KR20190140912A - 면역성 조절을 위한 펩티드, 폴리펩티드 또는 세포의 제조 방법 - Google Patents

면역성 조절을 위한 펩티드, 폴리펩티드 또는 세포의 제조 방법 Download PDF

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KR20190140912A
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임나트 에스에이알엘
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Abstract

본 발명은 NKT 세포의 활성화 수준을 기반으로, CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 선택적으로 결합하는 펩티드 에피토프의 능력을 결정하기 위한 방법, 에피토프 또는 이의 측접 영역을 변형시켜서 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질과 펩티드 에피토프의 선택적 결합을 증가시키거나 또는 감소시키기 위한 해당 방법, 이들 방법에 의해 수득가능한 해당 변형된 에피토프 및 활성화된 NKT 세포 또는 이의 일부분에 관한 것이다.

Description

면역성 조절을 위한 펩티드, 폴리펩티드 또는 세포의 제조 방법
본 발명은 자연 살해 T (NKT) 세포를 활성화시키는 에피토프를 포함하는 펩티드를 제조하기 위한 방법, 및 선천성 면역 반응을 유발시키는 것이 유리한 병태, 예컨대 종양, 감염성 질환, 만성 자가면역 및 염증성 질환, 및 면역노화의 치료에서 그들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 동종항원이 치료 목적으로 투여되어야 하거나 또는 개체가 음식물에 노출되는 상황에서 사용을 위한 NKT 세포를 활성화시키는 그들 능력을 상실한 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 더 나아가서, 본 발명은 상기 동종항원의 면역원성을 억제하도록 변형된 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 종양 및 자가면역 질환의 요법을 위한 키메라 수용체를 보유하도록 조작된 세포에 관한 것이다.
선천성 면역은 외인성 또는 내인성 분자와 연관된 패턴에 특이적인 수용체에 의한 문제성 물질의 인식으로 유발된다는 의미에서 비특이적으로 간주된다. 따라서, 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP)은 Toll-유사 수용체 (TLR)와 같은 수용체에 결합되어 활성화되고, 예를 들어, 산화성 스트레스에 의해 생성된 분자는 손상-연관 분자 패턴 (DAMP)에 결합하여 활성화된다.
선천성 면역의 일부로 분류되는 NKT 계통의 세포는 NKT 세포가 제한 엘리먼트로서 작용하는 MHC-유사 CD1 분자를 발현하는 항원-제시 세포와 동족 시냅스를 형성할 수 있는 항원-특이적 수용체 (CD3)를 발현하는 한, 사실은 선천성 반응과 획득성 반응 사이의 중간 위치를 차지한다. NKT 세포는 CD1 분자에 결합된 지질 또는 당지질에 의해 인식되고 활성화된다.
이러한 활성화의 전형은 CD3 수용체의 일부로서 불변 알파 사슬을 보유하는 NKT 세포로 대표되고, CD1 분자의 별개 그룹 (그룹 2)의 유일한 성분인 CD1d의, CD1 분자와 연관된 제시를 통한 당지질 (알파-gal-세라마이드)의 제시에 의해 활성화된다. 따라서, NKT 세포에 대한 통상의 견해는 그룹 2 CD1d 분자에 의한 제시 상황에서 알파-gal-세라마이드에 의해 활성화되는, 불변 NKT (iNKT) 또는 1형 NKT 세포를 거의 독점적으로 포함한다 (리뷰, 예컨대 [Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368] 및 [Godfrey et al, Nature reviews Immunology 2010, 11: 197-206] 참조). 다양한 CD3 알파 사슬을 보유하는 덜 정의된 2형 NKT 세포는 또한 그룹 2 CD1d 분자에 의해 제시되는 지질 또는 당지질에 대한 특이성으로 구별된다.
그룹 1 CD1이라고 하고, CD1a, CD1b, CD1c 및 CD1e 분자를 포함하는 CD1 분자의 별개 그룹은 인간에서는 발현되지만 마우스에서는 발현되지 않는다. CD1 유전자좌는 염색체 1 상에서 코딩된다. 이러한 그룹 1 CD1 분자는 세포 표면 스크리닝, 세포내 수송, 및 감염원 또는 내생성 공급원으로부터 유래된 다수의 지질 또는 당지질의 세포 표면에서의 제시에 참여한다. 이의 최고의 예는 술파타이드 및 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis)에 감염된 세포 유래 산물이다 (Felio et al, Journal of Experimental Medicine, 2009, 206:2497-2509). 그들은 그 구조, 분포, 조절, 세포내 수송, 분자 상호작용 및 기능이 서로, 그리고 CD1d와 상당히 상이하다. CD1e는 세포내 환경에 국한되는 반면, CD1a, CD1b 및 CD1c는 세포의 표면에서 발현되어, 그와 같이 NKT 계통의 세포와 직접적으로 상호작용할 수 있다.
상기 인용된 선행 기술 전부에서, NKT 세포는 펩티드 서열이 아니라, 오직 지질 또는 당지질에 의해서만 인식되고 활성화되는 것으로 여겨진다.
그러나, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2012069568, WO2012069572, WO2012069575 및 WO2013174805는 내인성, 예컨대 GAD65, 및 외인성, 예컨대 바이러스 벡터 유래의 것인, 다양한 항원 유래의 수많은 CD1d-제한 펩티드 에피토프를 기술한다. 이러한 에피토프는 특히 측접한 잔기 내 옥시도-리덕타제 모티프와 조합될 때 (WO2012069568), 또는 단일 아미노산 잔기 돌연변이를 도입시켜 에피토프의 코어 서열의 결합을 증가 (WO2012069572)시켜서, 특이적 NKT 세포의 활성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 유사하게, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2012069575는 NKT 세포의 바람직하지 않은 활성화를 방지하기 위해서, 치료 단백질로부터 CD1d-제한 에피토프의 제거를 기술하고 있고, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2013174805는 혈우병 A의 치료를 위한 응고 인자 VIII의 투여로 인해 유발되는 NKT 세포의 CD1d-제한된 활성화를 감소시키기 위한 방법을 기술한다.
상기 특허 출원에 기술된 바와 같은 펩티드 에피토프-특이적 NKT 세포는 그룹 2 MHC-유사 제한 분자를 대표하는, CD1d에 의해 제한된다.
수많은 병리학적 상태, 그리고 특히 종양의 치료 및 세포내 병원체의 감염에 대해 막대한 미충족된 의학적 요구가 여전히 존재한다.
체크포인트 억제제를 표적화하는 치료적 항체 및 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 포함하여, 종양의 요법에서 상당한 진보가 이루어졌음에도 불구하고, 이들 접근법의 효능은 환자가 반응할 것이라고 예측할 가능성 없이 소수의 환자에 국한된다. 종양 미세환경의 복잡성, 이의 다능성, 관여되는 세포의 수 및 이러한 미세환경내에서 일반적인 면역억제 조건은 효율적이고 예측가능한 요법이 목표에 도달하지 못하게 한다.
종양은 많은 물질대사 이상성을 공유하고, 이것은 다른 조직은 피하게 하는 요법의 디자인을 위한 적절하고 안전한 표적을 구성할 수 있다. 유감스럽게도, 대부분의 종양 세포는 주요 조직적합 복합체 (MHC)를 포함하여, 분자의 표면 발현을 하향조절시키므로, 획득성 면역 반응에게 보이지 않게 된다. 또한, 복잡한 종양내 및 종양주변 조절 회로가 출현하여, 종양 세포를 제거하려는 면역계 시도를 중화시킨다.
세포내 병원체는 바이러스 질환, 박테리아, 마이코박테리아 및 기생충을 포함한다. 대부분의 이들 병원체는 감염된 세포의 활성화에 관여하는 MHC 기구, 어댑터 단백질 또는 경로의 성분들을 우회시켜 특별한 획득성 반응을 중화시키는 전략을 정교하게 만든다. 그리하여 감염된 세포는 획득성 면역 반응에 관여하는 세포에게 보이지 않게 된다. 그러나, 1형 및 2형 헤르페스 바이러스와 같이, 일부 예외적으로, 감염된 세포는 CD1 분자와 연관되어 그들 표면에서 항원을 제시하는 그들 능력을 유지한다. 실제로, 예를 들어 마이코박테리움 튜버큘로시스로 감염된 마크로파지는 그들 표면에서 CD1 분자에 결합된 지질을 발현시킨다는 것은 충분히 공지되어 있다.
역시 수많은 병리학적 상태에서, 특히 만성 자가면역 질환 및 만성 염증성 질환의 치료에서 막대한 충족되지 않은 의학적 요구가 존재한다.
종양 또는 감염과 연관되지 않은 만성 질환은 자가면역 및 염증성 성분 둘 모두를 포함한다. 이와 같이, 조직 염증은 흉선에서 생리적 노출의 결여때문에 내성이 획득되지 않거나, 또는 새로운 항원이 되기위해 염증에 의해 충분히 변형된 항원을 방출시킨다. 자가면역 반응은 염증의 원인이 되고 그리하여 질환 진행을 유지시키는 양성 피드백 기전을 일으킨다.
이러한 복잡한 발병기전은 사실상 예를 들어 면역계를 약화시키거나 또는 영향받는 장기로 세포의 접근을 제한하는 항염증성 약물 또는 치료적 항체와 같은, 비특이적 척도에 대한 모든 치료적 시도를 제한한다. 병리학에 직접적으로 관여하는 개시 항원 또는 적어도 하나의 항원을 동정할 수 있다면, 전반적인 질환 과정을 제어 하에 유지시킬 수 있는 항원-특이적 접근법을 개발하는 것이 실현가능하게 될 것이다. 복잡한 면역 반응을 억제하려는 시도가 있어왔다. 그러나, 모든 이러한 예들에서, 자가면역 병리학적 반응을 유발시키고 유지시키는 만성 자기항원 특이적 염증성 성분은 본질적으로 영향받지 않은 채로 남아 있는다.
그러므로 단지 소수만을 인용하면, 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 자가면역성 갑상선염 및 셀리악병을 포함한, 만성 자가면역 질환의 치료에서 극적으로 충족되지 않는 의학적 요구가 존재한다. 조절 특성을 갖는 NKT 세포를 유발시키는 것은 염증 및 자가면역 반응을 감소시키는 항원-특이적 방법을 의미한다.
만성 천식 및 만성 폐색성 또는 비폐색성 폐 질환에서, 많은 항원이 만성 염증을 촉발시키고 유지시킨다. 알레르겐 예컨대 집먼지 진드기로부터 유래되는 것들은 알레르기성 천식의 주요한 원인 중 하나를 대표한다. 만성 감염 예컨대 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 또는 만성 폐색성 폐질환에서 엘라스틴에 대한 면역 반응은 염증 반응을 촉발하는 항원의 근원을 나타낸다. 조절 특성을 갖는 NKT 세포를 유발시켜 염증을 감소시키는 것은 염증 및 그에 따른 국소 조직 파괴를 감소시키는 방법을 의미한다.
소포체 스트레스와 연관된 병태는 매우 많고 특별한 치료가 여전히 존재하지 않는다. 만성 자가면역 질환, 종양 또는 만성 세포내 감염 이외에도, 세포 면역노화를 초래하는 기전이 역시 이러한 스트레스 병태를 수반한다.
많은 예에서, 치료 목적을 위한 단백질의 투여는 그 결과로 치료제에 대한 면역 반응을 초래하여, 상기 치료제의 임의의 추가 투여를 불가능하게 한다. 이의 예는 혈우병 A를 앓는 대상체에서 응고 경로의 인자 VIII의 투여에 의해 제공되며, 치료된 대상체의 약 1/3이 인자 VIII의 기능을 억제하는 항-인자 VIII 항체를 생산한다. 폼페병을 앓는 대상체에서 산 알파-글루코시다제와 같은 효소의 투여도 유사하게 임의의 추가 투여를 불가능하게 하는 치료제에 대한 면역 반응이 뒤따른다. 3번째 예는 치료제로서 사용되며 림프구 표면 분자, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 대해 유도된 항체에 의해 제공된다. 전체적으로, 치료제에 대한 면역화를 방지하는 새로운 치료적 접근법을 찾는 것이 매우 바람직하다.
유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위한 바이러스 벡터의 사용은 이러한 바이러스 벡터가 면역 반응을 유발시켜서, 그 결과 벡터가 형질도입된 세포의 신속한 제거 및 이식유전자 발현의 신속한 소실을 초래한다는 사실로 인해 심하게 제한적이다. 바이러스 벡터는 바이러스 벡터의 성질에 따라서 가변적인 강도로 선천성 및 획득성 면역 반응의 활성화를 유발시킨다. 따라서, 아데노바이러스 벡터는 선천성 면역 반응과 이어서 획득성 면역 반응을 강력하게 자극한다. 아데노-연합 바이러스 벡터는 보다 약하게 선천성 반응을 촉발시키지만 항체 생성을 유발시킨다. 유전자 요법과 유전자 백신접종 둘 모두의 잠재력은 막대하다. 바이러스 벡터에 대한 선천성 및/또는 획득성 반응을 방지하는 치료적 접근법은 이 분야의 매우 중요한 진전을 의미한다.
많은 대상체가 그들이 자연적으로 노출되는 단백질에 대해 유발된 반응으로 고생하고 있다. 공기매개 또는 음식물 유래 알레르겐은 예컨대 알레르기성 비염 및 천식, 두드러기, 습진 및 아나필락시스 반응과 같은 반응들을 유발시킨다. 상기 대상체가 이러한 반응이 존재하는 이유는 오직 부분적으로만 규명되었다. 음식물 알레르겐, 셀리악병을 유발하는 밀 또는 대상체가 전문적인 이유로 노출되는 효소와 같은 생성물처럼 다양한 단백질의 선천성 면역원성을 감소시키는 것이 훨씬 유리하다.
특히 종양의 치료에서 CAR T 세포 효능은 T 세포의 기능적 특성, 및 표적 분자 발현의 특이성에 의해 여전히 제한적이다. NKT 세포의 세포독성 특성은 첫번째 경우에 분명한 장점을 의미하고 표적 세포의 표면 항원에 대한 항체 가변부를 보유하는 CAR NKT 세포는 이러한 표적 세포의 박멸에 개선된 효능을 제공하게 된다. 두번째 경우에서, NKT 세포에 의한 CD1-결합된 에피토프의 동족 인식의 정교한 특이성은 NKTCR T 세포를 생성시킬 가능성을 제공하고, 여기서 NKT 항원 수용체는 CD1-결합된 에피토프를 발현하는 세포만을 표적화하기 위해 그러한 대안적인 T 세포의 특이적 특성을 이용하는, 대안적인 계통의 세포를 형질감염시키는데 사용된다.
본 발명은 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 선택적으로 결합하는 에피토프 (소수성 에피토프)의 능력을 결정하기 위한 방법에 관한 것으로서, 방법은
a) CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포를 제공하는 단계;
b) 단리된 세포에 (시험하려는) 에피토프를 (선택적으로) 적용시키는 단계;
c) 잠재적으로 에피토프를 제시하는 단계 b의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계; 및
d) NKT 세포의 활성화 수준을 측정하는 단계
를 포함한다.
바람직하게, 이 방법은 e) 단계 d)의 활성화된 NKT 세포를 단리하는 단계를 더 포함한다.
유리하게, 단리된 NKT 세포는 인터페론 감마를 생성시키거나 또는 세포독성 활성을 발휘한다.
따라서 본 발명의 밀접하게 관련된 양상은, 바람직하게 암, 또는 세포내 병원체에 의해 발병된 질환, 또는 자가면역 질환의 치료에서, 약물로서 사용을 위한, (단계 e의) 단리된 NKT 세포, 이러한 단리된 NKT 세포의 T 세포 수용체 또는 이러한 단리된 NKT의 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산 분자이다 (특히 세포독성 활성을 발휘하지 않는 NKT 세포). 예를 들어, T 세포 수용체를 코딩하는 핵산은 이후에 CAR NKT 세포를 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
가능하게, 본 발명의 방법은 CD1d 단백질 상의 소수성 에피토프의 선택적 결합을 측정하는 단계를 더 포함한다.
유리하게, CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포는 이들 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질을 특별히 과발현시키도록 형질전환된 세포이다.
유리하게, CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포는 암성 세포, 자가면역 질환에 의해 표적화되는 세포, 알레르겐에 만성적으로 노출된 세포 또는 세포내 병원체가 감염된 세포이다.
가능하게, (소수성) 에피토프는 소수성 특성을 갖는 7 내지 20개의 연속되는 아미노산의 도메인이고, 예를 들어 아미노산의 20% 초과 (바람직하게, 25% 초과)는 소수성 (방향족 아미노산, 메티오닌, 발린, 류신, 이소류신, 시트룰린, 지질-변형된 아미노산 예컨대 시스테인)이고/이거나, 소수성 아미노산은 소수성 모멘트를 나타내도록 조직화된다.
유리하게, 에피토프는 종양, 세포내 병원체, 생물학적 단백질, 알레르겐, 자가 항원 또는 만성 염증 유발원 유래 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩티드이거나 또는 단리된 단백질 (또는 이의 단편)이다.
본 발명의 방법은 특히 번역후 변형된 아미노산을 포함하거나, 또는 잠재적으로 포함하는 (소수성) 에피토프(들)의 스크리닝을 위해 적합화되고, 바람직하게 상기 번역후 변형된 아미노산의 소수성은 상응하는 비변형된 아미노산보다 더 높다 (즉, 아실화, 디카복실화).
가능하게, 이 방법에서, 에피토프는 CD1d 에피토프 [FYWTH]X2X3[ILMV]X5X6[FYWTH] 가 아니다.
가능하게, 본 발명의 방법은 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c와 선택적으로 결합하고, 바람직하게 CD1d와 결합하지 않는 것으로 결정된 (소수성) 에피토프(들)를 선택하는 단계를 더 포함한다.
바람직하게, CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포는 CD1d 보다 높은 상기 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c의 발현도를 갖고, 보다 바람직하게 이들 단리된 세포는 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않는다.
유리하게, NKT 세포는 CD4+ (전혀 없거나 또는 오직 소량의 NKT CD8+ 및 NKT CD4- CD8- 만을 가짐; 즉, NKT 세포 중 75% 초과가 CD4+이고, 바람직하게, 90% 초과, 여전히 더 바람직하게 95% 초과임), CD8+, (전혀 없거나 또는 오직 소량의 NKT CD4+ 만을 가지며, 가능하게, 전혀 없거나 또는 오직 소량의 NKT CD4- CD8- 만을 가짐; 즉, NKT 세포 중 75% 초과가 CD8+이고, 바람직하게, 90% 초과, 여전히 더 바람직하게 95% 초과임), 바람직하게 αα 또는 ββ, 또는 CD4-/CD8- 이다.
관련 양상은 암, 세포내 병원체에 의한 감염, 자가면역 질환 또는 알레르기성 질환에 대한 백신접종에서 사용을 위한 본 발명의 방법으로 수득가능한 펩티드이고, 바람직하게 이러한 펩티드는 하나 이상의 아실화된 아미노산 또는 디카복실화된 아미노산을 포함한다.
본 발명의 다른 관련 양상은 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 결합하는 (소수성) 에피토프 (바람직하게, 펩티드 에피토프)의 능력을 증가시키기 위한 방법이고, 방법은
a) CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포를 제공하는 단계;
b) 이들 단리된 세포에 이 에피토프를 (특이적으로) 적용시키는 단계;
c) 단계 b의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계;
d) 이들 NKT 세포의 저 또는 비 활성화를 측정하는 단계;
e) 이 에피토프에 소수성 아미노산, 소수성 번역후 변형된 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 강화 모티프를 첨가하고/하거나, 이 에피토프로부터 비소수성 아미노산을 결실시켜, 변형된 에피토프를 생성시키는 단계,
f) 이들 단리된 세포에 변형된 에피토프를 적용시키는 단계;
g) 잠재적으로 변형된 에피토프를 제시하는, 단계 f의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계, 및
h) 단계 d의 측정과 비교하여, 단계 g에서 NKT 세포의 증가된 활성을 가능하게 하는 변형된 에피토프를 선택하는 단계
를 포함한다.
바람직하게, NKT 세포는 유리하게 에피토프의 생성을 가능하게 하는 CD8+ 또는 CD4-/CD8- (즉, 비 CD4+ NKT 세포), 및 증가된 세포독성 반응을 야기하는 세포이다.
