JP2015518844A - 免疫原性が低下した凝固因子ｖｉｉｉ - Google Patents

Abstract

本発明は、先天性または後天性の血友病Ａおよび出血性障害の処置に使用するための、ＮＫＴ細胞を活性化する能力が低下したＶＩＩＩ因子分子を記載する。そのＶＩＩＩ因子分子は、下記により得られる：ａ．少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープであって、位置Ｐ１および／またはＰ７に疎水性アミノ酸残基を含むエピトープを同定する；ｂ．位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するか、位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を非疎水性残基で置換するか、あるいは位置Ｐ１および／またはＰ７に非疎水性残基を付加することにより、そのエピトープ（単数または複数）を修飾する。【選択図】図１

Description

本発明は、免疫原性が低下または欠如した凝固ＶＩＩＩ因子の分子、および凝固障害の療法、特に血友病Ａの処置における、それらの使用に関する。

ＶＩＩＩ因子は、凝固の必須成分であるトロンビンの産生に際して補因子として作用する凝固因子である。機能性ＶＩＩＩ因子が存在しないかまたは不十分であると、個体は出血性障害に罹患し、これらは血友病Ａと総称される。それの起源に応じて２タイプの血友病Ａがある：すなわち、遺伝性（特発性血友病、自発性血友病）または後天性（後天性または自己免疫性血友病）。ＶＩＩＩ因子はＸ染色体上に存在するため、特発性血友病は男性が罹患する疾患である。女性は２つのＸ染色体があるので、キャリヤーではあるが、出血性障害に罹患することはない。特発性血友病は、循環ＶＩＩＩ因子のレベルに従ってさらに３つのサブセットの患者に分類される：重症血友病（ＶＩＩＩ因子が１％未満）、軽症血友病（ＶＩＩＩ因子が１〜５％）および中等度血友病（ＶＩＩＩ因子濃度が５〜１０％）。

血友病に罹患している患者はＶＩＩＩ因子による補充療法が必要である。重症血友病Ａ患者については特発性の、時には致命的な出血のため、これは継続療法であり、あるいは軽症または中等度の血友病患者では間欠的であり、その場合は外傷または外科処置および一時的にＶＩＩＩ因子濃度を高める必要がある際にＶＩＩＩ因子が要求される。

血友病Ａに罹患している患者が直面せざるを得ないきわめて主要な合併症は、機能性凝固を再建するために用いる療法剤（ＶＩＩＩ因子）に対する抗体の出現である。現在、補充療法に用いられる２タイプのＶＩＩＩ因子、すなわち血漿由来のものおよび組換え体がある。血漿由来ＶＩＩＩ因子はヒト血漿プールから調製され、さらに他のタンパク質、特にＶＩＩＩ因子の生理的シャペロンであるフォンビルブラント因子(von Willebrand factor)を含有する。組換えＶＩＩＩ因子は、遺伝子工学、および動物またはヒトに由来する細胞による産生によって調製される。組換えＶＩＩＩ因子は純粋であり、フォンビルブラント因子を含有しない。血漿由来または組換えのいずれかのＶＩＩＩ因子分子を用いた場合に抗ＶＩＩＩ因子免疫応答を誘発するリスクにおいて有意差があるかどうかを判定するために、活発な論争がなされている。どのような状況でも、ＶＩＩＩ因子を療法剤として投与されている患者の平均２５％が抗体を産生し、それらが補充剤の活性を阻害する。そのような抗体はＶＩＩＩ因子インヒビターと呼ばれる。

ＶＩＩＩ因子インヒビターに対する対処法はない。経験に基づいて、きわめて高い用量のＶＩＩＩ因子を毎日投与すると若干の症例でインヒビターの消失が生じる可能性があることが立証された。免疫寛容の誘導と呼ばれるこの療法は、その成功に信頼性がない。免疫寛容の転帰を予測できる代理マーカーが存在しないことにより、ＶＩＩＩ因子インヒビターの形成を排除する意図でそれを使用するのは事実上制限される。さらに、寛容誘導に関連する法外な費用のため、寛容誘導を考慮できる患者はごくわずかである。

ＶＩＩＩ因子インヒビターは親和性の高い特異的抗体であり、これはそれらの形成にＴリンパ球が関与することを示唆する。その結果この免疫応答は十分に記憶され、刺激された際に抗体を産生する形質細胞にトランスフォームする記憶Ｂ細胞、および後にＶＩＩＩ因子に曝露されるとその都度さらなる抗体応答をマウントする能力を維持した記憶Ｔ細胞の集団が残される。ＶＩＩＩ因子インヒビターを呈する患者は、インヒビターがＶＩＩＩ因子機能を中和し、かつおそらくＶＩＩＩ因子のクリアランス速度を高めるという理由だけでなく、ＶＩＩＩ因子へのさらなる曝露の都度そのようなインヒビターの濃度が高まるという理由で、ＶＩＩＩ因子で処置することができない。

特許出願WO 2009/101206には、適応免疫のレベル、すなわちＶＩＩＩ因子特異的なＴ細胞とＢ細胞の相互作用のレベルで作用することにより、インヒビターの産生を排除できる方法が記載されている。この出願には、因子曝露に際して新たなインヒビターを産生するリスクをどのようにして排除できるかだけでなく、既存のインヒビターをどのようにして除去できるかも記載されている。しかし、本発明者らは意外にも、ＶＩＩＩ因子が自然免疫のきわめて有効なアクチベーターであり、これが適応応答およびインヒビターを誘発するための前提条件であるらしいことを見出した。ＶＩＩＩ因子は規則的に投与しなければならず（たとえば、重症血友病Ａ患者には週２または３回）、したがってＶＩＩＩ因子インヒビターの新たな産生を誘発するリスクが持続するので、それらが自然免疫を活性化する能力を喪失した療法用ＶＩＩＩ因子分子を調製できる方法を定めることが緊急に求められる。

PCT出願PCT/EP2011/070911には、ＮＫＴ細胞を活性化する能力をもつタンパク質をそのような能力が失なわれるように変換できる方法が記載されている。たとえば、ＮＫＴ細胞は自然免疫系の一部であり、一般的に記憶作用を欠如すると定められている。しかし、PCT出願PCT/EP2011/070911に記載されるように、ＮＫＴ細胞はＣＤ１ｄ分子による疎水性ペプチドの提示を認識してそれによって活性化される可能性がある。このペプチドは、それに対してＮＫＴ細胞が特異的である抗原に由来するので、これは抗原特異的自然免疫系の活性化を表わす。上記のＰＣＴ出願には、抗原特異的ＮＫＴ細胞を活性化する特性を示すタンパク質をアミノ酸の置換または欠失により修飾し、それによってＣＤ１ｄに結合する能力を排除できる方法が記載されている。

WO 2009/101206 PCT/EP2011/070911

本発明は、PCT出願PCT/EP2011/070911に記載された方法により得られたＶＩＩＩ因子であって、自然免疫系を活性化する能力を喪失し、その結果、インヒビターの産生を伴なう適応免疫応答を活性化する能力の欠如または有意の低下を示す分子を記載する。本発明はさらに、補充療法の必要がある患者、特に重症血友病Ａ患者の処置のための、そのようなＶＩＩＩ因子分子の使用を記載する。本発明はまた、本発明のＶＩＩＩ因子分子を用いる遺伝子療法を使用できる方法を開示する。

本発明は、免疫原性が低下したＶＩＩＩ因子分子の調製に関する。

本発明はまた、そのＶＩＩＩ因子分子を、その処置を必要とする患者の処置に使用することに関する。

PCT出願PCT/EP2011/070911に、ＮＫＴ細胞を活性化する能力が低下したペプチドまたはポリペプチドを得るための方法が記載されている。そこで、本発明者らは、有意割合のペプチドまたはポリペプチドが、それらをＣＤ１ｄ決定基に結合させてナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の活性化のために提示することができるアミノ酸配列を保有するという予想外の所見を得た。そのような細胞が活性化されると、サイトカインの放出、および場合によっては細胞溶解特性の獲得または増大が生じる。

