JP2020516237A - 免疫を調節するペプチド、ポリペプチド又は細胞を作製する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＮＫＴ細胞の活性化レベルに基づいて、ペプチド性エピトープのタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの選択的結合能を決定する方法、これに対応する当該エピトープ又はその隣接領域を修飾して、ペプチド性エピトープのタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの選択的結合を増加又は減少させる方法、当該方法により得られる対応する修飾エピトープ及び活性化ＮＫＴ細胞又はその部分に関する。

Description

本発明は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を活性化するエピトープを包含するペプチドを作製する方法、かつ、腫瘍、感染症、慢性自己免疫疾患及び炎症性疾患等の先天性免疫応答並びに免疫老化を誘発するのに有利な疾患の治療におけるその使用に関する。

本発明はまた、治療目的で同種抗原が投与されなければならないか又は個体が食物を提供された状況で用いる、ＮＫＴ細胞活性化能が失活しているペプチド又はポリペプチドを作製する方法に関する。さらに、本発明は、当該同種抗原の免疫原性が抑制されるように修飾されたペプチドに関する。

本発明はまた、腫瘍及び自己免疫疾患の治療のためのキメラ受容体を担持するように設計された細胞に関する。

先天性免疫は、外因性又は内因性の分子に関連するパターンに特異的な受容体が原因薬物を認識することで誘発される点で非特異的と考えられる。すなわち、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）がＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）等の受容体に結合して活性化し、例えば酸化ストレスにより生成される分子は損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）に結合して活性化される。

先天性免疫に分類されるＮＫＴ系細胞の応答が実際に先天性応答と適応応答の中間的な場合には、ＮＫＴ細胞は抗原特異的受容体（ＣＤ３）を発現して、制限因子として機能するＭＨＣ様ＣＤ１分子を発現する抗原提示細胞と同シナプスを形成させる。ＮＫＴ細胞はＣＤ１分子に結合した脂質や糖脂質を認識し活性化する。

当該活性化のパラダイムは、ＣＤ３受容体の部分として不変α鎖を担持するＮＫＴ細胞により呈示され、ＣＤ１分子、ＣＤ１分子特異グループ（グループ２）の唯一の構成成分であるＣＤ１ｄと関連する提示による糖脂質（α−ｇａｌ−ｃｅｒａｍｉｄｅ）の提示により活性化される。従って、ＮＫＴ細胞に関する従来の見解には、ほとんど例外なく不変ＮＫＴ（ｉＮＫＴ）又はグループ２のＣＤ１ｄ分子による提示と関連したα−ｇａｌ−セラミドにより活性化される１型ＮＫＴ細胞があげられる（非特許文献１及び非特許文献２等の総説を参照）。多様なＣＤ３α鎖を担持する２型ＮＫＴ細胞も、グループ２のＣＤ１ｄ分子により提示される脂質又は糖脂質に対する特異性で区別されるが当該２型ＮＫＴ細胞はそれほど特定されていない。

ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｅ分子を含むＣＤ１分子グループはヒトでは発現するが、マウスでは発現しない。ＣＤ１遺伝子座は第１染色体上にコードされている。当該グループ１のＣＤ１分子は、細胞表面スクリーニング、細胞内輸送及び感染性因子又は内在源に由来する多数の脂質又は糖脂質の細胞表面での提示に関与する。その最良例は、スルファチド及びヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染細胞由来の生成物である（非特許文献３）。これらはその構造、分布、調節、細胞内輸送、分子間相互作用及び機能により、互いに、またＣＤ１ｄとは大きく異なる。ＣＤ１ｅは細胞内環境に制限されるが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃは細胞表面に発現しており、ＮＫＴ系細胞と直接相互作用しうる。

上記のすべての先行技術では、ＮＫＴ細胞は、ペプチド配列によってではなく、脂質又は糖脂質によってのみ認識され、活性化されると考えられている。

しかしながら、特許文献１〜４には、ＧＡＤ６５等の内因性及びウイルスベクター等の外因性の種々の抗原由来の多数のCD1d拘束性ペプチドエピトープが記載されている。特に、隣接残基内のオキシド−レダクターゼモチーフと組み合わせること（特許文献１）や又は単一のアミノ酸残基突然変異を導入してエピトープのコア配列の結合を高めることで（特許文献２）、当該エピトープを用いて特定のＮＫＴ細胞の活性化が亢進されうる。同様に、特許文献３には、治療用タンパク質からＣＤ１ｄ拘束性エピトープを除去してＮＫＴ細胞の望ましくない活性化を防止することが記載され、特許文献４には、血友病Ａの治療の凝固第ＶＩＩＩ因子の投与で誘発されるＮＫＴ細胞のCD1d拘束性活性化を低下させる方法が記載される。

上記特許出願公報に記載されているペプチド性エピトープ特異的ＮＫＴ細胞は、グループ２のＭＨＣ様制限分子を示すＣＤ１ｄにより制限される。

国際公開第２０１２/０６９５６８号 国際公開第２０１２/０６９５７２号 国際公開第２０１２/０６９５７５号 国際公開第２０１３/１７４８０５号 国際公開第２００８/０１７５１７号

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多くの病態、特に腫瘍の治療や細胞内病原体感染には、未だに多くのアンメットメディカルニーズが存在する。

チェックポイントインヒビター及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を標的とする治療用抗体を含む腫瘍の治療が著しく進歩したにもかかわらず、当該アプローチの有効性は、少数の患者に限られ、反応する患者の予測も不可能である。腫瘍微小環境の複雑性、その汎用性、関連細胞数及び当該微小環境における一般的な免疫抑制状態により、効果的で予測可能な治療法という目標への到達にはほど遠い。

腫瘍は多くの代謝異常を共有し、これは他の組織を残す治療法を設計する適切かつ安全な標的となりうる。残念ながら、多くの腫瘍細胞は、主要組織適合複合体(MHC)を含む分子の表面発現を下方制御するため、適応免疫応答では認識されなくなる。さらに、腫瘍内及び腫瘍周囲の複雑な調節経路が出現し、免疫系を中和して腫瘍細胞を除去しようとする。

細胞内病原体としては、ウイルス性疾患、細菌、マイコバクテリア、寄生虫があげられる。当該病原体の多くは、感染細胞の活性化に関与するＭＨＣ装置、アダプタータンパク質又は経路の構成要素を変えて特異的な適応応答を中和する精巧な戦略をとる。感染細胞は適応免疫応答に関与する細胞から認識されなくなる。しかし、１型や２型のヘルペスウイルス等の例外はあるが、感染細胞はＣＤ１分子と結合して表面抗原提示能を保持する。実際に、例えば、結核菌に感染したマクロファージがＣＤ１分子に結合した表面脂質を発現することは知られている。

多くの病的状態及び、顕著には、腫瘍の治療および細胞内病原体の感染に対するアンメットメディカルニーズが存在する。

腫瘍又は感染に関連しない慢性疾患は、自己免疫性及び炎症性の要素を含む。このように、組織炎症により、胸腺での生理的曝露がおこらず寛容性が獲得されない抗原、又は炎症で十分に修飾されて新生した抗原が放出される。自己免疫応答は炎症に寄与し、正のフィードバック機構を生成して発症機構が維持される。

この複雑な病因により、すべての治療的試みは事実上、例えば、免疫系を減弱させるか又は発症臓器への細胞の接近を制限する抗炎症薬若しくは治療用抗体等の非特異的な手段に制限される。もし、開始抗原又は少なくとも１の病状に直接関連する抗原が同定されれば、疾患の全過程を制御して維持されうる抗原特異的アプローチの開発が実現しうるであろう。複雑な免疫応答を抑制する試みがなされてきた。しかし、これまでに自己免疫病理学的応答を誘発し維持する慢性自己抗原特異的炎症成分で本質的な影響を受けたものはない。

すなわち、ほんの数例である、１型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫性甲状腺炎及びセリアック病を含む慢性自己免疫疾患の治療にもアンメットメディカルニーズが多数存在する。調節特性があるＮＫＴ細胞の誘発は抗原特異的方法となり、炎症や自己免疫反応が軽減される。

慢性喘息、慢性閉塞性又は非閉塞性肺疾患では、多くの抗原が慢性炎症をもたらし、それが維持される。イエダニ等のアレルゲンは、アレルギー性喘息の主原因の１つである。インフルエンザ菌感染症等の慢性感染又は慢性閉塞性肺疾患におけるエラスチンに対する免疫応答は抗原源であり、炎症反応を誘引する。調節特性があるＮＫＴ細胞を誘発して炎症を軽減することは、すなわち局所組織破壊を軽減する方法を意味するであろう。

小胞体ストレスに関連する病態は数多く、また、特別な治療法もない。慢性自己免疫疾患、腫瘍又は慢性細胞内感染以外にも、細胞免疫老化に至るメカニズムもまた、当該ストレス状態に関連する。

多くの場合、治療目的のタンパク質を投与すると当該治療剤に対する免疫応答がおこり、それにより当該治療剤を投与することが妨げられる。この例としては血友病Ａに罹患した患者の凝固経路の第ＶＩＩＩ因子の投与があげられるが、治療された患者の約１／３は、第ＶＩＩＩ因子の機能を阻害する抗第ＶＩＩＩ因子抗体を産生する。同様に、ポンペ病に罹患した患者に酸性α−グルコシダーゼ等の酵素を投与すると治療剤に対する免疫応答がおこり、さらなる投与が妨げられる。第３例としては、リンパ球表面分子、サイトカイン又はサイトカイン受容体に対する治療剤として用いられる抗体があげられる。そこで、治療剤に対する免疫化を妨げる新しい治療アプローチを見出すことが大いに望まれる。

遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種へのウイルスベクターの使用は著しく制限されるが、それは当該ウイルスベクターが免疫応答を誘導し、ベクターが形質導入された細胞が直ちに消失し、導入遺伝子発現が直ちに減少するという事実による。ウイルスベクターは、その性質に応じて異なる強度で先天性及び適応免疫応答の活性化を誘導する。すなわち、アデノウイルスベクターは先天性免疫応答を強く刺激して適応免疫応答をおこす。アデノ随伴ウイルスベクターが誘発する先天性応答は弱いが、抗体産生を誘導する。遺伝子治療と遺伝子ワクチンの将来性は極めて高い。ウイルスベクターに対する先天性及び／又は適応性の応答を阻止する治療方法により当該分野は極めて著しい進歩をとげるであろう。

多くの患者は、自然曝露されるタンパク質から誘導される反応に苦しむ。空気中又は食物由来のアレルゲンは、アレルギー性鼻炎、喘息、蕁麻疹、湿疹、アナフィラキシー反応等の反応をおこす。当該反応がおこる理由は部分的にしか解明されていない。食物アレルゲン、セリアック病の原因となる小麦又は被験者が職業的理由で曝露される酵素等の生成物等の多様なタンパク質の先天性免疫原性を低下させることは極めて有益であろう。

ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性、特に腫瘍の治療における有効性は、Ｔ細胞の機能特性及び標的分子発現の特異性のために制限されてきた。ＮＫＴ細胞の細胞傷害特性は、第１症例では明らかな利点を示し、標的細胞の表面抗原に抗体可変部を運搬するＣＡＲ ＮＫＴ細胞は、当該標的細胞を破壊することで有効性が改善される。第２症例では、ＮＫＴ細胞によるＣＤ１結合エピトープの同族認識という優れた特異性により、ＮＫＴＣＲ Ｔ細胞が産生されうるが、ここで、ＣＤ１結合エピトープを発現する細胞のみを標的とする当該代替Ｔ細胞の特異的特性を利用して、ＮＫＴ抗原受容体が代替系の細胞を形質移入するために用いられる。

本発明は、エピトープ（疎水性エピトープ）のタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの選択的結合能を決定する方法であって、以下の、
ａ）表面にＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞を提供する工程、
ｂ）前記単離細胞に（試験される）前記エピトープを（選択的に）適用する工程、
ｃ）前記エピトープを提示しうる工程bの前記細胞とＮＫＴ細胞を接触させる工程、
ｄ）前記ＮＫＴ細胞の活性化レベルを測定する工程；を含む、方法である。
好ましくは、前記方法はさらに、工程ｄで活性化されたＮＫＴ細胞を単離する工程ｅ）を含む。
前記単離ＮＫＴ細胞は有利には、インターフェロンγを産生するか、又は細胞毒性を呈する。
本発明に密接に関連する態様としては、すなわち、製剤として、好ましくはがん、又は細胞内病原体が原因の疾病、又は自己免疫疾患の治療に用いる、（工程ｅの）単離ＮＫＴ細胞（特に、細胞傷害活性を呈しないＮＫＴ細胞）、前記単離ＮＫＴ細胞のＴ細胞受容体、又は前記単離ＮＫＴのＴ細胞受容体をコードする核酸分子である。例えば、Ｔ細胞受容体をコードする核酸をその後に用いて、ＣＡＲ ＮＫＴ細胞を生成しうる。
本方法は、ＣＤ１ｄタンパク質の疎水性エピトープの選択的結合を測定する工程をさらに含んでよい。
有利には、表面でＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞は、前記タンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを特異的に過剰発現するように形質転換された細胞である。
有利には、表面でＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞は、がん性細胞、自己免疫疾患で標的化された細胞、アレルゲンに慢性的に曝露された細胞又は細胞内病原体に感染した細胞である。
（疎水性）エピトープは、疎水性特性がある７〜２０個の連続したアミノ酸のドメインであってよく、例えば、２０％を超える（好ましくは、２５％を超える）アミノ酸は疎水性（芳香族アミノ酸、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、シトルリン、システイン等の脂質修飾アミノ酸）、及び／又は、疎水性アミノ酸は、疎水性モーメントを示すように構成されてよい。
有利には、エピトープは、単離たんぱく質（若しくはそのフラグメント）又は腫瘍、細胞内病原体感染、生物学的タンパク質、アレルゲン、自己抗原、又は慢性炎症をおこす製剤由来のタンパク質のアミノ酸配列を含む合成ペプチドである。
本方法は、翻訳後修飾されたアミノ酸を含むか又は潜在的に含む（疎水性）エピトープのスクリーニングに特に適し、好ましくは、該翻訳後修飾されたアミノ酸の疎水性は、対応する非修飾アミノ酸（すなわち、アシル化、脱炭酸）より高い。
本方法のエピトープはＣＤ１ｄエピトープ［ＦＹＷＴＨ］Ｘ_２Ｘ_３［ＩＬＭＶ］Ｘ_５Ｘ_６［ＦＹＷＴＨ］ではありえない。
本方法は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃに選択的に結合するが、ＣＤ１ｄには結合しないように決定された（疎水性）エピトープを選択する工程をさらに含んでよい。
好ましくは、表面でＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞は、前記ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃの発現レベルがＣＤ１ｄよりも高く、より好ましくは、前記単離細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない。
有利には、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４＋（つまり、ＮＫＴ ＣＤ８＋及びＮＫＴ ＣＤ４ＣＤ８−がないか、又はその量がごくわずかであり；すなわち、前記ＮＫＴ細胞の７５％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超はＣＤ４＋である）、ＣＤ８＋（つまり、ＮＫＴ ＣＤ４＋がないか又はごく少量であり、おそらく、ＮＫＴ ＣＤ４＋がないか又は少量である；すなわち、ＮＫＴ細胞の７５％超、好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超はＣＤ８＋であり）、好ましくはαα若しくはβ、又はＣＤ４−／ＣＤ８−である。
関連する態様は、がんに対するワクチン接種、細胞内病原体感染に対するワクチン接種、自己免疫疾患に対するワクチン接種又はアレルギー性疾患に対するワクチン接種に用いる本方法で得られるペプチドであり、好ましくは、前記ペプチドは、１又はそれ以上のアシル化アミノ酸又は脱カルボキシル化アミノ酸を含む。