바람직하게, 이 방법은 (단계 g 전에) 에피토프의 한쪽 또는 양쪽 측접 영역(들)에 팔미토일-시스테인 모이어티, CD8-특이적 결합 모이어티 (예컨대 TQQ 트리펩티드), Toll-유사-수용체 (TLR) 작용제 (바람직하게, CpG 올리고뉴클레오티드)를 첨가하고/하거나 이 에피토프의 양쪽 측접 영역에 시스테인 아미노산을 (바람직하게 시스테인 모티프 His-Cys-x-에피토프-x-C-H [여기서, H는 히스티딘을 나타내고, X는 0 내지 7개의 비한정 아미노산임]의 형태로) 첨가하는 단계를 더 포함한다.
가능하게, 에피토프는 암성 세포 또는 세포내 병원체로 감염된 세포로부터 유래된다.
바람직하게, 이 방법은 i) 단계 h)의 활성화된 NKT 세포를 단리하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 관련 양상은 암 또는 세포내 병원체에 대한 백신접종의 치료에서 사용을 위한 이 방법으로 수득가능한 펩티드이다.
대안적으로, CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 결합하는 (소수성) 에피토프의 능력을 증가시키기 위한 이 방법에서, NKT 세포는 바람직하게 강력한 조절성 에피토프 및/또는 NKT 세포를 생성시키는 것을 가능하게 하는, CD4+ (즉, 비 CD8+ NKT 세포 및 비 CD4-/CD8- NKT 세포)이다.
따라서, 이러한 양상에서, 유리하게 방법은 (단계 g 전에) 에피토프의 한쪽 또는 양쪽 측접 영역(들)에 팔미토일-시스테인 모이어티, CD4-특이적 결합 모이어티 (예컨대 RYD 트리펩티드)를 첨가하고/하거나, 양쪽 측접 영역에 시스테인 아미노산 (또는 상기 기술된 바와 같은 모티프)을 첨가하는 단계를 더 포함한다.
방법의 이러한 양상은 치료적 단백질, 예컨대 항체, 응집 인자 및 대체 요법에서 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들로부터 유래된 에피토프에 특히 유리하다.
그러므로 본 발명의 다른 관련 양상은 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질과 결합하는 (소수성) 에피토프의 능력을 증가시키기 위한 방법의 이러한 양상에 의해 수득가능한 치료적 단백질이다.
본 발명의 다른 관련 양상은 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질과 결합하는 (소수성) 에피토프의 능력을 감소시키기 위한 방법으로서, 방법은
a) CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포를 제공하는 단계;
b) 이들 단리된 세포에 이 에피토프를 특이적으로 적용시키는 단계;
c) 단계 b의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계;
d) NKT 세포의 유의한 활성화를 측정하는 단계,
e) 적어도 하나의 소수성 아미노산을 하나의 (유사한) 비소수성 아미노산으로 치환시키고/시키거나, (소수성) 에피토프로부터 하나의 소수성 아미노산을 선택적으로 제거하고/하거나, 번역후 변형된 아미노산을 상응하는 비변형된 아미노산으로 대체시켜서, 변형된 에피토프를 생성시키는 단계;
f) CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포에 변형된 에피토프를 적용시키는 단계;
g) 잠재적으로 변형된 에피토프를 제시하는, 단계 f의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계; 및
h) 단계 d의 측정에 비해, NKT 세포의 감소된 활성화를 측정하는 단계
를 포함한다.
유리하게, 에피토프는 바람직하게 항체, 응고 인자 및 대체 요법(예를 들어, 폼페병, 고세병 또는 파브리병의 치료)에서 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료적 단백질에 존재한다.
그러므로, 본 발명의 관련된 양상은 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 결합하는 (소수성) 에피토프의 능력을 감소시키는 이 방법으로 수득가능한 치료적 단백질이고, 이러한 (변형된) 단백질은 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 및 생물제제에 대한 면역 반응으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료에서 사용을 위한 것이다.
본 발명의 다른 관련된 양상은 에피토프 (바람직하게 CD1a, CD1b, CD1c, 또는 CD1d에 특이적인 펩티드 에피토프, 또는 MHCII 에피토프)를 제시하는 세포의 능력을 증가시키기 위한 방법으로서, 이 방법은 상기 에피토프의 한쪽 또는 양쪽 측접 영역(들)에 소수성 아미노산, 팔미토일-시스테인 모이어티, CD4-특이적 (예컨대 RYD 트리펩티드) 또는 CD8-특이적 모티프 (예컨대 TQQ 트리펩티드)를 첨가하거나 또는 에피토프의 양쪽 측접 영역에 시스테인 아미노산 (또는 상기 기술된 바와 같은 모티프)을 첨가하는 단계를 포함하고, 바람직하게 측접 영역은 에피토프의 상류 또는 하류의 10개 미만의 아미노산이다.
본 발명의 다른 관련된 양상은 혈액 또는 조직 샘플에서 NKT 세포를 검출, 단리 또는 고갈시키기 위한 시험관내 방법이고, 이 방법은 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질을 포함하는 표면을 제공하는 단계, 상기 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 결합하고 NKT 세포를 활성화시키는 것으로 결정된 에피토프를 상기 표면에 적용시키는 단계, 및 상기 에피토프를 포함하는 표면에 상기 혈액 또는 조직 샘플을 적용시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 그룹 1 CD1 분자 (CD1a, CD1b 및/또는 CD1c)와의 특이적 결합을 통해서 NKT 세포의 활성화를 촉발시키는 능력을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
그러므로, 본 발명은 치료적 특성을 제시하는 에피토프를 포괄하는 신규한 펩티드를 디자인하는 것을 가능하게 한다. 실제로 그룹 1 CD1 분자 (CD1a, CD1b 및/또는 CD1c)에 결합하는 펩티드의 능력은 그룹 1 CD1 분자에 제시를 통해서 NKT 세포를 활성화시키는 에피토프를 포함하는 백신제를 디자인하기 위해 측정될 수 있거나, 또는 그룹 1 CD1 분자 (CD1a, CD1b 및/또는 CD1c)에 결합하는 펩티드의 능력은 특이적 NKT 세포의 활성화를 조절 (증가 또는 감소)시키기 위해 조율될 수 있다.
NKT 세포의 활성의 특이적 조절은 예를 들어, 종양, 세포내 병원체와 연관된 감염, 자가면역 질환, 알레르기 또는 만성 감염에 의한 조직-특이적 만성 염증, 및 만성 소포체 스트레스를 특징으로 하는 상황에서 치료적 적용을 가능하게 한다.
관련 양상은 특이적 NKT 세포, 및 이의 엘리먼트, 예컨대 그들 T 세포 수용체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자의 제조, 및 종양, 세포내 병원체와 연관된 감염, 자가면역 질환, 알레르기, 또는 만성 감염에 의한 조직-특이적 만성 염증에서의 치료적 적용, 및 만성 소포체 스트레스를 특징으로 하는 상황을 위한 그들의 용도이다.
본 발명은 NKT 세포를 천연적으로 활성화시키는 펩티드 또는 폴리펩티드, 및 NKT 세포를 활성화시키는 그들 능력을 억제하기 위해 아미노산 돌연변이, 결실 또는 첨가에 의해 이러한 능력이 제거된 펩티드 또는 폴리펩티드를 디자인하는 것을 가능하게 하고, 예컨대 응고 인자, 치료적 항체, 효소, 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종의 실시를 위한 바이러스 벡터와 같이, 동종항원이 투여되어야 하는 치료적 적용을 위한 이러한 변형된 펩티드 또는 폴리펩티드의 용도를 기술한다.
본 발명은 NKT 세포의 표면에서 발현하는 항체 수용체를 보유하는 CAR NKT 세포를 디자인하는 것을 가능하게 하고, 대안적인 T 세포 예컨대 CD4+ 이펙터 또는 조절성 T 세포, 또는 CD8+ 세포독성 세포의 잠재성을 이용하는 NKTCR T 세포의 디자인을 가능하게 한다. 본 발명은 이러한 세포 및 종양 또는 자가면역 질환에서 그들의 치료적 적용을 포괄한다.
본 발명의 다른 관련 양상은 NKT 세포를 단리 및 확장시키기 위한 방법, NKT 세포가 질환 식별 및 추적조사를 위한 바이오마커로서 사용되는 진단 목적을 위한 방법, 및 생물학적 샘플로부터 NKT 세포를 고갈시키기 위한 방법에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은 치료적 목적을 위해서 그룹 1 CD1 분자 (CD1a, CD1b 및/또는 CD1c)에 결합하는 그들 능력 및/또는 NKT 세포를 활성화시키는 그들 능력을 기반으로 면역원성 펩티드를 동정하기 위한 방법에 관한 것이다.
면역원성 펩티드는 종양-연관 항원, 세포내 병원체, 자기항원, 알레르겐 또는 세포외 감염원으로부터 유래되고, 예방 또는 억제 상황에서, 해당 질환의 치료를 위해 사용된다.
반대로, 본 발명은 종양과 연관된 펩티드 항원, 세포내 병원체, 자기항원, 알레르겐 또는 세포외 감염원에 특이적인 NKT 세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 펩티드 항원은 그룹 1 CD1 분자 (CD1a, CD1b 및/또는 CD1c)를 발현하는 세포에 의해서 단리된 NKT 세포에게 제시된다.
이 방법은 종양, 세포내 병원체, 자기항원, 알레르겐 또는 세포외 감염원에 특이적인 NKT 세포의 제조, 검출, 또는 고갈을 위해 적합화될 수 있고, 여기서 NKT 세포를 포함하는 샘플은 상응하는 펩티드 항원이 적재된 그룹 1 CD1 분자 (CD1a, CD1b 및/또는 CD1c)를 포함하는 표면과 접촉된다.
본 발명은 또한 종양 및 세포내 감염의 치료에서 사용을 위해서, 또는 자가면역 질환, 알레르기 또는 만성 염증성 질환의 요법을 위해서 펩티드의 조절 특성 또는 면역원성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이고, 이 방법은 CD1-에피토프의 측접 잔기에 위치하는 강화 모티프의 첨가 단계를 포함한다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드" 또는 "펩티드성"은 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 초과 아미노산의 아미노산 서열을 포함하는 분자를 의미한다. 본 발명의 문맥에서, (예를 들어, 연결 유기 화합물과 같은) 비아미노산 구조가 펩티드 상에 그라프트될 수 있고 따라서 용어 "펩티드"는 비펩티드성 모이어티를 더 포함하는 펩티드 분자를 포괄할 수 있다 (바람직하게, 펩티드성 모이어티는 분자의 가장 큰 부분을 나타내고, 아미노산 중량: 총 중량 >50%임). 본 발명에 따른 펩티드는 임의의 통상적인 20개 아미노산 또는 이의 변형된 형태를 함유할 수 있거나, 또는 화학적 펩티드 합성 또는 화학적 또는 효소적 변형에 의해 도입된 비천연 발생 아미노산을 함유할 수 있다. 용어 "펩티드" 또는 "면역원성 펩티드"는 독립적으로 사용된다. 용어 "펩티드" 또는 "단백질"은 평등하게 사용되지만, "단백질"은 천연적으로-존재하는 긴 펩티드 (또는 생물제제), 예컨대 혈우병 또는 폼페병, 고셔병 또는 파브리병의 치료시에 대체 요법에서 사용되는 펩티드에 대해 우선적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용시 용어 "에피토프"는 항체 또는 이의 일부분 (Fab', Fab2' 등) 또는 B 또는 T 세포 림프구의 세포 표면에서 제시되는 수용체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되어, 상기 결합에 의해 면역 반응을 유도시킬 수 있는, 단백질의 하나 또는, 덜 바람직하게, 몇몇 부분 (입체형체적 에피토프를 한정할 수 있음)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원"은 하나 이상의 햅텐(들)을 포함하고/하거나 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 거대분자의 구조를 의미한다. 전형적으로, 상기 거대분자는 (폴리사카라이드가 있거나 또는 없는) 단백질 또는 펩티드이거나 또는 단백질 조성물로 만들어지고 하나 이상의 에피토프를 포함하며, 상기 거대분자는 대안적으로 "항원성 단백질" 또는 "항원성 펩티드"라고 할 수 있다.
용어 "측접 잔기"는 그룹 1 CD1 분자에 의해 결합되고 NKT 세포에 의해 더욱 인식되는 에피토프의 코어 결합 영역 외부에 위치되는, 아미노산 잔기를 의미하고, 본 발명의 문맥에서, "측접 잔기"는 그룹 1 CD1 에피토프의 N-말단 및/또는 C-말단에서 1개 내지 20개 아미노산 (바람직하게, 2 내지 10개 아미노산)의 영역에 상응한다.
용어 "강화 모이어티" 또는 "강화 모티프"는 (i) NKT 세포의 활성화를 증가시키거나 또는 NKT 세포 활성을 조절하기 위해서 에피토프에 첨가되고, 에피토프의 측접 잔기 내에 위치된 펩티드 서열, 또는 (ii) TLR의 작용제로서 DNA 또는 RNA 서열, 또는 (iii) 짧은 알킬 서열, 또는 (iv) 전술한 것의 임의 조합을 의미한다.
용어 "소수성 아미노산"은 바람직하게 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판, 티로신), 지방족 아미노산 (발린, 이소류신, 류신, 메티오닌), 아실화 아미노산, 및 디카복실화 아미노산 예컨대 시트룰린을 의미한다. 유사한 특성 (즉, 예를 들어 물:옥탄올 분배 계수에 따라 결정됨)을 공유하는 다른 비통상적이거나 또는 인공적인 아미노산이 또한 본 용어에 포괄된다.
용어 "NKT 세포"는 그들이 마스터 전사 인자 PLZF를 발현하고 수용체 예컨대 CD162 및 NKG2D를 보유한다는 사실을 특징으로 하는 선천성 면역계의 세포를 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 달리 명백하게 언급하지 않으면, NKT 세포는 CD1a, CD1b 또는 CD1c의 그룹 1 CD1 분자에 의해 제시되는 에피토프를 인식하고, 이러한 인식 시에 (특이적으로) 활성화된다. NKT 세포는 MHC-유사 CD1 제한 엘리먼트를 발현하는 항원-제시 세포와 동족 시냅스를 형성할 수 있는 항원-특이적 수용체 (CD3)를 발현한다.
용어 "NKT 세포 에피토프"는 T 림프구의 세포 표면에서 수용체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 항원성 단백질의 일부분을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 달리 명확하게 언급하지 않으면, NKT 세포 에피토프는 그룹 1 CD1 분자에 의해 결합된 에피토프이다.
"CD1 분자"는 지질, 당지질 또는 소수성 펩티드를 NKT 세포에게 제시할 수 있고 한쪽 또는 양쪽 측면 상에 개방된 깊은 소수성 그루브로 배열되는 베타 사슬의 역-평형 세트 및 3개 알파 사슬로 만들어진, 비-MHC 유래 분자, 또는 MHC-유사 분자를 의미한다.
용어 "NKTCR T 세포"는 펩티드-CD1 복합체에 대해 특이성을 갖는 NKT 세포 클론으로부터 수득된 수용체로 형질감염 또는 형질도입된 T 세포 또는 NKT 계통, 또는 클래스 I (CD8+) 또는 클래스 II-제한된 (CD4+) 계통을 의미한다.
용어 "CAR NKT 세포"는 임의로 신호전달 도메인을 갖는 TCR의 불변 부분, 항체 (또는 가변 사슬을 포함하는 이의 일부분)를 함유하는 구성체로 형질감염된 NKT 세포를 의미한다.
용어 "면역 장애" 또는 "면역 질환"은 면역계의 반응이 유기체에서 기능장애 또는 비생리적 상황을 담당하거나 또는 유지하는 질환을 의미한다. 본 발명의 문맥에서 면역 장애는 감염원 및 종양 감시에 의해 유도된 병상, 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 및 염증 또는 소포체 스트레스 상태에 만성 노출로 인한 질환을 의미한다.
용어 "치료적 생물제" 또는 "생물제제"는 동일한 종의 2 개체를 비교할 때, 다형성을 나타내거나, 또는 그룹 1 CD1 분자에 결합할 수 있고 NKT 세포를 활성화시킬 수 있는 에피토프를 보유하는 단백질, 펩티드 또는 인자 (즉, 임의의 펩티드 분자), 및, 보다 일반적으로, 생물제제를 수용한 대상체에서 (동종반응성) 면역 반응을 유도하는 임의의 단백질, 펩티드 또는 인자를 의미한다.
CD1 분자는 MHC 클래스 1 분자의 것과 유사한 일반적인 폴드로 베타-2 마이크로글로불린과 비공유적으로 회합된 중쇄의 이종이량체이다. 그들은 그 아키텍처가 분자 간에 훨씬 가변적인 소수성 잔기에 결합할 수 있는 그루브를 형성한다. CD1 분자는 기능, 세포 발현 및 세포내 수송의 관점에서 훨씬 상이하여, 그들의 비중복적 기능을 강조한다.
그러므로 본 발명은 CD1a, CD1b 또는 CD1c에 결합하는 능력을 갖는 소수성 펩티드 에피토프가 NKT 세포를 동원하여 활성화시키는 방법에 관한 것이다. 상기 에피토프는 항원-특이성을 보장하므로, 본 명세서에 기술된 방법은 몇몇 치료적 적응증에서 선천성 면역을 증가시키거나 또는 조절하기 위한 항원-특이적 접근법을 의미한다.
소수성 에피토프에 의해서, 이는 이러한 소수성 특성을 갖는 번역후 변형된 아미노산을 포함하는, 소수성 아미노산의 연속을 포함하는 에피토프를 의미하는 것이다. 소수성 아미노산의 연속은 몇몇 소수성 아미노산의 선형 스트렛치, 또는 소수성 모멘트일 수 있고, 이러한 연속은 에피토프의 (2D 또는 3D) 입체형태에 기인한다. 이러한 소수성 모멘트의 예측을 위한 도구가 존재한다.
본 발명은 적어도 하나의 CD1a-제한성, CD1b-제한성 및/또는 CD1c-제한성 T 세포 에피토프를 포괄하는 소수성 펩티드에 관한 것이다.
3종의 그룹 1 CD1 제한 엘리먼트는 그들의 일반 구조 및 발현 패턴이 서로 상당히 상이하므로, 개별적으로 간주되어야 한다.
CD1a는 주로 수지상 세포 및 피부 랑게르한스 세포에서 발현된다. 이것은 세포의 표면에 존재하고 세포외 환경을 스크리닝한다. CD1a는 세포내 이입되어 Rab2 - Arf6 의존적 경로에서 긴 세포질 꼬리부의 부재로 인해 초기 엔도솜으로 수송된다. 이것은 상기 초기 엔도솜 또는 세포 표면에서 조우하는 항원에 대한 제시 분자로서 기능한다. CD1a에 결합하는 것으로 알려진 유일한 외래 항원은 지질 모이어티의 포화 상태 및 길이에 따라서, 마이코박테리움 리포펩티드로부터 유래된다. CD1a는 또한 미엘린 시트에 풍부한 술포당지질의 한 클래스인, 술파타이드를 제시한다.
CD1b는 수지상 세포에서 발현된다. 이의 거대한 그루브는 매우 큰 잔기 또는 심지어 동시에 몇개의 지질 분자를 수용할 수 있다. CD1b는 소수성 모멘트의 제시에 이상적으로 적합하다. CD1b은 분자 어댑터에 결합하여 LAMP1-의존적 경로에서 후기 산성 리소솜을 통해 수송된다. 특히, CD1b는 클래스 II MHC 분자와 매우 유사하게, MHC 클래스 II 관련 불변 사슬에 의해 이의 세포내 수송 동안 보호된다. CD1b 분자는 마이코박테리움 튜버큘로시스 (마이콜산) 및 가능하게 박테리아 기원의 다른 항원에 대한 방어 기전에 관여된다.
CD1c는 수지상 세포, 랑게르한스 세포 및 B 림프구 상에 발현된다. 이것은 세포내이입 시스템에 의해 처리되지만 후기 엔도솜으로 수송되지 않는다. 이의 기능은 덜 충분하게 확립되어 있다. CD1c는 박테리아 및 마이코박테리움 유래의 수많은 항원 및 술파타이드를 비롯하여, 리포펩티드를 제시하지만, 펩티드 서열이 CD1c 클레프트의 밖으로 돌출된다 (그리하여 본 발명과 상이하고, 이 경우 적어도 하나의 소수성 아미노산이 CD1c 클레프트를 방해함).