本発明は、１観点において、アロファクター(allofactor)として用いる少なくとも１種類の単離ポリペプチドを、ＮＫＴ細胞により認識されるエピトープの形成に関与する少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するように修飾したものを、そのアロファクターに対する対象の免疫応答を阻止するための医薬の調製に使用することに関する。

より詳細には、本発明は、ＶＩＩＩ因子、および医薬としてのＶＩＩＩ因子の使用に関する。ＶＩＩＩ因子は凝固系の補因子であり、これはＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子およびＸ因子を組み立てるセリンエステラーゼであるテンナーゼ(tenase)の形成を促進することによりトロンビンの活性化に関与する。Ｘ因子は、トロンビンに変換する酵素活性を保有する。ＶＩＩＩ因子の非存在下では、テンナーゼ形成速度が劇的に低下して患者を特発性出血のリスク状態にし、これはしばしば致命的となり、速やかな療法措置が必要である。ＶＩＩＩ因子の濃度の低下が中等度（５〜１０％）である場合、患者は通常は外傷または外科処置に際して出血するにすぎない。

重症血友病Ａ（ＶＩＩＩ因子が１％未満）に罹患している患者は頻繁な特発性出血を伴ない、連続投与または週２もしくは３回のボーラス注射による予防処置が必要である。さらに、敗血症性ショック、急性フィブリン溶解、多発外傷または脳内出血の場合のようにＶＩＩＩ因子異化の増大がみられる患者もＶＩＩＩ因子投与が必要である。

定義
用語“ペプチド”は、本明細書中で用いる場合、２〜２００個のアミノ酸がペプチド結合により連結したアミノ酸配列を含む分子を表わすが、特定の態様において、非アミノ酸構造体（たとえば、連結する有機化合物）を含むことができる。本発明によるペプチドは、一般的な２０種類のアミノ酸のいずれか、またはその修飾形態を含むことができ、あるいはペプチドの化学合成により、または化学修飾もしくは酵素修飾により取り込まれた非天然アミノ酸を含むことができる。用語“ポリペプチド”は、本明細書中で用いる場合、一般に比較的長いペプチドまたはタンパク質を表わす。

用語“エピトープ”は、本明細書中で用いる場合、タンパク質の１つの部分もしくは幾つかの部分（コンホメーショナルエピトープを定めることができるもの）であって、抗体もしくはその一部分（Ｆａｂ’、Ｆａｂ２’など）またはＢもしくはＴ細胞性リンパ球の細胞表面に提示される受容体が特異的に認識して結合し、その結合により免疫応答を誘導できるものを表わす。

用語“抗原”は、本明細書中で用いる場合、１以上のハプテンを含み、および／または１以上のＴ細胞エピトープを含む、高分子構造体を表わす。一般に、その高分子はタンパク質またはペプチド（多糖類を含むもの、または含まないもの）であり、あるいはタンパク質組成物から構成され、１以上のエピトープを含む；あるいは、その高分子を本明細書中で“抗原性タンパク質”または“抗原性ペプチド”と呼ぶことができる。

用語“Ｔ細胞エピトープ”または“Ｔ−細胞エピトープ”は、本発明に関して、優性、準優性または副−Ｔ細胞エピトープ、すなわち抗原性タンパク質の一部分であって、Ｔリンパ球の細胞表面にある受容体が特異的に認識して結合する部分を表わす。エピトープが優性、準優性または副のいずれであるかは、そのエピトープに対して誘発される免疫反応に依存する。優性度は、あるタンパク質の、可能性のあるすべてのＴ細胞エピトープのうち、そのようなエピトープがＴ細胞により認識されてそれらを活性化できる頻度に依存する。特に、Ｔ細胞エピトープはＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合するエピトープである。

用語“ＮＫＴ細胞エピトープ”は、抗原性タンパク質の一部分であって、Ｔリンパ球の細胞表面にある受容体が特異的に認識して結合する部分を表わす。特に、ＮＫＴ細胞エピトープはＣＤ１ｄ分子が結合するエピトープである。

用語“ＣＤ４＋エフェクター細胞”は、ＣＤ４陽性サブセットのＴ細胞に属する細胞を表わし、それの機能は他の細胞、たとえばＢ細胞に対する補助を提供することである。これらのエフェクター細胞は一般的にＴｈ細胞（Ｔヘルパー細胞について）としてレポートされ、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞など種々のサブセットを含む。

用語“ＮＫＴ細胞”は、ＣＤ１分子により提示されるエピトープを認識するという事実を特徴とする、自然免疫系の細胞を表わす。本発明に関して、ＮＫＴ細胞は１型（インバリアント(invariant)）サブセット（ｉＮＫＴ）または他のいずれかのサブセットに配属でき、これらはＣＤ１ｄによるペプチドエピトープの提示によって活性化されるであろう。用語“ＮＫＴ細胞”には、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかの系列に属するＮＫＴ細胞も含まれる。ＮＫＴ細胞は、しばしばＮＫ１．１およびＮＫＧ２Ｄなどの受容体を保有する。

用語“ＣＤ１ｄ分子”は、非ＭＨＣ由来分子を表わし、３つのアルファ鎖および１セットの逆平行ベータ鎖から構成され、両側が開放した深い疎水性溝内に配置され、脂質、糖脂質または疎水性ペプチドをＮＫＴ細胞に提示できる。

用語“免疫障害”または“免疫疾患”は、免疫系の反応が生物における機能異常または非生理的状況に関与し、あるいはそれらを持続させる、疾患を表わす。本発明に関して、免疫障害は、感染性作用物および腫瘍監視機構により誘導される病態を表わす。

用語“アロファクター”または“アロ抗原”は、同種の２個体間で比較した場合に多型性を示すタンパク質、ペプチドまたは因子（すなわち、いずれかの分子）、より一般的にはそのアロファクターを投与される対象において（アロ反応性）免疫応答を誘導するいずれかのタンパク質、ペプチドまたは因子を表わす。拡大すると、アロファクターには供給するために遺伝子修飾したタンパク質も含まれる。

図１は、主要ＣＤ１ｄ結合モチーフがＳＥＱ ＩＤ ３（Ｐ２８ Ａ）にあり、限られてはいるが有意％のＮＫＴ細胞がＳＥＱ ＩＤ ４（Ｐ２８ Ｂ）のペプチドによって検出されたことを示す。 図２は、天然レパトア内に存在するＮＫＴ細胞のうち有意割合（８％）がＳＥＱ ＩＤ １のペプチドに対して特異的であること、およびＳＥＱ ＩＤ １のペプチドがＪＡＷＳ２細胞により提示されるとその割合が倍増すること（１６％）を示す。 図３ａは、ＶＩＩＩ因子変異体Ｆ３０９Ａ−Ｈ３１５Ａを注射したマウスにおいて３．６倍の抗体減少がみられたことを示す。 図３ｂは、ＶＩＩＩ因子の機能を阻害する抗体が３．６倍減少したことを示す。 図４は、ＣＤ１ｄを発現する細胞の割合が対照実験における６％から、ＣＤ１ｄ結合配列を含むペプチドを用いた場合に１３％に増加することを示す。ヒストグラムとして示したデータは３回測定の平均であり、星印は対照値より有意に高い結果を示す（ｐ＜０．０５）。 図５は、実施例５の所見の３つの顕微鏡視野のカウントの平均を示す（最低１０個の細胞／クラスター）。 図６は、ＳＥＱ ＩＤ ３のペプチドが、図４に示したＳＥＱ ＩＤ ５のペプチドと対照的に、Ｕ９３７細胞の表面におけるＣＤ１ｄの発現を増大させなかったことを示す。

本発明は、対象においてＶＩＩＩ因子分子に対する免疫応答を阻止するためのＶＩＩＩ因子分子を提供する。

ＶＩＩＩ因子は、２３３２個のアミノ酸から構成される成熟配列をもち、ドメイン構造Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２（Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１およびＣ２はドメインを表わし、ａ１、ａ２およびａ３はそれらのドメインを連結する酸性領域である）を備えている。ＶＩＩＩ因子は、分泌された後に起きるタンパク質分解プロセシングを受けると、Ａ３−Ｃ１−Ｃ２からなる軽鎖に共有結合した可変長Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ（この長さはＢドメインの長さによって調節される）からなる主要形態で血漿中に存在する。