本発明の他の関連する態様は、（疎水性）エピトープ（好ましくはペプチドエピトープ）のタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの結合能を高める方法であって、
ａ）表面にＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞を提供する工程、
ｂ）前記エピトープを前記単離細胞に（特異的に）適用する工程、
ｃ）ＮＫＴ細胞を工程ｂの前記細胞と接触させる工程、
ｄ）前記ＮＫＴ細胞の活性化の低下又は消失を測定する工程、
ｅ）前記エピトープに疎水性アミノ酸、疎水性翻訳後修飾アミノ酸残基からなる群から選択される増強モチーフを付加すること及び／又は前記エピトープ由来の非疎水性アミノ酸を欠失させることにより、修飾エピトープを生成させる工程、
ｆ）前記修飾エピトープを前記単離細胞に適用する工程、
ｇ）ＮＫＴ細胞を修飾されたエピトープを提示しうる工程ｆの細胞と接触させる工程、及び
ｈ）工程ｄの測定値と比較して、工程ｇの前記ＮＫＴ細胞の活性化を高めうる修飾エピトープを選択する工程、を含む方法である。
好ましくは、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ８＋又はＣＤ４−ＣＤ８−（すなわち、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞は非存在）であり、有利には、細胞毒性応答を高めるエピトープ及び細胞を生成させる。
好ましくは、本方法は、（工程ｇの前に）さらに、エピトープの片方又は両方の隣接領域にパルミトイル−システイン部分、ＣＤ８特異的結合部分（ＴＱＱトリペプチド等）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（好ましくはＣｐＧオリゴヌクレオチド）を加える工程、及び／又は前記エピトープの両方の隣接領域にシステインアミノ酸を加える工程（好ましくは、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−ｘ−エピトープ−ｘ−Ｃ−Ｈのシステインモチーフ形式、ここでＨはヒスチジンを表し、Ｘは０〜７個の定義されていないアミノ酸である）をさらに含む。
エピトープはがん細胞又は細胞内病原体感染細胞に由来しうる。
好ましくは、本方法は、工程h)の活性化ＮＫＴ細胞を単離する工程i)をさらに含む。
本発明の関連する態様は、がん又は細胞内病原体に対するワクチン接種の治療に用いる、本方法により得られるペプチドである。
あるいは、（疎水性）エピトープのタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの結合能を高める本方法では、前記ＮＫＴ細胞はＣＤ４＋（すなわち、ＣＤ８＋ＮＫＴ細胞でもＣＤ４−ＣＤ８− ＮＫＴ細胞でもない）であり、好ましくは、強力な調節性エピトープ及び／又はＮＫＴ細胞を生成させる。
すなわち、本態様では、本方法は有利にはさらに、（工程ｇの前に）エピトープの片方又は両方の隣接領域にパルミトイル−システイン部分、ＣＤ４特異的結合部分（ＲＹＤトリペプチド等）、及び／又は両方の隣接領域にシステインアミノ酸（又は上記モチーフ）を付加する工程を含む。
本方法の本態様は、補充療法で用いられる抗体、凝固因子及びタンパク質からなる群から選択されるような治療用タンパク質由来のエピトープに特に有利である。
従って、本発明の他の関連する態様としては、（疎水性）エピトープのタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの結合能を高める本方法の本態様により得られる治療用タンパク質である。

本発明の他の関連する態様は、（疎水性）エピトープのタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの結合能を低下させる方法であって以下の、
a)表面にＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞を提供する工程、
b)前記エピトープを前記単離細胞に特異的に適用する工程、
c)工程bの前記細胞とＮＫＴ細胞を接触させる工程、
d)前記ＮＫＴ細胞の有意な活性化を測定する工程、
e)少なくとも１の疎水性アミノ酸を１の(類似の)非疎水性アミノ酸で置換し及び／又は前記（疎水性）エピトープから１の疎水性アミノ酸を選択的に除去及び／又は翻訳後修飾されたアミノ酸を対応する非修飾アミノ酸で置換して、修飾エピトープを生成する工程、
f)前記修飾エピトープを、表面にＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞に適用する工程、
g)前記修飾エピトープを提示しうる工程fの細胞とＮＫＴ細胞を接触させる工程、及び、
h)工程gの前記ＮＫＴ細胞の活性化が工程dの測定値よりも低い修飾エピトープを選択する工程、を含む、方法である。
有利には、エピトープは治療用タンパク質中に存在し、好ましくは、（例えば、ポンペ病、ゴーシェ病又はファブリー病の治療の）補充療法で用いられる抗体、凝固因子及びタンパク質からなる群から選択される。
すなわち、本発明の関連する態様は、（疎水性）エピトープのタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの結合能を低下させる本方法により得られる治療用タンパク質であり、前記（修飾）タンパク質は、アレルギー性疾患、自己免疫疾患及び生物学的製剤に対する免疫応答からなる群から選択される疾患の治療に用いられる。

本発明の他の関連する態様は、前記エピトープの片方又は両方の隣接領域に、疎水性アミノ酸、パルミトイル−システイン部分、ＣＤ４特異的（ＲＹＤトリペプチド等）モチーフ若しくはＣＤ８特異的モチーフ（ＴＱＱトリペプチド等）を付加することを含むか、又は、前記エピトープの両方の隣接領域にシステインアミノ酸（又は上記モチーフ）を付加することを含む、細胞のエピトープ（好ましくは、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、又はＣＤ１ｄに特異的なペプチドエピトープ又はＭＨＣＩＩエピトープ）提示能を高める方法であって、好ましくは、前記隣接領域のアミノ酸は前記エピトープの上流又は下流の１０未満のアミノ酸である。

本発明の他の関連する態様は、タンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを含む表面を提供し、前記表面に前記タンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃに結合することが決定されたエピトープを適用してＮＫＴ細胞を活性化し、前記血液又は組織試料を前記エピトープを含む表面に適用する工程を含む、血液又は組織試料中のＮＫＴ細胞を検出、単離又は減少させるインビトロの方法である。

本発明は、グループ１のＣＤ１分子（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃ）への特異的結合を介してＮＫＴ細胞の活性化誘発能があるペプチドに関する。

従って、本発明によれば、治療特性を提示するエピトープを包む新規ペプチドを設計しうる。実際、ペプチドのグループ１のＣＤ１分子（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃ）への結合能を測定して、グループ１のＣＤ１分子への提示を介してＮＫＴ細胞を活性化するエピトープを含むワクチンを設計しうるか、又は、ペプチドのグループ１のＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの結合能を調整して、特定のＮＫＴ細胞の活性化を調節（増加又は減少）しうる。

ＮＫＴ細胞の活性化の特異的調節は、例えば、腫瘍、細胞内病原体関連感染症、自己免疫疾患、慢性感染症に起因するアレルギー又は組織特異的な慢性炎症、及び慢性小胞体ストレスに特徴付けられる疾患の治療に適用しうる。

関連する態様としては、特定のＮＫＴ細胞、及びそのＴ細胞受容体又はそれをコードする核酸分子等のそのエレメントの作製、並びに腫瘍、細胞内病原体関連感染症、自己免疫疾患、慢性感染症に起因するアレルギー又は組織特異的慢性炎症、並びに慢性小胞体ストレスにより特徴付けられる疾患への治療用途としての使用である。

本発明により、本来的にＮＫＴ細胞を活性化する特性をアミノ酸突然変異、欠失又は付加で消失させてＮＫＴ細胞活性化能を抑制するペプチド又はポリペプチドが設計され、遺伝子治療又は遺伝子ワクチン接種のために、凝固因子、治療用抗体、酵素又はウイルスベクター等のアロ抗原が投与される治療のための当該修飾ペプチド又はポリペプチドの使用が特定される。

本発明により、ＮＫＴ細胞の表面に発現された抗体受容体を担持するＣＡＲ ＮＫＴ細胞が設計され、それにより、ＣＤ４＋エフェクター又は調節性Ｔ細胞、又はＣＤ８＋細胞傷害性細胞等の代替Ｔ細胞でありうるＮＫＴＣＲ Ｔ細胞が設計されうる。本発明は、腫瘍又は自己免疫疾患における当該細胞及びその治療的適用を包含する。

本発明の他の関連する態様は、ＮＫＴ細胞を単離し及び増殖させる（expanded）方法、ＮＫＴ細胞を疾患の同定及び検出のバイオマーカーとして用いる診断方法、かつ、生体試料からＮＫＴ細胞を除去する方法に関する。

より具体的には、本発明は、グループ１のＣＤ１分子（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃ）への結合能に基づき、及び／又は治療目的のためのＮＫＴ細胞活性化能に基づき、免疫原性ペプチドを同定する方法に関する。

免疫原性ペプチドは、腫瘍関連抗原、細胞内病原体、自己抗原、アレルゲン又は細胞外感染因子に由来し、対応する疾患の治療やその予防又は抑制に用いられる。

逆に、本発明は、腫瘍、細胞内病原体、自己抗原、アレルゲン又は細胞外感染因子に関連するペプチド抗原に特異的なＮＫＴ細胞を調製する方法をもたらす。ペプチド抗原は、グループ１のＣＤ１分子（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃ）を発現する細胞で単離されたＮＫＴ細胞に提示される。

本方法は、腫瘍、細胞内病原体、自己抗原、アレルゲン、又は細胞外感染因子に特異的なＮＫＴ細胞の減少を検出でき、当該ＮＫＴ細胞を減少させるように調製でき、ここで、ＮＫＴ細胞を含む試料は、対応するペプチド抗原を負荷したグループ１のＣＤ１分子（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、及び／又はＣＤ１ｃ）を含む表面と接触される。

本発明はまた、腫瘍及び細胞内感染の治療又は自己免疫疾患、アレルギー又は慢性炎症性疾患の治療に用いるペプチドの免疫原性又は調節特性を高める方法に関し、本方法は、ＣＤ１−エピトープの隣接残基に位置する増強モチーフを付加する工程を含む。

定義
本明細書で用いられる用語「ペプチド」又は「ペプチド性（peptidic）」は、ペプチド結合で連結された２より多いアミノ酸のアミノ酸配列を含む分子をいう。本発明では、非アミノ酸構造（例えば、カップリングする有機化合物）をペプチドに結合でき、用語「ペプチド」は、すなわち、非ペプチド部分（好ましくは、ペプチド部分が分子の最大部分を示す；重量アミノ酸：総重量＞５０％）をさらに含むペプチド分子を包含してよい。本発明のペプチドは、従来の２０個のアミノ酸又はその修飾体を含有できるか、化学的ペプチド合成又は化学的若しくは酵素的修飾で取り込まれた非天然アミノ酸を含有しうる。用語「ペプチド」又は「免疫原性ペプチド」は相違なく用いられる。用語「ペプチド」又は「タンパク質」は相違なく用いられるが、「タンパク質」は、好ましくは血友病又はポンペ病、ゴーシェ病又はファブリー病の治療の補充療法に用いられるペプチド等の天然由来の長ペプチド（又は生物学的製剤）に用いられる。

本明細書中で用いられる用語「エピトープ」とは、抗体若しくはその部分（Ｆａｂ’、Ｆａｂ２’等）又はＢ細胞若しくはＴ細胞リンパ球の細胞表面に提示された受容体により特異的に認識され結合され、かつ当該結合で免疫応答を誘導しうる１のタンパク質、又は、それほど好ましくはないがその数個の部分（立体配座エピトープを定義してよい）をいう。

本明細書中で用いられる用語「抗原」とは、１又はそれ以上のハプテンを含む、及び／又は１又はそれ以上のＴ細胞エピトープを含む、高分子の構造をいう。典型的には、前記高分子は、（多糖の有無によらず）タンパク質又はペプチドであるか又はタンパク質組成物で作製され、かつ、１又はそれ以上のエピトープを含み；ここで前記高分子は、「抗原タンパク質」又は「抗原ペプチド」ともいう。

用語「隣接残基」とは、グループ１のＣＤ１分子に結合して、さらにＮＫＴ細胞に認識されるエピトープのコア結合領域外に位置するアミノ酸残基をいい、本発明の「隣接残基」とは、グループ１のＣＤ１エピトープのＮ末端及び／又はＣ末端の１〜２０個のアミノ酸（好ましくは２〜１０個のアミノ酸）の領域に対応する。

用語「増強部分」又は「増強モチーフ」は、（ｉ）エピトープの隣接残基内に位置する、ＮＫＴ細胞の活性化を高めるか又はＮＫＴ細胞活性を調節するためにエピトープに付加されたペプチド配列、又は（ｉｉ）ＴＬＲのアゴニストとしてのＤＮＡ配列若しくはＲＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）短鎖アルキル配列、又は（ｉｖ）これらのいかなる組合せをいう。

用語「疎水性アミノ酸」とは、好ましくは芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、脂肪族アミノ酸（バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン）、アシル化アミノ酸及び脱炭酸アミノ酸をいう。類似の特性を共有する他の非在来型又は人工のアミノ酸（すなわち、例えば、水：オクタノール分配係数に従って決定される）も、本用語に包含される。

用語「ＮＫＴ細胞」とは、マスター転写因子ＰＬＺＦを発現し、ＣＤ１６２及びＮＫＧ２Ｄ等の受容体を担持する事実で特徴付けられる先天性免疫系細胞をいう。本発明では、ＮＫＴ細胞は、別途明示されない限り、グループ１のＣＤ１分子、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃのいずれかで提示されたエピトープを認識し、当該認識により（特異的に）活性化される。ＮＫＴ細胞は、ＭＨＣ様ＣＤ１拘束性因子を発現する抗原提示細胞と同系シナプスを形成しうる抗原特異的受容体（ＣＤ３）を発現する。

用語「ＮＫＴ細胞エピトープ」とは、Ｔリンパ球の細胞表面において受容体で特異的に認識されて結合される抗原タンパク質の部分をいう。本発明では、ＮＫＴ細胞エピトープは、別途明示されない限り、グループ１のＣＤ１分子により結合されたエピトープである。

「ＣＤ１分子」とは非ＭＨＣ由来分子又はＭＨＣ様分子をいい、片方又は両方の側面で開かれた深い疎水性溝に配置された、３個のアルファ鎖及び逆平行のβ鎖のセットでできており、かつ、脂質、糖脂質又は疎水性ペプチドをＮＫＴ細胞に提示しうる分子をいう。

用語「ＮＫＴＣＲ Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞、又はＮＫＴ系か若しくはそのクラスＩ（ＣＤ８＋）若しくはクラスＩＩ−拘束性（ＣＤ４＋）系のいずれかであって、ペプチド−ＣＤ１複合体に特異性があるＮＫＴ細胞クローン由来の受容体で形質移入又は形質導入されたものをいう。

用語「ＣＡＲ ＮＫＴ細胞」とは、抗体（又は可変鎖を含むその部分）を含む構築物、場合によってはシグナル伝達ドメインがあるＴＣＲの定常部で形質移入されたＮＫＴ細胞をいう。

用語「免疫障害」又は「免疫疾患」とは、免疫反応が、生体内の機能不全又は非生理的状態に起因するか又はそれを維持する疾患をいう。本発明の免疫障害とは、感染性病原体及び腫瘍サーベイランス由来の疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、並びに炎症又は小胞体ストレス状態への慢性曝露に起因する疾患をいう。

用語「治療的生物学的製剤」又は「生物学的（製剤）」とは、同種の２個体間で比較した場合に多型性を示すタンパク質、ペプチド又は因子（すなわち、いかなるペプチド分子）、又はグループ１のＣＤ１分子に結合してＮＫＴ細胞を活性化しうるエピトープを担持するタンパク質、ペプチド又は因子、かつ、より一般的には、当該生物学的製剤が投与される対象で（同種反応性）免疫応答を誘導するいかなるタンパク質、ペプチド又は因子をもいう。

ＣＤ１分子は、β−２ミクログロブリンと非共有結合的に会合した重鎖のヘテロ二量体であり、折りたたみはＭＨＣクラス１分子の一般的な折りたたみに類似する。それらは溝を形成し、疎水性残基が分子間で構造が大きく異なっても当該残基に結合しうる。ＣＤ１分子は、機能、細胞発現及び細胞内輸送の点で大きく異なり、非冗長機能が強調される。

従って、本発明は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃへの結合能がある疎水性ペプチドエピトープがＮＫＴ細胞を補強して、活性化する方法に関する。上記エピトープにより抗原特異性が確実となるため、本明細書に記載の方法は、ある治療指標で先天性免疫を高めるか又は調節する抗原特異的アプローチを示す。

疎水性エピトープとは、疎水性特性がある翻訳後修飾アミノ酸を含む、一連の疎水性アミノ酸を含むエピトープをいう。疎水性アミノ酸の連続は、いくつかの疎水性アミノ酸の直線的伸長であってもよいし、エピトープの（２Ｄ又は３Ｄ）立体配置による疎水性モーメントであってもよい。当該疎水性モーメントを予測するツールが存在する。

本発明は、少なくとも１のＣＤ１ａ−、ＣＤ１ｂ−及び／又はＣＤ１ｃ−制限Ｔ細胞エピトープを含む疎水性ペプチドに関する。

３つのグループ１のＣＤ１拘束性因子は、その一般的な構造及び発現パターンが互いに有意に異なり、互いに別個に考慮されるべきである。

ＣＤ１ａは主に樹状細胞と皮膚のランゲルハンス細胞に発現する。それは細胞の表面に存在し、細胞外環境をスクリーニングする。ＣＤ１ａはエンドサイトーシスにより取り込まれるが、長い細胞質尾部が欠如しているため、Ｒａｂ２−Ａｒｆ６依存性経路で初期エンドソームへ輸送される。それは、前記初期エンドソーム又は細胞表面で会合する抗原の提示分子として機能する。ＣＤ１ａに結合することが知られている唯一の外来抗原はマイコバクテリウムリポペプチドに由来し、脂質部分の長さと飽和状態に依存する。ＣＤ１ａはまた、ミエリンシートに豊富に存在する硫酸化糖脂質の一種であるスルファチドを提示する。