CD1 분자는 소수성 모이어티, 예컨대 본 출원에서, 포켓을 구성하는 소수성 클레프트 내 펩티드 (예컨대 Leu, Ile 등과 같은 아미노산의 지방족 잔기, 아미노산 상에 그라프트된 아실 사슬)에 의해 제시된 소수성 모이어티를 격리시켜 항원을 제시한다. 이러한 포켓은 A', C' 및 F'으로 정의되고 CD1 분자 간에 그들 아키텍처 및 용매 접근가능성은 다양하다. CD1 분자의 에피토프 결합 영역의 클레프트는 그 자체가 하나의 그룹 1 CD1 분자마다 서로 매우 가변적이다. CD1a는 J-형상의 형태로서 클레프트를 제시하며, A'의 잔기는 3 측면 상에 폐쇄된 심부 내강에 매장되어 있는 반면, F' 위치는 개방된 상태로 있어서 실제로 보다 긴 구조를 수용할 수 있다. CD1b 분자의 클레프트는 최고로 크고 각각 A', C' 및 F'에 3개 소수성 포켓을 제시한다. 흥미롭게도, 산성 조건 하에서, 클레프트는 그 자체가 개방되어 그렇게 하지 않으면 할 수 없는 구조체를 수용한다. CD1c 분자의 클레프트는 2개의 소수성 포켓을 갖는 일반 A'-F' 구조를 제시하고, 양쪽 극단에서 말단을 개방시킨다.
따라서, NKT 세포 에피토프의 일반 구조는 CD1 분자에 따라서 다양하다. CD1a와 결합을 위해서, 소수성 거대 잔기 예컨대 페닐알라닌이 A' 위치를 차지해야 하고 이어서 위치 F'에 다양한 길이의 알킬 사슬 및 제2 소수성 잔기를 갖는 지방족 (소수성) 아미노산이 뒤따른다. 서열은 적재가 양쪽 방향에서 일어날 수 있으므로 대칭적일 수 있다. 그러나, CD1a의 흔치않은 J 형상은 에피토프의 한쪽 측면 상에서 추가 아미노산 서열의 결합을 불가능하게 한다. CD1b 분자는 A' 위치에 1, 2, 또는 심지어 3개 소수성 잔기를 수용할 수 있고, 위치 C' 및 임의로 위치 F'을 수용하기 위해 페닐알라닌, 트립토판, 및 소수성 잔기를 함유하는 긴 알킬 사슬의 다양한 조합을 갖는다. CD1c 분자는 CD1a에 대한 것과 동일한 특징을 나타내는 서열을 수용한다.
이들 다양한 그룹 1 CD1 분자의 구조 간에 관찰된 편차는 그룹 1 CD1 클레프트에 결합하는 모티프를 디자인하는 것을 어렵게 만든다. 그러나, CD1 분자와 결합하는 에피토프의 서열의 전체도는 온라인 상에서 접속가능한 알고리즘을 사용해 수득될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 prosite 웹사이트 상에서 서열을 입력하여 확인할 수 있다. 이것은 일반적인 제1 단계로서 간주되어야 하고, 하기 기술되는 기능적 어세이의 결과를 획득했을 때 개선될 수 있다. CD1a, CD1b 또는 CD1c에 의한 에피토프의 제시 상황에서 NKT 세포를 활성화시킬 수 있는 아미노산 서열은 기능적으로 한정되기 보다는, (1) 그룹 1 CD1 분자와 (특이적으로) 결합하는 그들의 능력, 및 (2) NKT 세포와 시냅스를 형성하고 그들을 활성화시키는 에피토프 및 CD1 분자 간에 만들어진 복합체의 능력에 의해 한정된다.
CD1a, CD1b 또는 CD1c-제한된 에피토프의 동정은 기능적 어세이에 의해 수행된다. 다른 적합한 시험은 에피토프를 포괄하는 펩티드, 또는 에피토프가 유래된 전체 단백질을 CD1a, CD1b 또는 CD1c로 형질감염된 항원-제시 세포와 인큐베이션시키는 것으로 이루어진다. 흥미롭게도, CD1 분자의 다형성 부재는 오직 제한된 수의 샘플로 NKT 활성화의 관련성을 쉽게 평가하게 한다.
이러한 목적을 위해서, CD1+ 항원-제시 세포는 동물 또는 인간 공급원으로부터 제공된다. 이것은 바람직하게 MHC 분자, 또는 MHC-유사 분자를 발현하지 않는 세포로부터 출발하여 수행된다. 마우스 또는 인간 세포주는 그룹 1 CD1 분자의 서열을 함유하는 구성체와 함께 베타-2 마이크로글로불린 서열을 코딩하는 구성체로 형질감염된다. 이러한 세포는 형광색소에 커플링된 특이적 항체를 사용한 후에 형광 활성화 세포 분류법을 사용한 형광 검출에 의해 CD1 수용체의 존재에 대해 검토된다. 바람직하게, CD1 수용체를 형질감염시키려는 세포는 전문적인 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 마크로파지 또는 B 세포여야 한다. 몇몇 예가 당분야에 공지되어 있다.
본 발명의 상황에서 고려되는 NKT 세포는 알파-베타 또는 감마-델타 사슬 회합으로 만들어진 항원-특이적 수용체 (CD3)를 보유한다.
본 발명의 NKT 세포는 CD4 (CD4+ NKT 세포) 또는 CD8 공-수용체 (CD8+ NKT 세포)를 보유하는, 상이한 표현형이거나, 또는 이러한 공-수용체에 이중 음성 (CD4-CD8- NKT 세포)이다. 본 발명은 또한 알파-베타 T 세포 수용체 또는 감마-델타 수용체를 보유하는 NKT 세포에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 세포내 병원체에 의해 초래되는 감염성 질환 또는 종양을 치료하도록 CD8+ NKT 세포 및/또는 CD4-CD8- NKT 세포를 활성화시키기 위해 적합화된다 (세포독성 기능). 반대로, 방법은 자가면역 또는 알레르기성 질환, 또는 소포체 스트레스를 특징으로 하는 병태를 치료하도록 CD4+ NKT 세포를 활성화시키기 위해 적합화된다 (조절 기능). 이러한 방법은 에피토프 서열의 다양한 조합 및 측접된 잔기 내에 강화 모티프의 존재 또는 부재를 사용한다 (하기 참조).
NKT 세포의 서브세트는 최근에 기술되었지만 오직 1형, 알파-gal-세라마이드-반응성, CD1d-제한성 NKT 세포만이다. 이들은 NKT1 (T-bet+, PLZFlo, RORγt-), NKT2 (T-bet-, PLZFhi, RORγt-) 및 NKT17 (T-bet-, PLZFint, RORγt+)을 포함한다. 이러한 CD1a, CD1b 또는 CD1c에 의해 제한되는 세포에 대한 정보는 결여되어 있지만, 본 출원자는 그룹 1 CD1 분자에 의해 제한되는 NKT 세포도 역시 다양하다는 것을 발견하였다. 따라서, 일반적으로, CD4를 발현하는 세포는 IL-4 및 IL-10의 분비에 의한 조절 특성을 나타내는 반면, CD8+ NKT 세포는 IFN-γ를 더 발현하고, 이중-음성 NKT 세포가 그러하듯이 더 많은 세포독성 활성을 보인다. 이러한 관찰은 제한을 의미하는 것이 아니라 일반적인 관찰로서 간주되어야 한다.
본 출원을 기초로 하는 발견은 이러한 그룹 1 CD1-제한성 NKT 세포가 사실 CD1a, CD1b 또는 CD1c에 의해 제시되는 소수성 펩티드 에피토프를 인식할 수 있고, 이러한 인식으로 상응하는 NKT 세포의 활성화가 뒤따른다는 것이다.
국제 특허 출원 공개 번호 WO2012069568, WO2012069572, WO2012069575 및 WO2013174805에 기술된 바와 같이, CD1d를 발현하는 세포에 대해 이미 유사하지만 별개의 관찰이 있었다. 그러나, CD1d는 구조, 분자 상호작용, 세포 수송, 세포 표면 발현 및 표면에 제시되는 에피토프의 레파토리를 포함한, 몇몇 특성에 의해 그 자체가 CD1a, CD1b 및 CD1c와 구별되어서, CD1d (그룹 2 CD1 분자의 단일 대표)은 그룹 1 CD1a, CD1b 및 CD1c 분자와 완전히 뚜렷하게 별개이다.
CD1a, CD1b 또는 CD1c에 결합된 펩티드 에피토프의 제시 시에, NKT 세포는 신속하게 활성화되어서 선천성 및 획득성 면역계 둘 모두로부터의 다른 세포를 활성화시키는 수많은 사이토카인을 분비하고, 그에 따라 잠재적으로 상응하는 (또는 동족) 에피토프를 보유하는 CD1a-양성, CD1b-양성 또는 CD1c-양성 세포 상에서 세포독성 활성을 발휘한다.
(본 발명의) 펩티드는 시냅스 형성을 증가시키고 그리하여 상응하는 NKT 세포의 활성화를 증가시키도록 NKT 세포에 의해 인식되는 코어 에피토프의 외부에 위치된 강화 모티프와 유리하게 조합될 수 있다.
2개 유형의 강화 모티프가 기대되는 효과에 따라 서술될 수 있다: 증강된 세포독성 활성 또는 증가된 조절 활성. 증강된 세포독성 활성은 표적 세포가 종양 기원이거나 또는 세포내 병원체가 감염된 상황에서 적절하다. 이러한 경우에, CD8+ 또는 CD4-CD8- 표현형의 NKT 세포가 바람직하다. 증강된 조절 활성은 만성 자가면역 질환, 또는 알레르겐 또는 감염원에 대한 만성 또는 반복 노출에서 처럼, 조직 염증이 감소되어야 하는 상황을 비롯하여, 소포체의 스트레스가 세포내 성분의 번역후 변경을 초래하는 상황에서 적절하다.
강화 모티프는 바람직하게 다양한 길이의 링커 서열이 있거나 또는 없이, 에피토프의 아미노-말단부 또는 카복시-말단부에, CD1-제한성 에피토프와의 공유 연결 후에 투여된다. 하나 또는 몇몇개의 이들 강화 모티프는 고려되는 용도에 따라서, 에피토프에 첨가될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
강화 모티프는 하기 범주 중 하나에 속한다:
(1) 측접 잔기, 바람직하게 에피토프의 각 측면 상에 시스테인 잔기 (또는 상기 기술된 바와 같은 모티프)의 첨가는 부적절한 절단으로부터 그를 보호하고 에피토프 제시를 증가시키는 에피토프의 응집을 가능하게 한다;
(2) (아미노산의 반응성 모이어티, 예컨대 -SH 상에) 짧은 알킬 사슬 예컨대 팔미트산 또는 미리스트산의 첨가는 또한 바람직한 가능성이다. 팔미테이트 및 시스테인 잔기를 반응시켜 얻은 티오에스테르는 바람직한 예를 구성한다;
(3) 공-수용체 예컨대 CD8 또는 CD4의 짧은 상보성 서열, 또는 TIGIT의 포함은 바람직한 선택안이다. 예에는 CD4에 특이적인 항체의 CDR (상보성 결정 영역), 특히 CD4 분자의 제2 세포외 도메인 내 에피토프를 인식하는 것, 및 이의 알파 또는 베타 이소폼의 CD8 분자에 특이적인 상보성 서열이 있다;
(4) Toll-유사 수용체 (TLR)에 대한 작용성 서열, 예컨대 CpG-DNA 모티프, dsDNA, ssDNA, LPS 또는 Pam3Cys의 첨가가 또한 포괄된다.
모든 이들 상황에서, 에피토프와 결합된 그룹 1 CD1 분자를 제시하는 세포와 시냅스를 형성하는 NKT 세포의 활성화가 증강된다.
강화 모티프의 특별한 경우는 표적 분자의 디술파이드 브릿지에 대해 감소된 활성을 발휘하는, 2개 아미노산에 의해 분리된 2개 시스테인 잔기로 만들어진 소위 티오리덕타제 모티프이다. CD4 공-수용체의 제2 세포외 도메인에 위치된 디술파이드 브릿지의 환원은 시냅스 지속 기간의 상당한 증가를 야기시키는 CD3의 동종이량체 및 중합체의 형성을 촉발시킨다. 그러나, CD1 에피토프에 인접한 티오리덕타제 모티프에 의한 환원에 감수성인 디술파이드 브릿지가 또한 CD8 보조인자 분자, CD3 수용체 및 NKT 세포에 의해 발현되는 표면 분자 예컨대 TIGIT에도 존재한다.
상기 기술된 바와 같은 강화 모티프는 티오리덕타제 모티프가 CD1d-제한성 에피토프 또는 클래스 II MHC 제한성 모티프에 대해 사용되지 않는 것을 조건으로, 클래스 1 CD1 분자에 의해 제한되는 것들에 대한 대안적인 에피토프로 적용될 수 있다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2012069568은 측접 잔기 내 티오리덕타제 모티프와 조합될 때 특이적 NKT 세포의 증가된 활성화를 기술하고, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2008017517은 그들의 측접 잔기에 티오리덕타제 모티프를 함유하는 클래스 II 제한성 에피토프가 CD4+ T 세포에게 그들을 세포독성 표현형이 되게 하는 신호를 제공한다고 기술한다.
유리하게, 면역원성 펩티드는 엔도솜 표적화 서열을 더 포함한다.
본 발명의 펩티드는 유리하게 에피토프 프로세싱의 효율을 증가시키고 세포 표면에서 CD1 분자의 발현을 증가시키기 위해 보강제 분자와 함께 투여될 수 있다 (상기 기술된 강화 모티프와 대조적으로, 공유적으로 또는 비공유적으로 결합됨). 예로는 toll-유사 수용체 9 (TLR9)를 활성화시키는 CpG 모티프, TLR4를 활성화시키는 리포폴리사카라이드 또는 팔미토일 cys3 또는 TLR3을 활성화시키는 올리고뉴클레오티드가 있다. 통상의 보강제 예컨대 수산화알루미늄 또는 마이코박테리움의 유성 에멀션 예컨대 완전 프로인트 보강제, 또는 당분야에 공지된 대안적인 분자가 대상체에게 투여를 위해 본 발명의 펩티드에 첨가될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같이 NKT 세포의 개체군을 수득하거나 또는 유도시키기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
(i) 단리된 천연 CD3+ T 세포를 제공하는 단계;
(ii) 세포를 CD1a, CD1b 또는 CD1c 분자에 의해 제시된 T 세포 에피토프, 및 임의로 강화 모티프를 포함하는 면역원성 펩티드와 접촉시키는 단계, 및
(iii) 상기 세포를 IL-7 및 IL-2/IL-15 존재 하에 확장시키는 단계
를 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명은 NKT 세포의 개체군을 동정하는 방법을 포괄하고, 상기 방법은
(i) 단리된 천연 CD3+ T 세포를 제공하는 단계;
(ii) 마스터 조절인자 PLZF를 발현하는 CD3+ T 세포를 제공하는 단계; 및
(iii) (ii)에서 제공되는 T 세포가 (i)에서 제공되는 T 세포와 비교하여, 상기 기술된 특징을 나타내는 것을 결정하는 단계
를 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명은 펩티드-CD1 복합체에 특이적인 단일 NKT 세포 수용체를 보유하는 세포를 제조하기 위한 방법을 포괄하고, 방법은
(i) 펩티드-CD1 복합체에 특이적인 NKT 세포 클론을 수득하는 단계;
(ii) (i)에서 수득된 세포의 TCR의 가변 부분을 코딩하는 DNA 서열을 단리하는 단계;
(iii) 단리된 CD3+ T 세포를 제공하는 단계;
(iv) (ii)에서 수득된 DNA를 유전자 조작하여 (iii)에서 수득된 세포에 도입시키는 단계;
(v) 임의로, 보조인자의 DNA 서열을 유전자 조작하여 (iii)에서 수득된 세포에 도입시키는 단계
를 포함한다.
(iii)에서 수득된 세포는 그들의 고려되는 용도에 따라서 다양한 계통에 속할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, NKT 계통 또는 클래스 I-제한성 계통의 세포는 세포독성 활성이 예컨대 종양 또는 세포내 병원체에 의해 감염된 세포에 대해 요구될 때 적절하다. 클래스 II-제한성 계통의 세포는 조절 기능이 자가면역 질환, 알레르기, 조직 항상성의 제어에서의 적용에 요구될 때 보다 유리하다.
본 발명의 이러한 양상에서 제조되는 세포는 그들이 다양한 기원의 T 세포를 형질감염 또는 형질도입시키는데 사용되는 펩티드-CD1 복합체에 특이적인 수용체를 보유한다는 의미에서, NKTCR T 세포라고 한다.
추가 양상에서, 본 발명은 표적 세포가 보유하는 표면 분자에 대한 항체 인식 도메인을 보유하는 세포를 제조하는 방법을 포괄하고, 방법은
(i) 표적 세포 표면 분자에 대한 항체를 생성시키는 B 세포 클론을 수득하는 단계;
(ii) 상기 항체를 코딩하는 DNA 서열을 단리하는 단계;
(iii) 임의로 신호전달 도메인의 DNA 서열과 TCR (CD3)의 불변 부분을 코딩하는 DNA를 갖는 (ii)에서 수득된 바와 같은 DNA를 함유하는 DNA 구성체를 생성시키는 단계;
(iv) 펩티드-CD1 복합체에 특이적인 NKT 세포 클론을 수득하는 단계;
(v) (iii)에서 수득된 바와 같은 DNA를 (iv)에서 수득된 바와 같은 세포에 도입시키는 단계
를 포함한다.
이러한 키메라 항체 수용체 (CAR) NKT 세포를 구축하는데 사용되는 항체의 특이성은 표적 세포에 따라 다양하다는 것을 이해해야 한다. 예에는 제한없이, NKG2D의 리간드, 종양 유전자 또는 소포체 스트레스의 결과로서 또는 세포내 병원체에 의한 감염의 결과로서 발현되는 항원을 포함한다.
(iv)에서 선택된 NKT 세포 클론은 고려되는 용법에 의존하여, 이의 표현형 및 기능에 따라 선택될 수 있다. 따라서, 배제를 의미하는 것이 아닌 예로서, Tbet+, PLZFlo, RORgt- NKT 세포는 표적 세포에 대해 세포독성 활성이 요구될 때 바람직하고, Tbet-, PLZFhi, RORgt- NKT 세포는 조절 기능이 요구되는 상황에서 바람직하게 된다. 적용분야에는 첫번째 경우로 세포내 병원체를 갖는 세포 및 종양 세포, 및 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 만성 염증 및 소포체 스트레스를 특징으로 하는 병태의 제거를 포함한다.
상기 중 어느 하나에서, 상기 종양-연관 항원은 돌연변이되거나 또는 과발현되는 전사 인자, 원종양유전자, 바이러스-유래 단백질, 생존 인자 또는 클론형 결정부 예컨대 B 세포 수용체로부터 유래된 이티오타입 결정부를 포함하는 종양유전자이다.
임의의 상기 용도에서 상기 세포내 병원체-연관 항원은 세포내 생활 주기를 갖는 바이러스, 박테리아, 마이코박테리움 또는 기생충으로부터 유래된 임의의 항원일 수 있다.
임의의 상기 용도에서, 상기 자기항원은 1형 당뇨병, 중증근무력증, 갑상선염, 다발성 경화증, 갑상선염, 셀리악병, 염증성 장질환, 류마티스성 관절염, 악성 빈혈, 포도막염, 달팽이염 및 부신염을 포함하는 장기-특이적 자가면역 질환과 연관될 수 있다.
임의의 상기 용도에서, 만성 염증성 질환은 알레르겐 또는 감염원에 대한 만성 노출과 연관될 수 있다.