ＶＩＩＩ因子は、適切なリン脂質表面でのＩＸ因子によるＸ因子の活性化を促進し、これにより凝固プロセスを増幅する。ＶＩＩＩ因子の活性形態は、Ａ１−ａ１、Ａ２−ａ２およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２で構成されるヘテロトリマーからなる。

特に、本発明は、ＮＫＴ細胞の拡張および機能活性を阻止する方法を提供する。そのような細胞は、通常は別個のサブセットに分類される：すなわち、インバリアントＴＣＲアルファ鎖を保有するＮＫＴ細胞についての１型（マウスにおけるＶａｌｐｈａ１４、ヒトにおけるＶａｌｐｈａ２４）、または多様なアルファ鎖レパトアを備え、スルファチドに対して特異的であると推定される２型ＮＫＴ細胞。しかし、最近の証拠により、１型または２型のカテゴリーに該当しない別のサブセットのＮＫＴ細胞が示唆された。本発明の目的は、ＣＤ４またはＣＤ８補助受容体(co-receptor)を保有する可能性があるこれらの一般的ではないＮＫＴ細胞を含めることである。ＣＤ１ｄに結合した抗原が提示されると、ＮＫＴ細胞は速やかに活性化され、自然免疫系および適応免疫系の両方に由来する他の細胞に影響を及ぼす決定因子であると考えられる多数のサイトカインを分泌する。ある環境では、それらの活性化したＮＫＴ細胞は細胞傷害特性を獲得し、またはそれが増大する。

本発明に関して、前記ペプチドをＣＤ１ｄ分子が提示できるという予想外の知見が得られた。ＣＤ１ｄ分子の特徴は、それが２つの逆平行ベータ鎖から構成されるプラットフォームの頂部に存在する裂溝を形成する、２つの逆平行アルファ鎖から構成されることである。この裂溝は狭くて深く、疎水性残基のみ（古典的には脂質のみと推定されていた）を受容する。この裂溝は、位置（Ｐ）１および７の疎水性残基ならびにＰ４の脂肪族残基を特徴とするアミノ酸７個の配列を収容できる。Ｐ１は絶対疎水性残基、たとえばＦ、Ｗ、ＨまたはＹである。しかし、Ｐ７は許容性があり、極性でない限り代替残基を含むことができる。Ｐ４の残基は、好ましくは脂肪族であるが、任意である。したがって、ＣＤ１ｄ結合モチーフの一般式は［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ_２Ｘ_３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ_５Ｘ_６−［ＦＷＴＨＹ］である。ただし、このモチーフが対称的であってＰ７をＰ１とみなすことができ、またＰ１をＰ７とみなすことができるのは、当業者に明らかなはずである。ＣＤ１ｄ結合モチーフのこの一般式は一般的指標としてここに示され、何らかの限定を意図するものではない。

本発明は、ＮＫＴ細胞を活性化する能力をＶＩＩＩ因子分子に付与するＣＤ１ｄ結合モチーフ（単数または複数）が下記により修飾されたものを含むＶＩＩＩ因子分子の調製およびその方法に関する；Ｐ１および／またはＰ７の疎水性残基を除去し、および／または非疎水性残基で置換する；ただし、位置３０９のＦがＳにより置換されることはなく、位置３１７のＨがＡにより置換されることはない；ならびに／あるいは位置Ｐ１および／またはＰ７に非疎水性残基を付加する；所望によりＰ４の脂肪族残基を置換し、または欠失させる；あるいはこれらのいずれかの組合わせ；その結果、ペプチドまたはポリペプチドがＣＤ１ｄに結合する能力が失われるか、または有意に低下し、それによりそれらのペプチドまたはポリペプチドがＮＫＴ細胞を活性化する能力が失われるか、または有意に低下する。

したがって本発明は、ドメイン構造Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２（Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１およびＣ２はドメインを表わし、ａ１、ａ２およびａ３はそれらのドメインを連結する酸性領域である）をもつＶＩＩＩ因子分子であって、ＮＫＴ細胞を活性化する能力が低下した、下記により得られるＶＩＩＩ因子分子に関する：
ａ．少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープであって、位置Ｐ１および／またはＰ７に疎水性アミノ酸残基を含むエピトープを同定する；
ｂ．位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するか、位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を非疎水性残基で置換するか、あるいは位置Ｐ１および／またはＰ７に非疎水性残基を付加することにより、そのエピトープ（単数または複数）を修飾する。

本発明はまた、ＮＫＴ細胞を活性化する能力が低下したＶＩＩＩ因子分子を得るための、下記の工程を含む方法に関する：
ａ．少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープであって、位置Ｐ１および／またはＰ７に疎水性アミノ酸残基を含むエピトープを同定する；
ｂ．位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するか、位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を非疎水性残基で置換するか、あるいは位置Ｐ１および／またはＰ７に非疎水性残基を付加することにより、そのエピトープ（単数または複数）を修飾する。

より特定の態様において、位置Ｐ１および／またはＰ７のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを非疎水性残基により置き換え、あるいは所望により位置Ｐ４のＩ、Ｌ、ＭまたはＶを非脂肪族残基で置き換え、あるいはこれらを組み合わせる。

さらに他の特定の態様において、位置Ｐ１および／またはＰ７にある疎水性残基、あるいは所望により位置Ｐ４にある脂肪族残基、あるいはこれらの組合わせを、非天然Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なる少なくとも１つの非天然アミノ酸により、または非芳香族有機化合物により置き換える。

さらに他の特定の態様において、少なくとも１つのアミノ酸をＣＤ１ｄ結合モチーフ内にＰ１〜Ｐ７配列内のいずれかの位置において付加し、それによりこのモチーフを攪乱し、ＣＤ１ｄに結合するそれの能力を妨害し、それによりＮＫＴ細胞を活性化するそれの能力を妨害する。

好ましい態様において、非天然アミノ酸はＤ−アミノ酸である。

本発明はまた、ＮＫＴ細胞を活性化する能力をＶＩＩＩ因子分子に付与するＣＤ１ｄ結合モチーフ（単数または複数）が下記により修飾されたものを含むＶＩＩＩ因子分子に関する；Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去する；Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を非疎水性残基で置換する；あるいは位置Ｐ１および／またはＰ７に非疎水性残基を付加する；ならびにさらにＰ４の脂肪族残基を欠失させる；あるいはこれらのいずれかの組合わせ；その結果、ペプチドまたはポリペプチドがＣＤ１ｄに結合する能力が失われ、または有意に低下し、それによりそれらのペプチドまたはポリペプチドがＮＫＴ細胞を活性化する能力が失われ、または有意に低下する。

そのようなＶＩＩＩ因子分子は、対象に投与した際にＣＤ１ｄ上に装填されず、それによりＮＫＴ細胞を活性化するのが阻止される。

さらなる観点において、本発明は、対象においてＶＩＩＩ因子に対する免疫応答を阻止するための、位置Ｐ１および／またはＰ７にＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹの少なくとも１つの置換または欠失を含むＶＩＩＩ因子分子の使用を含む。

なお、さらなる観点において、本発明は、対象においてＶＩＩＩ因子に対するＮＫＴ細胞の活性化を阻止するための、位置Ｐ１および／またはＰ７にＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹの少なくとも１つの置換または欠失を含むＶＩＩＩ因子分子の使用を含む。

なお、さらなる観点において、本発明は、対象においてＶＩＩＩ因子に対する免疫応答を阻止する医薬を調製するための、位置Ｐ１および／またはＰ７にＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹの少なくとも１つの置換または欠失を含むＶＩＩＩ因子分子の使用を含む。

ペプチドまたはポリペプチド中にＣＤ１ｄ結合モチーフが存在する場合、それらの数はごく限られている。そのようなペプチドまたはポリペプチドの例を、ＶＩＩＩ因子について後記に示す。一般に、ポリペプチドは１〜５個のこれらのモチーフを示す。