ＣＤ１ｂは樹状細胞で発現する。その大きな溝により、著しく大きな残基、あるいは複数の脂質分子を同時に収容しうる。ＣＤ１ｂは疎水性モーメントの提示に理想的である。ＣＤ１ｂは分子アダプターに結合し、ＬＡＭＰ１依存性経路において後期酸性リソソームを介して移行する。特に、ＣＤ１ｂは、細胞内輸送中はＭＨＣクラスＩＩ分子と近似のＭＨＣクラスＩＩ関連不変鎖により保護される。ＣＤ１ｂ分子は、結核菌（ミコール酸）及びおそらく細菌由来の他の抗原に対する防御機構に関与する。

ＣＤ１ｃは樹状細胞、ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球で発現する。これはエンドサイトーシス系で処理されるが、後期エンドソームには移行しない。その機能はそれほど確立されていない。ＣＤ１ｃは、スルファチド、並びに細菌及びマイコバクテリアに由来する多数の抗原、並びにリポペプチドを提示するが、ペプチド配列は、ＣＤ１ｃの裂け目から突出する（従って、少なくとも１の疎水性アミノ酸がＣＤ１ｃの裂け目を妨げる本発明とは異なる）。

ＣＤ１分子は、ポケットから構成される疎水性間隙内の疎水性部分を捕捉（sequestring）することにより抗原を提示するが、当該疎水性部分は本出願ではペプチド（アミノ酸にグラフトされたアシル鎖、Leu、lie、...等のアミノ酸の脂肪族残基）により提示される。当該ポケットはＡ’、Ｃ’及びＦ’と特定され、ＣＤ１分子間の構造及び溶媒の接近性は異なる。ＣＤ１分子のエピトープ結合領域の裂け目それ自体は、１のグループ１のＣＤ１分子と他のグループ１のＣＤ１分子とでは著しく異なる。ＣＤ１ａはＪ字形であり、Ａ’中の残基は３つの側面が閉じられた深い空洞に埋め込まれているが、位置Ｆ’では開放されており、実際により長い構造を収容できる。ＣＤ１ｂ分子の裂け目ははるかに大きく、Ａ’、Ｃ’、Ｆ’に各々３つの疎水性ポケットがある。興味深いことに、酸性条件下では、裂け目は、それ以外ではできない構造に対応するために開口する。ＣＤ１ｃ分子の裂け目は、２の疎水性ポケットがあり、両末端が開いている一般的なＡ’−Ｆ’構造を示す。

すなわち、ＮＫＴ細胞エピトープの一般的な構造は、ＣＤ１分子により異なる。ＣＤ１ａに結合するには、フェニルアラニン等の疎水性のかさ高い残基は、Ａ’位に存在し、その後長さが異なるアルキル鎖がある脂肪族（疎水性）アミノ酸が続き、Ｆ’位に第２疎水性残基があるはずである。挿入が両方向でおこりうるため、配列は対称的でありうる。しかしながら、ＣＤ１ａの異常なＪ型のためにエピトープの一方の側に他のアミノ酸配列は結合できない。ＣＤ１ｂ分子は、フェニルアラニン、トリプトファン及び疎水性残基を含む長いアルキル鎖の種々の組み合わせにより、Ａ’位に１、２、又は３個の疎水性残基をもたらすことができ、Ｃ’位及び場合によってはＦ’位にもたらしうる。ＣＤ１ｃ分子は、ＣＤ１ａと同じ特徴を示す配列を含む。

このような様々なグループ１のＣＤ１分子の構造間にみられるばらつきのため、グループ１のＣＤ１の裂け目に結合するモチーフの設計は困難である。しかし、ＣＤ１分子に結合するエピトープの配列の概観は、オンラインでアクセス可能なアルゴリズムを用いて得られうる。例えば、ペプチドは、プロサイトウェブサイトに配列を入力して同定しうる。これは一般的な第一段階と考えるべきであり、以下に記載される機能的分析の結果が得られれば、さらに精緻化しうる。ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、又はＣＤ１ｃによるエピトープ提示の観点からＮＫＴ細胞を活性化しうるアミノ酸配列は、むしろ（１）グループ１のＣＤ１分子への（特異的な）結合能及び（２）エピトープとＣＤ１分子の間で形成される複合体がＮＫＴ細胞とシナプスを形成することによる活性化能により機能的に定義される。

ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃの制限エピトープの同定は、機能的分析により行われる。１の適当な試験としては、エピトープを包含するペプチド、又はエピトープが由来する完全なタンパク質のいずれかを、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃのいずれかで形質移入された抗原提示細胞と培養する試験があげあれる。興味深いことに、ＣＤ１分子に多型がないことから、限られた数の試料のみでＮＫＴ活性化の関連性の評価が容易になる。

このため、ＣＤ１＋抗原提示細胞は、動物又はヒトから調製される。これは、ＭＨＣ分子又はＭＨＣ様分子を発現しない細胞を出発物質とするのが好ましい。マウス又はヒトの細胞株はグループ１のＣＤ１分子の配列を含む構築物及びβ−２ミクログロブリン配列をコードする構築物に形質移入される。当該細胞では、蛍光色素にカップリングされた特異的抗体を用いてＣＤ１受容体の存在が確認された後、蛍光活性化セルソーターを用いて蛍光が検出される。ＣＤ１受容体で形質移入される細胞は、樹状細胞、マクロファージ又はＢ細胞等のプロ抗原提示細胞であるのが好ましい。いくつかの例が当該技術分野で知られている。

本発明で想定されるＮＫＴ細胞は、α−β鎖会合又はγ−δ鎖会合で作製される抗原特異的受容体（ＣＤ３）を担持する。

本発明のＮＫＴ細胞の表現型は異なり、ＣＤ４（ＣＤ４＋ ＮＫＴ細胞）又はＣＤ８補助受容体（ＣＤ８＋ ＮＫＴ細胞）を担持し、又は当該補助受容体（ＣＤ４−ＣＤ８− ＮＫＴ細胞）に対して二重に陰性である。本発明はまた、α−βＴ細胞受容体又はγ−δ受容体を担持するＮＫＴ細胞に関する。

本発明の方法は、ＣＤ８＋ ＮＫＴ細胞及び／又はＣＤ４−ＣＤ８− ＮＫＴ細胞を活性化して、細胞内病原体が原因の腫瘍又は感染症（細胞傷害性機能）を治療するのに適する。逆に、本方法は、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患、又は小胞体ストレス（調節機能）により特徴付けられる疾患を治療するように、ＣＤ４＋ ＮＫＴ細胞を活性化するように構成される。当該方法では、エピトープ配列及び隣接残基内の増強モチーフの存在の有無の種々の組み合わせが用いられる（後述）。

最近、報告されているＮＫＴ細胞のサブセットは１型α−ｇａｌ−セラミド反応性CD1d拘束性ＮＫＴ細胞に対する当該サブセットのみである。これには、ＮＫＴ１（Ｔ−ｂｅｔ＋、ＰＬＺＦ^ｌｏ、ＲＯＲ_γｔ−）、ＮＫＴ２（Ｔ−ｂｅｔ−、ＰＬＺＦ^ｈｉ、ＲＯＲ_γｔ−）及びＮＫＴ１７（Ｔ−ｂｅｔ−、ＰＬＺＦ^ｉｎｔ、ＲＯＲ_γｔ＋）があげられる。ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃで制限される細胞に関する当該情報はないものの、出願人はグループ１のＣＤ１分子で制限されるＮＫＴ細胞も多様であることを見出した。従って、一般に、ＣＤ４を発現する細胞は、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の分泌を伴う調節特性を示し、一方、ＣＤ８＋ ＮＫＴ細胞は、ダブルネガティブＮＫＴ細胞と同様に、ＩＦＮ−γをより多く産生し、細胞毒性がより高い。この知見は限定的でなく、一般的な知見と考えられるべきである。

本出願の基礎となる発見は、当該グループ１のＣＤ１拘束性ＮＫＴ細胞が、実際に、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃで提示される疎水性ペプチドエピトープを認識でき、それにより対応するＮＫＴ細胞が活性化されることである。

特許文献１〜４に記載されているように、ＣＤ１ｄを発現する細胞に関する、類似するが異なる知見が既に得られていた。しかし、ＣＤ１ｄは、構造、分子間相互作用、細胞輸送、細胞表面発現及び表面提示エピトープのレパートリーを含むいくつかの特徴でＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、及びＣＤ１ｃとは異なり、ＣＤ１ｄ（グループ２のＣＤ１分子の単一の代表）はグループ１のＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、及びＣＤ１ｃ分子とは完全に異なる。

ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃに結合したペプチド性エピトープの提示により、ＮＫＴ細胞は急速に活性化され、先天性免疫系及び適応免疫系から他の細胞を活性化する多くのサイトカインを分泌し、対応する（又は同族の）エピトープを担持するＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃ陽性細胞に対して細胞毒性を潜在的に発揮する。

（本発明の）ペプチドは、ＮＫＴ細胞で認識されるようなコアエピトープの外側に位置する増強モチーフと有利に組み合わせることで、シナプス形成を高め、対応するＮＫＴ細胞の活性を高める。

細胞毒性の促進又は調節活性の亢進という予期された効果により、２つのタイプの増強モチーフが明らかにされうる。当該細胞毒性の促進は、標的細胞が腫瘍由来であるか又は細胞内病原体に感染している場合に適する。この場合はＣＤ８＋又はＣＤ４−ＣＤ８−表現型のＮＫＴ細胞が好ましい。当該調節活性の亢進は、組織の炎症が、慢性自己免疫疾患、又はアレルゲン若しくは感染性病原体への慢性的又は反復的な曝露で低減されるべき症状、並びに小胞体のストレスが細胞内成分の翻訳後変化をもたらす症状に適する。

増強モチーフは、好ましくは、長さが異なるリンカー配列の有無にかかわらず、ＣＤ１拘束性エピトープのアミノ末端又はカルボキシ末端への共有結合後、投与される。当該増強モチーフの１又は複数を、意図される用途に応じてエピトープに加えうることが理解されるべきである。

増強モチーフは、次のいずれかのカテゴリーに属する：
（１） 隣接残基内、好ましくはエピトープの両側へのシステイン残基（又は上記モチーフ）の付加であり、当該エピトープが凝集することで不適切な切断から保護されて、エピトープ提示が高まる；
（２） パルミチン酸又はミリスチン酸（−ＳＨ等のアミノ酸の反応性部分上）等の短いアルキル鎖の付加も好ましい選択肢である。パルミチン酸とシステイン残基を反応させて得られたチオエステルが好ましい例である；
（３） ＣＤ８又はＣＤ４、又はＴＩＧＩＴ等の補助受容体の短い相補的な配列を包むことも好ましい選択肢である。例として、ＣＤ４に対する特異的抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）、特にＣＤ４分子の第２細胞外ドメイン内のエピトープを認識するもの、及びそのα又はβアイソフォームであるＣＤ８分子に特異的な相補的配列があげられる；
（４） ＣｐＧ−ＤＮＡモチーフ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＬＰＳ又はＰａｍ３Ｃｙｓ等のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に対するアゴニスト配列の付加もあげられる。

これにより、エピトープと結合したグループ１のＣＤ１分子を提示する細胞とシナプスを形成するＮＫＴ細胞の活性化が促進される。

増強モチーフの特異的な例は、２つのアミノ酸で分離された２つのシステイン残基からなるいわゆるチオレダクターゼモチーフであり、標的分子のジスルフィド架橋に対して還元活性を呈示する。ＣＤ４補助受容体の第２細胞外ドメインに位置するジスルフィド架橋の還元により、ＣＤ４のホモ二量体及びポリマーの形成が誘発されて、シナプス持続時間を有意に高める。しかし、ＣＤ１エピトープに隣接するチオレダクターゼモチーフで還元されやすいジスルフィド架橋は、ＣＤ８補因子分子、ＣＤ３受容体、及びＴＩＧＩＴ等のＮＫＴ細胞により発現される表面分子にも存在する。

チオレダクターゼモチーフがＣＤ１ｄ拘束性エピトープ又はクラスＩＩ ＭＨＣ−制限エピトープに用いられない場合、上記増強モチーフがクラス１ ＣＤ１分子により拘束されるエピトープに対する代替エピトープとともに適用されうる。特許文献１には、隣接残基内のチオレダクターゼモチーフと組み合わせると特異的ＮＫＴ細胞の活性化が高まったことが記載され（特許文献１）、特許文献５には、クラスＩＩ拘束性エピトープの隣接残基内にチオレダクターゼモチーフがあると、ＣＤ４＋Ｔ細胞を強制的に細胞傷害性表現型にするシグナルをもたらすことが記載されている。

好ましくは、免疫原性ペプチドは、エンドソーム標的配列をさらに含む。

本発明のペプチドは、有利には、アジュバント分子とともに（上記の増強モチーフとは対照的に、共有結合に関係なく）投与して、エピトーププロセシングの効率を高め、かつ、細胞表面でのＣＤ１分子の発現を高めうる。例としては、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）を活性化するＣｐＧモチーフ、ＴＬＲ４を活性化するリポ多糖類又はパルミトイルｃｙｓ３、又はＴＬＲ３を活性化するオリゴヌクレオチドがあげられる。水酸化アルミニウム等の従来のアジュバント、又は完全フロイントアジュバント等のマイコバクテリウムの油性エマルジョン、又は当業界で公知のそれらの代替分子を被験体に投与するために本発明のペプチドに付加しうる。

本発明はさらに、上記のＮＫＴ細胞群を獲得又は誘導する方法に関し、当該方法は以下の、
（ｉ） 単離された天然ＣＤ３＋Ｔ細胞を提供する工程、
（ｉｉ） 当該細胞を、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃ分子で提示されるＴ細胞エピトープを含む免疫原性ペプチド、及びいかなる増強モチーフと接触させる工程、
（ｉｉｉ） ＩＬ−７及びＩＬ−２／ＩＬ−１５の存在下で前記細胞を増殖させる工程、を含む。

さらなる態様では、本発明はＮＫＴ細胞群を同定する方法を包含し、当該方法は以下の、
（ｉ） 単離された天然ＣＤ３＋Ｔ細胞を提供する工程、
（ｉｉ） マスター調節因子ＰＬＺＦを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞を提供する工程、
（ｉｉｉ） 工程（ｉ）で提供されたＴ細胞と比較して、工程（ｉ）で提供されたＴ細胞が上記特徴を呈示するか否かを判定する工程、を含む。

さらなる態様では、本発明は、ペプチド−ＣＤ１複合体に特異的な単一のＮＫＴ細胞受容体を担持する細胞を作製する方法を包含し、以下の、
（ｉ） ペプチド−ＣＤ１複合体に特異的なＮＫＴ細胞クローンを獲得する工程、
（ｉｉ） 工程（ｉ）で得られた細胞のＴＣＲの可変部をコードするＤＮＡ配列を単離する工程、
（ｉｉｉ） 単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞を提供する工程、
（ｉｖ） 工程（ｉｉｉ）で得られた細胞に、工程（ｉｉ）で得られたＤＮＡを遺伝子操作により導入する工程、
（ｖ） 場合によっては、工程（ｉｉｉ）で得られた細胞に補因子のＤＮＡ配列を遺伝子操作により導入する工程、を含む。

工程（ｉｉｉ）で得られた細胞は、その意図される用途により様々な系に属しうることが理解されるべきである。従って、腫瘍又は細胞内病原体に感染した細胞等の細胞傷害活性が求められる場合、ＮＫＴ系細胞又はクラスＩ拘束性系細胞が適切である。クラスＩＩ拘束性系細胞は、自己免疫疾患、アレルギー、組織恒常性制御に適用される場合や、調節機能が求められる場合により有利である。

本発明の本態様で作製される細胞はＮＫＴＣＲ Ｔ細胞といい、様々な起源のＴ細胞の形質移入又は形質導入に用いられるペプチド−ＣＤ１複合体に特異的な受容体を担持する。

さらなる態様では、本発明は、標的細胞により担持された表面分子のための抗体認識ドメインを担持する細胞を作製する方法を含み、以下の、
（ｉ） 標的細胞表面分子に対する抗体を産生するＢ細胞クローンを獲得する工程、
（ｉｉ） 前記抗体をコードするＤＮＡ配列を単離する工程、
（ｉｉｉ） 工程（ｉｉ）で得られたＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を、ＴＣＲ（ＣＤ３）の定常部をコードするＤＮＡ、場合によっては、シグナル伝達ドメインのＤＮＡ配列で、作製する工程、
（ｉｖ） ペプチド−ＣＤ１複合体に特異的なＮＫＴ細胞クローンを獲得する工程、
（ｖ） 工程（ｉｉｉ）で得られたＤＮＡを、（ｉｖ）で得られた細胞に導入する工程、を含む。

当該キメラ抗体受容体（ＣＡＲ） ＮＫＴ細胞を構築するために用いられる抗体の特異性は、標的細胞により異なることが理解されるべきである。例としては、ＮＫＧ２Ｄのリガンド、がん遺伝子又は小胞体ストレス応答の結果又は細胞内病原体による感染の結果として標的細胞の表面に発現される抗原があげられるが、これらに限定されない。