임의의 상기 용도에서, 소포체 스트레스로 인한 항원의 번역후 변경은 종양, 만성 자가면역 질환, 만성 감염성 질환, 과다자극, 저산소증 또는 고농도의 프로염증성 사이토카인 예컨대 인터페론-감마 (IFN-γ) 또는 인터루킨-1베타 (IL1-β)에 대한 노출과 연관될 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 CD1a, CD1b 또는 CD1c-제한성 NKT 세포의 개체군을 수득하기 위한 (시험관내) 방법이고, 상기 방법은
(i) 종양-연관 항원, 세포내 병원체-연관 항원, 자기항원, 알레르겐, 감염원 또는 전사체후 수준에서 변형된 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프, 및 임의로 강화 모티프를 포함하는 면역원성 펩티드를 제공하는 단계;
(ii) 임의로 보강제의 존재 하에서 면역원성 펩티드를 대상체 (또는 NKT 세포를 포함하는 샘플)에 투여하는 단계;
(iii) NKT 세포의 개체군을 수득하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 목적인 펩티드 및 폴리펩티드는 기능적 어세이를 사용해 수득될 수 있다. 바람직하게 인간 기원의, 바람직하게 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않고, 바람직하게 항원-제시 세포 예컨대 수지상 세포, 마크로파지 또는 B 림프구로부터 수득되는 세포주가 관련 그룹 1 CD1 분자의 서열 및 베타-2 마이크로글로불린의 서열에 의한 형질감염에 사용된다. 이러한 세포의 예는 U937 세포주 및 HeLa 세포이다. 참고하여, 그룹 1 CD1 분자의 중요한 다형성의 부재는 그룹 1 CD1 분자의 각각에 대해 단일한 형질감염 세포를 사용할 수 있게 한다. 형질감염은 바이러스 벡터, 전기천공 등을 사용하여 당분야에 공지된 방법으로 수행된다. 세포 표면에서 형질감염체의 발현은 표면 발현이 베타-2 마이크로글로불린의 존재를 요구하므로 분자의 기능성을 보장하는, CD1 분자에 특이적인 항체에 의해 검출된다. 형질감염된 수용체의 검출은 일반적으로 형광-표지 특이적 항체 및 세포 분류기를 사용해 수행된다. 이어서, 형질감염된 세포는 형질감염된 CD1 분자에 의해 제시될 수 있는 에피토프를 잠재적으로 함유하는 고려 중인 항원의 전체 또는 부분 아미노산 서열과 인큐베이션된다. CD3+ 세포의 개체군은 말초 혈액 또는 조직으로부터 수득되고 하나 또는 몇몇의 형질감염된 세포와 인큐베이션된다. 그 다음으로 CD1-제시된 에피토프에 특이적인 NKT 세포의 존재는 NKT 세포 활성화, 예컨대 NKT 세포와 에피토프-제시된 형질감염 세포주 사이에 시냅스의 형성과 연관된, NUR77의 활성화 또는 티미딘 도입을 통해 평가된다.
NKT 에피토프는 일부 예에서 적절한 경우에, 이러한 에피토프가 병리학적 상태 하에 생체 내에서 제시되는 상태를 모방하도록 번역후 번형을 보유할 수 있다.
상기 방법에 의해 수득가능한 NKT 세포의 개체군을 비롯하여, 대상체에서, 종양, 세포내 병원체에 의한 감염, 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 만성 감염, 변역후 변형된 항원이 유해한 역할을 하는 상황을 예방 또는 치료(하기 위한 약물의 제조)하기 위한 그들의 용도가 역시 본 발명의 일부이다.
본 발명은 MHC-유사 분자 CD1a, CD1b 또는 CD1c에 결합하는 에피토프에 특이적인 NKT 세포의 기능적 활성 및 확장을 증가시키는 방식을 제공한다
형질감염된 세포는 시험하려는 에피토프를 포함하는 펩티드와 인큐베이션된다. 그를 포함하는 전체 길이 펩티드 대신 에피토프가 사용될 때, 예를 들어, 강화 모티프, 및/또는 번역후 변형이 첨가되는, 상이한 형태 하에서 그들을 사용하는 것이 고려된다.
상기 면역원성 펩티드의 강화 모티프는 펩티드 내 에피토프 서열에 바로 인접하여 위치되거나, 또는 링커에 의해 NKT 세포 에피토프로부터 이격된다. 보다 특히, 링커는 7개 이하의 아미노산을 포함한다. 가장 특히, 링커는 1개, 2개, 3개, 또는 4개 아미노산을 포함한다. 링커는 또한 D-아미노산 또는 비천연 아미노산 또는 소형 화학 구조를 함유할 수 있다. 결합 클레프트가 양쪽 측면에서 개방되므로, CD1a를 제외하고, 7개 아미노산보다 긴 펩티드가 수용될 수 있다.
면역원성 펩티드가 엔도솜 표적화 서열을 포함할 때, 측접 서열은 NKT 에피토프 및 엔도솜 표적화 서열 사이 및/또는 강화 모티프 및 엔도솜 표적화 서열 사이에 존재할 수 있다. 보다 특히, 측접 서열은 최대 10개 아미노산의 서열, 또는 1 내지 7개 아미노산, 예컨대 2개 또는 3개 아미노산의 서열이다. 보다 특히, 측접 서열은 CD1 분자에 펩티드를 안정화시키는데 유용한 소수성 (예를 들어, F, Y, W,) 아미노산 잔기 (즉, 측접 영역의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 심지어 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산이 소수성임)를 함유한다.
NKT 세포의 공급원으로서 세포 샘플은 PBMC로 이루어지고, 이로부터 CD3+ T 세포가 추출 및 정제되어서, CD1a, CD1b 또는 CD1c 형질감염 세포를 함유하는 세포 배양물에 첨가된다. 이어서 NKT 세포는 분석을 위해 세포주 및 클론을 정착시키기 위해 증폭될 수 있고, 그 방법 및 기술은 당분야에 공지되어 있다. 에피토프 또는 에피토프가 유래된 단백질과 인큐베이션된 형질감염 세포는 IL-7 및 다양한 비율의 IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 배양이 유지된다. NKT 세포의 검출, 확장 및 특징규명은 상기 기술된 대로 수행된다.
그룹 1 CD1 분자 중 하나로 형질감염된 세포는 예를 들어 인간 세포의 공급원으로 재구성된 면역약화 동물에서처럼 생체내에서 사용될 수 있다. 획득성 및 선천성 면역의 세포가 결여된 NOG 마우스는 예를 들어, 소정 질환 (예를 들어, 종양, 세포내 감염 참조)에 걸린 환자 또는 건강한 개체의 말초 혈액으로부터 수득된 CD3+ T 세포에 의해 재구성된다. CD1-형질감염된 세포는 CD1-결합 에피토프를 함유하는 단백질, 또는 CD1-제한성 에피토프를 포괄하는 펩티드가 적재된다. 세포는 면역약화 마우스의 복막에 이식된다. 수 일 후에, 복막을 천자하여 NKT 세포의 검출, 동정 및 확장을 위해 세포를 회수한다. 대안적으로, 단백질 또는 상응하는 에피토프가 적재된 형질감염된 세포는 면역약화 마우스에 직접 IV 주사된다. NKT 세포의 검출 및 확장을 위해 3일 내지 4일 이후에 비장을 회수한다.
투여 시, 소수성 잔기를 함유하는 펩티드는 항원-제시 세포에 의해 흡수되고, 관여되는 CD1 분자의 클래스 및 이를 발현하는 세포의 기능으로서, 상이한 경로를 통해 프로세싱된다. 따라서, 제한을 의미하지 않는 예로서, 표면-발현된 CD1a 분자와의 결합 이후에 세포내 흡수 및 초기 엔도솜과 융합이 뒤따른다. 복합체는, 종양 세포 또는 병원체 감염된 세포에서 우세하듯이, 세포의 대사 상태, 특히 소포체 스트레스 병태의 존재 또는 부재에 의존적인 상황에서 NKT 세포와의 상호작용을 위해 세포 표면으로 재지정된다. 세포내이입 이후 CD1b와의 결합은 CD1b가 그룹 2-제한성 에피토프의 프로세싱과 매우 유사한 과정으로, 후기 엔도솜 경로 및 이의 산성 상태로 진입할 수 있다면 상이한 상황에서 발생된다. 후기 엔도솜 구획에서, 소수성 펩티드 및 지질은 CD1b 클레프트와의 결합에 대해 경쟁한다. 적재되면, 이러한 CD1b 분자는 NKT 세포의 제시 및 활성화를 위해 세포 표면을 향해 지정된다. CD1c 분자는 세포내이입 경로에서 에피토프를 교환하고 어댑터 단백질을 통해 다수의 세포내 바디와 상호작용하지만, 아직 후기 엔도솜과는 아니다. 그들은 세포 표면에서의 제시 및 NKT 세포 인식을 위해 자기항원, 또는 돌연변이된 자기항원을 제시하는 경향이 있다.
본 발명은 천연적으로 그룹 1 CD1 결합 모티프로 구성된 소수성 잔기로 만들어진 펩티드에 관한 것이다. 때때로 상기 모티프의 아미노산 잔기는 일반적으로 CD1과 결합하는 능력을 증가시키는 잔기로 치환시켜 변형된다.
그룹 1 CD1 분자와 펩티드의 결합을 측정하기 위한 방법은 당분야에 공지된 방법으로부터 유래된다. 일반적으로 CD1 분자를 고체상 예컨대 폴리스티렌 플레이트에 불용화시키거나, 또는 CD1 분자의 다량체를 구축하는 것으로 이루어진 몇몇 방법들이 사용될 수 있다. 결합의 상대적으로 약한 친화성은 덱사머 이하 크기의 다량체를 사용하는 것을 유리하게 만든다. 따라서, 관련 그룹 1 CD1 분자의 다량체는 예를 들어 바이오틴으로 표지될 수 있는 펩티드 서열 (즉, 이의 일부)과 인큐베이션된다. CD1 다량체에 결합된 펩티드의 존재는 형광색소-표지된 아비딘을 사용하는 형광발광 및 형광-활성화 세포 분류기에 의한 검출을 통해 평가될 수 있다. 동일한 원리를 기반으로 몇몇 대안들이 당분야에 공지되어 있다.
상기 본 명세서에 기술된 방법은 그룹 1 CD1-제한성 NKT 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 따라서, 그룹 1 CD1 분자의 다량체는 말초 혈액 유래를 포함하여, 다양한 기원의 림프구의 개체군과 인큐베이션된다. 바람직한 방법은 일반적으로 항-CD3 항체로 코팅된 표면 (예를 들어, 비드) 상에서 전체 세포 개체군의 인큐베이션을 통해 수득되는, 혈액 샘플로부터 CD3 항원 수용체를 발현하는 세포를 먼저 단리하는 것이다. 필요하다면, 단일 그룹 1 CD1 분자를 발현하는 형질감염체 및 추정 CD1 결합 서열을 수득한 단백질, 또는 이러한 서열을 포함하는 펩티드와 CD3+ 세포를 인큐베이션시켜 시험관 내에서 자극 사이클을 수행할 수 있다. 그 다음으로, 예를 들어 IL-7, IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 CD3+ 세포 확장을 수행한다. 이러한 자극 단계로부터 수득된 세포는 다시 분류될 수 있고 (즉, CD1 분자의 다량체가 불용화된 비드 사용), 이후에 필요하면 1회 또는 수회의 자극 사이클이 후속된다.
그룹 1 CD1 분자 중 하나에 의해 제한되는 세포의 개체군은 전사 인자 예컨대 PLZF 및 표면 분자 예컨대 CD162 및 NKG2D를 포함하는, NKT 세포의 마커에 대해 평가될 수 있다. 대안적으로, 단리된 CD3 세포는 그룹 1 CD1 분자와 인큐베이션 전에 NKT 마커에 대해 분류된다.
대부분의 종양 세포는 염증성 사이토카인 예컨대 IL-1β 또는 IFN-γ에 의한 자극 이후에 또는 자발적으로 CD1 계통의 분자를 발현한다. 히스톤 디아세틸라제 (HDAC) 억제제 또는 소포체 스트레스 자극제 (예컨대, 브레펠딘 A, 탑시가르긴, 2-데옥시글루코스, 투니카마이신)의 사용은 CD1 표면 발현을 상당히 증가시켜서, NKT 세포에 대한 표적을 제공한다.
본 출원은 그룹 1 CD1 분자에 결합하고 에피토프-특이적 NKT 세포를 활성화시키는 능력을 갖는 에피토프를 동정하기 위한 방법을 기술한다. 강화 모티프 및 임의로 후기 엔도솜 표적화 서열을 함유하거나 또는 단독으로 이들 에피토프는 화학 합성으로 제조되어 종양을 앓는 개체에서 직접 백신접종에 사용된다.
일 양상에서, NKT-세포 에피토프는 (1) 일부 흑색종에서 동정된 바와 같은 돌연변이된 전사 인자 예컨대 Tp53, 과발현된 전사 인자 또는 키나제, MAGE를 포함하는, 종양유전자; (2) 원종양유전자, 예컨대 연조직 암종 예컨대 신장 또는 부갑상선의 것을 비롯하여 다발성 골수종에서 발현되는 사이클린 D1; (3) 바이러스-유래 단백질, 예컨대 일부 암종 및 일부 호지킨-유형 림프종의 엡스타인-바 바이러스 유래의 것; (4) 항-아폽토시스 인자 예컨대 서비빈 또는 bcl2인 생존 인자; (5) 클론형 결정부, 예컨대 소포성 림프종 또는 다발성 골수종의 B 세포 수용체 또는 T 세포 악성종의 T 세포 수용체 결정부로부터 유래되는 이디오타입 결정부로부터 유래된 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는, 종양으로부터 유래된다.
NKT 세포는 종양 세포에 대한 선천성 및 획득성 반응 둘 모두를 부양시킬 수 있는 사이토카인을 생성시켜 간접적으로, 또는 동족 에피토프를 제시하는 종양 세포를 사멸시켜 직접적으로, 종양에 대한 방어에 참여한다. 직접 사멸은 그랜자임 및 퍼포린 생성 및 종양 괴사 인자 (TNF) 수퍼패밀리의 몇몇 대안적인 경로에 관여된다. 본 발명에 의해 치료되는데 민감한 종양은 상기 열거된 바와 같은 종양유전자를 발현하는 것들을 포함한다.
이러한 NKT 세포의 유발에서 사용하는 것에 민감한 에피토프는 상기 기술된 방법으로 동정된다. 이러한 펩티드의 투여 시, 감염된 세포를 특이적으로 인식하고 제거하는 특이적 NKT 세포가 유발된다.
따라서 NKT-세포 에피토프는 유리하게 세포내 병원체로부터 유래된다. 이러한 병원체는 바이러스, 박테리아 또는 기생충일 수 있다. 바이러스는 ssDNA, dsDNA 및 RNA 바이러스를 포함하고, 예로서 헤르페스바이러스과, 플라비바이러스과 및 피코르나바이러스과, 인플루엔자, 홍역 및 면역결핍 바이러스가 있다. 박테리아 및 마이코박테리아는 마이코박테리움 튜버큘로시스, 인간 또는 동물에 병원성인 다른 마이코박테리아 병원체, 여시니아증 (Yersiniosis), 브루셀라 (Brucella), 클라미디아 (Chlamydiae), 마이코플라즈마 (Mycoplasma), 리켓치아 (Rickettsiae), 살모넬라 (Salmonellae) 및 시겔라 (Shigellae)를 포함한다. 기생충은 플라스모듐 (Plasmodium), 리슈마니아 (Leishmania), 트리파노소마 (Trypanosoma), 톡소플라즈마 곤디 (Toxoplasma gondii), 리스테리아 (Listeria), 히스토플라스마 (Histoplasma)를 포함한다.
CD8+ NKT 세포의 표현형은 사실 다양한데, 일부 세포는 이소폼 알파-알파 또는 알파-베타를 발현한다. 출원인은 상당한 비율의 이러한 세포가 베타 이소폼의 동종이량체를 발현하는데 반해 알파 이소폼은 고전적으로 클래스 I MHC 분자에 대한 결합 유닛으로서 간주된다는 것을 발견하였다. 사실, 알파 및 베타 이소폼 간 주요 기능적 차이가 시냅스로 키나제 예컨대 LCK를 동원시키는 베타 이소폼의 증가된 능력에서 발견되고, 그에 따라 세포의 초기 신호전달 및 활성화가 증가된다. 따라서 베타 이소폼의 상보성 서열의 측접 영역(들) 내 삽입은 CD8+ NKT 세포를 동원하는 추가의 선택적 장점을 의미한다.
다수의 자가면역 질환이 본 발명에서 고려되며, 특히 가장 빈번하게 언급되는 것으로서 1형 당뇨병, 중증근무력증, 다발성 경화증, 갑상선염, 셀리악병, 부신염을 포함하는 장기-특이적 자가면역 질환, 포도막염을 포함하는 안질환, 내이 질환 예컨대 달팽이염이 있다. 이들 모든 예에서 중요한 염증성 성분은 그 중에서도 TLR의 활성화에 기인하여 영향받은 조직에서 우세하다. 조절성 NKT 세포는 질환있는 장기를 침윤하는 염증성 세포와 시냅스를 형성하지만, 또한 호르몬 (인슐린, 갑상선 호르몬) 또는 항상성 단백질 예컨대 미엘린을 생성하는 세포와 직접적으로 상호작용할 수 있다. 이러한 세포는 그룹 1 CD1 계통에 속하는 제한 MHC-유사 분자를 발현한다. 그러므로 이러한 조절 NKT 세포의 유발은 이중 영향: 표적 장기를 침윤하는 세포의 유입 및 기능의 조절 및 정상 세포 기능의 복원을 제공한다.
자기항원의 번역후 변형은 빈번하게 만성 자가면역 질환에서 관찰된다. NKT 세포를 유발시키는데 사용되는 펩티드는 이러한 질환에서 관찰되는 번역후 변형에 따라서 유리하게 변형된다. 이러한 변형의 많은 예가 기술되어 있고, 가장 일반적인 것 중 하나는 아르기닌 잔기의 시트룰린화, 팔미토일 및 미리스토일 모이어티를 포함하는 짧은 알킬 사슬의 첨가, 인산화 또는 황산화가 있다. 이들 변형은 본 출원의 일부로서 간주된다.
그러므로 자가면역 질환 분야에서 바람직한 적용은 예컨대 측접 잔기에 CD4에 대한 상보성 서열을 포함하는 것과 같은, CD4+ NKT 세포를 동원하는데 도움을 주는, 예를 들어 강화 모티프를 통해서, IL-4 및 IL-10을 생산하는 것으로 알려진, CD4+ 보조인자를 보유하는 NKT 세포의 유발이다.
만성 알레르기성 천식은 기관지벽 및 기관지 주변 공간의 수준에서 염증성 세포의 축적이 지배적이다. 그러므로 만성 염증의 알레르겐-특이적 제어는 조절 특성을 갖는 NKT 세포를 유발시켜서 획득가능하다. 만성 폐색성 기관지 질환의 원인이 되는 감염원에 대한 만성 노출은 병상이 감염 그 자체보다는 주로 염증으로 초래된다는 것을 고려하면, 동일한 접근법으로부터 이득을 얻을 것이다.
조절성 NKT 세포의 유도는 하기에 열거되는 것과 같은 치료적 목적을 위해 사용되는 작용제에 대한 내성을 정착시키기 위해 흥미로울 수 있다. 이러한 경우에서, 그룹 1 CD1 분자에 결합하여 NKT 세포를 활성화시키는 능력을 보이는 모티프를 포괄하는 서열은 만성 또는 재발성 알레르겐 또는 감염원 노출에 대해 기술된 바와 같은 백신접종 목적에 사용된다.
따라서 본 발명은 항-CD4 상보성 구조로 만들어진 강화 모티프 및 그룹 1 CD1 에피토프를 함유하는 펩티드를 사용하여 유리하게 유발시킬 수 있는, CD4 보조인자를 보유하는 NKT 세포의 유발을 통해 치료적 목적에 사용되는 생물제제에 대한 면역 내성의 유도 및 만성 염증의 분야에서의 적용을 포괄한다.
소포체의 만성 내성은 자가면역의 분명한 징후가 없는 많은 상황에서 관찰된다. 이들은 심근 경색 또는 뇌혈전증 또는 뇌출혈 이후에 발생되는 것과 같은 저산소증을 포함한다. 외상후 기간이 또한 소포체 스트레스에 의해 지배되는 것으로 여겨진다. 이러한 사건 이후에 우세한 염증 반응은 조직 복구에 유해하다. 이들 경우에서 어떠한 특이적 자기항원 또는 감염원도 직접적으로 연루될 수 없다. 본 명세서에서 제시하는 방법은 이러한 조직과 반응하는 NKT 세포를 동정하고 그리하여 조절성 NKT (CD4+) 세포 개체군을 유발시키는데 유용한 펩티드를 디자인할 기회를 제공한다. 염증의 약화는 조직 복구 및 복원을 가속화시키고 증폭시킬 것이다. 이러한 적용의 다른 예는 비만으로서, 지방 조직 덩어리의 증가로 인한 저산소증이 저산소증, 스트레스 반응 및 염증을 수반한다.