本発明の他の利点は、ＣＤ１ｄ分子がごく限られた多型度を示すことである。したがって、本発明による同じアミノ酸置換、付加または欠失がすべてまたは大多数の対象に有用なペプチドまたはポリペプチドを提供することは当業者に明らかである。これは、適切な配列を含む多数のペプチドが描き出される可能性のあるＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドまたはポリペプチドのモチーフと著しく対照的である。これは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドに課される制約が最少であること、およびクラスＩＩ分子の多型性が大きいことによるものである。

本発明の目的であるＶＩＩＩ因子分子は、下記により従って同定される：
（１）所望により、ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を、Ｐ１およびＰ７に疎水性残基ならびにＰ４に脂肪族残基を含む、少なくとも１つのＣＤ１ｄモチーフの存在について評価する。一般配列、たとえば［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ_２Ｘ_３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ_５Ｘ_６−［ＦＷＴＨＹ］を、下記のような当技術分野で周知のアルゴリズムを用いるために使用できる：
http://expasy.org/tools/scanprosite/
この一般配列は、そのペプチドまたはポリペプチドがＮＫＴ細胞を活性化できるようにするモチーフをそれらのペプチドまたはポリペプチド中のどの配列（単数または複数）が含むかを同定するのを補助するためのツールと考えるべきである。

（２）そのペプチドまたはポリペプチドがＣＤ１ｄに結合する能力をインビトロで、ＣＤ１ｄ分子を発現する細胞系を用いて試験する。そのような細胞系の例は当技術分野で既知であり、本出願における例を調製するために用いられている（たとえば、ＪＡＷＳ２細胞およびＵ９３７細胞）。好ましい態様において、その細胞系はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現せず、ＣＤ１ｄのＤＮＡ配列を含むウイルスベクターを用いて、または細胞に遺伝子を導入するための他のいずれかの手段を用いて、ＣＤ１ｄの過発現のためにトランスダクションされている。細胞トランスダクションの方法は当技術分野で知られている。この細胞系に、培養に際して、このペプチドもしくはポリペプチド、または対応する配列を含む合成ペプチドを装填する。そのような合成ペプチドは合成によって、たとえば当技術分野で周知のｆｍｏｃ固相合成法を用いて、容易に製造される。次いで、ＣＤ１ｄ分子によるそのペプチド、ポリペプチドまたは合成ペプチドの効果的な提示を、ＮＫＴ細胞の活性化を測定することにより評価する。そのような細胞は、末梢血からたとえば磁気ソーティングにより採取し、ＩＬ−２、ＩＬ−１５またはＩＬ−７などのサイトカインの存在下で培養維持することができる。これらの方法は当技術分野で記載されている(たとえば、Godfrey et al, Nature reviews Immunology 2010, 11: 197-206を参照)。サイトカイン産生の評価などの方法を用いて、ＮＫＴ細胞の活性化を評価する。

あるいは、抗原提示細胞によりＣＤ１ｄ分子において実際に提示されたペプチドを種々のクロマトグラフィー法により溶離および分離することができる。そのような方法についての十分な記載が、Scott et al, Immunity, 12: 711-720, 2000にみられるであろう。そのようなペプチドを次いで配列決定して、どのアミノ酸残基がＰ１およびＰ７に存在するかを同定する。

あるいは、それらの合成ペプチドをＣＤ１ｄ分子のダイマー、テトラマーまたはポリマーに装填して、そのようなペプチドに対して特異的なＮＫＴ細胞を検出することができる。１つの可能性は、蛍光標識したテトラマーの使用、および蛍光活性化セルソーティングシステム（ｆａｃｓ）を用いる検出である。

（３）ＮＫＴ細胞を活性化できると同定され、かつ所望によりアルゴリズムにより同定されたアミノ酸配列を、次いで置換または欠失により修飾する。好ましい態様において、位置Ｐ１および／またはＰ７のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを、Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なる少なくとも１つのアミノ酸により置き換える。天然アミノ酸を翻訳後修飾により修飾し、またはメチル基などの化学基で置換することができる。他の好ましい態様において、位置Ｐ１および／またはＰ７のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを、いずれか適切な別の非天然アミノ酸により置き換える。非天然アミノ酸残基の例はＤ−アミノ酸である。さらに他の態様において、位置Ｐ１および／またはＰ７のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを、Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なる少なくとも１つのアミノ酸により置き換える。他の好ましい態様において、位置Ｐ１のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを、Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なる少なくとも１つのアミノ酸により、いずれか適切な別の非天然アミノ酸により、または非芳香族有機化合物により置き換える。そのようなアミノ酸置換は、当技術分野で周知の方法を用いて得られる。なお、さらなる好ましい態様において、位置Ｐ１のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを欠失させる。さらに他の態様において、位置Ｐ１およびＰ７のＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹを欠失させる。そのような欠失を行なう方法は当技術分野で周知である。さらに、特定の態様において、少なくとも１つのアミノ酸をＣＤ１ｄ結合モチーフ内にＰ１−Ｐ７配列のいずれかの位置において付加する。

（４）所望により、最初（Ｐ１）および／または最終（Ｐ７）の位置に隣接する疎水性アミノ酸残基を非疎水性残基により置き換えることが有利な場合がある。そのような疎水性残基は、エピトープのフランキング領域内、またはエピトープ配列自体の位置Ｐ２もしくはＰ６に、存在する可能性がある。それぞれエピトープのアミノ末端またはカルボキシ末端にある位置Ｐ−２およびＰ−１、Ｐ２および／またはＰ６、Ｐ８およびＰ９を、有利には非疎水性残基、すなわちＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹとは異なるアミノ酸により占有し、それはＣＤ１ｄに対するエピトープの親和性をさらに低下させ、それによりエピトープがＮＫＴ細胞を活性化する能力はさらに低下する。

（５）ＮＫＴ細胞を、次いでそれらと（３）の記載に従って修飾したペプチドとの反応性について試験する。あるいは、そのペプチドが由来する全長タンパク質を、（３）の記載に従って配列修飾した状態で製造することができる。種々の方法を用いて、ＮＫＴ細胞が修飾ペプチドまたはタンパク質と反応するそれらの能力を喪失または低減したかどうかを判定することができる。これらの方法は当技術分野で知られている。放射性チミジンの取込みにより、または培地中に産生されたサイトカインの濃度を評価することにより、ＮＫＴ細胞の増殖を評価することができる。あるいは、ＮＫＴ細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴにより、サイトカインまたは細胞溶解特性と関連するグランザイム(granzyme)Ｂなどの分子を指向する、多様な抗体を用いて評価することができる。あるいは、ＮＫＴ細胞は、初期シグナル伝達事象、たとえばＦｙｎまたは表面活性化マーカーのリン酸化について評価することができる。

特に、ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメインの配列の分析により、ＶＩＩＩ因子がＣＤ１ｄ分子に結合できるようにするモチーフを含む２領域が前記の方法に従って同定された。これらの２領域は、下記の配列をもつアミノ酸残基１９０−２０９および３０９−３２３、好ましくは３０９−３１６を含む：
１９０−２０９：ＱＴＬＨＫＦＩＬＬＦＡＶＦＤＥＧＫＳＷＨ（ＳＥＱ ＩＤ １）
３０９−３２３：ＦＣＨＩＳＳＨＱＨＤＧＭＥＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ２）
疎水性アミノ酸残基にアンダーラインを施してあり、これらの２配列はそれぞれ２つのＣＤ１ｄ結合モチーフ、すなわち下記のものを含む：
Ｈ１９３−Ｆ１９９
Ｆ１９５−Ｖ２０１（Ｐ７は許容され、バリンを含むことができる）
Ｆ３０９−Ｈ３１５
Ｈ３１７−Ｙ３２３。

本発明によれば、ＶＩＩＩ因子の投与が必要な疾患、たとえば先天性または後天性のＶＩＩＩ因子欠損症、ならびにＶＩＩＩ因子の投与が有益である障害、たとえば敗血症性ショック、多発外傷および急性フィブリン溶解に際して、または脳内出血に伴なう無制御な出血に際してみられる急性のＶＩＩＩ因子消費に関連する出血性障害の処置のための医薬が考慮される。