工程（ｉｖ）で選択されたＮＫＴ細胞クローンは、意図される使用法に応じた、その表現型及び機能により選択されうる。従って、例えば、Ｔｂｅｔ^＋、ＰＬＺＦ^ｌｏ、ＲＯＲｇｔ⁻ ＮＫＴ細胞は、標的細胞に対する細胞毒性が必要な場合に好ましく、Ｔｂｅｔ⁻、ＰＬＺＦ^ｈｉ、ＲＯＲｇｔ⁻ ＮＫＴ細胞は、調節機能が必要な設計で好ましいが、これらに限定されることは意図されない。用途としては、前者では腫瘍細胞及び細胞内病原体がある細胞の除去、並びに自己免疫疾患、アレルギー性疾患、慢性炎症及び小胞体ストレスを特徴とする症状の除去があげられる。

上記のいずれにおいても、当該腫瘍関連抗原は、突然変異又は過剰発現された転写因子、がん原遺伝子、ウイルス由来タンパク質、生存因子、又はＢ細胞受容体に由来するイディオタイプ決定基等のクローンタイプ決定基を含むがん遺伝子である。

上記用途のいずれにおいても、当該細胞内病原体関連抗原は、細胞内生活環を伴うウイルス、細菌、マイコバクテリウム又は寄生虫に由来するいかなる抗原であってよい。

上記用途のいずれにおいても、当該自己抗原は、１型糖尿病、重症筋無力症、甲状腺炎、多発性硬化症、甲状腺炎、セリアック病、炎症性腸疾患、関節リウマチ、悪性貧血、ブドウ膜炎、蝸牛炎及び無神経症を含む器官特異的自己免疫疾患と関連してよい。

上記用途のいずれにおいても、慢性炎症性疾患は、アレルゲン又は感染性病原体への慢性曝露と関連してよい。

上記用途のいずれにおいても、小胞体ストレスによる抗原の翻訳後変化は、腫瘍、慢性自己免疫疾患、慢性感染症、過剰刺激、低酸素症、又はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）又はインターロイキン−１β（ＩＬ１−β）等の高濃度の炎症誘発性サイトカインへの曝露と関連してよい。

本発明のさらなる態様は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃ拘束性ＮＫＴ細胞群を得る（インビトロ）方法であり、以下の：
（ｉ）腫瘍関連抗原、細胞内病原体関連抗原、自己抗原、アレルゲン、感染性因子、又はトランスクリプトーム後レベルで修飾された抗原に由来するＮＫＴ細胞エピトープ、かつ場合によっては増強モチーフを含む免疫原性ペプチドを提供する工程；
（ｉｉ） 前記免疫原性ペプチドを被験体（又はＮＫＴ細胞を含む試料）に、場合によってはアジュバントの存在下で、投与する工程；
（ｉｉｉ） ＮＫＴ細胞群を獲得する工程；を含む。

本発明の目的であるペプチド及びポリペプチドは、機能的分析を用いて得られうる。形質移入には、関連するグループ１のＣＤ１分子の配列及びβ−２ミクログロブリンの配列と、好ましくはヒト由来の細胞系、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない細胞系、好ましくは樹状細胞、マクロファージ又はＢリンパ球等の抗原提示細胞から得られる細胞系を用いる。当該細胞の例はＵ９３７細胞系及びＨｅＬａ細胞である。グループ１のＣＤ１分子に顕著な多型がないことから、グループ１のＣＤ１分子の各々に単一の形質移入細胞を用いうることは注目に値する。形質移入は、ウイルスベクター、エレクトロポレーション等の当業界の公知の方法を用いて行われる。細胞表面での形質移入体の発現はＣＤ１分子に特異的な抗体により検出されるが、これは、表面発現にはβ−２ミクログロブリンの存在を要するため、当該分子の機能性が確実になる。形質移入された受容体の検出は、通常、蛍光標識された特異的抗体及びセルソーターを用いて行われる。その後、形質移入された細胞を、検討中の抗原の完全又は部分的なアミノ酸配列、及び形質移入されたＣＤ１分子により提示されうるエピトープを潜在的に含む配列と共に培養する。ＣＤ３＋細胞のグループは、末梢血又は組織から得られ、形質移入された１又は複数の細胞と培養される。その後、ＣＤ１提示エピトープに特異的なＮＫＴ細胞の存在を、ＮＫＴ細胞とエピトープ提示形質移入細胞株との間のシナプスの形成と関連するＮＫＴ細胞活性化（例えば、チミジンの取り込み又はＮＵＲ７７の活性化）により評価する。

いくつかの例では、ＮＫＴエピトープは、適当な場合、当該エピトープが病態下のインビボで提示される条件を模倣するような翻訳後修飾を担持しうる。

上記の方法で得られるＮＫＴ細胞群及び被験体にて翻訳後修飾された抗原が悪影響を及ぼす状態で腫瘍、細胞内病原体感染、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、慢性感染症を予防又は治療するための（薬物の製造への）その使用はまた、本発明の一部である。

本発明は、ＭＨＣ様分子ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃに結合したエピトープに特異的なＮＫＴ細胞の増殖及び機能的活性を高める方法を提供する。

その後、形質移入細胞は試験するエピトープを包含するペプチドと共に培養する。エピトープが用いられる場合、当該全長ペプチドのかわりに、例えば、エピトープに増強モチーフの付加及び／又は翻訳後修飾を施した異なる形態で用いることも考えられる。

免疫原性ペプチドの増強モチーフは、当該ペプチド内のエピトープ配列に近接して配置されるか又はリンカーでＮＫＴ細胞エピトープから離される。より詳細には、リンカーのアミノ酸配列のアミノ酸は７個以下である。さらに詳細には、リンカーのアミノ酸は１、２、３、又は４個である。リンカーはまた、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸又は小型化学構造を含んでよい。当該結合裂け目は両側に開き、ＣＤ１ａ以外は、ペプチド長はアミノ酸７個より長くてよい。

免疫原性ペプチドがエンドソーム標的配列を含む場合、隣接配列は、ＮＫＴエピトープとエンドソーム標的配列との間及び／又は増強モチーフとエンドソーム標的配列との間に存在しうる。より詳細には、隣接配列のアミノ酸の配列は、１０個までのアミノ酸の配列、又は１〜７個のアミノ酸の配列、例えば、２又は３残基の配列である。より詳細には、隣接配列は、ＣＤ１分子でのペプチドを安定化させるのに有用な疎水性（例えば、Ｆ、Ｙ、Ｗ）アミノ酸残基を含む（すなわち、隣接領域のアミノ酸の少なくとも２、３、４、５、６、又は７、８、９又は１０が疎水性である）。

ＮＫＴ細胞の供給源としての細胞試料はＰＢＭＣからなり、そこからＣＤ３＋Ｔ細胞が抽出され、精製された後に、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃが形質移入された細胞を含む細胞培養物に加えられる。その後、ＮＫＴ細胞を増幅して細胞株及びクローンを確立し、分析に供しうるが、当該方法及び技術は当業界で知られている。形質移入細胞はエピトープ又はエピトープ由来タンパク質と培養された後、ＩＬ−７及び比率を変えたＩＬ−２及びＩＬ−１５の存在下で培養液中に保持される。その後、ＮＫＴ細胞の検出、増殖及び特徴付けを上記のように実施する。

グループ１のＣＤ１分子の１つが形質移入された細胞は、インビボ、例えば、ヒト細胞由来の物質で再構成された免疫不全動物で用いられうる。適応免疫及び先天性免疫の細胞が欠損するＮＯＧマウスは、例えば、健常者又は所定の疾患（腫瘍、細胞内感染、実施例参照）に罹患した患者の末梢血から得られたＣＤ３＋Ｔ細胞で再構成される。ＣＤ１−形質移入細胞には、ＣＤ１結合エピトープを含むタンパク質又はＣＤ１−拘束性エピトープを含むペプチドが含まれる。当該細胞はその後、免疫不全マウスの腹膜に移植される。数日後、腹膜を穿刺して細胞を回収し、ＮＫＴ細胞の検出、同定及び増殖に用いる。あるいは、タンパク質又は対応するエピトープが含まれる形質移入細胞を免疫不全マウスに直接静注する。３〜４日後に脾臓を回収してＮＫＴ細胞の検出及び増殖に用いる。

疎水性残基を含むペプチドは投与後に抗原提示細胞により取り込まれ、関連するＣＤ１分子のクラス及びそれを発現する細胞の機能ごとに異なる経路でプロセシングされる。従って、非限定例として、表面に発現されたＣＤ１ａ分子への結合の後に細胞内取り込み及び初期エンドソームとの融合がおこる。複合体は、細胞の代謝状態、特に、小胞体ストレス条件の有無に依存する状況で、細胞表面に再指向されてＮＫＴ細胞と相互作用し、腫瘍細胞又は病原体感染細胞で優勢となる。エンドサイトーシス後のＣＤ１ｂへの結合は、ＣＤ１ｂが後期エンドソーム経路とその酸性条件に移行しうる限り、様々な状況でおこるが、当該過程は、グループ２に制限されたエピトープのプロセシングと近似する。後期エンドソーム区画では、疎水性ペプチドと脂質がＣＤ１ｂの裂け目への結合を競合する。一度取り込まれると、当該ＣＤ１ｂ分子は細胞表面に指向してＮＫＴ細胞を提示及び活性化させる。ＣＤ１ｃ分子はエンドサイトーシス経路でエピトープを交換し、アダプタータンパク質を介して複数の細胞内の物質と相互作用するが、後期エンドソームとは相互作用しない。それらは自己抗原又は細胞表面での提示とＮＫＴ細胞認識のための突然変異自己抗原を提示する傾向がある。

本発明は、グループ１のＣＤ１結合モチーフを天然疎水性残基からなるペプチドに関する。当該モチーフのアミノ酸残基は、通常、ＣＤ１結合能を高める残基に置換されて修飾される。

ペプチドのグループ１のＣＤ１分子への結合能を測定する方法は、当業界で公知の方法に由来する。一般に、ポリスチレンプレート等の固相上でＣＤ１分子を不溶化するか、又はＣＤ１分子の多量体を構築することからなるいくつかの方法が用いられうる。結合の親和性が比較的弱いため、有利な多量体の大きさはデキサマーまでである。従って、関連するグループ１のＣＤ１分子の多量体を、例えばビオチンで標識しうるペプチド配列（すなわち、その部分である）と共に培養する。その後、ＣＤ１多量体に結合したペプチドの存在を、蛍光色素標識アビジンを用いる蛍光及び蛍光活性化セルソーターで検出して評価しうる。当業界では、同じ原理に基づいた他の代替案が知られている。

本明細書中に記載の方法は、グループ１のＣＤ１拘束性ＮＫＴ細胞の検出に用いうる。すなわち、グループ１のＣＤ１分子の多量体が末梢血由来の物質を含む種々の起源のリンパ球のグループと培養される。好ましい方法は、最初に血液試料からＣＤ３抗原受容体を発現する細胞を単離するもので、これは、通常、抗ＣＤ３抗体被覆表面（例えば、ビーズ）上で全細胞グループを培養して得られる。必要な場合、刺激サイクルは、ＣＤ３＋細胞を、単一のグループ１のＣＤ１分子を発現する形質移入体及び推定ＣＤ１結合配列が得られたタンパク質と培養すること又は当該配列を包含するペプチドと培養することで、インビトロで行いうる。その後、ＣＤ３＋細胞を、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−２及びＩＬ−１５の存在下で増殖する。その後、当該刺激工程から得られた細胞を、（ＣＤ１分子の多量体が不溶化されたビーズを用いて）再度選別し、必要であれば、刺激サイクルを１回又は数回行いうる。

グループ１のＣＤ１分子の１つで制限される細胞集団は、ＰＬＺＦ等の転写因子及びＣＤ１６２及びＮＫＧ２Ｄ等の表面分子を含むＮＫＴ細胞のマーカーを評価しうる。あるいは、単離ＣＤ３細胞は、ＮＫＴマーカーによる選別後にグループ１のＣＤ１分子と培養される。

腫瘍細胞の大部分は、自然発生的又はＩＬ−１βやＩＦＮ−γ等の炎症性サイトカインによる刺激後、ＣＤ１系分子を発現する。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤又は小胞体ストレスを刺激する製剤（ブレフェルジンＡ、タプシガルギン、２−デオキシグルコース、ツニカマイシン等）を用いると、ＣＤ１表面発現が有意に高まり、ＮＫＴ細胞が標的化される。

本発明は、グループ１のＣＤ１分子への結合能やエピトープ特異的ＮＫＴ細胞活性化能があるエピトープを同定する方法に関する。当該エピトープは、単独で、又は増強モチーフ、及び場合によっては後期エンドソーム標的配列を含有し、化学合成により調製され、腫瘍に罹患した個人の直接ワクチン接種に用いられる。

一態様では、ＮＫＴ細胞エピトープは腫瘍由来であって、以下の、（１）一部のメラノーマで確認される、Ｔｐ５３等の突然変異した転写因子、過剰発現された転写因子又はキナーゼ、ＭＡＧＥを含むがん遺伝子；（２）腎臓又は副甲状腺等の軟部組織のがん及び多発性骨髄腫で発現されるサイクリンＤ１等のがん原遺伝子；（３）一部のがん腫及び一部のホジキン型リンパ腫でのエプスタイン−バーウイルス由来等のウイルス由来のタンパク質；（４）サバイビン又はｂｃｌ２等の抗アポトーシス因子である生存因子；（５）濾胞性リンパ腫又は多発性骨髄腫でのＢ細胞受容体由来のイディオタイプ決定因子又はＴ細胞悪性腫瘍におけるＴ細胞受容体決定因子等のクローンタイプ決定因子；由来のペプチド又はポリペプチドがあげられる。

ＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞に対する先天的及び適応的応答を共に促進しうるサイトカインを産生することで間接的に、又は同族エピトープを提示する腫瘍細胞を破壊することで直接的に、腫瘍に対する防御に関与する。直接破壊には、グランザイム及びパーフォリンの産生、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのいくつかの代替経路が関与する。本発明で治療されうる腫瘍としては、上記のがん遺伝子を発現するものがあげられる。

当該ＮＫＴ細胞の誘発に有用でありうるエピトープは上記の方法で同定される。当該ペプチドを投与すると特定のＮＫＴ細胞が誘発され、感染細胞が特異的に認識されて除去される。

従って、ＮＫＴ細胞エピトープは、有利には、細胞内病原体由来である。当該病原体は、ウイルス、細菌又は寄生虫でありうる。ウイルスとしては、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスがあげられ、例えば、ヘルペスウイルス科、フラビウイルス科及びピコルナウイルス科、インフルエンザ、麻疹及び免疫不全ウイルスである。細菌及びマイコバクテリアとしては、結核菌、ヒト又は動物に病原性を示す他のマイコバクテリア、エルシニア症、ブルセラ、クラミジア、マイコプラズマ、リケッチア、サルモネラ及び赤痢菌があげられる。寄生虫としては、マラリア原虫、リーシュマニア、トリパノソーマ、トキソプラズマ原虫、リステリア、ヒストプラズマがあげられる。

ＣＤ８＋ ＮＫＴ細胞の表現型は実際に多様であり、いくつかの細胞はα−α又はα−βのアイソフォームを発現する。出願人は、当該細胞のかなりの部分がβアイソフォームのホモダイマーを発現するが、αアイソフォームは古典的なクラスＩ ＭＨＣ分子の結合単位と考えられることを見いだした。実際、αアイソフォームとβアイソフォームの主な機能的相違は、βアイソフォームの方がＬＣＫ等のキナーゼをシナプスに動員する能力が高く、それにより細胞の初期のシグナル伝達と活性化が促進される。従って、βアイソフォームにより相補的配列が隣接領域へ挿入されると、ＣＤ８＋ ＮＫＴ細胞を動員する選択的利点が高まる。

本発明で考慮される自己免疫疾患は多数あげられるが、特に、１型糖尿病、重症筋無力症、多発性硬化症、甲状腺炎、セリアック病、副腎炎、ぶどう膜炎を含む眼疾患、蝸牛炎等の内耳疾患を含む臓器特異的自己免疫疾患が、最も高頻度に引用される。これらの全ての例では、ＴＬＲの活性化のために重要な炎症成分が罹患組織で優勢である。調節性ＮＫＴ細胞は、疾患臓器に浸潤する炎症細胞とシナプスを形成するが、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン）又はミエリン等の構成タンパク質を産生する細胞と直接相互作用しうる。当該細胞は、グループ１のＣＤ１系に属する制限ＭＨＣ様分子を発現する。すなわち、当該調節性ＮＫＴ細胞が誘導されると、標的臓器に浸潤する細胞の流入と機能の調節及び正常な細胞機能の回復という２つの効果がもたらされる。