치료적 목적에 사용되는 생물제제는 종종 그들 사용을 제한하는 면역 반응을 유도시킨다. 본 발명을 기반으로 하는 발견은 대부분의 이들 생물제제가 선천성 면역계와 상호작용하고 이러한 상호작용이 획득성 반응을 유발시키는데 필요하다는 것을 보여주었다. 보다 특히, 생물제제는 그룹 1 CD1 패밀리의 제한 분자에 결합할 수 있는 서열을 발현하고, 그 결과로 특이적 NKT 세포의 인식 및 활성화를 야기시킨다. 아미노산 치환, 첨가의 결실, 또는 서열에 번역후 변경의 도입에 의한 그룹 1 CD1 모티프의 제거는 NKT의 활성화 및 획득성 면역 반응의 유발을 방지한다. 이러한 결과로 그렇게 변형된 생물제제에 대한 완전한 면역 내성이 야기되어서, 효능을 잃을 위험성 없이 장기간 동안 투여될 수 있다.
이러한 범주로 간주되는 생물제제는 (1) 혈우병 A의 응고 인자 결함 (인자 VIII) 또는 B (인자 IX), 스타필로키나제, 조직 플라스미노겐 활성인자, 및 간 기능과 연관된 유전자 결함, 예컨대 폼페병의 알파-글루코시다제 또는 파브리병의 갈락토시다제를 포함하는, 유전자 결함 또는 기능이상의 상황에서의 대체 요법; (2) 호르몬 예컨대 인슐린, 성장 호르몬, 부갑상선 호르몬; (3) IFN-a, IFN-g, GM-CSF 및 G-CSF를 포함하는 사이토카인 및 성장 인자, 사이토카인 수용체 예컨대 IL-1b 수용체; (4) 알레르기성 질환에서 IgE에 대한 항체, 이식 거부 또는 자가면역 질환에서 항-CD3 (특히 CD3d 및 CD3e) 또는 항-CD4 항체, 류마티스성 관절염 또는 대안적인 병태의 치료에서 사이토카인 예컨대 IFN-g에 대한 항체, PD-1 및 PD-1 리간드 및 TIGIT와 같은 체크포인트 억제제에 대한 항체, 또는 면역 세포 표면 항원 예컨대 CD20에 대한 항체를 포함하는, 면역 반응의 조절에 사용되는 치료적 항체; (5) 종양의 치료에서 사용을 위한 유전자 변형된 B 세포 (CAR B 세포)에 의해 운반되는 항체 또는 CAR T 세포의 구축에서 사용되는 항체; (6) 신장 부전증의 치료에서의 에리쓰로포이어틴; (7) 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합 바이러스 벡터, 레트로바이러스-유래 바이러스 벡터를 포함하는 유전자 요법 및 유전자 백신접종에 사용되는 바이러스 벡터에 사용되는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 목록은 제한적인 것이 아니고 당업자는 이것이 치료적 목적에 사용되는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드와 관련된다는 것을 인식할 것이다.
상기 생물제제의 펩티드 또는 폴리펩티드는 화학 합성 또는 유전자 조작에 의해 제조될 수 있다. 결실, 치환, 첨가 및/또는 번역후 변형은 2개 방법의 조합을 포함할 수 있고, 여기서 유전자 조작에 의해 생성되는 생물제제는 번역후 변형의 도입에 의해 더욱 처리된다.
본 발명의 치료적 잠재성 이외에도, 그들의 천연 서열에서 또는 강화 모티프의 첨가에 의한 변형 이후에, 또는 돌연변이, 결실 또는 번역후 변형 이후에 그룹 I CD1 분자에 결합하는 능력을 갖는 에피토프를 포괄하는 펩티드는 적절한 경우에 상응하는 NKT 세포를 검출, 단리, 확장 또는 고갈시키는데 사용될 수 있다. CD1 분자의 올리고머 또는 다량체는 가용성으로 또는 불용성 형태로 사용되고 관심 펩티드로 시험관 내에서 적재된다. 그러고 나서 올리고머 또는 다량체는 상기 펩티드와 시냅스를 형성하는데 민감한 NKT 세포의 공급원과 인큐베이션된다. NKT 세포의 공급원은 말초 혈액, 천자 또는 생검에 의해 조직으로부터 수득된 세포, 또는 배양된 세포 유래의 것을 포함한다. 이러한 과정으로 수득된 NKT 세포는 대상체에게 투여 시에 유도되는 작용 기전 또는 잠재적 독성 또는 부작용을 밝히는데 사용될 수 있다.
이 방법론은 예를 들어, 자가면역 질환에서처럼 생물학적 샘플로부터 NKT 세포를 제거하는 것이 유리할 때마다 사용될 수 있다. 말초 혈액으로부터 수득된 세포는 CD1 분자로부터 만들어진 올리고머 또는 중합체가 불용화되고 혈액으로부터 추출하고자 하는 NKT 세포에 상응하는 펩티드가 적재된 체외 시스템을 통과하게 되고, 그 다음으로 상응하는 NKT 세포는 대상체에게 재투여된다. CD1 분자는 대안적으로 펩티드의 공유 부착으로 생성될 수 있거나 또는 펩티드와 단일 분자로서 유전자 조작에 의해 생성될 수 있다. 이를 달성하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다.
본 발명의 추가 양상은 CD1 분자에 의해 제시되는 소정 에피토프에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 보유하도록 조작된 (NK) T 세포의 제조를 위한 방법이다. 이 방법은 중합효소 연쇄 반응을 통한 TCR의 동정 및/또는 증폭 단계, 이러한 수용체를 코딩하는 DNA의 바람직하게 특이적인 표현형 및/또는 특이적인 기능에 대해 선택된, 자기유래 T 세포로의 도입 단계를 포함한다. 바람직하게 CD8을 보유하거나 또는 CD4 및 CD8 둘 모두가 음성인 NKT 계통의 세포가 사용된다. 자가면역 질환의 요법을 위해서, CD4+ 표현형이 바람직하다. 그러나, 바람직한 용법에 따라서, 클래스 I-제한성 (CD8+) 계통 또는 클래스 II-제한성 (CD4+) 계통에 속하는 T 세포를 선택하는 것이 유리할 수 있다. NKT 클래스 I 또는 클래스 II 계통의 세포는 예를 들어 조절성 T 세포 또는 TIGIT 또는 DNAM을 보유하는 억제성 세포, 또는 세포독성 기능과 연관된 리간드, 예컨대 NKG2D에 대한 수용체 발현 세포의 기능을 보유하도록 더욱 선택될 수 있다. 당업자는 이러한 목록이 제한적인 것이 아님을 이해할 것이다. 이러한 세포를 제조하기 위한 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 취합하여, 이러한 조작된 세포는 NKTCR T 세포라고 한다.
본 발명의 추가 양상은 표적 세포의 표면 항원에 특이적인 항체를 보유하는 NKT 세포의 제조를 위한 방법이다. 이러한 경우에서, NKT 세포는 이의 표현형 및 기능에 따라서 선택되고 항체는 소포체 스트레스 병태와 연관된 리간드, 세포내 병원체와 연관된 분자의 종양유전자를 인식한다. 이러한 세포를 제조하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 취합하여, 이러한 조작된 세포는 CAR NKT 세포라고 한다.
본 발명은 또한 병원체로 감염된 세포 또는 종양 세포를 제거하는 그 능력을 증가시키기 위해서 숙주에게 재투여를 위해 시험관 내에서 수득, 확장 및 활성화된 NKT 세포에 관한 것이다. CD1a, CD1b 또는 CD1c 양성 APC에 의한 NKT 세포의 시험관내 자극에 대한 대안으로서, 본 발명은 또한 CD1 분자 상에 적재를 위해 엔도솜 경로로 면역원성 펩티드의 발현을 구동시킬 수 있는 유전자 구성체를 사용한 APC의 형질감염 또는 형질도입 방법을 적용한다.
특히, 본 발명은 특이적 NKT 세포를 확장하기 위한 방식을 제공하고, 그 결과로서 증가된 활성은 제한없이
(i) 프로-염증성 사이토카인의 증가된 생산,
(ii) 시냅스가 형성되는 표적 세포의 증가된 접촉- 및 가용성 인자-의존적 제거
를 포함한다.
그러므로 그 결과는 세포내 병원체로 감염된 세포 또는 종양 세포에 대한 보다 효율적인 반응이다.
반대로, 본 발명은 또한 만성 자가면역 질환, 만성 염증의 상황에서 억제성 또는 조절성 기능을 증가시키기 위해 숙주에게 수동 투여, 또는 치료적 목적을 위한 생물제제의 투여를 위해 시험관 내에서 수득, 확장 및 활성화된 NKT 세포에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 특이적 NKT 세포를 확장시키기 위한 방식을 제공하고, 그 결과로서 증가된 활성은 제한없이
(i) 억제성 사이토카인의 증가된 생산,
(ii) 시냅스가 형성되는 표적 세포의 기능의 증가된 접촉- 및 가용성 인자-의존적 조절
을 포함한다.
그러므로 그 결과는 치료적 목적을 위해 투여되는 생물제제에 대한 면역 반응, 또는 만성 염증에 대응하거나, 또는 자가면역 반응에 관여하는 세포의 활성화의 억제이다. 이러한 억제성 활성은 호르몬 예컨대 당뇨병의 인슐린의 생성, 또는 탈수초성 질환 예컨대 다발성 경화증에서의 미엘린의 생성을 포함하는, 정상 기능의 복원으로 표적 세포에서 소포체 스트레스로부터의 경감을 포함한다.
본 발명의 범주 내에서 특히 흥미로운 것은 본 명세서에 기술된 방법이 NKT 세포의 하류에서 작용하는 세포의 기능 또는 수의 변경을 야기시킬 수 있다는 것이다. 자연 살해 (NK) 세포는 가용성 인자 예컨대 사이토카인의 생성 및 세포 대 세포 접촉 둘 모두를 통해서, NKT 세포에 의해 제공되는 도움에 매우 의존적이다. 이것은 그 결과로 NK 세포의 증가되거나 또는 감소된 활성을 야기한다. 증가된 활성은 종양 및 세포내 병원체에 의한 감염과 같은 상황에서 바람직하고, 여기서 활성화된 NK 세포는 종양 또는 감염된 세포에 대한 세포독성 반응에 참여하여 증폭시킨다. 감소된 활성은 NK 세포가 예컨대 1형 당뇨병 및 다발성 경화증을 포함한 조직 특이적 자가면역 질환에서 유해한 역할을 하는 상황에서 바람직하다.
본 발명은 또한 체액 또는 장기에서 필요한 특징 또는 특성을 갖는 NKT 세포의 동정에 관한 것이다. 그 방법은 CD162, NKG2D 및 CD244의 발현을 포함하여, 그들 표면 표현형을 통한 NKT 세포의 동정 단계를 포함한다. 그 다음으로 세포는 CD1 분자에 의해 제시될 수 있는 펩티드로서 한정되는 NKT 세포 에피토프와 접촉된다. 유리하게, CD1 분자의 다량체가 이러한 동정을 수행하는데 사용될 수 있다. 이어서 세포는 IL-7 및 IL-2 및/또는 IL-15의 존재 하에 시험관 내에서 확장될 수 있다.
본 발명은 치유적 및 예방적 적용 둘 모두를 포괄한다.
본 발명의 치료적 잠재성은 억제성 또는 조절성 특성을 갖는 NKT 세포가 시냅스를 형성하는 세포의 물질대사를 변경시킬 수 있고, 그와 같이 소포체 스트레스로부터 표적 세포를 구제하는 잠재성을 보유하여, 정상 세포 기능의 복원을 위한 단계를 설정한다는 관찰에 관한 것이다. 이의 예는 인슐린-의존적 당뇨병 및 인슐린 생성의 복원, 및 탈수초성 질환 예컨대 다발성 경화증에서 미엘린 생성을 복원하는 희소돌기교세포의 능력에서 확인된다.
본 발명의 치유적 잠재성은 또한 세포내 병원체에 의한 감염 및 이미 존재하는 종양에서의 적용에서 설명된다. 감염 또는 종양 세포의 제거는 감염 또는 종양과 연관된 항원의 방출이 뒤따른다. 이러한 항원은 항원-제시 세포에 의해 흡수되어서 감염 또는 종양의 박멸을 초래하는 면역 반응의 캐스캐이드를 유발시킨다.
본 발명은 또한 능동 백신접종 또는 세포의 수동 전달에 의한, 요법의 예방적 용법을 포괄한다.
본 발명의 추가 장점은 그룹 I CD1 분자의 매우 제한된 정도의 다형성에 관한 것이다. 그러므로 본 발명의 범주 하에서 약물은 펩티드가 요법을 필요로 하는 많은 수의 환자에게 이와 같이 적용가능하다는 의미에서, 범용 분자로서 간주될 수 있다.
NKT 세포 개체군은 유리하게 시험관내 확장 또는 유전자 조작을 통해 수득된다 (NKTCR T 세포 또는 CAR NKT 세포). 이러한 세포 개체군은 반드시 MHC 호환성이지 않은 환자에게 투여될 수 있다.
하나 초과의 항체가 대상체에 존재하는 상황에서, 약물은 NKT 세포 조제물의 혼합물, 또는 직접 백신접종 접근법을 위한 펩티드의 조합으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 약물은 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 활성 성분으로서 본 발명의 면역원성 펩티드, 상기 면역원성 펩티드에 대한 NKT 세포의 개체군 또는 상기 면역원성 펩티드를 발현할 수 있는 유전자 치료 벡터 중 적어도 하나를 포함하는 (약학) 제제이다. 활성 성분(들) 이외에도, 이러한 제제는 (약학적으로 허용가능한) 희석제, 담체 또는 보강제 중 적어도 하나를 포함하게 된다. 특히, 본 발명의 약학 조성물은 예방적 또는 치료적 적용을 위한 백신이다.
NKT 세포 에피토프는 하나 초과의 그룹 1 CD1 분자에 결합할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, CD1a 및 CD1c의 구조는 유사하지만 동일하지는 않아서, 펩티드가 CD1a 및 CD1c 둘 모두에 결합할 수 있다. 이것은 CD1a 및 CD1c의 특성이 상이하므로 (특히 그들의 상이한 세포내 수송 경로로 인해) NKT 세포 인식 및 활성화의 효과가 동일하다는 것을 의미하지 않는다.
본 발명의 면역원성 펩티드의 NKT 세포 에피토프는 단백질의 천연 에피토프 서열에 상응할 수 있거나 또는 변형된 NKT 세포 에피토프가 천연 NKT 세포 에피토프 서열과 유사한, CD1 클레프트 내에서 결합할 수 있는 이의 능력을 보유하는 한, 이의 변형된 형태일 수 있다. 변형된 NKT 세포 에피토프는 천연 에피토프와 동일한 CD1 단백질에 대한 결합 친화성을 가질 수 있지만, 또한 더 낮거나 또는 더 높은 친화성을 가질 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 면역원성 펩티드는 CD1 분자 내에서 프로세싱 및 제시를 위해 초기 또는 후기 엔도솜으로 펩티드의 흡수를 촉진하는 아미노산 서열 (또는 다른 유기 화합물)을 더 포함한다.
후기 엔도솜 표적화는 단백질의 세포질 꼬리부에 존재하는 신호에 의해 매개되고 충분히-동정된 펩티드 모티프 예컨대 디류신-기반 [DE]XXXL[LI] 또는 DXXLL 모티프 (예를 들어, DXXXLL), 티로신-기반 YXXØ 모티프 또는 소위 산성 클러스터 모티프에 해당된다. 기호 Ø는 부피 큰 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, Ile, Leu)를 의미한다. 후기 엔도솜 표적화 서열은 MHC-유사 CD1 분자에 의한 항원-유래 NKT 세포 에피토프의 프로세싱 및 효율적인 제시를 가능하게 한다. 이것은 3D 구조를 변경시키고 에피토프 교환을 최적화시키는, 촉진된 산성 환경에서 에피토프를 수송하기 위해 후기 엔도솜으로 전달되는 CD1b의 경우에 특히 흥미롭다.
단리된 펩티드 서열은 펩티드 서열이 NKT 세포 반응을 유발시키는지 여부를 결정하기 위해, 예를 들어 NKT 세포 생물학 기술을 통해 시험된다. NKT 세포 반응을 유발시키는 것으로 확인된 이들 펩티드 서열은 NKT 세포 자극 활성을 갖는 것으로 정의된다. 인간 NKT 세포 자극 활성은 종양-유래 항원, 병원체-연관 항원, 자기항원, 알레르겐, 감염원 또는 상기 항원 유래 펩티드/에피토프와 치료적 목적에 사용되는 생물제제에 감작된 개체로부터 수득된 NKT 세포를 배양하고, NKT 세포의 증식이 예를 들어 삼중수소화 티미딘의 세포 흡수를 통해 측정시 펩티드/에피토프에 대한 반응이 발생되는지 여부를 결정하여 더욱 시험될 수 있다. 펩티드/에피토프에 대한 NKT 세포의 반응에 대한 자극 지수는 펩티드/에피토프에 반응한 최대 CPM을 대조군 CP으로 나누어서 계산될 수 있다. 배경 수준보다 1.5배 이상인 NKT 세포 자극 지수 (S.I.)는 "양성"으로 간주된다. 결과적으로, 배경 수준보다 1.5배 미만인 SI는 "낮음"으로 간주된다. 양성 결과는 시험된 펩티드/에피토프의 그룹에 대한 각 펩티드/에피토프의 평균 자극 지수를 계산하는데 사용된다.
본 발명의 면역원성 펩티드는 바람직하게 2.0 이상의 평균 NKT 세포 자극 지수를 갖는다. 2.0 이상의 NKT 세포 자극 지수를 갖는 면역원성 펩티드는 예방제 또는 치료제로서 유용한 것으로 간주된다. 보다 특히, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드는 적어도 2.5, 적어도 3.5, 적어도 4.0, 또는 심지어 적어도 5.0의 평균 NKT 세포 자극 지수를 갖는다. 그룹 1 CD1 분자의 유의한 다형성의 부재는 단일 또는 짧은 수의 에피토프가 대부분의 개체의 NKT 세포에 의해 인식되어야 하므로, 이 단계를 상당히 용이하게 한다.
비천연 또는 변형된 NKT-세포 에피토프는 그룹 1 CD1 분자에 대한 그들 친화성에 대해 더욱 임의로 시험될 수 있다.
예를 들어, 상세 맵핑 기술을 통해 최적 NKT 세포 에피토프를 결정하기 위해서, T 세포 자극 활성을 갖고 따라서 T 세포 생물학 기술을 통해 결정된 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드는 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 아미노산 잔기의 첨가 또는 결실에 의해 변형되고 변형된 펩티드에 대한 NKT 세포 반응성의 변화를 결정하기 위해 시험된다. 과확장의 부재 하에서 NKT 세포의 활성화 정도를 평가하기 위한 대안적인 방법은 TCR 관여의 평가 (이러한 관여 이후에 신속하게 발생되는 NUR77의 인산화 정도를 측정함에 의함)에 의존적이다. NKT 세포는 대조군 실험에서 수득된 값보다 1.2배를 초과하면 양성으로 간주되는 NUR77 인산화로 측정된, 강직성 자극에 의한 시냅스 형성에 반응할 수 있다. 그러므로 낮은 인산화 지수는 대조군 값의 ≤ 1.2로서 간주된다.
일 양상에서, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 단리된 말초 혈액 세포와 접촉시킴으로써 혈액 샘플을 시험관내 자극시키고 IL-7 및 다양한 비율의 IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 자극된 세포를 확장시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명에 따른 방법은 높은 수의 NKT 세포가 생성되고 종양-관련 항원, 병원체-연관 항원, 자기항원, 알레르겐, 감염원 또는 치료적 목적에 사용되는 생물제제에 특이적이라는 장점을 갖는다.
대안적으로, NKT 세포는 생체 내에서, 즉 본 명세서에 제공된 면역원성 펩티드의 대상체 (인간, 또는 인간외 포유동물이 (천연 또는 외생성) 그룹 1 CD1 분자를 발현하는 항원-제시 세포를 갖는다면 인간외 포유동물)에 대한 투여, 및 생체 내에서 생성된 NKT 세포의 수집을 통해서 생성될 수 있다.
