tumor sólido. Los criterios representativos son los siguientes: (1) Respuesta completa (RC), definida como la desaparición completa de toda la enfermedad mensurable y evaluable sin nuevas lesiones, y sin síntomas relacionados con la enfermedad. Ausencia de indicios de enfermedad no evaluable; (2) Respuesta parcial (RP), definida como un descenso mayor o igual al 30% con respecto al valor inicial en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones mensurables, sin progresión de la enfermedad evaluable ni nuevas lesiones. Según los criterios RESIST, los pacientes con al menos una lesión mensurable;(3) Progresión, definida como un incremento del 20% o de 10 cm2 en la suma de los productos de las lesiones mensurables con respecto a la suma más pequeña observada con las mismas técnicas en el momento inicial, o bien un claro empeoramiento de cualquier enfermedad evaluable, o la reaparición de cualquier lesión que hubiera desaparecido, o la aparición de una nueva lesión, o la imposibilidad de que el paciente sea evaluado de nuevo a causa de su muerte o del deterioro de su estado (siempre que la causa no sea ajena al cáncer); (4) Estable o Sin Respuesta, definida como no ser apto para ser calificado como RC, RP ni Progresión. (Véase, Clinical Research Associates Manual, supra.)

La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

A. Líneas celulares y reactivos

Líneas celulares de melanoma A375 (CRL 1619; American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE.UU.) y Mel526 (Arrighi y col., Cancer Res. 60 16: 4446-52, 2000; Marcinola et al. J lmmunother Emphasis Tumor Immunol. 19(3):192-205, 1996.) se mantuvieron en RPMl con HEPES (25 mM), L-glutamina (4 mM), penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 mg/ml), piruvato de sodio (10 mM), aminoácidos no esenciales (1 mM), y suero fetal bovino al 10% (Hyclone, Utah, EE.UU.). Ambas estirpes expresan el alelo HLA-A2, pero solo la Mel 526 expresa el antígeno MART-1. La estirpe celular T2 es un híbrido de linfocito T y B deficiente en TAP que expresa el alelo HLA-A2. Las líneas celulares EBV-LCL son líneas celulares linfoblastoides transformadas con el virus de Epstein-Barr (Yee, FHCRC, Seattle, WA, EE.UU.).

B. Inducción de los linfocitos T CD8+ humanos específicos de antígeno

Se generaron linfocitos T específicos del péptido M26-35 del melanoma (Yee y col., PNAS 99:16168, 2002; Yee y col., J. Immunol. 162:2227, 1999; Tsai y col., J. Immunol. 158:1796, 1997). La sangre procedente de donantes fue tipada por el laboratorio de tipado del HLA del Puget Sound Blood Center (Seattle, WA, EE.UU.). Primero, los linfocitos T CD8+ se aislaron primero mediante un kit de aislamiento de CD8+.

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La tinción con anexina V de los linfocitos T tetrámero-positivos en el día 7 revela un pequeño descenso de la fracción de los linfocitos T específicos de antígeno en apoptosis (anexina V+) en los cultivos tratados con la IL-21 con respecto a los cultivos no tratados (10,4% frente a 5,4% de linfocitos T tetrámero+, respectivamente, Figura 2). En conjunto, tales resultados indican que el incremento de la frecuencia y de las cifras absolutas de los linfocitos T CD8 específicos de antígeno generado en los cultivos tratados con la IL-21 obedeció principalmente a la potenciación de la proliferación de las células específicas de antígeno y, en menor medida, a la mayor supervivencia

o menor apoptosis de las mismas.

Ejemplo 3

La IL-21 potencia la respuesta de los linfocitos T específicos de antígeno en la población de CTL predominantemente vírgenes.

La capacidad de la IL-21 para potenciar la generación de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno se evaluó por separado en los linfocitos T vírgenes y en los de memoria. Las poblaciones purificadas de linfocitos T CD8+ vírgenes (> 98% CD45RA+, CD62L+) se compararon con las de los linfocitos T CD8+ de memoria (100% CD45RO+) procedentes tanto de un donante normal sano (CG) (Figura 5) como de un individuo con melanoma metastásico (ST). Si bien la IL-21 ejerce un efecto mínimo sobre la frecuencia de los linfocitos específicos de MART-1 generados a partir de los linfocitos T CD8+ de memoria (0,10% a 0,15% y 0,05% a 0,037%), sí se observó un incremento de 12 a 90 veces en la de los linfocitos T CD8+ vírgenes tras la exposición a la IL-21 (0,94% a 12,5% y 0,08% a 7,08%), lo cual prueba que la IL-21 influye principalmente en los linfocitos T vírgenes.