自己抗原の翻訳後修飾は慢性自己免疫疾患で頻繁に観察される。ＮＫＴ細胞の誘導に用いられるペプチドは、有利には、当該疾患で観察される翻訳後修飾により修飾される。当該修飾の多くの例が報告されており、最も一般的なものは、アルギニン残基のシトルリン化、パルミトイル及びミリストイル部分を含む短いアルキル鎖の付加、リン酸化又は硫酸化である。当該修飾は、本出願の一部として考慮される。

従って、自己免疫疾患分野における好ましい用途は、例えば、増強モチーフを介して、ＩＬ−４及びＩＬ−１０を産生することが知られているＣＤ４＋補助因子を担持するＮＫＴ細胞を誘導することであり、これにより隣接残基のＣＤ４に対する相補的配列を含むようなＣＤ４＋ ＮＫＴ細胞の動員が促進されるであろう。

慢性アレルギー性喘息は、気管支壁のレベル及び気管支周囲腔における炎症細胞の蓄積に影響を受ける。すなわち、調節特性があるＮＫＴ細胞が誘導されるとアレルゲン特異的な慢性炎症が制御される。慢性閉塞性気管支疾患の原因である感染性病原体への慢性曝露は主として病理が感染そのものではなく炎症に由来することを考慮すると、同様のアプローチが有益であろう。

調節性ＮＫＴ細胞の誘導により、以下に記載するような治療目的で用いられる製剤に対する耐性が確立されることは興味を引く。この場合、グループ１のＣＤ１分子に結合し、ＮＫＴ細胞活性化能を示すモチーフを含む配列は、慢性又は再発性のアレルゲン又は感染性病原体の曝露で特定される、ワクチン接種目的に用いられる。

従って、本発明は、慢性炎症分野での用途、及びＣＤ４補因子を担持するＮＫＴ細胞の誘発を介した治療目的で用いられる生物学的製剤に対する誘導免疫寛容のための用途を網羅し、これは、グループ１のＣＤ１エピトープ含有ペプチド及び抗ＣＤ４相補構造からなる増強モチーフを用いて有利に誘発しうる。

小胞体の慢性ストレスは、自己免疫の明らかな徴候がない多くの症状で観察される。これには、心筋梗塞、脳血栓症又は脳出血後に生じる低酸素症があげられる。外傷後期間（post-trauma period）もまた、小胞体ストレスの影響をうけると考えられる。当該事象後の主要な炎症反応は組織修復に有害である。この場合、特異的な自己抗原や感染性病原体は直接原因ではない。本発明の方法により、当該組織と反応するＮＫＴ細胞を同定し、それにより調節性ＮＫＴ （ＣＤ４＋）細胞群を誘発するのに有用なペプチドを設計する機会がもたらされる。炎症を緩和することで、組織の修復及び復元が促進され、増強される。本適用例の他の例は、低酸素症、ストレス応答及び炎症を伴う脂肪組織塊の増加による低酸素症が関連する肥満である。

治療目的で用いられる生物学的製剤は、しばしば免疫応答を誘発するためその使用が制限される。本発明に基づく発見では、当該生物学的製剤の大部分が先天性免疫系と相互作用し、この相互作用が適応応答を誘導するのに必要であることが示された。より詳細には、生物学的製剤により、グループ１のＣＤ１ファミリーの拘束性分子に結合しうる配列を発現して特異的ＮＫＴ細胞が認識され及び活性化される。アミノ酸の置換、付加の欠失により、又は翻訳後変化を配列に導入して、グループ１のＣＤ１モチーフを除去すると、ＮＫＴの活性化と適応免疫応答の誘発が阻害される。この結果、当該改変生物学的製剤に対する完全な免疫寛容が獲得され、当該免疫寛容は、その後有効性が損なわれる危険もなく、長期間投与しうる。

この分類で考慮される生物学的製剤には、（１）例えば、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）又はＢ（第ＩＸ因子）の凝固因子欠損、スタフィロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、及びポンペ病のα−グルコシダーゼやファブリー病のガラクトシダーゼ等の肝機能に関連する遺伝子欠損等の遺伝子欠損又は機能不全の補充療法に用いられるペプチド又はポリペプチド；（２）インスリン、成長ホルモン、パラソルモン等のホルモンに用いられるペプチド又はポリペプチド；（３）ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−ｇ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ等のサイトカイン及び成長因子、ＩＬ−１ｂ受容体等のサイトカイン受容体に用いられるペプチド又はポリペプチド；（４）免疫応答の調節に用いられる治療用抗体であって、当該治療用抗体は、アレルギー性疾患でのＩｇＥに対する抗体、抗ＣＤ３抗体（特にＣＤ３ｄ及びＣＤ３ｅ）又は移植片拒絶反応又は自己拒絶反応における抗ＣＤ４抗体、関節リウマチ又はその他の疾患の治療におけるＩＦＮ−ｇ等のサイトカインに対する抗体、ＰＤ−１及びＰＤ−１リガンド及びＴＩＧＩＴ等のチェックポイント阻害薬に対する抗体、又はＣＤ２０等の免疫細胞表面抗原に対する抗体、に用いられるペプチド又はポリペプチド；（５）腫瘍の治療に用いるＣＡＲ Ｔ細胞の構築に用いる抗体又は遺伝子組換えＢ細胞（ＣＡＲ Ｂ細胞）により担持される抗体に用いられるペプチド又はポリペプチド；（６）腎不全の治療に用いるエリスロポエチンに用いられるペプチド又はポリペプチド；（７）アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルス由来ウイルスベクターを含む遺伝子治療及び遺伝子ワクチン接種に用いるウイルスベクターに用いられるペプチド又はポリペプチド；があげられる。当該リストは限定的でなく、当業者であればこれが治療目的で用いられるペプチド又はポリペプチドに関することを理解するであろう。

前記生物学的製剤のペプチド又はポリペプチドは、化学合成又は遺伝子工学で製造されうる。欠失、置換、付加及び／又は翻訳後修飾は、２つの方法を組み合わせてよく、遺伝子工学を用いて作製される生物学的製剤には、さらに、翻訳後修飾が導入される。

本発明の治療的可能性に加えて、適当な場合、自然配列又は増強モチーフの添加による修飾後又は突然変異、欠失又は翻訳後修飾の後、グループ１のＣＤ１分子への結合能があるエピトープを包含するペプチドを、対応するＮＫＴ細胞を検出、単離、付加又は欠失するのに用いうる。ＣＤ１分子のオリゴマー又は多量体は、可溶性又は不溶性の形態で用いられ、目的のペプチドをインビトロで含む。その後、オリゴマー又は変異体をＮＫＴ細胞の供給源と共に培養し、前記ペプチドとシナプスを形成させる。当該ＮＫＴ細胞の供給源としては、末梢血、穿刺又は生検により組織から得られた細胞又は培養細胞があげられる。当該手順で得られたＮＫＴ細胞を用いて、被験体への投与によって誘発される作用機序又は潜在的な毒性若しくは副作用を解明しうる。

本方法は、生体試料、例えば自己免疫疾患由来の生体試料からＮＫＴ細胞を除去することが有利である場合に用いうる。末梢血から得られた細胞は、ＣＤ１分子から作製されたオリゴマー又はポリマーが不溶化され、かつ、血液から抽出しようとするＮＫＴ細胞に対応するペプチドを含む体外システムを通過させた後、対応するＮＫＴ細胞が存在しない細胞を再び被検体に戻す。あるいは、ＣＤ１分子は、ペプチドの共有付着により産生されうるか、又はペプチドとの単一分子として遺伝子工学により産生されうる。これを達成する方法は、当業界で知られている。

本発明のさらなる態様は、ＣＤ１分子により提示される所与のエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を担持するように操作された（ＮＫ）Ｔ細胞の作製方法である。本方法は、ポリメラーゼ連鎖反応によるＴＣＲの同定工程及び／又は増幅、当該受容体をコードするＤＮＡの自己Ｔ細胞への導入工程、好ましくは特定の表現型及び／又は特定の機能の選択工程を含む。好ましくは、ＣＤ８があるか、又はＣＤ４及びＣＤ８に対して陰性であるＮＫＴ系細胞が用いられる。自己免疫疾患の治療には、ＣＤ４＋表現型が好ましい。しかし、所望の用法により、クラスＩ拘束性（ＣＤ８＋）系又はクラスＩＩ拘束性（ＣＤ４＋）系に属するＴ細胞を選択することが有利でありうる。ＮＫＴクラスＩ又はクラスＩＩ系細胞は、例えば、調節性Ｔ細胞、ＴＩＧＩＴ若しくはＤＮＡＭを担持する抑制性細胞、又はＮＫＧ２Ｄ等の細胞傷害性機能に関連するリガンドに対する受容体を発現する細胞の機能を担持するように、さらに選択されうる。当業者は、このリストが網羅的でないことを理解するであろう。当該細胞の作製方法は当業界で知られている。総じて、このように遺伝子操作された細胞をＮＫＴＣＲ Ｔ細胞という。

本発明のさらなる態様は、標的細胞の表面抗原に特異的な抗体を担持するＮＫＴ細胞の作製方法である。この場合、ＮＫＴ細胞は、その表現型及び機能に応じて選択され、当該抗体は、小胞体ストレス条件に関連するリガンド、すなわち細胞内病原体に関連する分子のがん遺伝子を認識する。当該細胞の作製方法は、当業界で知られている。総じて、このように操作された細胞をＣＡＲ ＮＫＴ細胞という。

本発明はまた、宿主に再投与して腫瘍細胞又は病原体感染細胞の除去能を高めるためのインビトロで獲得、増殖、活性化されたＮＫＴ細胞に関する。本発明は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃ陽性ＡＰＣによるＮＫＴ細胞のインビトロ刺激のかわりに、ＣＤ１分子に挿入するためのエンドソーム経路への免疫原性ペプチドの発現を駆動しうる遺伝的構築物を用いたＡＰＣの形質移入又は形質導入の方法にも適用される。

特に、本発明は、特定のＮＫＴ細胞の増殖方法を提供し、その結果、以下の：
（ｉ） 炎症誘発性サイトカインの産生；
（ｉｉ） シナプスが形成される標的細胞の接触依存性及び可溶性因子依存性の消失；が、促進されるが、促進される活性はこれらに限定されない。
その結果、腫瘍細胞又は細胞内病原体感染細胞に対する応答がより効果的となる。

その一方で、本発明はまた、慢性自己免疫疾患、慢性炎症、又は治療目的で生物学的製剤が投与された場合に、抑制的又は調節的な機能を高める、宿主への受動投与のためのインビトロで獲得、増殖、活性化されたＮＫＴ細胞に関する。

特に、本発明は、特定のＮＫＴ細胞を増殖する方法を提供し、その結果、以下の：
（ｉ） 抑制性サイトカインの産生；
（ｉｉ） シナプスが形成される標的細胞の機能の接触依存性及び可溶性因子依存性の調節；が、促進されるが、促進される活性はこれらに限定されない。
その結果、自己免疫応答、慢性炎症に対する応答又は治療目的で投与された生物学的製剤に対する免疫応答に関与する細胞の活性化が抑制される。当該抑制活性としては、糖尿病でのインスリン等のホルモンの産生又は多発性硬化症等の脱髄疾患におけるミエリンの産生を含む、正常機能の復元を伴う標的細胞における小胞体ストレスの寛解があげられる。

本発明の範囲内で特に興味深いのは、本明細書に記載の方法が、ＮＫＴ細胞の下流で作用する細胞の数又は機能を変化させうることである。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、サイトカイン等の可溶性因子の産生と細胞間接触による、ＮＫＴ細胞の支持に大きく依存する。これによりＮＫ細胞の活性が促進又は低減される。活性の促進は、腫瘍及び細胞内病原体感染等の場合に望ましく、活性化されたＮＫ細胞は、腫瘍又は感染細胞に対する細胞傷害性応答に関与して、これを促進する。活性の低減は、ＮＫ細胞の機能が有害となる状態、例えば、１型糖尿病及び多発性硬化症を含む組織特異的自己免疫疾患において望ましい。

本発明はまた、必要な特徴又は特性があるＮＫＴ細胞の体液又は器官における同定に関する。本方法は、ＣＤ１６２、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ２４４の発現を含む、表面表現型でＮＫＴ細胞を同定することを含む。その後、細胞を、ＣＤ１分子により提示されうるペプチドと特定されるＮＫＴ細胞エピトープと接触させる。有利には、本同定は、ＣＤ１分子の多量体を用いて行いうる。その後、細胞を、ＩＬ−７及びＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５の存在下で、インビトロで増殖させうる。

本発明は、治療及び予防の用途を網羅する。

本発明の治癒可能性は、抑制又は調節特性があるＮＫＴ細胞が、シナプスが形成される細胞の代謝を変化させると、標的細胞が小胞体ストレスから解放されることで、細胞機能を正常状態に回復するための状況段階が設定されるという所見に関する。この例は、インスリン依存性糖尿病及びインスリン産生の回復、並びにオリゴデンドロサイトの多発性硬化症等の脱髄疾患におけるミエリン産生回復能で見出される。

本発明の治癒可能性としては、細胞内病原体感染及びすでに存在する腫瘍への適用もあげられる。感染細胞又は腫瘍細胞の除去後、感染又は腫瘍に関連した抗原のリレー（relase）が生じる。当該抗原が抗原提示細胞に取り込まれると、感染や腫瘍を除去する免疫応答のカスケードが誘導される。

本発明はまた、能動ワクチン接種又は細胞の受動移入による予防治療的適用を網羅する。

本発明は、グループＩのＣＤ１分子の多型の程度が極めて限定されている点が利点である。従って、本発明の範囲内の製剤は、治療が必要な多数の患者にペプチドを適用しうる点で普遍的分子とみなしうる。

ＮＫＴ細胞群は、有利には、インビトロ増殖又は遺伝子工学で得られる（ＮＫＴＣＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ ＮＫＴ細胞）。当該細胞群は必ずしもＭＨＣ適合性ではない患者に投与しうる。

被験体中に２以上の抗原が存在する状態では、当該製剤は、直接ワクチン接種アプローチのためのペプチドの組み合わせ、又はＮＫＴ細胞調製物の混合物から構成されてよい。

本発明の製剤は、必ずしも必要ではないが、本発明の少なくとも１の免疫原性ペプチド、当該免疫原性ペプチドのためのＮＫＴ細胞群、又は当該免疫原性ペプチドを発現しうる遺伝子治療ベクターを活性成分として含む（医薬）製剤である。活性成分とは別に、当該製剤は、（薬学的に許容される）希釈剤、担体又はアジュバントの少なくとも１つを含む。特に、本発明の医薬組成物は予防的又は治療的に適用されるワクチンである。

ＮＫＴ細胞エピトープは、１又はそれ以上のグループ１のＣＤ１分子に結合しうると考えられる。例えば、ＣＤ１ａとＣＤ１ｃの構造は類似するが同一ではなく、ペプチドはＣＤ１ａとＣＤ１ｃに結合しうる。これは、ＮＫＴ細胞の認識及び活性化の効果が同一であることは意味しない。ＣＤ１ａとＣＤ１ｃは特にその細胞内輸送経路が異なり、その性質も異なるからである。

本発明の免疫原性ペプチドのＮＫＴ細胞エピトープは、修飾ＮＫＴ細胞エピトープが、天然ＮＫＴ細胞エピトープ配列に類似のＣＤ１の裂け目内への結合能を保持する場合には、タンパク質の天然エピトープ配列に合致しうるか、又はその修飾エピトープでありうる。当該修飾ＮＫＴ細胞エピトープは、天然エピトープと同じＣＤ１タンパク質に対する結合親和性がありうるが、その親和性はより低いか又はより高い場合がありうる。

好ましくは、本発明の免疫原性ペプチドは、ＣＤ１分子内でのプロセシング及び提示のための初期又は後期エンドソームへのペプチドの取り込みを促進するアミノ酸配列（又は別の有機化合物）をさらに含む。

後期エンドソームの標的は、タンパク質の細胞質尾部に存在するシグナルにより介在され、２ロイシンベースの（ｄｉｌｅｕｃｉｎｅ−ｂａｓｅｄ）［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］又はＤＸＸＬＬモチーフ（例えば、ＤＸＸＸＬＬ）、チロシンベースのＹＸＸｒｙモチーフ又はいわゆる酸性クラスターモチーフ等のよく同定されているペプチドモチーフに対応する。φはかさ高な疎水性側鎖をもつアミノ酸残基を表す（イソロイシンＩｌｅ，ロイシンＬｅｕ等）。後期エンドソームの標的配列により、ＭＨＣ様ＣＤ１分子による抗原由来ＮＫＴ細胞エピトープのプロセシングと効果的提示が可能になる。これは、３Ｄ構造を変化させ、エピトープ交換を最適化する促進された酸性環境で、搭載（cargoing）エピトープを後期エンドソームに移行させるＣＤ１ｂにとって特に興味深い。