상기 방법으로 수득될 수 있는 종양 항원-특이적 NKT 세포는 특히 흥미로우며, 종양과 연관된 이환율 및/또는 사망률을 억제하는 치료 (를 위한 약물의 제조)를 위해 사용된다. 이것은 종양을 앓는 환자가 자발적으로 또는 요법의 결과로서, 빈번하게 면역약화되어서, 직접 백신접종에 반응할 수 없기 때문에 특히 중요하다. 상기 방법으로 수득될 수 있는 병원체-연관 항원-특이적 NKT 세포는 또한 바이러스, 박테리아 또는 기생충의 감염과 연관된 이환율 및/또는 사망률의 대상체에서의 치료 또는 예방 (을 위한 약물의 제조)을 위해 사용하기 위해 특히 흥미롭다.
그들의 천연 또는 번역후 변형된 형태에 있어서 자기 항원에 특이적인 NKT 세포는 자기항원에 대한 면역 반응과 연관된 대상체 이환율 및/또는 사망률을 치료하기 위해, 자가면역 질환의 치료 (를 위한 약물의 제조)를 위해 사용된다. 대상체가 만성적으로 노출되고, 감염원에 의해 생성되는 항원 또는 알레르겐에 특이적인 NKT 세포는 이의 수반되는 이환율 및 사망률과 함께, 이러한 만성 노출로 인한 염증 반응의 치료 (를 위한 약물의 제조)를 위해 사용된다. 치료 목적으로 사용되는 생물제제에 특이적인 NKT 세포는 상기 생물제제에 대한 면역 반응이 상승되고, 이러한 생물제제의 투여 부재 하에서, 이환율 및/또는 사망률을 겪는 대상체의 치료 (를 위한 약물의 제조)를 위해 사용된다.
본 발명의 면역원성 펩티드의 상기 기술된 임의의 용도를 위해서, 펩티드는 NKT 세포로 대체될 수 있다. 동종이계 및 자기발생 세포 둘 모두의 사용이 고려된다.
본 발명은 펩티드-CD1 복합체 (NKTCR T 세포) 및 CAR NKT 세포에 특이적인 항원 수용체를 보유하는 T 세포의 개체군으로 확대된다. NKTCR T 세포는 클래스 I-제한성 (CD8+) 또는 클래스 II-제한성 (CD4+) T 세포에 속하는 T 세포, 또는 NKT 계통의 T 세포로 구성된다. 이들 세포는 항원-특이적 NKT 세포로부터 수득된 수용체를 발현한다. 또한, 본 발명은 표적 세포 (CAR NKT 세포)에 의해 발현되는 표면 분자에 특이적인 항체를 보유하도록 조작된 NKT 세포의 개체군으로 확대된다.
NKTCR T 세포는 바람직하게 종양 및 세포내 병원체에 의한 감염의 치료에 사용되고, 이 경우에, 세포용해성 또는 세포독성 표현형, 예컨대 NKT 세포의 클래스 I-제한성 CD8+ T 세포가 바람직하다. 조절성 기능을 요구하는 상황, 예컨대 자가면역질환, 알레르기성 질환, 만성 염증 또는 소포체 스트레스를 특징으로 하는 상황에서 적용을 위해서, 비세포독성 표현형, 예컨대 클래스 II-제한성 CD4+ T 세포, 천연 조절성 T 세포 또는 조절성 NKT 세포가 바람직하다. CAR NKT 세포는 바람직하게 종양 및 세포내 병원체에 의한 감염의 치료에 사용된다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 예를 들어 재조합 발현 또는 유전자 요법을 위해 그들을 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 핵산 서열은 본 발명의 면역원성 펩티드를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 면역원성 펩티드는 임의의 적합한 유전자 요법 방법을 사용하여 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 종양, 세포내 병원체, 자기항원, 알레르겐, 감염원에 만성 노출 또는 치료적 목적에 사용되는 생물제제와 연관된 이환율/사망률의 예방을 위한 본 발명의 임의의 용도 또는 방법에서, 본 발명의 면역원성 펩티드에 의한 면역화는 양자 세포 전달과 조합될 수 있다. 조합될 경우에, 상기 면역화, 양자 세포 전달 및 유전자 요법은 임의의 가능한 조합으로, 동시발생적으로, 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
유전자 요법에 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드가 그 펩티드 또는 폴리펩티드가 유래되는 전체 항원의 일부일 수 있다는 것은 당업자에게 분명하다.
본 발명의 약물은 일반적으로, 반드시 그럴 필요는 없지만, 활성 성분으로서 본 발명의 면역원성 펩티드, 면역원성 펩티드에 특이적인 NKT 세포 (의 개체군), 또는 상기 면역원성 펩티드를 발현할 수 있는 유전자 요법 벡터 중 적어도 하나를 포함하는 (약학) 제제이다.
실시예
실시예 1. 그룹 1 CD1 분자를 발현하는 세포 형질감염체의 생성
인간 자궁경부 암종 세포주 (예를 들어, ATCC CCL-2 세포주)로부터 유래된 HeLa 세포는 베타 2 마이크로글로불린의 서열 및 그룹 1 CD1 분자의 서열을 포함하는 구성체로 형질감염시켰다. 베타 2 마이크로글로불린 및 CD1 둘 모두에 의한 공동-형질감염은 세포 표면에서 기능성 수용체를 가능하게 하였고 그러므로 성공적으로 형질감염된 세포는 특이적 항-CD1 항체와의 반응으로 검출되고 배양 배지에서 확장시킨다.
HeLa 세포는 클래스 II 주요 조직적합 복합체 (MHC) 분자를 거의 발현시키기 않거나 또는 전혀 발현시키지 않는다. CD1-제한성 분자의 제조에 사용될 때, 클래스 II MHC 분자에 대한 항체가 배양 배지에 첨가될 수 있다 (하기의 응용 참조).
HeLa 세포에 의한 클래스 I MHC 분자의 발현은 반복된 세포 분열 동안 안정한 넉다운을 가능하게 하는, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 사용하여 해제시켰다. 그렇지 않으면, 클래스 I MHC 분자의 기능은 세포 배양 동안 클래스 I 특이적 항체의 첨가를 통해 일시적으로 억제될 수 있다 (하기의 응용 참조).
배양으로 확장 및 CD1 분자의 표면 발현에 특이적인 항체를 사용한 선별에 의해, 그룹 1 CD1 분자 (CD1a, CD1b 또는 CD1c)를 발현하는 세포주가 수득된다.
실시예 2. NKT 세포의 개체군
그룹 1 CD1 분자가 마우스에서 발현되지 않으므로, 모든 실험은 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 수득된 세포로 수행되었다.
보다 예외적인 상황 하에서, 예컨대 종양을 앓는 환자에서, 세포는 또한 수술 또는 생검에 의해 수득된 조직 샘플, 또는 유체 채취물 예컨대 흉막 또는 복막으로부터 수득될 수 있다.
헤파린 처리 혈액에서 얻은 PBMC는 항-CD19 자성 비드 상에서 음성 선별에 의해 B 림프구를 고갈시켰다. 이어서 나머지 세포들은 CD3 수용체의 발현에 대해 양성적으로 선별된다. 이러한 개체군은 클래스 I 및 클래스 II MHC, 및 CD1 제한성 세포에 의해 제한되는 세포를 함유한다.
실시예 3. Tp53에 대한 CD1b-제한성 NKT 세포의 생성 및 특징규명
CD1b 분자에 의해 제한되고 종양-연관 전사 인자에 특이적인 NKT 세포의 개체군을 생성시켰고 종양 세포를 인식하고 제거하는 이의 능력이 평가되었다.
재조합 Tp53 단백질은 배양 배지 중에 37℃에서 16시간 동안 CD1b 분자로 형질감염된 HeLa 세포와 인큐베이션된다. 다음으로 세포를 세척하고 IL-7, IL-2 및 IL-15의 존재 하에서, 실시예 2에서 수득된 바와 같은 인간 CD3+ T 세포의 존재 하에 인큐베이션된다. 6일의 인큐베이션 후에, CD3+ T 세포는 IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 활성화의 제2 사이클 동안 재조합 Tp53과 사전인큐베이션된 CD1b 형질감염체의 새로운 개체군을 함유하는 웰로 옮겨진다. 이 과정을 총 5회의 사이클 동안 반복한다.
CD3+ 확장 세포의 개체군은 마스터 전사 인자 PLZF를 포함하는, NKT 계통에 특이적인 마커의 존재를 특징으로 한다. 세포는 또한 CD4 및/또는 CD8 보조인자의 발현을 특징으로 한다. 이것은 통상의 형광 활성화된 세포 분류법 (FACS)으로 수행된다. 필요하다면, 세포의 개체군은 단일 보조인자-발현 세포 (CD4+ 또는 CD8+ 세포)로 자성 비드를 사용해 더욱 분리될 수 있다. 이중 음성의 개체군 (CD4-CD8- 세포)이 일반적으로 사용된다.
20개-아미노산 길이의 펩티드는 5개 아미노산이 중복된 Tp53의 전체 서열을 포괄하는 화학 합성으로 제조된다.
CD1b로 형질감염된 HeLa 세포는 이러한 펩티드, 일반적으로 Tp53의 별개 영역으로부터 선택된 5개 펩티드의 혼합물과 16시간의 기간 동안 인큐베이션된다. 이어서, 세포를 세척하고 보조인자 발현의 그들 패턴에 따라서 분리된 단일 개체군으로서 또는 대량 개체군으로서, 상기 기술된 바와 같이 수득된 확장된 인간 CD3+ T 세포의 개체군의 존재 하에 인큐베이션된다.
T 세포의 증식은 적절하다면, 특이적 항체를 사용하는 인산화된 NUR77의 검출 또는 티미딘 도입을 사용하여 3일 후에 평가된다. 증식된 세포 (또는 NUR77의 인산화된 형태를 발현하는 세포)를 연속 희석하고 단일 Tp53 펩티드가 적재된 CD1b-형질감염된 HeLa 세포의 존재 하에서 다시 인큐베이션시킨다. 증식율에 의존하여, 이러한 실험은 클론성이 평가될 수 있는 시점까지 수 회 반복될 수 있다.
에피토프 활성화 NKT 세포를 함유하는 펩티드의 서열 (SEQ ID NO: 1)은 또한, 이러한 에피토프의 측접 잔기 내에 위치되는 강화 모티프와 함께 합성을 통해 생성된다. 바람직한 모티프는 증가된 세포독성 특성을 갖는 NKT 세포의 개체군을 선별하고 확장하기 위해서 CD8 보조인자에 대한 상보성 서열 (SEQ ID NO: 2)을 함유한다.
Tp53 에피토프 및 CD8에 대한 상보성 서열 (SEQ ID NO: 2)을 함유하는 펩티드는 순환성 단핵구로부터 유래된 인간 수지상 세포와 시험관 내에서 사용된다. 간략하게, 단핵구는 항-CD14 항체와 커플링된 자성 비드를 사용해 PBMC로부터 제조된다. 단핵구는 공개된 방법에 따라서, TNF-a가 추가 밤샘 인큐베이션 동안 첨가된 후, 3일 내지 6일 동안 IL-4 및 GM-CSF와의 인큐베이션에 의해 수지상 세포로 전환된다. 이어서 수지상 세포는 밤새 TP53-CD8 펩티드와 인큐베이션되고, 세척되고 나서 상기 기술된 바와 같은 NKT 세포의 존재 하에서 더욱 인큐베이션된다. NKT 세포의 증식 (또는 NUR77 인산화 속도)은 제시 세포가 MHC 및 MHC-유사 분자의 전체 어레이를 발현하는 상태 하에서 에피토프가 제시된다는 증거로서 선택된다. 또한 실험은 단백질의 프로세싱 결과로 예상 에피토프의 제시가 일어난다는 것을 확인하기 위해 전체 길이 재조합 Tp53을 사용해 반복된다.
종양의 치료에서 이러한 NKT 세포의 관련성을 평가하기 위해서, NOG 마우스 (CD3+ T 세포 없음)에게 인간 종양 세포를 이식시키고 종양을 제거하는 NKT 세포의 능력은 이러한 세포의 수동 전달에 의해 평가된다. 따라서, 종양 세포는 인간 종양에서 빈번한 사건인, 고농도의 Tp53의 발현으로서 선택된다. 이러한 종양에서 Tp53의 서열은 NKT 세포가 특이적인 에피토프를 변경시키는 돌연변이가 없다는 것을 보장하기 위해 qPCR에 의해 확인된다. 필요하다면, 종양은 CD1 분자의 표면 발현을 증가시키는 것으로 알려진, 히스톤 디아세틸라제 억제제로 치료될 수 있다 (예를 들어, [Tiper IV, Cancer Immunol Immunother 65: 1411-1421, 2016] 참조). 시간 경과에 따른 종양의 크기를 측정할 수 있기 위해서 종양 세포의 이식편 (± 200,000)을 만든다. 다음 날 NKT 세포 (1 내지 5x106)가 IV 주사된다. 다음으로 마우스는 시간 경과에 따라 종양 성장의 일일 측정이 후속되고 윤리적으로 정당할 때 희생시킨다. 종양 세포를 회수할 수 있고 괴사 징후에 대해 분석할 수 있다.
실시예 4. Tp53을 발현하는 인간 종양 세포 상에서 직접 확장에 의한 CD1b-제한성 NKT 세포의 생성 및 특징규명
인간 유방암-유래 세포주 MDA-MB-231은 Tp53의 Arg280Lys 돌연변이를 보유하고, 증가된 수준의 단백질을 발현하며, 상업적 공급처 (ATCC)로부터 수득하여 기술된 바와 같이 히스톤 디아세틸라제 억제제 예컨대 트리코스타틴-A의 존재 하에서 배양물 중 유지된다 (Tiper IV, Cancer Immunol Immunother, ibid).
실시예 3에서 수득된 Tp53-특이적 NKT 세포 클론은 6일의 공동-인큐베이션 동안 IL-2 및 IL-15의 존재 하에서 세포주 배양물에 첨가되고, 그 이후에 비부착성 NKT 세포는 회수하고 신선한 세포주 개체군에 첨가한다. 3 내지 5회 사이클의 자극을 수행한다.
이러한 배양 이후에 수득되어 확장된 세포는 NKT 계통의 표준 마커의 발현, 예컨대 PLZF의 발현에 대해 특징규명되고, FACS를 사용하여 NKT 계통과 연관된 보조인자 및 표면 분자의 발현에 대해 더욱 특징규명된다.
대안적인 실험에서 종양 세포주는 상응하는 종양을 앓는 환자의 PBMC로부터 수득된 CD3+ 세포의 존재 하에서 공동-배양된다. 이러한 CD3+ T 세포는 NKT 세포 클론이 수득될 때까지 실시예 3에 기술된 대로 확장된다.
이들 실험은 인간 종양 세포주가 Tp53 유래 에피토프와 연관된 CD1b 표면 분자를 발현하고 이러한 발현은 말초 혈액으로부터 수득된 Tp53-특이적 NKT 세포를 활성화시키는데 충분하다는 것을 확고히 한다.
실시예 5. Tp53의 번역후 변형을 발현하는 인간 종양 세포 상에서 직접 확장에 의한 CD1b-제한성 NKT 세포의 생성 및 특징 규명
유비퀴틴화를 포함한, 다수의 Tp53의 번역후 변경이 설명되어 왔다. 유비퀴틴화는 Tp53의 주요 억제인자인, 유비퀴틴 단백질 리가제, MDM2 단백질에 의해 본질적으로 수행되고, 그 자체가 MDM2에 대해 음성 피드백을 행사한다. MDM2는 많은 종양 유형에서 과발현되어서, Tp53의 과유비퀴틴화를 일으킨다. 유비퀴틴은 단백질을 프로테오솜으로 안내하고 프로테오솜 분해로부터의 펩티드는 소포체에 의해 흡수되어 골지체를 관통해 세포 표면 발현된다.
MDM2의 과발현을 보이는 식도 암종 세포주를 배양물 중 유지시킨다.
고농도의 유비퀴틴화된 Tp53의 존재는 특이적 항체를 사용해 검출된다. 암종 세포주는 실시예 3에서 수득된 바와 같은 CD1b-제한성 NKT 세포와 공동배양되고 NKT 세포의 활성화는 실시예 3에 기술된 바와 같이 티미딘의 도입 또는 NUR77의 인산화를 통해 평가된다.
마이크로RNA-661 (miR-661)은 MDM2 RNA를 특이적으로 표적화한다. 암종 세포주의 miR-661에 의한 일시적 형질감염은 MDM2의 발현을 억제하고, Tp53 기능성을 증가시키며, Tp53 유비퀴틴화를 감소시켜서, 프로테오솜 분해가 감소되고, CD1b의 상황에서 세포 표면 제시가 감소되며 NKT 세포 활성화가 감소된다.
이들 실험은 증가된 농도의 번역후 변형된 (즉, 유비퀴틴화) Tp53을 발현하는 인간 종양 세포주가 Tp53-특이적 NKT 세포의 증가된 활성화를 야기시킨다는 것을 확증해 준다.
실시예 6. NKTCR T 세포의 생성
실시예 3에서 생성된 바와 같은 항-Tp53 NKT 세포 클론의 서열은 qPCR을 통해 결정된다. 상응하는 DNA를 제조하여, 본래 CD3이 결실된 클래스 I-제한성 CD8+ T 세포를 형질감염시키는데 사용한다. 형질감염은 유전자 펄서/마이크로펄서 전기천공 큐벳 (BIO-Rad) 및 예를 들어, 문헌 [Kreiter S, Journal of Immunology 2008; 180: 309-318]에 기술된 방법을 사용해 수행되었다.
CD8+ T 세포 개체군은 먼저 B 림프구 (항-CD19 항체) 및 단핵구 (항-CD14 항체)를 제거한 후에 항-CD8 항체로 CD8+ T 세포의 양성 선별을 후속하기 위해서 특이적 항체에 커플링된 자성 비드를 사용하여, Tp53+ 종양의 요법을 필요로 하는 환자의 말초 혈액으로부터 수득된다.
이후에 형질감염된 CD8+ T 세포는 클래스 I-제한성 T 세포의 완전한 세포독성 장비일체를 갖춘 CD1b 분자에 의해 제시되는 Tp53의 에피토프를 인식할 수 있다.
이러한 세포는 Tp53+ 종양을 앓는 환자에게 수동 투여를 위해 사용된다.
실시예 7. 마이코박테리아 감염의 치료를 위한 CD1b-제한성 NKT 세포의 생성 및 특징규명
마크로파지는 마이코박테리움의 주요 저장소를 구성하고 감염의 제어는 이러한 감염된 마크로파지의 특이적 인식 및 제거를 요구한다. 인간 마크로파지는 마이코박테리움의 비병독성 균주로 감염시키고 NKT 세포의 공급원과 인큐베이션시켜서, 감염된 마크로파지를 제거하는 이러한 NKT 세포의 능력을 평가한다.
마크로파지는 20%의 자기유래 혈청을 함유하는 RPM-1640 배지에서의 5일간 PBMC 배양물로부터 수득되었다. 부착성 세포는 2시간 동안 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅한 후에 수집되었고 비부착성 세포는 세척해 버렸다.
마이코박테리움의 비병독성 균주 예컨대 M.tb H37Rv 균주 (ATCC 256)는 이러한 마크로파지를 감염시키는데 사용되었다. 감염된 마크로파지의 장기간 배양은 10%의 자기유래 혈청을 함유하는 RPMI 중에서 단일층으로 정착시켰다.
감염된 마크로파지의 개체군은 NKT 세포의 공급원, 즉 실시예 2에 기술된 바와 같은 PBMC로부터 수득된 CD3+ T 세포와 인큐베이션된다. 참고로, 그룹 1 CD1 분자의 다형성의 부재는 유전자적으로 비관련된 개체로부터 수득된 NKT 세포를 시험하기 위해 단일 마크로파지 개체군을 사용하는 것을 가능하게 한다.
이러한 배양으로 증식되는 세포는 Tp53에 대해 실시예 3에 기술된 것과 유사한 방법에 따라서, 마이코박테리움-감염된 마크로파지에 대한 주기적 노출을 통해 확장된다. 바람직한 상황에서, 상응하는 클래스 I-제한성 또는 클래스 II-제한성 T 세포의 확장을 최소화시키기 위해서, 클래스 I 및 클래스 II MHC 결정부에 대한 중화 항체를 배양 기간 동안 포함시킨다.