Ejemplo 4

Los CTL generados en los cultivos tratados con la IL-21 constituyen una población de linfocitos T específicos de antígeno y alta afinidad provista de una reactividad potenciada contra el tumor

Para caracterizar mejor la función de las poblaciones de linfocitos T específicas de antígeno generadas bajo la influencia de la IL-21 a nivel clonal, el séptimo día se seleccionaron linfocitos T CD8+ tetrámero+ procedentes de un donante sano (CG) y de un paciente con melanoma (ST) y se procedió a clonarlos a una dilución limitante en placas de 96 pocillos. Los clones específicos de MART-1 identificados en los ensayos de microcitotoxicidad se expandieron y se analizaron para determinar: 1) La concentración de péptido necesaria para lograr un 50% de la lisis máxima (P50) de las células T2 pulsadas con el péptido; y 2) La capacidad para lisar las dianas del melanoma portadoras del antígeno. Para evaluar la P50, la estirpe de linfocitos B transfectados por EBV con el HLA-A2, T2, se titularon con concentraciones del péptido comprendidas entre 107 y 102 pM. Los resultados se presentan en forma de la dosis necesaria de péptido (nM) para lograr el 50% de lisis (P50). Los clones de CTL generados a partir de los cultivos tratados con la IL-21 precisaron una dosis de péptido > 1 log inferior que sus contrapartidas no tratados: media de 3 nM (intervalo 0,6 a 30 nM) de los primeros en comparación con una media de 80 nM de los segundos (intervalo 16 a 500 nM) (Figura 6 A). En los clones de CTL generados a partir del paciente con melanoma (ST) se observó un efecto similar de la IL-21 (Figura 6B).

A una razón de 10:1 entre la célula efectora y su diana (E:T; por sus iniciales en inglés Effector/Target), los clones de linfocitos T aislados tras la estimulación en presencia de la IL-21 mostraron una actividad lítica específica mucho mayor contra la estirpe de células de melanoma 526 positiva para MART-1 (35%-45%) que los aislados sin la presencia de la IL-21 (Figuras 6C y 6D). En todos los clones individuales estudiados, la reactividad antitumoral potenciada coincidió con el descenso de la dosis necesaria de péptido, lo cual indica que los CTL generados en presencia de la IL-21 mostraron una mayor avidez hacia su diana afín.

Puede demostrarse que la avidez potenciada hacia el tumor es atribuible a la mayor afinidad del TCR y no a otros factores accesorios con ensayos de tinción de los TCR con tetrámeros. Si bien la intensidad de la tinción con tetrámeros en general se puede correlacionar con la afinidad del TCR (Yee y col., J. Immunol. 162:2227, 1999; Crawford y col., Immunity 8:675, 1998), es posible obtener una definición más precisa de dicha afinidad recurriendo a la velocidad de disociación de los tetrámeros, Kd, con respecto a su ligando TCR específico (Dutoit y col., J. Immunol. 168:675, 1990). En dicho ensayo, la Kd de la interacción entre el MHC-péptido y el TCR o afinidad del TCR es inversa a la fracción de tetrámeros unidos que permanece así con el tiempo en presencia de un exceso de tetrámeros sin marcar. Los clones de CTL activados en los cultivos tratados y no tratados con la IL-21 se tiñeron con tetrámeros con el péptido M27 conjugados con PE y se incubaron con un exceso de tetrámero-M27 sin marcar. La fracción de CTL que reconocieron los tetrámeros y se unieron a ellos se determinó por citometría de flujo en intervalos de tiempo predefinidos (2 a 60 minutos). Las constantes de disociación (off-rates) de los complejos de TCR/tetrámero-péptido resultaron ser sustancialmente más rápidas en los clones aislados de los cultivos no tratados que en los clones derivados de los cultivos tratados con la IL-21 (Fig. 7). En conjunto, tales resultados demuestran que el tratamiento con la IL-21 propicia la generación de clones de linfocitos T que expresan TCR de alta afinidad.