単離ペプチド配列は、例えば、ＮＫＴ細胞生物学的技術による試験を行い、当該ペプチド配列がＮＫＴ細胞応答を誘導するか否かが決定される。ＮＫＴ細胞応答を誘導することが見出されたペプチド配列は、ＮＫＴ細胞刺激活性があると定義される。ヒトＮＫＴ細胞刺激活性は、腫瘍由来抗原に感作された個体から得られたＮＫＴ細胞を、病原体関連抗原、自己抗原、アレルゲン、感染性物質、又は治療目的で用いられる生物学的製剤で培養し、当該抗原由来のペプチド／エピトープでさらに試験でき、ＮＫＴ細胞が、ペプチド／エピトープに応答して増殖するか否かを、例えばトリチウム化チミジンの細胞取り込みを測定して、判定しうる。ＮＫＴ細胞のペプチド／エピトープに対する応答の刺激指数は、対照ＣＰＭで除算したペプチド／エピトープに対する応答の最大ＣＰＭとして算定しうる。バックグラウンドレベルの１．５倍以上のＮＫＴ細胞刺激指数（Ｓ．Ｉ．）が「陽性」とみなされる。すなわち、ＳＩがバックグラウンドレベルの１．５倍未満であれば、「低」とみなす。陽性結果を用いて、試験したペプチド／エピトープグループについて各ペプチド／エピトープの平均刺激指数が算定される。

本発明の免疫原性ペプチドの平均ＮＫＴ細胞刺激指数は、好ましくは２．０以上である。ＮＫＴ細胞刺激指数が２．０以上である免疫原性ペプチドは、予防又は治療剤として有用であると考えられる。より詳細には、本発明の免疫原性ペプチドの平均ＮＫＴ細胞刺激指数は、少なくとも２．５、少なくとも３．５、少なくとも４．０、又は少なくとも５．０である。極めて多くの個体のＮＫＴ細胞は単一又は少数のエピトープを認識するはずであるため、グループ１のＣＤ１分子に有意な多型がないことで、本工程は容易となる。

非天然又は修飾ＮＫＴ細胞エピトープは、さらに、場合によっては、グループ１のＣＤ１分子に対する結合親和性を試験しうる。

例えば、微細マッピング技術で最適ＮＫＴ細胞エピトープが決定されるが、それは、Ｔ細胞刺激活性があり、すなわちＴ細胞生物学的技術により決定される少なくとも１のＴ細胞エピトープを含むペプチドを、ペプチドのＮ末端又はＣ末端におけるアミノ酸残基の付加又は欠失により修飾し、当該修飾ペプチドに対するＮＫＴ細胞反応性を試験してその変化を測定するものである。ＮＫＴ細胞の活性化の程度を評価する他の方法としては、過剰増殖がない場合はＴＣＲ結合の評価に依存し、これは当該結合直後におこるＮＵＲ７７のリン酸化の程度を測定することによる。ＮＫＴ細胞は、強直性刺激によるシナプス形成に応答しうるが、これは、ＮＵＲ７７リン酸化が測定されて、対照実験で得られた値の１．２倍以上が陽性とみなされる。すなわち、リン酸化の対照値の１．２以下が低指数とみなされる。

一態様では、本発明による免疫原性ペプチドを単離末梢血細胞と接触させて血液試料をインビトロで刺激し、かつ、当該刺激された細胞群の増殖を、より具体的には、ＩＬ−７及び比率が異なるＩＬ−２及びＩＬ−１５の存在下で行う方法が提供される。本発明の方法では、腫瘍関連抗原、病原体関連抗原、自己抗原、アレルゲン、感染性物質、又は治療目的で用いられる生物学的物質に特異的なＮＫＴ細胞がより多量に作製されるという利点がある。

あるいは、ＮＫＴ細胞は、本明細書に関する免疫原性ペプチドを被験体（ヒト又は（天然又は外因性の）グループ１のＣＤ１分子を発現する抗原提示細胞がある非ヒト哺乳動物）へ投与し、インビボで生成されたＮＫＴ細胞を回収して、インビボで生成されうる。

上記方法で得られる腫瘍抗原特異的ＮＫＴ細胞が腫瘍関連疾病の罹患及び／又は死亡を抑制する治療に用いられることは特に興味深い。このことは、腫瘍に罹患した患者は自然発生的又は治療の結果として免疫不全状態にあることが多く、直接ワクチン接種に反応できないために特に重要である。上記方法で得られる病原体関連抗原特異的ＮＫＴ細胞はまた、ウイルス、細菌又は寄生虫の感染に関連する疾病の対象への罹患及び／又は死亡を治療又は予防（のための製剤の製造）に用いうることが特に興味深い。

自己抗原に特異的なＮＫＴ細胞は、天然又は翻訳後修飾された形態で、被験者の自己抗原に対する免疫応答に関連する病的状態及び／又は発症を治療する、自己免疫疾患の治療（のための医薬の製造）に用いられる。被験者が慢性曝露されるアレルゲン又は感染性因子により産生される抗原に特異的なＮＫＴ細胞は、当該慢性曝露から生じる、病的状態及び／又は発症を伴う炎症反応の治療（のための製剤の製造）に用いられる。治療目的で用いられる生物学的製剤に特異的なＮＫＴ細胞は、生物学的製剤が投与されなければ病的状態及び／又は発症に至るのにもかかわらず当該生物学的製剤に対する免疫応答を惹起してしまった被験体の治療（のための製剤の製造）に用いられる。

本発明の免疫原性ペプチドの上記使用について、当該ペプチドは当該ＮＫＴ細胞に置換されうる。同種細胞と自家細胞を用いてよい。

本発明はまた、ペプチド−ＣＤ１複合体（ＮＫＴＣＲ Ｔ細胞）に特異的な抗原受容体を担持するＴ細胞群及びＣＡＲ ＮＫＴ細胞に関する。ＮＫＴＣＲ Ｔ細胞は、ＮＫＴ系Ｔ細胞、又はクラスＩ拘束性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞、又はクラスＩＩ拘束性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞に属するＴ細胞から構成される。当該細胞は抗原特異的ＮＫＴ細胞から得られた受容体を発現した。さらに、本発明はまた、標的細胞（ＣＡＲ ＮＫＴ細胞）により発現される表面分子に特異的な抗体を担持するように操作されたＮＫＴ細胞群に関する。

ＮＫＴＣＲ Ｔ細胞は、好ましくは、腫瘍及び細胞内病原体感染の治療に用いられ、この場合、細胞溶解性又は細胞傷害性表現型が好ましく、例えば、ＮＫＴ細胞のクラスＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞があげられる。自己免疫疾患、アレルギー性疾患、慢性炎症、又は小胞体ストレスにより特徴付けられる症状等の調節機能が必要な状態へ適用するため、クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞、天然調節性Ｔ細胞、又は調節性ＮＫＴ細胞等の非細胞傷害性表現型が好ましい。ＣＡＲ ＮＫＴ細胞は、好ましくは、腫瘍及び細胞内病原体感染の治療に用いられる。

本発明はまた、本発明の免疫原性ペプチドをコードする核酸配列及びその使用のための、例えば組換え発現又は遺伝子治療のための方法に関する。特に、当該核酸配列は本発明の免疫原性ペプチドを発現しうる。本発明の免疫原性ペプチドは、適当な遺伝子治療法が必要な被験体に投与され得る。腫瘍、細胞内病原体、自己抗原、アレルゲン、感染性物質への慢性曝露、又は治療目的で用いられる生物学的製剤に関連する罹患／死亡を予防する本発明のいかなる使用又は方法においても、本発明の免疫原性ペプチドは、養子細胞移入と組み合わせて免疫化されてよい。当該組み合わせにおいては、前記免疫化、養子細胞移入及び遺伝子治療は、可能ないかなる組み合わせで同時に又は連続的に逐次的に用いられうる。

当業者にとって、遺伝子治療に用いられるペプチド又はポリペプチドは、当該ペプチド又はポリペプチドが由来する完全な抗原の一部でありうることは明らかである。

本発明の製剤は、しばしば、活性成分として、少なくとも１の本発明の免疫原性ペプチド、免疫原性ペプチドに特異的なＮＫＴ細胞（群）、又は当該免疫原性ペプチドを発現しうる遺伝子治療ベクターを含む（医薬）製剤であるが、必ずしもその必要はない。

〔グループ１のＣＤ１分子を発現する細胞形質移入体の作製〕
ヒト子宮頸がん細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２細胞株）由来ＨｅＬａ細胞は、β２ミクログロブリンの配列及びグループ１のＣＤ１分子の配列を含む構築物で形質移入された。β２ミクログロブリンとＣＤ１の同時形質移入により、細胞表面での機能的受容体及び形質移入細胞が特異的抗ＣＤ１抗体との反応で検出され、培養液中で増殖される。

ＨｅＬａ細胞は、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子をほとんど又は全く発現しない。ＣＤ１拘束性分子の提示に用いる場合、クラスＩＩ ＭＨＣ分子に対する抗体を培養液に加えうる（実際的応用については以下参照）。

ＨｅＬａ細胞によるクラスＩ ＭＨＣ分子の発現は、短いヘアピン型ＲＮＡ （ｓｈＲＮＡ）を用いて抑制されたが、それにより細胞分裂中のノックダウンは安定化された。さもなければ、クラスＩ ＭＨＣ分子の機能は、細胞培養中にクラスＩ特異的抗体を添加することで一時的に抑制されうる（実際的応用については以下参照）。

ＣＤ１分子の表面発現に特異的な抗体を用いた細胞の培養及び当該細胞の選択により、グループ１のＣＤ１分子（ＣＤ１ａ，ＣＤ１ｂ又はＣＤ１ｃ）を発現する細胞株が得られる。

〔ＮＫＴ細胞群〕
グループ１のＣＤ１分子はマウスでは発現しないため、全ての実験はヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られた細胞を用いて行った。

腫瘍に罹患した患者等のより例外的な状況下では、細胞はまた、手術又は生検で得られた組織試料、又は胸膜又は腹膜等の体液貯留物から得られうる。

ヘパリン化血液から得られたＰＢＭＣでは、抗ＣＤ１９磁気ビーズの負の選択によりＢリンパ球が除去された。その後、残存細胞はＣＤ３受容体の発現で正に選択される。当該群は、クラスＩ ＭＨＣ及びクラスＩＩ ＭＨＣで制限された細胞、及びＣＤ１拘束性細胞を含む。

〔Ｔｐ５３に対するＣＤ１ｂ拘束性ＮＫＴ細胞の作製と特徴付け〕
腫瘍関連転写因子特異的、かつ、ＣＤ１ｂ分子拘束性ＮＫＴ細胞群を作製し、その腫瘍細胞の認識能及び除去能を評価した。

その後、組換えＴｐ５３タンパク質を、ＣＤ１ｂ分子が形質移入されたＨｅＬａ細胞とともに培養液中で３７℃１６時間培養する。その後、当該細胞を洗浄して、実施例２で得られたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞及びＩＬ−７、ＩＬ−２及びＩＬ−１５の存在下で培養する。培養６日後、ＣＤ３＋Ｔ細胞をウェルに移すが、当該ウェルには組換えＴｐ５３と前培養された新しいＣＤ１ｂ形質移入体のグループが含まれ、ＩＬ−２及びＩＬ−１５の存在下で活性化第２サイクルが行われる。本手順を計５サイクル繰り返す。

その後、ＣＤ３＋増殖細胞群を、マスター転写因子ＰＬＺＦを含むＮＫＴ系に特異的なマーカーの存在について特徴付ける。細胞は、ＣＤ４及び／又はＣＤ８補助因子の発現についても特徴付けられる。これは、従来型の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で行われる。必要であれば、細胞群は、磁気ビーズを用いて、単一の補因子発現細胞（ＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞）にさらに分離しうる。通常は、ダブルネガティブ（ＣＤ４−ＣＤ８−細胞）群が獲得される。

２０アミノ酸長のペプチドは、５アミノ酸の重複で、Ｔｐ５３の全配列をカバーする化学合成で作製される。

ＣＤ１ｂが形質移入されたＨｅＬａ細胞を、通常はＴｐ５３の異なる領域から選択された５つのペプチドの混合物と１６時間以上培養する。その後、細胞を洗浄し、上記で得られた増殖ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞群の存在下で、バルク群又は補因子発現のパターンで分離された単一群として培養する。

３日後、Ｔ細胞の増殖を、チミジン取り込み、又は、適宜特異的抗体を用いたリン酸化ＮＵＲ７７の検出で評価する。その後、増殖細胞（又はリン酸化形態のＮＵＲ７７を発現する細胞）を段階希釈液に供し、単一のＴｐ５３ペプチドを含むＣＤ１ｂ−形質移入ＨｅＬａ細胞の存在下で再培養する。当該実験は増殖速度に応じて、クローン性が評価される時点まで数回繰り返しうる。

その後、エピトープ活性化ＮＫＴ細胞を含むペプチド（配列番号１）の配列を、さらに、当該エピトープの隣接残基内に位置する増強モチーフと共に合成して作製する。好ましいモチーフはＣＤ８補助因子（配列番号２）の相補的配列を含み、それにより細胞傷害性特性が亢進されたＮＫＴ細胞の群を選択し、増殖する。

その後、Ｔｐ５３エピトープ及びＣＤ８の相補的配列を含むペプチド（配列番号２）を、循環単球由来のヒト樹状細胞とともにインビトロで用いる。端的には、単球は、抗ＣＤ１４抗体にカップリングした磁気ビーズを用いてＰＢＭＣで調製する。次に、単球を、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦと共に３〜６日間培養して樹状細胞に変化させた後、ＴＮＦ−αを公知の方法で添加してさらに一晩培養する。樹状細胞をＴＰ５３−ＣＤ８ペプチドと一晩培養した後、洗浄し、上記で得られたＮＫＴ細胞の存在下でさらに培養する。ＮＫＴ細胞の増殖（又はＮＵＲ７７リン酸化の速度）は、提示細胞がＭＨＣ及びＭＨＣ様分子の全アレイを発現する条件下でエピトープが提示される根拠となる。さらに、全長組換えＴｐ５３を用いて実験を繰り返し、タンパク質のプロセシングが予想されるエピトープの提示が得られたことを確認する。

腫瘍の治療における当該ＮＫＴ細胞の適用可能性を評価するため、ＮＯＧマウス（ＣＤ３＋Ｔ細胞非存在）にヒト腫瘍細胞を移植（engrafted）して、当該細胞の受動移入によりＮＫＴ細胞の腫瘍除去能を評価する。すなわち、腫瘍細胞は、ヒト腫瘍で頻繁に起こる事象である、高濃度のＴｐ５３を発現するものとして選択される。当該腫瘍におけるＴｐ５３の配列はｑＰＣＲで判定され、ＮＫＴ細胞特異的なエピトープを変化させる変異が生じないことが確実となる。必要であれば、ＣＤ１分子の表面発現を亢進することが知られるヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、非特許文献４を参照）で腫瘍を治療しうる。腫瘍細胞（±２００，０００）の移植は、経時的に腫瘍の大きさを測定しうるように皮下で行う。その翌日にＮＫＴ細胞（１〜５×１０^６）を静注する。その後は毎日腫瘍増殖を測定して、経時的にマウスを追跡し、倫理的に正当化された場合には殺処分する。腫瘍細胞を回収し、壊死の徴候を分析しうる。

〔Ｔｐ５３を発現するヒト腫瘍細胞での直接増殖によるＣＤ１ｂ拘束性ＮＫＴ細胞の作製及び特徴付け〕
ヒト乳がん由来細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、Ｔｐ５３のＡｒｇ２８０Ｌｙｓ突然変異があり、当該タンパク質レベルを高めるが、市販の供給者（ＡＴＣＣ）から入手され、上記のようにトリコスタチン−Ａ等のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養し継代される（非特許文献４）。

実施例３で得られたＴｐ５３特異的ＮＫＴ細胞クローンを、ＩＬ−２及びＩＬ−１５の存在下で細胞系培養物に添加して６日間培養した後、非接着性ＮＫＴ細胞を回収して、新鮮な細胞系群に添加する。刺激を３〜５サイクル行う。

当該培養後に得られ、増殖された細胞を、ＰＬＺＦの発現等のＮＫＴ系の標準的マーカーの発現について特徴付け、ＦＡＣＳを用いてＮＫＴ系に関連する補因子及び表面分子の発現についてさらに特徴付ける。

他の実験では、腫瘍細胞株を、対応する腫瘍に罹患した患者のＰＢＭＣから得られたＣＤ３＋細胞の存在下で共培養する。その後、ＮＫＴ細胞クローンが得られるまで、当該ＣＤ３＋Ｔ細胞を実施例３に記載のように増殖する。

当該実験により、ヒト腫瘍細胞株がＴｐ５３由来のエピトープに関連するＣＤ１ｂ表面分子を発現し、当該発現は末梢血から得られたＴｐ５３特異的ＮＫＴ細胞を活性化するのに十分であることが示される。