NKT 세포가 수득되면, 이들은 단일 재조합 마이코박테리움-유래된 단백질과 인큐베이션된 CD1b-형질감염된 세포에 적용된다. 초기 분비성 항체 (ESA)는 항체 및 세포 반응 둘 모두를 유발시키는 것으로 알려진 마이코박테리움의 대부분의 면역원성 단백질 중 하나이다. 그러므로 재조합 ESA는 자극 사이클 동안 CD1b-형질감염된 세포를 적재하는데 사용된다.
대안적으로, CD1b-형질감염된 세포는 마이코박테리움-유래 단백질을 코딩하는 DNA의 구성체로 더욱 형질감염된다. 이러한 대안은 재조합 형태에서 이용불가능한 단백질을 평가할 기회를 제공하고 마이코박테리움으로부터 유래된 지질 또는 당지질에 반응하는 NKT 세포를 제거하는 것을 가능하게 한다.
또한, 중복된 펩티드는 마이코박테리움-유래 단백질의 서열을 반복하여 생성되고 이러한 펩티드가 CD1b 형질감염된 세포에 적용된다.
세포의 수 및 인큐베이션 시간을 포함한 이들 방법은 Tp53 단백질에 대해 실시예 3에 보고된 것과 본질적으로 유사하다.
최종 결과는 CD1b 분자에 의해 제한되고, 마이코박테리움의 펩티드 에피토프에 특이적인 NKT 세포의 개체군이다. 실시예 3에 기술된 바와 같이, 세포를 특징규명하고 배양으로 확장시킨다.
상응하는 CD1b-제한성 에피토프 (SEQ ID NO: 3)는 TLR9에 대한 작용제로서 CpG 모티프를 함유하는 서열과 함께 화학 합성으로 제조된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드 (ODN) 서열 (SEQ ID NO: 4)은 펩티드-ODN 서열 (한 분자에 SEQ ID NO: 3+ SEQ ID NO: 4)을 생성시키기 위해서, SEQ ID 4의 펩티드의 카복시 말단부에서 공유적으로 커플링된다.
펩티드-ODN은 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조된 수지상 세포에 의한 제시에 사용되고 세포는 실시예 2에 기술된 바와 같이, 말초 혈액으로부터 수득된 CD3+ T 세포의 조제물과 인큐베이션된다. NKT 세포의 활성화는 티미딘 도입 또는 NUR77 인산화에 의해 평가된다.
인간 항-마이코박테리움 NKT 세포의 생체 내 관련성을 평가하기 위해서, NOG 마우스를 마이코박테리움 균주로 감염시킨 후에, 마우스 그룹은 NKT 세포 수동 투여 후 시간 경과에 따라 마이코박테리아의 존재량에 대해 평가된다 (일반적으로 마우스 당 2x105 세포).
실시예 8. 미엘린에 특이적인 CD1c-제한성 NKT 세포의 생성 및 특징규명 및 희소돌기교세포에 의한 미엘린 형성에 대한 그들 효과의 평가
인간 희소돌기교세포 (ODN) 세포주는 CD1c-제한성 NKT 세포의 개체군을 유발시키는 다양한 배양 조건 하에서 사용되고, 미엘린의 생성을 조절하는 이러한 세포의 능력을 특징규명한다.
인간 희소돌기교세포 전구체 세포 (OPC) (A2B5+ OPC)는 상업적 공급 업체에서 입수된다. OPC는 성숙한 OPC와 구별하기 위해서, A2B5 항원 및 PGDFRa에 대한 항체로 코팅된 마이크로비드를 사용해 준비된다.
OPC 세포주는 배양으로 유지시키고 미엘린 희소돌기교세포 당단백질 (MOG)을 생성시키는 이의 능력은 특이적 ELISA를 사용하거나, 또는 단백지방 단백질 (PLP)에 대한 인시츄 하이브리드화를 통해서 시간 경과에 따라 평가된다. 병행 배양은 소포체 스트레스를 증가시키는 조건 하에서, 예컨대, 예를 들어 탑시가르긴 또는 툰니카마이신을 첨가하여 수행된다. OPC 세포주는 특이적 항-CD1 항체에 의해 검출되는 바와 같이 그들 표면에 CD1 분자를 발현시키는 것이 확인된다.
OPC 세포주는 실시예 2에 기술된 바와 같이 PBMC로부터 제조되는 NKT 세포의 공급원과 인큐베이션된다. 3일 인큐베이션 후에, 비부착성 세포를 회수하고, 세척하여 신선한 OPC 세포주와 동일 조건 하에서 재-인큐베이션시킨다. 자극 사이클은 3회 내지 4회 반복된다. 이어서, 비부착성 세포를 회수하고, 세척하여 그들의 표현형을 특징규명한다. 병행 실험에서, 인큐베이션 단계는 클래스 I 및 클래스 II 분자에 대한 항체의 존재 하에서 수행된다.
이러한 배양 조건으로부터 회수된 세포는 PLZF의 발현을 포함하여, NKT 계통에 특징적인 마커의 존재에 대해 분석된다.
세포의 추가 조제물은 재조합 MOG 단백질이 적재된 후 MOG 단백질-유래 에피토프를 제시하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득된 CD1 형질감염체의 존재 하에서 배양하여 수득된다. 3회 내지 4회의 자극 사이클은 Tp53-특이적 NKT 세포에 대해 실시예 3에서 한정한 조건 하에서 수행된다. 이러한 자극 사이클 종료시에 수득된 세포 개체군은 NKT 세포에 특징적인 표현형 마커에 대해 분석된다.
다음으로 MOG에 대한 특이성은 실시예 3에 기술된 바와 같은 진보적인 접근법으로 MOG 단백질의 서열이 중복된 펩티드의 혼합물을 사용해 평가된다.
NKT 세포에 의해 인식되는 에피토프를 포괄하는 펩티드는 화학 합성으로 제조된다. 적절한 에피토프를 함유하는 펩티드는 그와 같이 더 생성되거나 (SEQ ID NO: 4) 또는 측접 잔기 내에 위치된 강화 모티프를 포함하고 CD4 보조인자에 대한 항체의 가변 부분의 서열을 함유하게 생성된다 (SEQ ID NO: 6의 말단).
그러므로 에피토프 및 강화 모티프의 전체 서열은 SEQ ID NO: 6이다.
상기에 기술된 대로 수득된 NKT 세포 클론은 SEQ ID NO: 5의 펩티드, 또는 CD4 보조인자에 대한 상보성 서열을 함유하는 펩티드 (SEQ ID NO: 6)가 사전적재된 인간 단핵구-유래 수지상 세포와의 배양에서 사용된다. 신선한 수지상 세포에 대해 각 시기에 수행되는 3회 내지 4회의 자극 사이클 이후에, 비부착성 세포를 수집하여 그들 표현형에 대해 특징규명된다.
NKT 세포의 클론은 인간 OPC 세포주와 인큐베이션되고 미엘린 생성을 복원시키는 그들 능력은 미엘린의 주요 성분인, 주요 염기 단백질 (MBP) 또는 PLP에 대한 인시츄 하이브리드화를 통해 분석된다.
NOG 마우스는 ODN 세포주로 재구성되고, 뒤이어 NKT 세포 클론의 IV 투여가 이루어지며, 인간 미엘린 생성이 ELISA에 의해 평가된다.
실시예 9. GAD65에 특이적인 CD1c-제한성 NKT 세포의 생성 및 특징규명 및 랑게르한스 섬 b 세포에 의한 인슐린 생성에 대한 그들 효과의 평가
인슐인을 생성하는 인간 β 세포주가 CD1c-제한성 NKT 세포의 개체군을 유발시키는 다양한 배양 조건 하에서 사용되고 인슐린의 생성을 조절하는 이러한 세포의 능력이 평가된다.
인간 β 세포주 Blox5 (Levin F, Molecular Endocrinology, 2001 15, 478)는 배양으로 유지시키고 인슐린을 생성시키는 그 능력은 특이적 ELISA로 시간 경과에 따라 평가된다. 병행 배양은 실시예 8처럼 증가된 소포체 스트레스의 조건 하에서 수행된다 (또한 [Marre ML, Journal of autoimmunity 2016, 72, 33-46] 참조). 세포주는 특이적 항-CD1 항체로 검출시 표면에서 CD1 분자를 발현하는 것으로 확인된다.
세포주는 ODN에 대해 실시예 8에 기술된 바와 같은 방법에 따라서, 실시예 2에 기술된 바와 같은 NKT 세포의 공급원으로서 인간 PBMC와 인큐베이션된다.
이러한 배양 조건으로부터 회수된 세포는 PLZF의 발현을 포함하여, NKT 계통에 특징적인 마커의 존재에 대해 분석된다.
이러한 NKT 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같은 CD1c 형질감염체 세포주와 인큐베이션시킨다. 이 경우에서, 형질감염체는 먼저 그의 전체 길이 또는 5개 아미노산의 중복부를 갖는 단백질의 전체 서열을 포괄하는 20개 아미노산-길이 펩티드의 혼합물로서 GAD65와 인큐베이션된다. 에피토프의 일부는 소포체 스트레스를 수반하는 GAD65의 변경을 모방하기 위해서, 팔미토일 또는 미리스토일 사슬과 같은 알킬 사슬을 함유하도록 변형된다.
3회 내지 4회의 자극 사이클 이후에 수득된 NKT 세포의 개체군은 표현형 마커에 대해 분석된다.
NKT 세포에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 펩티드는 화학 합성으로 제조되고 자극 어세이에서 사용된다. CD1c에 의해 제한되는 에피토프를 포함하는 한 펩티드 (SEQ ID NO: 7)는 SEQ ID NO: 8의 전체 서열을 수득하기 위해서, CD4 보조인자에 대한 항체의 가변 부분의 서열을 함유하고 측접 잔기 내에 위치된 강화 모티프를 포함하여 합성된다. 이러한 펩티드는 당분야에 공지된 방법을 사용하여, 결합된 티오에스테르의 형성에 의해 SEQ ID NO: 8의 펩티드의 위치 2에서 Cys의 팔미토일화를 통해 더욱 변형된다 (SEQ ID NO: 9의 펩티드).
상기 기술된 바와 같이 수득된 NKT 세포 클론은 SEQ ID NO: 9의 펩티드가 사전적재된 인간 단핵구-유래 수지상 세포와의 배양에서 사용된다. 신선한 수지상 세포에 대해 각 시점에 수행된 3회 내지 4회의 자극 사이클 이후에, 비부착성 세포를 수집하고 그들 표현형에 대해 특징규명된다.
NKT 세포의 클론은 인간 β 세포주와 인큐베이션되고 인슐린 생성을 복원시키는 그들 능력을 분석한다.
참고로, 이러한 실시예에서, 인슐린 생성의 제어는 GAD65-특이적 CD1c-제한성 NKT 세포의 의존 하에 있고, GAD65는 글루타메이트를 γ-아미노부티르산 (GABA)으로 전환시키는 표면-앵커링 효소로서 β 세포주에 의해 생성되고, 이는 β 세포 표면 수용체, GABAR에 결합한 후에 β 세포에 대한 보호 효과 및 인슐린을 생성시키는 그들 능력을 발휘한다. GAD65의 표면 발현은 특이적 항체를 사용해 평가된다.
NOG 마우스는 증가된 소포체 스트레스 조건에 따르는 β 세포주로 재구성되고, 뒤이어 NKT 세포 클론이 IV 투여되고 인간 인슐린의 생성이 ELISA를 통해 검출된다.
실시예 10. 집먼지 진드기-유래 알레르겐, Der p1에 특이적인 CD1a -제한성 NKT 세포의 생성 및 특징규명, 및 CD1a 분자가 유전자이식된 실험 마우스 모델에서 천식의 제어에 대한 그들 효과의 평가
아세틸콜린의 흡입에 대한 증가된 기도 반응성으로 정의되는 기관지 천식은 알레르겐의 흡입에 의한 기관지 상피 수준에서 발생된 염증 변화를 통해 유도된다. 상피 세포는 염증 및 증가된 기도 과반응성을 유발시키는 수많은 프로염증성 분자 및 케모카인을 생산한다. CD1a에 의해 제한되는 NKT 세포는 이러한 사건을 제어하고 기도 과반응성을 감소시킨다.
실시예 1에서 수득된 바와 같은 CD1a-발현 형질감염체 세포는 실시예 2에 기술된 바와 같이 수득된 인간 CD3+ PBMC의 개체군과 함께 재조합 Der p1과 인큐베이션된다. Il-2, IL-7 및 IL-15의 존재 하에서 3회 내지 4회의 자극 사이클 이후에, NKT 세포의 존재는 표현형 결정 및 표준 전사 인자, PLZF의 발현을 통해 평가된다.
Der p1-특이적 NKT 세포의 개체군은 Der p1의 전체 서열을 포괄하는 20개-아미노산 길이 펩티드가 사전적재된 CD1a-형질감염체 세포와 인큐베이션되고, 자극 사이클은 3회 내지 4회 반복된다. 단일 에피토프와 반응하는 클론이 확장된다.
CD1a-제한성 에피토프를 함유하는 펩티드는 합성으로 제조된다. CD1a-제한성 에피토프를 포괄하는 펩티드가 선택되고 (SEQ ID NO: 10) C-XH-C 형식 [여기서 C는 시스테인을 의미하고 H는 양자 교환체로서 히스티딘을 의미함] (SEQ ID NO: 11)의 티오리독스 모티프를 함유하는 강화 모티프와 함께 생성되어, 전체 서열 SEQ ID NO: 12가 수득된다.
CD1a 분자를 발현하는 마우스 품종이 통상의 프로토콜을 사용하여 천식 모델을 개발하는데 사용된다. 이러한 마우스 품종을 수득하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다.
간략하게, 마우스는 명반 상에 흡착된 Der p1 (100 μg)의 1회 IP 주사를 통해 감작시키고, 1주 후에 염수 중 Der p1의 3회 비내 투여를 후속한다 (투여 당 10 μg). 이러한 조건 하에서 마우스는 신체 프레치스모그래피를 통해 측정시 아세틸콜린의 흡입에 대한 과반응성이 발생된다 (예를 들어, [Vanoirbeek JA, Toxicology Science 2014; 80: 310-321] 참조).
이러한 마우스는 IP 감작 이후 알레르겐의 비내 투여 전에 항-Der p1 NKT 세포 (마우스 당 2x105 세포)의 IV 투여에 의해 재구성된다.
증가하는 농도의 아세틸콜린의 흡입으로 평가시 기관지 과반응성을 예방하는 SEQ ID NO: 12에 특이적인 Der p1-특이적 NKT 세포의 능력은 신체 프레치스모그래피로 측정된다.
실시예 11. 감염원 단백질에 특이적인 CD1a-제한성 NKT 세포의 생성 및 특징규명, 및 CD1a 분자의 유전자이식 실험 마우스 모델에서 만성 기도 염증의 제어에 대한 그들 효과의 평가
해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) (HI)는 소형 그람-음성 구상간균으로서, 기도의 만성 군락화를 초래하고 만성 폐색성 폐질환 (COPD)을 앓는 환자에 대해 상당한 악화 인자를 구성하여, 만성 염증 및 조직 파괴를 초래한다. 이러한 염증은 종종 인플루엔자 바이러스의 존재 하에서 악화되고 주로 선천성 면역 반응에 의한 것으로 여겨진다.
CD1a-제한성 B형 HI (HIb)-특이적 NKT 세포를 발생시키고 기관지 및 폐 염증 침윤의 제어에 대해 평가된다.
실시예 1에서 수득된 바와 같은 CD1a-발현 형질감염체 세포는 HI 유형 중에서 고도의 보존성 항원인, HIb의 26-kDa 외막 단백질 (OMP26)과 인큐베이션시키고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 PBMC로부터 수득된 인간 CD3+ 세포의 개체군 존재 하에서 배양시킨다. 3회 내지 4회의 자극 사이클 이후에, CD3+ T 세포의 개체군은 PLZF 전사 인자의 발현을 포함하여, NKT 계통의 마커에 대해 평가된다.
OMP26의 전체 서열을 포괄하는 펩티드는, 평균 20개 아미노산 길이이고 5개 아미노산이 중복된 것으로서 수득된다. 이들 펩티드는 CD1a 형질감염체 세포를 적재하는데 사용되고, 상기에서 수득된 바와 같은 NKT 세포의 존재 하에서 더욱 배양된다. 3회 내지 4회의 자극 사이클 이후에, NKT 세포는 표면 표현형, 사이토카인 생성 및 전사체에 대해 특징규명된다.
서열 (SEQ ID NO: 13)의 펩티드는 이러한 CD1a-제한성 NKT 세포를 활성화시키고 에피토프의 아미노 말단부 및 카복시 말단부 둘 모두에서 측접 잔기에 삽입된 하나의 시스테인을 갖도록 합성을 통해 생성된다 (SEQ ID NO: 14).
실시예 10에 기술된 바와 같이 CD1a 분자를 발현하는 마우스 품종 (C57BL/6)은 기도 염증을 제어하는 OMP26에 특이적인 NKT 세포의 능력을 평가하는데 사용된다. 마우스는 저병원성 인플루엔자 바이러스 (A/PR8)의 비내 (IN) 적용으로 접종되고 3일 후에 105 CFU의 HIb의 IN 적용이 후속된다. 염증 정도는 폐 및 기관지 분지의 염증 세포의 침윤을 평가하여 기도에서 측정된다.
이러한 마우스는 HIb의 IN 적용 전, 또는 1일 이후에 OMP26-특이적 CD1a-제한성 NKT 세포로 재구성되고 폐 및 기관지 분지 염증에 대한 세포 투여의 효과가 평가된다. 이러한 재구성은 만성 염증 세포 침윤의 징후를 경감시키는 것으로 입증된다.
실시예 12. 산성 α 글루코시다제 (AAG)는 CD1b-제한성 에피토프의 제거에 의해 비면역원성을 야기시킨다
산성 α 글루코시다제 (AAG)는 폼페병에서 기능적으로 결손되어서, 유아형의 질환에서 조기 사망, 또는 후기 발병 질환에서 점진적인 글리코겐 축적 및 근육 기능이상을 초래한다. 그러나, AAG의 재조합 형태의 투여는 이 효소의 후속 사용을 불가능하게 하는 면역 반응이 수반된다.
실시예 1에서 제조된 바와 같은 CD1b-형질감염체 세포는 밤새 37℃에서 인간 AAG의 재조합 형태 (SEQ ID NO: 15)와 인큐베이션시키고, 세척하고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 PBMC로부터 수득된 인간 CD3+ 세포의 존재 하에서 배양된다. 3회 내지 4회의 자극 사이클 이후에, CD3+ T 세포를 배양물로부터 회수하고, 세척하고 표면 마커 및 PLZF의 발현에 대해 평가된다.
AAG의 전체 952개 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 20개 아미노산 길이 및 5개 아미노산의 중복부를 갖게 합성된다. 이들 펩티드는 CD1b 형질감염체 세포를 적재하는데 사용되고, 상기 수득된 바와 같이 NKT 세포의 개체군과 더욱 인큐베이션된다. 증식된 NKT 세포는 펩티드-적재된 CD1b 형질감염체 세포 상에서 확장되고 그들 표현형이 평가된다.
CD1b에 의해 제시된 에피토프를 포괄하는 펩티드는 상응하는 NKT 세포 클론의 증식 상실로 평가하여, 이러한 제시에 필요한 아미노산을 동정하기 위해 돌연변이된다. 이어서, 필요한 돌연변이가 전체 단백질에 적용된다.
NKT 세포의 활성화를 방지하는 돌연변이된 단백질의 능력은 CD1b 형질감염체 세포를 적재하고 상기 기술된 바와 같은 NKT 세포 클론과 인큐베이션시켜서 검토된다.
SEQ ID NO: 16의 돌연변이된 재조합 AAG는 이의 활성에 대해 시험된다.
실시예 13. 아데노-연합 바이러스 (AAV) 벡터의 클래스 II-제한성 에피토프에 의한 백신접종은 벡터에 대한 획득성 면역 반응을 제거시키고 효율적인 유전자 요법을 가능하게 한다
강화 모티프를 함유하는 바이러스 벡터 T 세포 에피토프에 의한 사전면역화는 바이러스 벡터 단백질에 대한 CD4+ 이펙터 T 세포의 후속 발생을 방지한다.