本発明の医薬は、必ずしもそうではないが、通常は有効成分として少なくとも１種類の本発明のＶＩＩＩ因子分子またはそのＶＩＩＩ因子分子を発現できる遺伝子療法ベクターを含む（医薬）配合物である。有効成分（単数または複数）のほかに、そのような配合物は少なくとも１種類の（医薬的に許容できる）希釈剤を含むであろう。

一般に、本発明のＶＩＩＩ因子分子の投与は、自然免疫系の活性化、より具体的にはＮＫＴ細胞の活性化、より具体的にはＮＫＴ細胞の活性化に伴なうサイトカインの産生を阻止する。

本発明に関するＮＫＴ細胞エピトープの同定法は当業者に既知である。たとえば、ＶＩＩＩ因子分子から単離したペプチド配列を、たとえばＮＫＴ細胞生物学的方法により試験して、それらのペプチド配列がＮＫＴ細胞応答を誘発するかどうかを判定する。ＮＫＴ細胞応答を誘発すると認められたペプチド配列を、ＮＫＴ細胞刺激活性をもつと定める。ヒトＮＫＴ細胞刺激活性は、ＶＩＩＩ因子に対して感作された個体から得たＮＫＴ細胞を培養し、そのペプチド／エピトープに応答してＮＫＴ細胞の増殖が起きるかどうかを、たとえばトリチウム化チミジンの細胞取込みにより判定することによって、さらに試験することができる。ペプチド／エピトープに対するＮＫＴ細胞による応答についての刺激指数は、ペプチド／エピトープに応答した最大ＣＰＭを対照ＣＰＭで割ったものとして計算できる。バックグラウンドレベルより２倍以上大きいＮＫＴ細胞刺激指数(stimulation index)（Ｓ．Ｉ．）を“陽性”とみなす。陽性結果を用いて、試験したペプチド／エピトープのグループの各ペプチド／エピトープについて平均刺激指数を計算する。２以上のＮＫＴ細胞刺激指数をもつ免疫原性ペプチドは、本発明に述べる疎水性アミノ酸残基の置換または欠失を行なうための候補として有用であると考えられる。

本発明のペプチドまたはポリペプチドは、Ｓ．Ｉ．がバックグラウンドレベルの２倍未満である場合、または刺激に際して産生されたサイトカインのレベルが天然のペプチドもしくはポリペプチド配列で刺激を行なった際に産生されたものの５０％未満である場合、または天然のペプチドもしくはポリペプチド配列と比較してグランザイムＢなどの細胞溶解物質が少なくとも２倍低下した場合、ＮＫＴ細胞を活性化する能力が低下していると言われる。

可溶性ＣＤ１ｄ分子を入手し、合成および／または化学的カップリングによりテトラマーにする。ＣＤ１ｄ分子をアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。可溶性ＣＤ１ｄ分子を、ＣＤ１ｄ分子に対する強い結合親和性によって調製されたビオチン標識した標準ペプチドと共にインキュベートする。ＣＤ１ｄ結合について評価すべきペプチドを、次いで種々の濃度でインキュベートし、それらが標準ペプチドをそれのＣＤ１ｄ結合部位から排除する能力をニュートラアビジン(neutravidin)の添加により計算する。ＭＨＣクラスＩＩ決定基が提示するペプチドについては、たとえばTexier et al., (2000)J. Immunology 164, 3177-3184)に方法があるが、この方法をＣＤ１ｄ限定したＮＫＴ細胞エピトープに容易に適用できる。

天然のペプチドもしくはポリペプチド配列においてオーバーラップ領域を共有する２以上のアミノ酸配列がＴ細胞生物学的手法により判定してヒトＮＫＴ細胞刺激活性をもつことが認められれば、それらの配列のうち一方または両方に属する残基について疎水性アミノ酸残基の変異または欠失を行なうことができる。

本発明のＶＩＩＩ因子分子の投与経路は、適応症に従って変更できる。例はＶＩＩＩ因子の静脈内または皮下注射であるが、本発明には鼻腔内、経口、舌下、経皮または筋肉内など別の投与経路も含まれる。

本発明のＶＩＩＩ因子分子は、当技術分野で既知の組換えタンパク質調製のための、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞などの発現系を用いる方法により調製できる。

本発明のＶＩＩＩ因子分子は、組換え法により、たとえば細菌細胞（たとえば、大腸菌(Escherichia coli)）、酵母細胞（たとえば、ピチア属(Pichia)種、ハンゼヌラ属(Hansenula)種、酵母菌属(Saccharomyces)種、または分裂酵母菌属(Schizosaccharomyces)種）、昆虫細胞（たとえば、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)またはキンウワバ(Trichoplusia ni)由来のもの）、植物細胞または哺乳動物細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＣＯＳ細胞）において調製できる。その際、それに要求される適切な発現ベクター（プロモーターおよび終止配列など、さらなる情報を含むもの）の構築は、一方で標準組換えＤＮＡ法を伴なう。組換え調製した本発明のＶＩＩＩ因子分子は、より大きな前駆タンパク質から、たとえばそのペプチドまたはポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に挿入した酵素開裂部位の酵素開裂により得ることができ、続いて適切に精製される。

本発明はまた、本発明のＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸配列、およびたとえば組換え発現または遺伝子療法のためのそれらの使用に関する。特に、それらの核酸配列は本発明のＶＩＩＩ因子分子を発現することができる。

遺伝子療法において、本発明のＶＩＩＩ因子分子をコードする組換え核酸分子を裸のＤＮＡとして、またはターゲット細胞へ送達するためのリポソームその他の脂質系において使用できる。ヒト遺伝子療法に使用するためにプラスミドＤＮＡを細胞内へ直接移入するための他の方法は当業者に周知であり、プラスミドＤＮＡをタンパク質に複合体化することによりＤＮＡを細胞上の受容体にターゲティングさせることを伴なう。遺伝子移入は、それの最も単純な形態では、少量のＤＮＡを細胞の核内へマイクロインジェクション法で単に注入することにより実施できる。組換え遺伝子が細胞に導入されると、それらを転写および翻訳のための普通の細胞機序が認識でき、遺伝子生成物が発現するであろう。ＤＮＡをより多数の細胞に導入するために他の方法も試みられた。これらには下記のものが含まれる：トランスフェクション、この方法ではＤＮＡをリン酸カルシウムと共に沈殿させてピノサイトーシスにより細胞に取り込ませる；エレクトロポレーション、この方法では細胞に大きな電圧パルスを印加して膜に孔を設ける；リポフェクション／リポソーム融合、この方法ではＤＮＡを親油性ベシクルに充填してそれをターゲット細胞と融合させる；および小型の投射体に結合させたＤＮＡを用いる粒子衝撃法。ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法は、化学修飾したタンパク質にＤＮＡをカップリングさせるものである。アデノウイルスタンパク質はエンドソームを脱安定化して細胞内へのＤＮＡの取込みを増大させることができる。ＤＮＡ複合体を含有する溶液にアデノウイルスを混合するか、あるいはアデノウイルスに共有結合したポリリシンにタンパク質架橋剤を用いてＤＮＡを結合させることにより、組換え遺伝子の取込みおよび発現が実質的に改善される。アデノ随伴ウイルスベクターも遺伝子送達に使用できる。本明細書中で用いる“遺伝子移入(gene transfer)”は、外来核酸分子を細胞に導入するプロセスを意味し、それは遺伝子がコードする特定の生成物の発現を可能にするために一般的に実施されている。その生成物には、タンパク質、ポリペプチド、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、または酵素活性ＲＮＡを含めることができる。遺伝子移入は、培養細胞において、または哺乳動物への直接投与により実施できる。他の態様において、本発明によるＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸分子配列を含むベクターが提供される。特定の態様において、核酸分子配列が特定の組織のみにおいて発現するようにベクターを作製する。組織特異的な遺伝子発現を達成する方法は当技術分野で周知であり、たとえば本発明のＶＩＩＩ因子分子をコードする配列を、１以上の組織または臓器におけるその分子の特異的発現を指令するプロモーターの制御下におくことによる。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＲＮＡウイルスまたはウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、本発明によるペプチド、そのホモログまたは誘導体をコードするヌクレオチド配列（たとえば、ｃＤＮＡ）をターゲット組織または細胞集団内へ送達するために使用できる。当業者に周知の方法を用いて、そのようなコード配列を含む組換えウイルスベクターを構築できる。あるいは、本発明によるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子を内包する工学的に処理した細胞を、遺伝子療法に使用できる。