〔Ｔｐ５３の翻訳後修飾を発現するヒト腫瘍細胞上での直接増殖によるＣＤ１ｂ拘束性ＮＫＴ細胞の作製及び特徴付け〕
Ｔｐ５３の翻訳後変化にはユビキチン化を含む多数の報告がある。これは、基本的にはＭＤＭ２タンパク質であり、Ｔｐ５３の主要な抑制因子であり、ＭＤＭ２に負のフィードバックを及ぼすユビキチンタンパク質リガーゼにより行われる。ＭＤＭ２は多くの腫瘍で過剰発現され、Ｔｐ５３の過剰ユビキチン化をもたらす。ユビキチン化はタンパク質をプロテアソームに指向し、プロテアソームで消化されたペプチドは小胞体とトランスゴルジ体に取り込まれて細胞表面に発現する。

ＭＤＭ２の過剰発現を示す食道がん細胞株を培養して継代する。
高濃度のユビキチン化Ｔｐ５３の存在は、特異的抗体を用いて検出される。がん細胞株を、実施例３で得られたＣＤ１ｂ拘束性ＮＫＴ細胞と共培養し、実施例３に記載のＮＵＲ７７のチミジン取込み又はリン酸化についてＮＫＴ細胞の活性化を評価する。

マイクロＲＮＡ−６６１（ｍｉＲ−６６１）は、ＭＤＭ２ ＲＮＡを特異的に標的とする。がん細胞株のｍｉＲ−６６１を一過性形質移入すると、ＭＤＭ２の発現が抑制され、Ｔｐ５３の機能が亢進し、Ｔｐ５３のユビキチン化が低下し、プロテアソーム分解が低下し、ＣＤ１ｂの細胞表面提示が低下し、ＮＫＴ細胞の活性化が低下する。

当該実験は、翻訳後修飾（すなわち、ユビキチン化）Ｔｐ５３の濃度を高めるヒト腫瘍細胞株が、Ｔｐ５３特異的ＮＫＴ細胞の活性化を高めることを示す。

〔ＮＫＴＣＲ Ｔ細胞の作製〕
実施例３で作製された抗Ｔｐ５３ ＮＫＴ細胞クローンの配列をｑＰＣＲで判定する。対応するＤＮＡを調製して、ＣＤ３欠失クラスＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞に形質移入した。形質移入は、例えば、非特許文献５に記載の遺伝子パルサ／マイクロパルサエレクトロポレーションキュベット（ＢＩＯ−Ｒａｄ）及び方法を用いて行った。

ＣＤ８＋Ｔ細胞群は、Ｔｐ５３＋腫瘍の治療が必要な患者の末梢血から、まず特異的抗体にカップリングされた磁気ビーズを用いてＢリンパ球（抗ＣＤ１９抗体）及び単球（抗ＣＤ１４抗体）を除去した後、抗ＣＤ８抗体を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を正に選択する。

その後、形質移入されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、クラスＩ拘束性Ｔ細胞の完全な細胞傷害装置があるＣＤ１ｂ分子が提示しうるＴｐ５３のエピトープを認識しうる。
その後、当該細胞を、Ｔｐ５３＋腫瘍に罹患した患者への受動投与に用いる。

〔マイコバクテリア感染の治療のためのＣＤ１ｂ拘束性ＮＫＴ細胞の作製と特徴付け〕
マクロファージはマイコバクテリウムの主要な保有宿主であり、感染の制御には当該感染マクロファージを特異的に認識して排除する必要がある。ヒトマクロファージを非病原性のマイコバクテリウム株で感染させ、ＮＫＴ細胞源と培養し、当該ＮＫＴ細胞の感染マクロファージ排除能を評価する。

マクロファージは、２０％自己血清を含むＲＰＭ−１６４０培養液中で５日間培養されたＰＢＭＣ培養物から得られる。組織培養プレート上に２時間平板培養して付着細胞を回収し、非付着細胞を洗浄した。

当該マクロファージへの感染にはＭ．ｔｂ Ｈ３７Ｒｖ株（ＡＴＣＣ ２５６）等のマイコバクテリウムの非病原性株が用いられる。感染マクロファージの長期培養は、１０％の自己血清を含むＲＰＭＩ中の単層培養として確立される。

感染マクロファージ群を、ＮＫＴ細胞、すなわち、実施例２に記載したＰＢＭＣから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞の供給源と共に培養する。注目すべきことは、グループ１のＣＤ１分子には多型がないことから、遺伝的に無関係な個体から得られたＮＫＴ細胞を検査するのに、単一のマクロファージグループを用いうることである。

当該培養物中で増殖する細胞は、実施例３で記載されたＴｐ５３の方法と同様の方法により、マイコバクテリウム感染マクロファージへの周期的曝露により増殖される。好ましい設定では、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ決定基に対する抗体を培養中に中和化させると、対応するクラスＩ又はクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞の増殖が最小限に抑えられる。

得られたＮＫＴ細胞を、単一の組換えマイコバクテリウム由来タンパク質と培養したＣＤ１ｂ形質移入細胞に適用する。初期分泌抗原（ＥＳＡ）は、抗体と細胞応答をともに誘導することが知られているマイコバクテリアのうち最も免疫原性の高いタンパク質の１つである。すなわち、組換えＥＳＡを用いて、ＣＤ１ｂで形質移入された細胞を処理して刺激サイクルに供する。

あるいは、ＣＤ１ｂ形質移入細胞を、マイコバクテリウム由来タンパク質をコードするＤＮＡ構築物でさらに形質移入する。この代替法により、組換体が利用できないタンパク質を評価でき、マイコバクテリア由来の脂質又は糖脂質に応答するＮＫＴ細胞が除去されうる。

さらに、マイコバクテリウム由来タンパク質の配列を反復する重複ペプチドが作製され、当該ペプチドがＣＤ１ｂ形質移入細胞に適用される。
当該方法は、細胞数及び培養時間を含み、実施例３に記載されたＴｐ５３タンパク質に関する方法と本質的に類似する。

最終的な結果は、ＣＤ１ｂ分子で制限された、マイコバクテリアのペプチドエピトープに特異的なＮＫＴ細胞群である。実施例３の記載のように、その後、細胞を特徴付け、培養により増殖させる。

その後、対応するＣＤ１ｂ制限エピトープ（配列番号３）を、ＴＬＲ９のアゴニストとしてＣｐＧモチーフを含む配列と共に化学合成で作製する。すなわち、オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）配列（配列番号４）は、配列番号４のペプチドのカルボキシ末端で共有結合的に結合し、配列（１分子中配列番号３＋配列番号４）のペプチド−ＯＤＮを生成する。

その後、ペプチド−ＯＤＮを実施例３で調製された樹状細胞による提示に用いて、実施例２に記載のように、末梢血から得られたＣＤ３＋Ｔ細胞の調製物と細胞を培養する。ＮＫＴ細胞の活性化は、チミジン取り込み又はＮＵＲ７７リン酸化で評価する。

ＮＯＧマウスをマイコバクテリウム株に感染させ、マウス群をＮＫＴ細胞受動投与（通常、マウス当たり２×１０^５細胞）した後にマイコバクテリア負荷を経時的に評価して、ヒト抗マイコバクテリウムＮＫＴ細胞のインビボ適用可能性を評価する。

〔ＣＤ１ｃに制限されたミエリン特異的ＮＫＴ細胞の作製と特徴付け、及びオリゴデンドロサイトによるミエリン形成に対する効果の評価〕
ヒト乏突起膠細胞（ＯＤＮ）細胞株は、ＣＤ１ｃ拘束性ＮＫＴ細胞群を誘発する種々の培養条件下で用いられ、当該細胞ミエリンの作製の調節能を特徴付ける。

ヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）（Ａ２Ｂ５＋ＯＰＣ）は商業的供給業者から入手される。ＯＰＣは、成熟ＯＰＣでの分化を獲得すべく、Ａ２Ｂ５抗原及びＰＧＤＦＲａに対する抗体でコーティングされたマイクロビーズで調製する。

ＯＰＣ細胞株を培養継代し、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）の特異的ＥＬＩＳＡ又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）産生能を経時的に評価する。例えば、タプシガルギン又はツニカマイシンの添加等の小胞体ストレスを高める条件下で並行培養を行う。ＯＰＣ細胞株はその表面に、特異的抗ＣＤ１抗体で検出されるＣＤ１分子を発現することが示される。

ＯＰＣ細胞株を実施例２に記載されたＰＢＭＣから調製したＮＫＴ細胞源と共に培養する。培養３日後に非接着細胞を回収し、洗浄し、同条件で新鮮なＯＰＣ細胞株と再培養する。刺激サイクルを３〜４回繰り返す。その後、非接着細胞を回収し、洗浄し、その表現型を特徴付ける。並行実験の培養工程は、クラスＩ及びクラスＩＩ分子に対する抗体の存在下で行う。

当該培養条件で回収した細胞を、ＰＬＺＦの発現を含むＮＫＴ系に特徴的なマーカーの存在について分析する。

さらなる細胞の調製を、その後、実施例１の記載で得られたＣＤ１ｃ形質移入体の存在下で培養し、組換えＭＯＧタンパク質の担持後にＭＯＧタンパク質由来のエピトープを提示して行う。Ｔｐ５３特異的ＮＫＴ細胞について実施例３で特定された条件下で３〜４サイクルの刺激を行う。当該刺激サイクル終了時に得られた細胞群を、ＮＫＴ細胞に特有の表現型マーカーについて分析する。

その後、ＭＯＧに対する特異性を、実施例３に記載の漸進的アプローチにおいて当該ＭＯＧタンパク質の配列と重複するペプチドの混合物を用いて評価する。

ＮＫＴ細胞で認識されるエピトープを包含するペプチドは化学合成で作製される。適当なエピトープを含む１のペプチドは、さらに（配列番号４）のように作製されるか、又は隣接残基内に位置し、ＣＤ４補因子に対する抗体の可変部（配列番号６の末端）の配列を含む増強モチーフを含む。

従って、エピトープ及び増強モチーフの全配列は配列番号６である。

上記のよう得られたＮＫＴ細胞クローンは、配列番号５のペプチド、又はＣＤ４補因子（配列番号６）の相補的配列を含むペプチドを予め含むヒト単球由来樹状細胞との培養で用いられる。新鮮な樹状細胞に毎回３〜４サイクルの刺激を行った後、非接着細胞を回収し、その表現型について特徴付ける。

その後、ＮＫＴ細胞のクローンをヒトＯＰＣ細胞株と培養し、ミエリンの主成分であるＰＬＰ又は主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）についてのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでミエリン産生回復能を分析する。

ＮＯＧマウスをＯＤＮ細胞株で再構成した後、ＮＫＴ細胞クローンを静脈内投与し、ＥＬＩＳＡで評価されたヒトミエリンを作製する。

〔ＧＡＤ６５に特異的なＣＤ１ｃ拘束性ＮＫＴ細胞の作製と特徴付け、及びランゲルハンス島ｂ細胞のインスリン産生に対する効果の評価〕
インスリンを産生するヒトβ細胞株を異なる培養条件下で用いて、ＣＤ１ｃ拘束性ＮＫＴ細胞群を誘導させて、当該細胞のインスリンの産生調節能を評価する。

ヒトβ細胞株Ｂｌｏｘ５（非特許文献６）を継代培養し、インスリン産生能を特定のＥＬＩＳＡで経時的に評価する。並行培養は、実施例８で小胞体ストレスが亢進された条件下で行う（非特許文献７も参照)。細胞株は表面にCD1分子を発現し、特異的抗CD1抗体で検出されることが示される。

細胞系を、実施例２に記載のようにＮＫＴ細胞の供給源としてヒトＰＢＭＣと共に、実施例８に記載の方法で培養する。

当該培養条件から回収した細胞を、ＰＬＺＦの発現を含むＮＫＴ系に特徴的なマーカーの存在について分析する。

その後、当該ＮＫＴ細胞を実施例１に記載のＣＤ１ｃ形質移入体細胞株と培養する。この場合、形質移入体を、最初に、その全長又は５アミノ酸が重複するタンパク質の全配列を含む２０アミノ酸長ペプチドの混合物として、ＧＡＤ６５と共に培養する。いくつかのエピトープはパルミトイル鎖又はミリストイル鎖等のアルキル鎖を含むように修飾され、小胞体ストレスに伴うＧＡＤ６５のように変化する。

３〜４サイクルの刺激後に得られたＮＫＴ細胞群を、表現型マーカーについて分析する。

ＮＫＴ細胞で認識されるエピトープを包含するペプチドは化学合成で作製され、刺激アッセイに用いられる。ＣＤ１ｃで制限されるエピトープ（配列番号７）を包含する１のペプチドが合成され、隣接残基内に位置し、ＣＤ４補因子に対する抗体の可変部の配列を含む増強モチーフを含む、配列番号８の全配列が得られる。当該ペプチドは、当業界で公知の方法を用いて、チオエステル結合（配列番号９のペプチド）の形成により、配列番号８のペプチドの２位のＣｙｓのパルミトイル化によりさらに修飾される。

上記のよう得られたＮＫＴ細胞クローンを、配列番号９のペプチドを予め含むヒト単球由来樹状細胞と共に培養する。新鮮な樹状細胞に３〜４サイクルの刺激を行った後、非接着細胞を回収し、その表現型について特徴付ける。

その後、ＮＫＴ細胞のクローンをヒトβ細胞株と培養してインスリン産生回復能を分析する。

本実施例では、インスリン産生の制御は、ＧＡＤ６５特異的ＣＤ１ｃ拘束性ＮＫＴ細胞に依存的であるが、ＧＡＤ６５は、β細胞株からグルタミン酸をγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）に変換する表面アンカー酵素としても産生されるため、β細胞に対する保護作用が発揮されて、β細胞表面受容体ＧＡＢＡＲに結合した後にインスリン産生能が発揮される。ＧＡＤ６５の表面発現は、特異的抗体を用いて評価される。

ＮＯＧマウスは、小胞体ストレスが亢進する条件でβ細胞株により再構成された後、ＮＫＴ細胞クローンを静脈内投与し、ＥＬＩＳＡでヒトインスリンの産生を検出する。

〔イエダニ由来アレルゲンＤｅｒ ｐ１特異的ＣＤ１ａ拘束性ＮＫＴ細胞の作製と特徴付け、及びＣＤ１ａ分子の遺伝子導入で作製された実験マウスモデルの喘息調節に対する効果の評価〕
アセチルコリンの吸入に対する気道反応性の亢進と定義される気管支喘息は、アレルゲンの吸入により気管支上皮レベルで生じる炎症性変化で誘発される。上皮細胞は、炎症誘発性分子やケモカインを産生し、気道過敏性を亢進させる。当該事象はＣＤ１ａ拘束性ＮＫＴ細胞に制御されて、気道過敏性が低下する。

実施例１で得られたＣＤ１ａ発現形質移入体細胞を、実施例２で得られたヒトＣＤ３＋ ＰＢＭＣ群と組換えＤｅｒ ｐ１と共に培養する。Ｉｌ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５の存在下で刺激を３〜４サイクル行った後、ＮＫＴ細胞の存在を、表現型判定及び標準的転写因子ＰＬＺＦの発現で評価する。

その後、Ｄｅｒ ｐ１特異的ＮＫＴ細胞群を、Ｄｅｒ ｐ１の全配列を包含する２０アミノ酸長のペプチドを予め含むＣＤ１ａ−形質移入体細胞と培養し、刺激サイクルを３〜４回繰り返す。その後、単一のエピトープと反応するクローンを増殖させる。

ＣＤ１ａ拘束性エピトープを含むペプチドは合成により作製される。ＣＤ１ａ拘束性エピトープを包含するペプチド（配列番号１０）を選択し、Ｃ−ＸＨ−Ｃ体のチオレドックスモチーフを含む増強モチーフを用いて作製するが、ここでＣはプロトン交換体としてのシステインを、Ｈはプロトン交換体としてのヒスチジンを示し（配列番号１１）、配列番号１２の全長ペプチドが得られる。

ＣＤ１ａ分子を発現するマウス系を用いて、従来方法を用いて喘息モデルを開発した。当該マウス系を得る方法は、当業界で知られている。

端的には、マウスを、ミョウバンに吸着させたＤｅｒ ｐ１（１００μｇ）の単回腹腔内注射で感作し、１週間後、生理食塩水（１０μｇ／投与）中のＤｅｒ ｐ１の鼻腔内投与を３回行う。当該条件下で、マウスは、身体プレチスモグラフ（非特許文献８を参照）で測定される、アセチルコリン吸入に対する過剰反応を発現する。

当該マウスは、腹腔内感作後及びアレルゲンの鼻腔内投与前に、抗Ｄｅｒ ｐ１ ＮＫＴ細胞（マウス当たり２×１０^５細胞）の静脈内投与により再構成される。

その後、配列番号１２に特異的なＤｅｒ ｐ１特異的ＮＫＴ細胞の気管支過敏性の予防能を身体プレチスモグラフで測定し、アセチルコリン濃度の吸入亢進を評価する。

〔感染性因子タンパク質に特異的ＣＤ１ａ拘束性ＮＫＴ細胞の作製と特徴付け、及びＣＤ１ａ分子が遺伝子導入された実験マウスモデルの慢性気道炎症の制御に対するＣＤ１ａ拘束性ＮＫＴ細胞の効果の評価〕
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＨＩ）は小型グラム陰性球桿菌であり、気道の慢性コロニー形成の原因で、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に罹患した患者の有意な悪化因子となり、慢性炎症及び組織破壊をもたらす。この炎症はしばしばインフルエンザウイルスの存在下で悪化し、主として先天性免疫応答に起因すると考えられる。