A fin de demostrar si el enriquecimiento de linfocitos T de alta afinidad mediado por la IL-21 se debía a una expansión oligoclonal de un escaso número de linfocitos T específicos de antígeno o representaba un efecto más amplio sobre el repertorio de linfocitos T, se examinó la expresión de la cadena V beta del TCR en las cohortes de clones de linfocitos T de alta y de baja afinidad con un conjunto de anticuerpos anti-V beta. Por ejemplo, en el caso

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del paciente CG, de los nueve clones de linfocitos T con alta afinidad, siete expresaron cadenas V beta únicas (solo dos compartieron la expresión de V beta comunes), y en el grupo de los clones de linfocitos T con baja afinidad de este paciente se observó un repertorio de TCR similarmente diverso (entre diez clones distintos con baja afinidad, solo dos compartían la misma V beta) lo cual parece indicar que el efecto de la IL-21 no obedeció meramente a la expansión de una población oligoclonal de clones de linfocitos T con alta afinidad en condiciones in vitro (Figura 3).

Ejemplo 5

El cultivo de linfocitos T CD8 específicos de antígeno con la IL-21 mantiene la expresión del CD28 y la producción de IL-2 y de IFN-γ

El CD28 es una molécula coestimuladora importante tanto para el desencadenamiento de la respuesta de los linfocitos T CD4 como de los CD8. La señalización a través del receptor CD28 refuerza la estabilidad del ARNm de la IL-2 y potencia la producción de esta interleucina, tanto en los linfocitos T CD4 como en los CD8 (Boise et al, Immunity 3:87-98, 1995; Ragheb et al, J. Immunol. 163:120-129, 1999). La expresión del CD28 se pierde en un subgrupo de linfocitos T CD8+ humanos tras su activación y este subgrupo exhibe una proliferación reducida tras la estimulación con anticuerpo anti-CD3 (Azuma et al, J. Immunol. 150:1147-1159, 1993). Los linfocitos T CD28-CD8+ son más numerosos en las personas ancianas y en el acervo de linfocitos T de memoria CD8 en las personas que sufren infecciones víricas persistentes, como las causadas por el EBV y los CMV (Posnett et al, Int. Immunol. 11:229-241, 1999). La pérdida de la expresión del CD28 es más pronunciada en los pacientes con VIH (Appay et al, Nat. Med. 8:379-385, 2002) y se han descrito incrementos de dicha población en los pacientes con melanoma. En fecha reciente, se ha mostrado que la restauración de la expresión del CD28 en linfocitos T CD8 específicos contra los CMV mantiene la producción de la IL-2 y prolonga la supervivencia de los linfocitos T CD8 específicos de antígeno en condiciones in vitro (Toppet al, J. Exp. Med. 198:947-955, 2005). Esta vía es reconocida por tanto como importante para prolongar la supervivencia y la función de los CD8.

Los CTL que reconocen el autoantígeno MART-1 se hallan en escaso número en la sangre periférica de los donantes sanos y normalmente se caracterizan por tener un fenotipo virgen (CD45RA+, CCR7+ y CD28int). Se ha examinado la diferenciación de esta escasa población en presencia de la IL-21. Linfocitos no tratados pero estimulados con el antígeno mostraron un fenotipo CD45RO+ acompañado por la pérdida de la expresión del CCR7 y del CD28 al cabo de una semana de cultivo. En contraste, los cultivos tratados con la IL-21 mostraron niveles sostenidos de expresión del CD28, aun cuatro semanas después de la estimulación primaria con el antígeno (Figura 10).Esta regulación al alza del CD28 se observó tanto en los donantes sanos no expuestos como en los pacientes con melanoma tanto en los CTL específicos para MART-1 como en los específicos para la gp-100.

Para valorar si la expresión al alza del CD28 propició una señal funcionalmente competente, en dichos cultivos se analizó la producción de IL-2 y de IFN-γ activada por el antígeno. Tal y como se aprecia en la Figura 11, la producción de la IL-2 aumentó sustancialmente en los linfocitos CD28hi tratados con la IL-21 en comparación con los linfocitos que expresaban CD28lo y que no fueron tratados. Asimismo, la producción de IL-2 resultó inhibida por la adición de CTLA-4lg, lo cual indica que la expresión del CD28 fue esencial para la producción de la IL-2 en dichos linfocitos.