本発明のＶＩＩＩ因子分子は、当技術分野で既知の方法により修飾できる。ＶＩＩＩ因子分子は、ＶＩＩＩ因子の配列の全体またはそれの一部分のみを含むことができる。一例はＢドメインを欠失したＶＩＩＩ因子分子により示される。ＢドメインはＶＩＩＩ因子の機能にとって欠如してもよく、したがって欠失してもＶＩＩＩ因子機能に影響はない。ａ２およびａ３ドメインは通常はアミノ酸配列により連結しており、それは人工的な配列であってもよく、あるいはＢドメイン自体からの配列であってもよい。ＶＩＩＩ因子の安定性を高めるように、ＶＩＩＩ因子分子をアミノ酸の付加および／または置換により修飾することができる；たとえば、Ａ２ドメインの崩壊速度を低下させることによるか、あるいはタンパク質分解酵素に対するＶＩＩＩ因子の抵抗性を高めることによる。たとえば、ＦｃＲｎ受容体によるリサイクリングを高めるために抗体のＦｃガンマ部分にカップリングさせることにより、ＶＩＩＩ因子分子を安定化させることができる。ポリエチレングリコール残基（ＰＥＧ誘導体）または別の化学置換を用いて分解を低減することにより、ＶＩＩＩ因子を安定化することができる。これらの修飾はすべて本発明の範囲内であるとみなされる。

先行技術(Swaroop et al., The Journal of Biological Chemistry, vol 272, pp 24121-24124, 1997; Cerullo et al., Molecular Therapy, vol 15, pp 2080-2087, 2007)は、Ｆ３０９（ＳＥＱ ＩＤ ２）の変異がＶＩＩＩ因子構築体をトランスフェクションした細胞によるＶＩＩＩ因子分子の産生速度を高めることを確認した。Cerulloらは、このＦ３０９変異体で処理したＶＩＩＩ因子ＫＯマウスにおいて阻害抗体の産生低下が有意ではないことを観察した；これは、そのような変異体をＶＩＩＩ因子免疫原性の低下のために使用することから当業者が遠ざかる教示をする。さらに、その先行技術にはＦ３０９がＣＤ１ｄ結合モチーフの一部分である可能性があることは述べられていない。

本発明の医薬は、必ずしもそうではないが、通常は有効成分として少なくとも１種類の本発明のＶＩＩＩ因子分子、そのＶＩＩＩ因子分子を発現できる遺伝子療法ベクターを含む（医薬）配合物である。有効成分（単数または複数）のほかに、そのような配合物は少なくとも１種類の（医薬的に許容できる）希釈剤を含むであろう。医薬的に許容できる化合物は、たとえば薬局方ハンドブック（たとえば、米国、欧州または国際薬局方）中にある。本発明の医薬または医薬組成物は、普通は（予防または療法）有効量の有効成分（単数または複数）を含み、その際、有効性は予防または治療すべき状態または障害に対するものである。

本発明の医薬または医薬組成物は、好ましい態様において、必要な対象に、その医薬または組成物の多数回投与を含む予防または療法計画の一部として投与することが必要な場合がある。そのような多数回投与は通常は連続的に行なわれ、２回の投与の間隔は変更でき、有効成分の性質および予防または治療すべき状態の性質に合わせて調整されるであろう。単回投与を必要とする対象に投与する有効成分の量も変更でき、その対象の身体状況（たとえば、体重および年齢）、予防または治療すべき状態の状況、ならびに処置する医師、内科医または看護士の経験などの要因に依存するであろう。

用語“希釈剤”は、たとえば生理食塩水を表わす。用語“医薬的に許容できるキャリヤー”は、下記のために有効成分をそれと共に配合するいずれかの材料または物質を意味する；たとえばその組成物を溶解、分散もしくは拡散させることにより処置すべき部位への適用もしくは播種を容易にするために、および／またはそれの有効性を損なうことなく貯蔵、輸送もしくは取扱いを容易にするために。それらには、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤（たとえば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張化剤（たとえば、糖類または塩化ナトリウム）などが含まれる。組成物中の有効成分の作用持続時間を制御するために追加成分を含有させてもよい。医薬的に許容できるキャリヤーは固体もしくは液体、または圧縮して液体にした気体であってもよく、すなわち本発明の組成物は適切には濃縮液剤、乳剤、液剤、顆粒剤、散粉剤、スプレー剤、エアゾル剤、懸濁液剤、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、ペレット剤または散剤として使用できる。それらの医薬組成物中に用いるのに適した医薬用キャリヤーおよびそれらの配合物は当業者に周知であり、本発明の範囲内でそれらの選択に対する特別な制限はない。それらは添加剤、たとえば湿潤剤、分散剤、展着剤、接着剤、乳化剤、溶剤、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤（たとえば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張剤（たとえば、糖類または塩化ナトリウム）などをも含有することができる；ただし、それらが医療実施と調和する限りにおいてであり、すなわち哺乳動物に永続的な損傷を生じないキャリヤーおよび添加剤である。本発明の医薬組成物は、いずれか既知の様式で、たとえば有効成分を１工程または多工程で、選択したキャリヤー材料および適切な場合には界面活性剤など他の添加剤と均一に混合し、それらでコーティングし、および／またはそれらと共に粉砕することにより調製できる。それらは、有効成分の制御放出または持続放出のために、たとえばそれらを通常は約１〜１０μｍの直径をもつマイクロスフェアの形態で得るという観点で、すなわちマイクロカプセルの作成のために、微細化によっても調製できる。

配合物は好都合には単位剤形で提供でき、医薬技術分野で周知のいずれかの方法で調製できる。

本発明を具体的に説明するため以下の実施例を示す。ただし、本発明をそのような例に限定する意図はない。

実施例１：
ＣＤ１ｄテトラマーへのペプチドＳＥＱ ＩＤ １の結合
ＳＥＱ ＩＤ １を含むペプチドを化学合成により得た。このペプチドを、一夜のインキュベーションによりＣＤ１ｄテトラマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）に装填するために用いた。
ナイーブマウスの脾臓から磁性ビーズを用いてすべてのＣＤ４（−）細胞を除去することによりＮＫＴ細胞を調製した。
ＣＤ４＋細胞を次いで、ＳＥＱ ＩＤ １（図１のＰ２８ ＷＴ）のペプチド（アミノ酸配列１９０−２０９に対応する）を装填したＣＤ１ｄテトラマーと共にインキュベートした。
図１は、±１％のＣＤ４＋ Ｔ細胞が検出されたことを示す。さらに、ＳＥＱ ＩＤ １を２部分に分け、配列１９０−２００（ＳＥＱ ＩＤ ３，図１のＰ２８ Ａ）および２００−２１０（ＳＥＱ ＩＤ ４，図１のＰ２８ Ｂ）を含む合成ペプチドを調製した。
ＳＥＱ ＩＤ ３のペプチドの配列は、下記のとおりである：
ＱＴＬＨＫＦＩＬＬＦＡ（アミノ酸配列１９０−２００に対応する）
ＳＥＱ ＩＤ ４のペプチドの配列は、下記のとおりである：
ＡＶＦＤＥＧＫＳＷＨＳ（アミノ酸配列２００−２１０に対応する）
この図は主要ＣＤ１ｄ結合モチーフがＳＥＱ ＩＤ ３に存在し、限られてはいるが有意％のＮＫＴ細胞がＳＥＱ ＩＤ ４のペプチドによって検出されたことを示す。
したがって、主要ＣＤ１ｄ結合モチーフはＳＥＱ ＩＤ ３に存在すると結論された。