ＣＤ１ａ制限Ｂ型ＨＩ（ＨＩｂ）特異的ＮＫＴ細胞を開発し、気管支及び肺の炎症性浸潤の制御を評価する。

実施例１で得られたＣＤ１ａ発現形質移入体細胞を、ＨＩ型でも高度に保存された抗原であるＨＩｂの２６−ｋＤａ外膜タンパク質（ＯＭＰ２６）と培養し、実施例２に記載のＰＢＭＣから得られたヒトＣＤ３＋細胞群の存在下で培養する。３〜４サイクルの刺激後、ＣＤ３＋Ｔ細胞群を、ＰＬＺＦ転写因子の発現を含むＮＫＴ系のマーカーについて評価する。

得られたＯＭＰ２６の全配列を包含するペプチドは、平均２０アミノ酸長で５アミノ酸が重複する。当該ペプチドは、ＣＤ１ａ形質移入体細胞を挿入するのに用いられ、上記のように、ＮＫＴ細胞群の存在下でさらに培養される。３〜４サイクルの刺激後、ＮＫＴ細胞は表面表現型、サイトカイン産生及びトランスクリプトームについて特徴付けられる。

配列（配列番号１３）の当該ペプチドは、当該ＣＤ１ａ拘束性ＮＫＴ細胞を活性化し、当該エピトープのアミノ末端及びカルボキシ末端の隣接残基に１のシステインが挿入される合成で作製される（配列番号１４）。

実施例１０に記載のＣＤ１ａ分子を発現するマウス株（Ｃ５７ＢＬ／６）を用いて、ＯＭＰ２６に特異的なＮＫＴ細胞の気道炎症制御能を評価する。マウスへの低病原性インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ８）の鼻腔内塗布から３日後に１０５ ＣＦＵのＨＩｂを鼻腔内塗布する。気道で炎症の程度を測定し、肺及び気管支樹における炎症細胞の浸潤を評価する。

当該マウスを、ＨＩｂの鼻腔内塗付前又はその１日後に、ＯＭＰ２６特異的ＣＤ１ａ拘束性ＮＫＴ細胞で再構成し、細胞投与の効果を肺及び気管支樹の炎症で評価する。当該再構成により慢性炎症細胞浸潤の徴候が緩和されることが示される。

〔酸性αグルコシダーゼ（ＡＡＧ）はＣＤ１ｂ拘束性エピトープの除去で非免疫原性となる〕
酸性αグルコシダーゼ（ＡＡＧ）はポンペ病で機能的に欠損し、乳児型疾患では早期死亡、遅発型疾患ではグリコーゲンの進行性蓄積と筋機能障害をもたらす。しかしながら、組換えＡＡＧを投与すると、免疫応答のためにそれ以上酵素が使用できなくなる。

実施例１で作製されたＣＤ１ｂ−形質移入体細胞を、組換え型のヒトＡＡＧ（配列番号１５）と共に３７℃で一晩培養し、洗浄し、実施例２に記載のＰＢＭＣから得られたヒトＣＤ３＋細胞の存在下で培養する。３〜４サイクルの刺激の後、ＣＤ３＋Ｔ細胞を培養物から回収し、表面マーカー及びＰＬＺＦの発現について評価する。

２０アミノ酸長のアミノ酸かつ５個のアミノ酸が重複したアミノ酸を用いて、ＡＡＧの９５２個のアミノ酸の全長アミノ酸配列を網羅するペプチドが合成される。当該ペプチドを用いて、ＣＤ１ｂ形質移入体細胞の挿入を行い、ＣＤ１ｂ形質移入体細胞を上記のようにＮＫＴ細胞群とさらに培養する。増殖中のＮＫＴ細胞をペプチド含有ＣＤ１ｂ形質移入体細胞で増殖させ、その表現型を評価する。

ＣＤ１ｂの提示に必要なアミノ酸を同定するために、ＣＤ１ｂ提示エピトープを包含するペプチドに変異を導入し、対応するＮＫＴ細胞クローンの増殖抑制で評価する。その後、必要な突然変異を当該完全タンパク質に適用する。

当該変異タンパク質のＮＫＴ細胞の活性化阻害能は、上記のようにＣＤ１ｂ形質移入体細胞を挿入してＮＫＴ細胞クローンと培養することで確認される。

配列番号１６の突然変異組換えＡＡＧの活性が試験される。

〔アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのクラスＩＩ拘束性エピトープによるワクチン接種により、ベクターに対する適応免疫応答が阻害されて、効果的な遺伝子治療が可能になる〕
増強モチーフを含むウイルスベクターＴ細胞エピトープによる前免疫により、その後のウイルスベクタータンパク質に対するＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の生成が妨げられる。

ＡＡＶベクターカプシドは３つのタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）からなり、遺伝子治療の業務で一般的に用いられる。しかしながら、当該ベクターは抗体及び細胞傷害性免疫応答をも誘導するため、その使用は著しく制限される。抗体及び細胞傷害性ＣＤ８＋細胞はいずれもクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化に依存するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を妨げることが遺伝子治療の安全かつ容易な実施につながることが示される。

マウスを、２×１０^１１のＡＡＶベクター粒子を含む５μｌの静脈内投与により処理し、脾臓を１０日後に回収する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ４抗体でコーティングされた磁気ビーズを含む、当業界で公知の方法を組み合わせて、脾細胞群から調製される。ＶＰ１カプシドタンパク質の７３５アミノ酸配列全体をカバーするペプチドは、２０アミノ酸長かつ５アミノ酸が重複したアミノ酸を用いた化学合成で作製される。当該ペプチドを、抗原提示細胞として採取された樹状細胞に挿入後、脾細胞ＣＤ４＋群を添加する。サイトカインの存在下で１０日間共培養を行い、ＡＡＶ特異的クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋エフェクター細胞を増殖させる。３サイクルの刺激を、ペプチドが挿入された新鮮な樹状細胞に行う。

ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するエピトープを含むペプチド（配列番号１７）は、チミジン取込みを評価して増殖マーカーとして特異的であることが確認される。その後、対象ペプチドは、エピトープ（配列番号１８）の両側の隣接領域に付加されたシステイン残基で作製された増強モチーフと共に、化学合成により作製される。

当該ペプチド（配列番号１８）をアジュバントとして、ミョウバンと共に、皮下経路で２週間おきに４回マウスに投与する。当該マウスの脾臓を最後の免疫化から１０日後に獲得し、ＡＡＶカプシドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を機能的分析で評価する。

この免疫化スケジュールにより得られたＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示の抑制及びクラスＩＩ拘束性レパートリーとCD1d拘束性レパートリーに属するバイスタンダーＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化制御を特徴とする調節活性を発揮することが示される。標的抗原提示細胞及びバイスタンダー活性化Ｔ細胞のアポトーシスは、これらに限定されないＴＩＧＩＴ−ＰＲＶ、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ４及びＦａｓＬ−Ｆａｓ相互作用を含む調節機構の組み合わせに起因する。抗原提示細胞及び抗原提示細胞の表面で活性化されたバイスタンダーＣＤ４＋Ｔ細胞上の抑制特性が組み合わされて、当該抑制活性がＡＡＶカプシドのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのアンサンブルに対する応答に作用することは注目すべきである。

その後、配列番号１８のペプチドで免疫化されたマウスに、１０^９のＡＡＶベクター粒子を直接静脈内投与で６週間ごとに２回投与する。当該マウスは、ＡＡＶ粒子の追加注射後でもＡＡＶベクターに対する免疫応答が始まらないことが示される。

〔セリアック病のトランスグルタミナーゼに特異的なクラスＩＩ拘束性調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞の作製と特徴付け〕
セリアック病は、グルテンの構成成分であるグリアジンに含まれるグルタミンが２型トランスグルタミナーゼによりグルタミン酸に変換されておこる自己免疫疾患である。当該グルタミン酸残基を含むクラスＩＩ拘束性エピトープは、ＤＱ２又はＤＱ８制限エレメントにより提示された場合、クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導する。グルテン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞により高濃度の抗グルテン抗体が産生されて、セリアック病が発症する。グルテンに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を除去すると、セリアック病が治癒することを意味する。

未感作のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ４＋抗体でコーティングされたマイクロビーズを用いて、ＤＱ２又はＤＱ８ハプロタイプのいずれかを有する対象の末梢血から得られる。当該細胞を、末梢血単球由来の自己樹状細胞と共に培養し、配列（配列番号１９）のペプチドを挿入して、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞を得る。

並行実験では、隣接残基内に増強モチーフを含む同じ配列のペプチドを用いる。従って、その隣接残基中に、ＣＤ４の第２細胞外ドメインに特異的なＣＤ４に対する抗体に由来する配列を含む配列（配列番号２０）のペプチドが生成される。

クラスＩＩ拘束性エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞を含む培養物中の樹状細胞に配列（配列番号２０）のペプチドを添加すると、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の調節活性が亢進する。当該活性としては、抗原提示樹状細胞及び同じ樹状細胞の表面で活性化されたバイスタンダーエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞のアポトーシスの誘導があげられる。

すなわち、グルテン特異的調節性ＣＤ４＋Ｔ細胞はグルテンに対する進行中の免疫応答を抑制し、セリアック病の治療に有用であることが示された。

〔デング熱ウイルス感染に対するワクチン接種のためのCD1d拘束性ＣＤ８＋ ＮＫＴ細胞の作製と特徴付け〕
デング熱ウイルスへの感染では、特に被験者が抗体依存性増強（ＡＤＥ）として知られる現象である第２ウイルス血清型に曝露されると、重篤な反応がおこりうる。従って、抗体のかわりに、感染細胞に対する細胞毒性がある細胞を誘導する戦略がより安全でありうる。

フラビウイルスの非構造糖タンパク質ＮＳ１タンパク質は、ＣＤ１ｄ分子により提示されうるエピトープを含む。タンパク質の全配列をカバーし、５アミノ酸が重複するペプチドを作製して同定に用いうる。その後、当該ペプチドを、実施例５に詳解された末梢血単球を変換して得られたヒト樹状細胞に添加して一晩培養する。その後、当該樹状細胞を、ＰＢＭＣから得られたＣＤ３＋リンパ球の存在下で培養する（実施例２参照）。対応する細胞の活性化を阻害するため、クラスＩ及びクラスＩＩ分子に対する抗体の存在下で培養を行う。

刺激サイクルを３〜４回行った後、ＣＤ３＋Ｔ細胞を回収し、標準的な転写因子であるＰＬＺＦの表現型及び発現を分析する。その後、細胞をさらに増殖させて、クローニングする。

配列番号２１のペプチドは、ＣＤ８補助因子の相補的配列の隣接残基中に含有物を含むように合成により作製され、樹状細胞による提示によりＮＫＴ細胞を刺激するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで用いられる。ＣＤ８補因子の相補的配列を加えると、ＮＫＴは細胞傷害性表現型に指向し、シナプスが形成された樹状細胞を排除する。

当該ペプチドは、すなわち、デング熱に罹患しやすい個人、特に初期デング熱血清型に曝露された、重度の全身性合併症の危険がある個人のワクチン接種への適用が考えられる。

Claims (15)

1. ペプチドエピトープのタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの選択的結合能を決定する方法であって、
   ａ） 表面にＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞を提供する工程、
   ｂ） 前記単離細胞に前記エピトープを選択的に適用する工程、
   ｃ） 前記エピトープを提示しうる工程bの前記細胞とＮＫＴ細胞を接触させる工程、及び
   ｄ） 前記ＮＫＴ細胞の活性化レベルを測定する工程、
   を含む、方法。
2. 前記エピトープが、単離されたタンパク質又はタンパク質若しくはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む合成ペプチドに由来し、前記タンパク質が腫瘍、細胞内病原体、自己抗原、生物学的タンパク質、アレルゲン又は慢性炎症をおこす製剤に由来し、かつ/又は、前記エピトープが翻訳後修飾アミノ酸を含み、好ましくは前記翻訳後修飾アミノ酸の疎水性が対応する非修飾アミノ酸の疎水性よりも高い、請求項1に記載の方法。
3. 前記請求項のいずれか1項に記載の方法により得られる、がん、細胞内病原体感染、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患に対するワクチン接種に用いられるペプチド。
4. エピトープのタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの結合能を高める方法であって、
   ａ) 表面にＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞を提供する工程、
   ｂ) 前記エピトープを前記単離細胞に特異的に適用する工程、
   ｃ) ＮＫＴ細胞を工程bの前記細胞と接触させる工程、
   ｄ) 前記ＮＫＴ細胞の活性化の低下又は消失を測定する工程、
   ｅ) 疎水性アミノ酸、疎水性翻訳後修飾アミノ酸残基からなる群から選択される部分の付加及び／又は前記エピトープ中に存在する非疎水性アミノ酸の欠失により、前記エピトープを修飾して、修飾タンパク質を生成させる工程、
   ｆ) 前記修飾エピトープを前記単離細胞に特異的に適用する工程、
   g) 前記修飾エピトープを提示しうる工程fの前記細胞とＮＫＴ細胞を接触させる工程；及び
   h) 工程gの前記ＮＫＴ細胞の活性化が工程dの測定値よりも高い修飾エピトープを選択する工程、
   を含む、方法。
5. 前記ＮＫＴ細胞がＣＤ８＋又はＣＤ４−／ＣＤ８−であり、好ましくは前記エピトープががん細胞由来又は細胞内病原体感染細胞由来である、請求項4に記載の方法。
6. エピトープの片方又は両方の隣接領域に、パルミトイル-システイン部分、CD8特異的結合部分、TLRアゴニストを付加する工程、及び／又は、両方の隣接領域にシステインアミノ酸若しくはシステインモチーフを付加する工程をさらに含む、請求項4又は5に記載の方法。
7. がん又は細胞内病原体の治療又はワクチン接種に用いられる、請求項5又は6に記載の方法により得られるペプチド。
8. 前記ＮＫＴ細胞がCD4+であり、好ましくは、前記エピトープが、自己抗原由来、アレルゲン由来又は慢性炎症をおこす製剤由来、及び抗体、凝固因子及び補充療法で用いられるタンパク質からなる群から選択される治療用タンパク質由来である、請求項4に記載の方法。
9. エピトープの片方又は両方の隣接領域に、パルミトイル-システイン部分、CD4特異的結合部分、TLRアゴニストを付加する工程、及び／又は、両方の隣接領域にシステインアミノ酸若しくはシステインモチーフを付加する工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
10. 請求項8又は9に記載の方法により得られる治療用タンパク質。
11. エピトープのタンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃへの結合能を低下させる方法であって、
    a) 表面にＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを発現する単離細胞を提供する工程、
    b) 前記エピトープを前記単離細胞に特異的に適用する工程、
    c) 工程bの前記細胞とＮＫＴ細胞を接触させる工程、
    d) 前記ＮＫＴ細胞の有意な活性化を測定する工程、
    e) 少なくとも１の疎水性アミノ酸を１の(類似の)非疎水性アミノ酸で置換及び／又は前記エピトープから１の疎水性アミノ酸を選択的に除去及び／又は翻訳後修飾されたアミノ酸を対応する非修飾アミノ酸で置換する工程、
    f) 前記修飾エピトープを前記単離細胞に特異的に適用する工程、
    g) 前記修飾エピトープを提示しうる工程fの細胞とＮＫＴ細胞を接触させる工程、及び、
    h) 工程gの前記ＮＫＴ細胞の活性化レベルが工程dの測定値よりも低い修飾エピトープを選択する工程、
    を含む、方法。
12. 前記エピトープが、抗体、凝固因子、及び補充療法で用いられるタンパク質からなる群から選択される治療用タンパク質由来である、請求項11に記載の方法。
13. アレルギー性疾患及び自己免疫疾患からなる群から選択される疾患の治療に用いられる、請求項12記載の方法により得られる治療用タンパク質。
14. 細胞のエピトープ提示能を高める方法であって、前記エピトープの片方又は両方の隣接領域に、疎水性アミノ酸、パルミトイル-システイン部分、CD4特異的モチーフ、CD8特異的モチーフを付加する工程、又は、両方の隣接領域におけるシステインアミノ酸若しくはシステインモチーフを付加する工程を含む、方法。
15. 血液又は組織試料中のＮＫＴ細胞を検出、単離又は減少させるインビトロ方法であって：タンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃを含む表面を提供する工程、前記表面に前記タンパク質ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ及び／又はＣＤ１ｃに結合してＮＫＴ細胞を活性化するように決定されたエピトープを適用する工程、かつ、前記血液又は組織試料を前記エピトープを含む表面に適用する工程を含む、方法。