Estos datos indican que, en condiciones in vitro, la IL-21 es capaz de inducir una población de linfocitos T CD8 de memoria que expresan el CD28 y que son capaces de producir la IL-2. Esto se podría traducir en una mayor supervivencia y activación de dichos linfocitos T CD8 en condiciones in vitro e in vivo y apunta a un importante papel del tratamiento con IL-21 como monoterapia y en la terapia con células adoptivas contra el cáncer y las infecciones víricas.

Ejemplo 6

La IL-21 influye en la respuesta de los linfocitos T CD8 frente a los antígenos gp100 y NY-ESO-1

Para demostrar que los linfocitos T reconocen otros autoantígenos, se evaluó de forma similar la influencia de la IL21 sobre los linfocitos T CD8+ usando otros dos autoantígenos asociados a tumores: el antígeno del melanosoma gp100 (péptido GI54) y el antígeno de cáncer-testículo NY-ESO-1 (NY157). Véase Li y col., J. Immunol. 175:22612269. 2005.

A los linfocitos T CD8+ se los estimuló en condiciones in vitro con células dendríticas autólogas pulsadas con el péptido NY-ESO-1 (NY157) o con el gp100 (G154). A los cultivos destinados a ser tratados con la IL-21 se les añadió esta citocina (30 ng/ml). Seis días después de la estimulación primaria in vitro se analizaron los cultivos para determinar la especificidad antigénica y el fenotipo de la superficie mediante la tinción con tetrámeros y el análisis multiparamétrico con citometría de flujo.

En el recuadro A de la Figura 13, las frecuencias de los CTL específicos del NY157 y del G154 se exponen en forma de porcentaje con respecto al total de linfocitos T CD8+ junto a las ventanas de análisis (gates) enmarcadas. Por ejemplo, el incremento de los CTL específicos del NY-ESO-1 fue 9,8 veces mayor en los linfocitos tratados con la IL21 que en los linfocitos control (5,3%:0,54%). Se calculó el incremento de la cifra absoluta de CTL específicos del NY-ESO-1 a partir del número de células en los respectivos cultivos y, en el caso del NY-ESO-1, se comprobó que

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los linfocitos que habían sido tratados con la IL-21 eran casi 20 veces más numerosos.

En el recuadro B de la Figura 13, se expone el análisis de la expresión del CD28 en los linfocitos tetrámero+ seleccionados procedentes de los cultivos tratados con la IL-21 y de los cultivos de control. (Todos los linfocitos eran CD45RO+ y CCR7-negativos). El análisis por histogramas de la expresión del CD28 en los CTL específicos del NY-OEST-1 y del gp1000 mostró que esta aparecía notablemente regulada al alza en los cultivos tratados con la IL-21 con respecto a los controles. Estos resultados son representativos de 6 experimentos independientes efectuados con 3 individuos que eran HLA-A2+.

Ejemplo 7

Potenciación de la inmunidad antitumoral en los pacientes con melanoma que reciben el tratamiento con la IL-21 después de haber sido sometidos a un tratamiento mielodepresor y a la transferencia de las células adoptivas

La terapia con células adoptivas (TCA) se basa en la selección en condiciones ex vivo de los linfocitos que reaccionan contra el tumor y en su activación en el hospedador portador del tumor autólogo. Los linfocitos T específicos de tumor (TIL) se activan y se expanden in vitro en presencia de los propios antígenos tumorales del paciente con la concurrencia de citocinas, y después se transfieren a dicho paciente que seguirá recibiendo un tratamiento de mantenimiento con citocinas. En un número sustancial de pacientes, ello provoca el alza del número de linfocitos T específicos de antígeno en la periferia resultando en efectos antitumorales, tal y como se evidencia a través de respuestas antitumorales objetivas. La IL-21 se emplea como activador/expansor in vitro de los linfocitos T específicos de antígeno y también como tratamiento de mantenimiento para los linfocitos T una vez que estos se transfieren a los pacientes con cáncer.