実施例２：
ＳＥＱ ＩＤ １のペプチドを装填したＪＡＷＳ２細胞を用いる免疫化によるＮＫＴ細胞の活性化
ＪＡＷＳ２細胞はＣＤ１ｄを発現するが、ＭＨＣクラスＩＩ決定基を発現しない。ＳＥＱ ＩＤ １のペプチドの提示をＣＤ１ｄにより行なうことができることを示すために、これらの細胞を用いた。
ＪＡＷＳ２細胞を３７℃で２時間、ＳＥＱ ＩＤ １のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、２回、十分に洗浄した。細胞を次いでマイトマイシンで処理して細胞分裂を遮断し、４回洗浄してマイトマイシンを除去した。生理的血清中に２×１０^６個の細胞を含有する細胞懸濁液を、腹腔内経路により３匹のナイーブなＶＩＩＩ因子ＫＯマウスのシリーズそれぞれに注射した。対照として、３匹のナイーブなＶＩＩＩ因子ＫＯマウスに、ＳＥＱ ＩＤ １のペプチドと共にインキュベートしていない同数のＪＡＷＳ２細胞を投与した。

腹腔内注射の５日後にマウスを屠殺し、それらの脾臓を前記に従って磁性ビーズを用いて調製して、すべてのＣＤ４（−）細胞を除去した。
ＣＤ４＋細胞を次いで、ＳＥＱ ＩＤ １のペプチドを装填したテトラマーと共にインキュベートした。
図２は、天然レパトア内に存在するＮＫＴ細胞のうち有意割合（８％）がＳＥＱ ＩＤ １のペプチドに対して特異的であること、およびＳＥＱ ＩＤ １のペプチドがＪＡＷＳ２細胞により提示されるとその割合が倍増すること（１６％）を示す。
このＮＫＴ細胞検出の特異性は、非装填テトラマーおよびＳＥＱ ＩＤ １のペプチドとは関連のないペプチドを装填したテトラマーの場合にはＮＫＴが検出されないことにより示される。
したがって、ＳＥＱ ＩＤ １のペプチドの提示がＣＤ１ｄ提示により行なわれ、この提示はＮＫＴ細胞を結合して活性化するのに十分であると結論された。

実施例３：
変異型ＶＩＩＩ因子の投与はＶＩＩＩ因子に対する抗体の形成を低下させる
ＶＩＩＩ因子中のＣＤ１ｄ結合モチーフを除去することを目的とした変異が抗ＶＩＩＩ因子抗体の濃度を低下せることができるかどうかを判定するために、野生型または変異型ＶＩＩＩ因子をプラスミドｐＧＣ５ＡＭ−ＥＮ中にクローニングした。オーバーラップ伸長によるスプライシングを用いるＰＣＲ(PCR and the splicing by overlap extension）（ＳＯＥ−ＰＣＲ）法を用いて、位置Ｆ３０９およびＨ３１５における変異（それぞれの場合、アラニンに）をＶＩＩＩ因子の配列に導入した。
天然配列または変異配列のいずれかを収容したプラスミドを配列決定により検査し、マキシプレップ(maxiprep)により調製した。
プラスミド（１００μｇ，２ｍｌ中）をナイーブなＶＩＩＩ因子ＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（グループ当たり３匹）に動水圧法(hydrodynamic pressure method)（７秒以内で注入を行なった）により直接投与した；これはプラスミドを本質的に肝臓へ指向させることが当技術分野で知られている。対照マウスに同じ方法で、ただし無装填(naked)プラスミドを注入した（ｎ＝３）。
合計３回の注入を１０日間隔で行なった。
最終注入の１０日後、ＶＩＩＩ因子に対する抗体の血漿濃度、およびＶＩＩＩ因子の機能を阻害する抗体の濃度を、それぞれＥＬＩＳＡおよび発色アッセイ(chromogenic assay)により測定した。
図３ａは、ＶＩＩＩ因子変異体Ｆ３０９Ａ−Ｈ３１５Ａを注入したマウスにおいて３．６倍の抗体減少がみられたことを示す。図３ｂは、ＶＩＩＩ因子の機能を阻害する抗体が３．６倍減少したことを示す。
これらのデータは、ＶＩＩＩ因子の機能を阻害するものを含めて特異的抗体の濃度を有意に低下させるために、ＶＩＩＩ因子分子中の単一のＣＤ１ｄ結合モチーフの除去で十分であることを示した。

実施例４：
ＣＤ１ｄ結合モチーフを含むペプチドと共にインキュベートした際のヒト抗原提示細胞におけるＣＤ１ｄの発現増大
ヒト抗原提示細胞がＣＤ１ｄ分子に関連してペプチドエピトープをプロセシングして提示する能力をもつかどうかを判定するために、ヒトマクロファージ細胞系Ｕ９３７を用いた。その細胞はクラスＩＩ主要組織適合性複合体を発現しないので、ＣＤ１ｄによる提示を評価するために用いられる。
特異的な抗ＣＤ１ｄ抗体で検出したＣＤ１ｄを発現している休止期Ｕ９３７細胞の割合は低い。ＣＤ１ｄに結合できるようにする配列モチーフをもつペプチドと共にＵ９３７細胞をインキュベートすれば、これを細胞表面におけるＣＤ１ｄ発現の増大により検出できるはずであると推論した。ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含むペプチドについて見られたように、ペプチドの結合によりその分子（クラスＩＩ、またはこの場合にはＣＤ１ｄ）のコンホメーションが安定化し、その複合体を細胞表面に繋ぎ留めることができ、それの細胞内リサイクリングが低下する。
Ｕ９３７細胞（７×１０^５個）を３７℃で２４時間、５μｇの、ＣＤ１ｄ結合モチーフを含むペプチドまたは対照類と共にインキュベートした。細胞を次いで洗浄し、蛍光標識したＣＤ１ｄ特異的抗体と共にインキュベートし、ＦＡＣＳシステムを用いて陽性細胞の数を評価した。
図４は、ＣＤ１ｄを発現する細胞の割合が、対照実験における６％から、ＣＤ１ｄ結合配列を含むペプチドを用いた場合の１３％に増加することを示す。ヒストグラムとして示したデータは３回測定の平均であり、星印は対照値より有意に高い結果を示す（ｐ＜０．０５）。
対照は（左から右へ）、非装填Ｕ９３７、アルファ−ｇａｌ−セラミドと共にインキュベートした細胞、および一般的なクラスＩＩ限定エピトープ（ＭＨＣＩＩ−ＭＯＧ）を含む。この実験は、ＶＩＩＩ因子配列のアミノ酸１８８−２０４に対応するヒト由来（ＩＤ ＳＥＱ ５）またはマウス由来（ＩＤ ＳＥＱ ６）ＶＩＩＩ因子の配列を含む。
したがって、ヒト抗原提示細胞はそのペプチドと共にインキュベートした際に、ペプチドと細胞の表面にあるＣＤ１ｄとの複合体を安定化すると結論される。

実施例５：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＣＤ１ｄ結合ペプチドエピトープに対して特異的なＮＫＴ細胞を含む
ヒトＰＢＭＣがＣＤ１ｄ結合ペプチドエピトープと反応する細胞を含有するかどうかを確認するために、Ｔ細胞受容体のＶａｌｐｈａ２４−Ｊａｌｐｈａ１８鎖（いわゆるインバリアント鎖）に対して特異的な抗体でコートした磁性ビーズを用いて、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞をバフィーコートから調製した。
次いでこのヒトｉＮＫＴ細胞（１０^５／条件）を、ヒトＶＩＩＩ因子のアミノ酸残基１８８−２０４を含むペプチド（ＩＤ ＳＥＱ ５）または対照ペプチド（ＭＨＣＩＩ−ＭＯＧ）のいずれかを５μｇ装填したマイトマイシン−Ｃ処理Ｕ９３７細胞（比率１：１）と共にインキュベートした。インキュベーションを３７℃で２週間、１０％のウシ胎仔血清および５０Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ中で実施した。
培養プレートを細胞クラスターの存在について目視検査した。ＩＤ ＳＥＱ ５のペプチドを装填したＵ９３７を用いるとアルファ−ｇａｌ−セラミドを装填したものと同程度に細胞クランプが生成したが、対照ペプチド（ＭＨＣＩＩ−ＭＯＧ）では生成しなかったことが認められる。図５は、この所見の３つの顕微鏡視野のカウントの平均を示す（最低１０個の細胞／クラスター）。
したがって、ヒト末梢血レパトアは、ＣＤ１ｄにより提示されるペプチドと反応するインバリアント鎖ＮＫＴ細胞として規定される細胞を含有すると結論される。