3개 단백질 (VP1, VP2 및 VP3)로 이루어진 AAV 벡터 캡시드는 유전자 요법의 실시에서 일반적으로 사용된다. 그러나, 이러한 벡터는 항체 및 세포독성 면역 반응을 유발시켜, 그들의 사용을 심각하게 제한한다. 항체 및 세포독성 CD8+ 세포 둘 모두는 클래스 II-제한성 CD4+ T 세포의 활성화에 의존적이며, 이는 CD4+ T 세포 활성화 방지가 유전자 요법의 안전하고 보다 용이한 실시를 이끌게 된다는 것을 의미한다.
마우스는 2x1011 AAV 벡터 입자를 함유하는 5 μl의 IV 투여로 처치되고 비장을 10일 이후에 회수한다. CD4+ T 세포는 항-CD4 항체가 코팅된 자성 비드를 포함하는, 당분야에 공지된 방법의 조합을 통해 비장세포 개체군으로부터 제조된다. VP1 캡시드 단백질의 전체 735개 아미노산 서열을 포괄하는 펩티드는 20개 아미노산 길이이고 5개 아미노산의 중복부를 갖게 화학 합성으로 생성된다. 이러한 펩티드를 항원-제시 세포로서 선택된 수지상 세포 상에 적재시킨 후에 비장세포 CD4+ 개체군을 첨가한다. AAV-특이적 클래스 II-제한성 CD4+ 이펙터 세포를 확장시키기 위해 사이토카인의 존재 하에 10일 동안 공동 배양을 수행한다. 3회 자극 사이클이 펩티드 적재된 신선한 수지상 세포에 의해 수행된다.
에피토프 활성화 CD4+ T 세포를 포괄하는 펩티드 (SEQ ID NO: 17)는 증식 마커로서 티미딘 도입을 평가하여 특이적인 것으로 확증된다. 관심 펩티드는 에피토프 상의 각 측면 상의 측접 영역에 첨가된 시스테인으로 만들어진 강화 모티프와 함께 화학 합성으로 제조된다 (SEQ ID NO: 18).
이 펩티드 (SEQ ID NO: 18)는 보강제로서 명반과 함께 마우스에게 2주 간격으로 피하 경로를 통해서 4회 투여된다. 이러한 마우스의 비장은 마지막 면역화 이후 10일에 수득되어 AAV 캡시드에 대한 CD4+ T 세포의 제시를 기능적 어세이로 평가한다.
이러한 감작 일정으로 수득된 CD4+ T 세포는 클래스 II-제한성 레파토리 및 CD1d 제한성 레파토리 둘 모두에 속하는 바이스탠더 CD4+ T 세포의 활성화의 제어 및 항원 제시의 억제를 특징으로 하는 조절 활성을 행사한다는 것이 확인된다. 바이스탠더 활성화된 T 세포를 비롯하여, 표적 항원-제시 세포의 아폽토시스는 그 목록으로 제한되는 것이 아닌, TIGIT-PRV, TRAIL-DR4 및 FasL-Fas 상호작용을 포함한, 조절 기전의 조합에 의해 일어난다. 참고로, 이러한 억제 활성은 항원-제시 세포, 및 항원-제시 세포의 표면에서 활성화된 바이스탠더 CD4+ T 세포에 대한 억제 특성의 조합으로 인한 AAV의 CD4+ T 세포 에피토프의 앙상블에 대한 반응에 대해 발휘된다.
SEQ ID NO: 18의 펩티드로 면역화된 마우스는 6주의 간격으로 2회 투여되는 109 AAV 벡터 입자의 직접 IV 투여에 사용된다. 이러한 마우스는 AAV 입자의 부스트 주사 이후이더라도, AAV 벡터에 대한 면역 반응을 증가시키지 않는다는 것이 확인된다.
실시예 14. 셀리악병에서 트랜스글루타미나제에 특이적인 클래스 II-제한성 조절성 CD4+ T 세포의 생성 및 특징규명
셀리악병은 2형 트랜스글루타미나제에 의해 수행되는 글루텐의 성분인 글리아딘에 함유된 글루타민의 글루탐산으로의 전환으로 인해 초래되는 자가면역 질환이다. 이러한 글루탐산 잔기를 함유하는 클래스 II-제한성 에피토프는 DQ2 또는 DQ8 제한 엘리먼트에 의해 제시될 때 클래스 II-제한성 CD4+ T 세포의 활성화를 유발시킨다. 글루텐-특이적 CD4+ T 세포는 고농도의 항-글루텐 항체의 생성 및 셀리악병의 증상을 초래한다. 글루텐에 특이적인 CD4+ T 세포의 제거는 셀리악병에 대한 치유를 의미한다.
나이브 인간 CD4+ T 세포는 항-CD4+ 항체가 코팅된 마이크로비드를 사용하여 DQ2 또는 DQ8 일배체형을 보유하는 대상체의 말초 혈액으로부터 수득된다. 이러한 세포는 이펙터 CD4+ T 세포를 수득하기 위해서 서열 (SEQ ID NO: 19)의 펩티드가 적재되고 말초 혈액 단핵구로부터 유래된 자기유래 수지상 세포와 인큐베이션된다.
병행 실험에서, 동일한 서열이지만 측접 잔기 내에 강화 모티프를 함유하는 펩티드가 사용된다. 따라서, 서열 (SEQ ID NO: 20)의 펩티드가 제조되는데, 이는 그의 측접 잔기에, CD4의 제2 세포외 도메인에 특이적인, CD4에 대한 항체로부터 유래된 서열을 함유한다.
클래스 II-제한성 이펙터 CD4+ T 세포를 함유하는 배양 중 수지상 세포에 서열 (SEQ ID NO: 20)의 펩티드의 첨가는 이펙터 CD4+ T 세포를 강력한 조절 활성을 갖는 세포로 전환시킨다. 이러한 활성은 항원-제시 수지상 세포, 및 동일한 수지상 세포의 표면에서 활성화된 바이스탠더 이펙터 CD4+ T 세포의 아폽토시스의 유도를 포함한다.
그러므로 글루텐-특이적 조절성 CD4+ T 세포는 글루텐에 대해 진행되는 면역 반응을 억제하는 것으로 보이며 그에 따라 셀리악병의 치료에 유용하다.
실시예 15. 뎅기 바이러스 감염에 대한 백신접종을 위한 CD1d-제한성 CD8+ NKT 세포의 생성 및 특징규명
뎅기 바이러스에 의한 감염은 특히 대상체가 제2 바이러스 혈청형에 노출시, 항체-의존적 증강 (ADE)이라고 알려진 현상인, 심각한 반응을 초래할 수 있다. 따라서, 항체 대신에, 감염된 세포에 대해 세포독성 특성을 갖는 세포의 유발을 촉진하는 전략이 더 안전한 잠재성을 갖는다.
플라비바이러스 비구조 당단백질 NS1 단백질은 CD1d 분자에 의해 잠재적으로 제시되는 에피토프를 함유한다. 그들을 동정하기 위해서, 단백질의 전체 서열을 포함하는 합성 펩티드를 5개 아미노산의 중복부를 갖게 제조한다. 이러한 펩티드를 실시예 5에 상술한 바와 같이, 말초 혈액 단핵구의 전환에 의해 수득된 인간 수지상 세포와의 밤샘 인큐베이션을 위해 첨가한다. 적재된 수지상 세포를 PBMC로부터 수득된 CD3+ 림프구의 존재 하에서 인큐베이션시킨다 (실시예 2 참조). 배양은 상응하는 세포의 활성화를 방지하기 위해서 클래스 I 및 클래스 II 분자에 대한 항체의 존재 하에 수행된다.
3회 내지 4회의 자극 사이클 이후에, CD3+ T 세포를 회수하고 표준 전사 인자, PLZF의 발현 및 표현형 관점에서 분석한다. 그 이후에 세포를 확장시키고 클로닝한다.
SEQ ID NO: 21의 펩티드는 이의 측접 잔기에 CD8 보조인자에 대한 상보성 서열을 포함시켜 합성에 의해 제조되고 수지상 세포의 제시에 의해 NKT 세포를 시험관 내에서 자극시키는데 사용된다. CD8 보조인자 상보성 서열의 첨가는 NKT를 세포독성 표현형이 되게 하여, 시냅스가 형성된 수지상 세포를 제거한다.
그러므로 이러한 펩티드는 뎅기 감염에 걸리는데 민감한 개체, 및 특히 이미 제1 뎅기 혈청형에 노출되어 그에 따라 심각한 전신 합병증의 위험성이 있는 개체에서 백신접종을 위해 사용되는 것이 고려된다.
SEQUENCE LISTING <110> Imnate SA-arl <120> METHODS TO PRODUCE PEPTIDES, POLYPEPTIDES OR CELLS FOR MODULATING IMMUNITY <130> Pbf1740EP00 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> epitope p53 <400> 1 Lys Thr Tyr Gly Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 Binding <400> 2 Lys Thr Tyr Gly Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Thr Gln Gln 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <220> <221> MISC_FEATURE <223> Epitope M. Tuberculosis <400> 3 Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG ODN <400> 4 acgttcgc 8 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Epitope MOG protein <400> 5 Phe Tyr Trp Val Ser Pro Gly Val Leu 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ 5 + motif CD4 <400> 6 Phe Tyr Trp Val Ser Pro Gly Val Leu Arg Tyr Asp 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Trp Cys Gln Val Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ 10 (GAD65) + CD4 motif <400> 8 Trp Cys Gln Val Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Arg Tyr Asp 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ 8 modified <220> <221> LIPID <222> (2)..(2) <223> PALMITATE <400> 9 Trp Cys Gln Val Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Arg Tyr Asp 1 5 10 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Dermatophagoides pteronyssinus <220> <221> MISC_FEATURE <223> DerP1 <400> 10 Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXHX motif <400> 11 Arg Cys Pro His Cys 1 5 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQs10+11 <400> 12 Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Arg Cys Pro His Cys 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <400> 13 Phe Ile Asn Ala Gly Tyr Ile Phe Gln His His 1 5 10 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ 14 + Cys and Cys <400> 14 His Cys Phe Ile Asn Ala Gly Tyr Ile Phe Gln His His Cys 1 5 10 <210> 15 <211> 524 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Pompe disease <400> 15 Met Tyr Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Leu Gly Leu Lys Glu Cys Thr Arg Gly Ser Ala Val Trp 20 25 30 Cys Gln Asn Val Lys Thr Ala Ser Asp Cys Gly Ala Val Lys His Cys 35 40 45 Leu Gln Thr Val Trp Asn Lys Pro Thr Val Lys Ser Leu Pro Cys Asp 50 55 60 Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp Met Leu Lys Asp Asn 65 70 75 80 Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Tyr Leu Glu Lys Thr Cys Asp Trp 85 90 95 Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys Glu Ile Val Asp Ser 100 105 110 Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly Glu Met Ser Arg Pro 115 120 125 Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu Ser Leu Gln Lys His 130 135 140 Leu Ala Glu Leu Asn His Gln Lys Gln Leu Glu Ser Asn Lys Ile Pro 145 150 155 160 Glu Leu Asp Met Thr Glu Val Val Ala Pro Phe Met Ala Asn Ile Pro 165 170 175 Leu Leu Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Pro Arg Ser Lys Pro Gly Pro Lys 180 185 190 Asp Asn Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile 195 200 205 Gln Thr Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu 210 215 220 His Val Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile 225 230 235 240 Cys Lys Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met 245 250 255 Met His Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Ala Leu Val Gly Phe Cys Asp 260 265 270 Glu Val Lys Glu Met Pro Met Gln Thr Leu Val Pro Ala Lys Val Ala 275 280 285 Ser Lys Asn Val Ile Pro Ala Leu Glu Leu Val Glu Pro Ile Lys Lys 290 295 300 His Glu Val Pro Ala Lys Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe 305 310 315 320 Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys 325 330 335 Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Glu Glu Cys Gln Glu Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile 355 360 365 Leu Ser Ile Leu Leu Glu Glu Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met 370 375 380 Leu His Leu Cys Ser Gly Thr Arg Leu Pro Ala Leu Thr Val His Val 385 390 395 400 Thr Gln Pro Lys Asp Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val 405 410 415 Gly Tyr Leu Asp Arg Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Gln Glu Ile 420 425 430 Leu Ala Ala Leu Glu Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln 435 440 445 Lys Gln Cys Asp Gln Phe Val Ala Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu 450 455 460 Ile Leu Val Glu Val Met Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly 465 470 475 480 Ala Cys Pro Ser Ala His Lys Pro Leu Leu Gly Thr Glu Lys Cys Ile 485 490 495 Trp Gly Pro Ser Tyr Trp Cys Gln Asn Thr Glu Thr Ala Ala Gln Cys 500 505 510 Asn Ala Val Glu His Cys Lys Arg His Val Trp Asn 515 520 <210> 16 <211> 524 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated pompe <400> 16 Met Tyr Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Leu Gly Leu Lys Glu Cys Thr Arg Gly Ser Ala Val Trp 20 25 30 Cys Gln Asn Val Lys Thr Ala Ser Asp Cys Gly Ala Val Lys His Cys 35 40 45 Leu Gln Thr Val Trp Asn Lys Pro Thr Val Lys Ser Leu Pro Cys Asp 50 55 60 Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp Met Leu Lys Asp Asn 65 70 75 80 Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Ser Leu Glu Lys Thr Cys Asp Ala 85 90 95 Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys Glu Ile Val Asp Ser 100 105 110 Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly Glu Met Ser Arg Pro 115 120 125 Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu Ser Leu Gln Lys His 130 135 140 Leu Ala Glu Leu Asn His Gln Lys Gln Leu Glu Ser Asn Lys Ile Pro 145 150 155 160 Glu Leu Asp Met Thr Glu Val Val Ala Pro Phe Met Ala Asn Ile Pro 165 170 175 Leu Leu Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Pro Arg Ser Lys Pro Gly Pro Lys 180 185 190 Asp Asn Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile 195 200 205 Gln Thr Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu 210 215 220 His Val Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile 225 230 235 240 Cys Lys Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met 245 250 255 Met His Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Ala Leu Val Gly Phe Cys Asp 260 265 270 Glu Val Lys Glu Met Pro Met Gln Thr Leu Val Pro Ala Lys Val Ala 275 280 285 Ser Lys Asn Val Ile Pro Ala Leu Glu Leu Val Glu Pro Ile Lys Lys 290 295 300 His Glu Val Pro Ala Lys Ser Asp Val Ser Cys Glu Val Cys Glu Val 305 310 315 320 Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys 325 330 335 Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Glu Glu Cys Gln Glu Val Val Asp Thr 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Cys <400> 18 His Cys Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val Asn Glu Ala Cys 1 5 10 15 His <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Celiac Disease <400> 19 Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ I9 + CD4 motif <400> 20 Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Arg Tyr 1 5 10 15 Asp <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flavivirus NS1 + CD8 motif <400> 21 Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Ser Asn Thr Gln Gln 1 5 10

Claims (15)

  1. CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 선택적으로 결합하는 펩티드 에피토프의 능력을 결정하기 위한 방법으로서,
    a) CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 단리된 세포에 상기 에피토프를 선택적으로 적용시키는 단계;
    c) 상기 에피토프를 잠재적으로 제시하는 단계 b의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계; 및
    d) 상기 NKT 세포의 활성화 수준을 측정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 에피토프는 단리된 단백질로부터 유래되거나, 또는 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 합성 펩티드로부터 유래되고, 상기 단백질은 종양, 세포내 병원체, 자기 항원, 생물학적 단백질, 알레르겐 또는 만성 염증 유발원으로부터 유래되고/되거나, 에피토프는 번역후 변형된 아미노산을 포함하고, 바람직하게 상기 번역후 변형된 아미노산의 소수성은 상응하는 비변형된 아미노산보다 높은 것인 방법.
  3. 암, 세포내 병원체에 의한 감염, 자가면역 질환 또는 알레르기성 질환에 대한 백신접종에서 사용을 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 방법으로 수득가능한 펩티드.
  4. CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 결합하는 에피토프의 능력을 증가시키기 위한 방법으로서,
    a) CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 단리된 세포에 상기 에피토프를 특이적으로 적용시키는 단계;
    c) 단계 b의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계;
    d) 상기 NKT 세포의 저 또는 비 활성화를 측정하는 단계;
    e) 변형된 단백질을 생성시키기 위해서, 소수성 아미노산, 소수성 번역후 변형된 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 첨가하고/하거나 상기 에피토프에 존재하는 비소수성 아미노산을 결실시켜 상기 에피토프를 변형시키는 단계;
    f) 상기 단리된 세포에 상기 변형된 에피토프를 특이적으로 적용시키는 단계;
    g) 상기 변형된 에피토프를 잠재적으로 제시하는, 단계 f의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계, 및
    h) 단계 d의 측정에 비해, 단계 g에서 상기 NKT 세포의 증가된 활성화를 보이는 변형된 에피토프를 선택하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, NKT 세포는 CD8+ 또는 CD4-/CD8- 이고, 바람직하게 에피토프는 암성 세포 또는 세포내 병원체로 감염된 세포로부터 유래되는 것인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 에피토프의 한쪽 또는 양쪽 측접 영역(들)에 팔미토일-시스테인 모이어티, CD8-특이적 결합 모이어티, TLR 작용제를 첨가하고/하거나, 양쪽 측접 영역에 시스테인 아미노산 또는 시스테인 모티프를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  7. 암 또는 세포내 병원체에 대한 치료 또는 백신접종에서 사용을 위한, 제5항 또는 제6항의 방법으로 수득가능한 펩티드.
  8. 제4항에 있어서, NKT 세포는 CD4+이고, 바람직하게 에피토프는 자기항원, 알레르겐 또는 만성 염증 유발원, 및 항체, 응고 인자 및 대체 요법에서 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료적 단백질로부터 유래되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 에피토프의 한쪽 또는 양쪽 측접 영역(들)에 팔미토일-시스테인 모이어티, CD4-특이적 결합 모이어티, TLR 작용제를 첨가하고/하거나, 양쪽 측접 영역에 시스테인 아미노산 또는 시스테인 모티프를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항의 방법으로 수득가능한 치료적 단백질.
  11. CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 결합하는 에피토프의 능력을 감소시키기 위한 방법으로서,
    a) CD1a, CD1b 및/또는 CD1c를 그들 표면에 발현시키는 단리된 세포를 제공하는 단계;
    b) 상기 단리된 세포에 상기 에피토프를 특이적으로 적용시키는 단계;
    c) 단계 b의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계;
    d) 상기 NKT 세포의 유의한 활성화를 측정하는 단계,
    e) 적어도 하나의 소수성 아미노산을 하나의 (유사한) 비소수성 아미노산으로 치환시키고/시키거나, 상기 에피토프로부터 하나의 소수성 아미노산을 선택적으로 제거시키고/시키거나, 번역후 변형된 아미노산을 상응하는 비변형된 아미노산으로 대체시키는 단계;
    f) 상기 단리된 세포에 변형된 에피토프를 특이적으로 적용시키는 단계;
    g) 상기 변형된 에피토프를 잠재적으로 제시하는, 단계 f의 세포와 NKT 세포를 접촉시키는 단계, 및
    h) 단계 d의 측정에 비해, 단계 g에서 상기 NKT 세포의 감소된 활성화를 보이는 변형된 에피토프를 선택하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 에피토프는 항체, 응고 인자, 및 대체 요법에서 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료적 단백질로부터 유래되는 것인 방법.
  13. 알레르기성 질환 및 자가면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료에서 사용을 위한, 제12항의 방법으로 수득가능한 치료적 단백질.
  14. 에피토프를 제시하는 세포의 능력을 증가시키기 위한 방법으로서, 상기 에피토프의 한쪽 또는 양쪽 측접 영역(들)에 소수성 아미노산, 팔미토일-시스테인 모이어티, CD4-특이적 모티프, CD8-특이적 모티프를 첨가하거나 또는 양쪽 측접 영역에 시스테인 아미노산 또는 시스테인 모티프를 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 혈액 또는 조직 샘플에서 NKT 세포를 검출, 단리 또는 고갈시키기 위한 시험관내 방법으로서, CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질을 포함하는 표면을 제공하는 단계, 상기 CD1a, CD1b 및/또는 CD1c 단백질에 결합하고 NKT 세포를 활성화시키는 것으로 결정된 에피토프를 상기 표면에 적용시키는 단계, 및 상기 에피토프를 포함하는 표면에 상기 혈액 또는 조직 샘플을 적용시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
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