Todos los estudios con pacientes humanos cuentan con la aprobación del comité de ética de investigación clínica del hospital donde se efectuaron los ensayos clínicos. Tras otorgar el consentimiento informado, se obtienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se generan los linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (CTL) mediante el uso de células dendríticas pulsadas con el epítopo peptídico restringido a A2 de MART-1 (M27) o el de gp100 (G154) o por medio de un lisado de células tumorales extraídas por biopsia del tumor del paciente. Los linfocitos T se expanden en un reactor aprobado para las BPF con las citocinas oportunas (25-50 ng/ml de IL-2 o 1050 ng/ml de IrIL-21).En ciertos casos, al cabo de tres ciclos de estimulación a intervalos semanales, los linfocitos T se clonan y se expanden para proceder a su análisis in vitro. Se seleccionan los clones de CTL que demuestran lisar de forma específica las dianas tumorales portadoras del antígeno en cuestión en el ensayo de liberación de cromo. Los clones se expanden en ciclos de 14 días mediante la adición de un anticuerpo anti-CD3 (OKT3, Orthoclone; Ortho Biotech, Raritan, NJ, EE.UU.) a razón de 30 ng/ml, con PBMC alogénicas irradiadas, 106 células/ml, líneas celulares linfoblastoides alogénicas irradiadas (2 x l05 células/ml), e IL-2 en serie (aldesleukin; Chiron) a razón de 2550 unidades/ml cada 2 o 3 días. Todos los clones se caracterizan como CD3+, CD4-y CD8+, y expresan el receptor de la IL-2 de alta afinidad (CD25) tras la estimulación con antígeno.

A los pacientes con melanoma metastásico en estadio III-IV se les somete a quimioterapia sin mielodepresión, consistente en 2 días con ciclofosfamida (60 mg/kg) seguidos de 5 días con fludarabina (25 mg/m2).El día siguiente de recibir la última dosis de fludarabina, los pacientes reciben la infusión de linfocitos oncorreactivos (106-1010 células/infusión) y el tratamiento con citocinas (dosis alta de IL-2 720.000 UI/kg por vía i.v. cada 8 horas o 10-30 µg/kg de rlL-21 en diversas pautas posológicas). A algunos pacientes se les vacuna con 1 mg de péptido MART1:26-35 (27L) o de péptido gp100:209-217 (210M) acompañado del adyuvante incompleto de Freund (IFA) a través de una inyección subcutánea. Los parámetros hematológicos de los pacientes se controlan a diario. El resultado terapéutico positivo se puede medir con protocolos objetivos del estado para evaluar la respuesta del tumor sólido. La respuesta del paciente se evalúa con estudios radiológicos ordinarios y exploración física. Véase, Clinical Research Associates Manual, Southwest Oncology Group, CRAB, Seattle, WA, EE.UU., 6 de octubre de 1998, actualizado en agosto de 1999.

La presencia de respuesta RC y/o RP objetiva en este ensayo parece indicar el importante papel de la IL-21 en las respuestas antitumorales en el contexto de la terapia con células adoptivas mediante el cultivo de linfocitos in vitro junto con la IL-21 o el mantenimiento de los pacientes con la IL-21 tras haber recibido la terapia con células adoptivas (TCA).

Ejemplo 8

El cultivo in vitro junto con la IL-21 potencia los efectos antitumorales en un modelo de TCA en ratón

Los ratones transgénicos Pmel-1 han sido genéticamente modificados para expresar un receptor de linfocito T (TCR) que es específico del antígeno peptídico específico del melanoma humano gp10025-33 (Overwijk y col., J. Exp. Med. 198:569-580. 2003). Los esplenocitos de los ratones transgénicos pmel-1 se aíslan y se cultivan durante 6 o 7 días en presencia del péptido humano gp10025-33 en concentración 1 µM; los medios de cultivo contienen 30 UI/ml de IL-2 humana recombinante o 10-100 ng/ml de IL-21 de ratón.

A ratones hembra C57B116 (6 a 12 semanas de vida, Charles River Laboratories) se les inyectan por vía s.c. 25 x 105 células de melanoma B16-F10 y entre 10 a 14 días después reciben una transferencia adoptiva de

Claims

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