実施例６：
ＣＤ１ｄ結合裂溝の外側に存在するフランキング残基が効果的な細胞表面提示のために重要である
実施例１に示した実験は、ヒトＶＩＩＩ因子アミノ酸１９０−２００に対応するＳＥＱ ＩＤ ３のペプチドがＣＤ１ｄテトラマーに結合し、ＮＫＴ細胞の検出を可能にすることを示す；これは、この配列がＣＤ１ｄに対する最小結合モチーフを含んでいたことの指標となる。このモチーフが細胞による効果的な提示に十分であるかどうかを判定するために、実施例４に報告した実験をＳＥＱ ＩＤ ３について繰り返した。
図６は、ＳＥＱ ＩＤ ３のペプチドが、図４に示したＳＥＱ ＩＤ ５のペプチドと対照的に、Ｕ９３７細胞の表面におけるＣＤ１ｄの発現を増大させなかったことを示す。
したがって、ＣＤ１ｄ結合モチーフを含むペプチドの効果的なインビボ装填にはＣＤ１ｄ裂溝の外側にあるフランキング領域の存在が必要であると結論される。

実施例７：
ＣＤ１ｄ結合ＶＩＩＩ因子エピトープに対して特異的なＮＫＴ細胞はＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両系列に属する
ＮＫＴ細胞が属する系列を判定するために、実施例２に記載した実験を行なった。そこで、ＪＡＷＳ２細胞にＳＥＱ ＩＤ ３、Ｂドメイン欠失ＶＩＩＩ因子、アルファ−ｇａｌ−セラミドを装填した後、あるいは装填しないままで、ＶＩＩＩ因子ＫＯマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した（細胞２×１０^６個／マウス）。腹腔内注射の５日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を調製した。次いで細胞懸濁液を、ＳＥＱ ＩＤ３またはアルファ−ｇａｌ−セラミドを装填しない、または装填した、ＣＤ１ｄテトラマーと反応させた。
ｆａｃｃｓ分析のために、ＣＤ１ｄテトラマーを結合する細胞を、ＤＸ５−およびＣＤ１６０−特異的抗体ならびに抗ＣＤ４または抗ＣＤ８抗体で標識した。表にその結果をまとめる。

これらの実験は下記のことを示す：
・ ＮＫＴ細胞の天然レパトアは、ＩＤ ＳＥＱ ３のペプチドに反応する有意数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋両系列の細胞を含有する（列３）
・ ＩＤ ＳＥＱ ３のペプチドで免疫化することにより、この細胞集団をさらに拡張できる；この場合もＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両系列（列６）
・ ＶＩＩＩ因子による免疫化は、これらの細胞集団を拡張するのにさらにいっそう効果的である（列９）
・ アルファ−ｇａｌ−セラミドによる免疫化は、ＩＤ ＳＥＱ ３のペプチドに対して特異的なＣＤ４＋ Ｔ細胞の数をわずかに増加させるが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の数は増加させない
合わせると、これらの結果はＶＩＩＩ因子による免疫化がＣＤ４＋およびＣＤ８＋両方の表現型のＮＫＴ系列に属する細胞の拡張を誘発することを示す。

配列
ＩＤ１ ＱＴＬＨＫＦＩＬＬＦＡＶＦＤＥＧＫＳＷＨ（ヒト１９０−２０９）
ＩＤ２ ＦＣＨＩＳＳＨＱＨＤＧＭＥＡＹ（ヒト３０９−３２３）
ＩＤ３ ＱＴＬＨＫＦＩＬＬＦＡ（ヒト１９０−２００）
ＩＤ４ ＡＶＦＤＥＧＫＳＷＨＳ（ヒト２００−２１０）
ＩＤ５ ＫＴＱＴＬＨＫＦＩＬＬＦＡＶＦＤＥ（ヒト１８８−２０４）
ＩＤ６ ＲＴＱＭＬＹＱＦＶＬＬＦＡＶＦＤＥ（マウス１８８−２０４）

Claims (22)

1. ドメイン構造Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２（Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１およびＣ２はドメインを表わし、ａ１、ａ２およびａ３はそれらのドメインを連結する酸性領域である）をもつＶＩＩＩ因子分子であって、ＮＫＴ細胞を活性化する能力が低下した、下記により得られるＶＩＩＩ因子分子：
   ａ．少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープであって、位置Ｐ１および／またはＰ７に疎水性アミノ酸残基を含むエピトープを同定する；
   ｂ．位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するか、位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を非疎水性残基で置換するか、あるいは位置Ｐ１および／またはＰ７に非疎水性残基を付加することにより、そのエピトープ（単数または複数）を修飾する。
2. 位置Ｐ１および／またはＰ７の疎水性残基がＦ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙであることを特徴とする、請求項１に記載のＶＩＩＩ因子分子。
3. ＮＫＴ細胞エピトープがＰ４に脂肪族残基を含み、その脂肪族残基がＩ、Ｌ、Ｍであることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分子。
4. ＮＫＴ細胞エピトープのモチーフが［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ_２Ｘ_３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ_５Ｘ_６−［ＦＷＴＨＹ］であることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分子。
5. 位置Ｐ１および／またはＰ７のＦ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙのうち少なくとも１つが、少なくとも１つのいずれかの天然アミノ酸、非天然アミノ酸または非芳香族アミノ酸化合物により置換され、そのアミノ酸がＦ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙとは異なることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分子。
6. 位置Ｐ−１および／またはＰ−２および／またはＰ８および／またはＰ９のＦ、Ｗ、Ｔ、Ｈ、Ｙのうち少なくとも１つが、非疎水性残基で置換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分子。
7. Ｐ１および／またはＰ７位に隣接する位置Ｐ−２、Ｐ−１、Ｐ２、Ｐ６、Ｐ８および／またはＰ９に存在する少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を含み、その少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基が非疎水性残基で置換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分子。
8. 位置Ｐ−２、Ｐ−１、Ｐ２、Ｐ６、Ｐ８および／またはＰ９に存在する少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基がＦ、Ｗ、Ｔ、ＨまたはＹとは異なることを特徴とする、請求項７に記載のＶＩＩＩ因子分子。
9. ＮＫＴ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋系列に属することを特徴とする、請求項１に記載のＶＩＩＩ因子分子。
10. ＮＫＴ細胞エピトープがＶＩＩＩ因子のＡ１ドメイン内に存在することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分子。
11. ＮＫＴ細胞エピトープがアミノ酸配列１９０−２０９および／または３０９−３１６内に存在することを特徴とする、請求項１０に記載のＶＩＩＩ因子分子。
12. 分子が、Ｂドメインの欠失により、および／またはアミノ酸（単数または複数）の付加もしくは置換により、さらに修飾されていることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分子。
13. 分子が組換え発現により製造されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分子。
14. 医薬として使用するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分子。
15. 分子をタンパク質の形で、または遺伝子療法により投与する、請求項１４に記載のＶＩＩＩ因子分子。
16. 先天性または後天性の血友病Ａの処置における医薬として使用するための、請求項１５に記載のＶＩＩＩ因子分子。
17. 敗血症性ショック、急性フィブリン溶解、多発外傷または脳内出血などにおける出血性障害を伴なう患者の処置における医薬として使用するための、請求項１５に記載のＶＩＩＩ因子分子。
18. ＮＫＴ細胞を活性化する能力が低下したＶＩＩＩ因子分子を得るための、下記の工程を含む方法：
    ａ．少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープであって、位置Ｐ１および／またはＰ７に疎水性アミノ酸残基を含むエピトープを同定する；
    ｂ．位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するか、位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を非疎水性残基で置換するか、あるいは位置Ｐ１および／またはＰ７に非疎水性残基を付加することにより、そのエピトープ（単数または複数）を修飾する。
19. ＮＫＴ細胞エピトープが［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ_２Ｘ_３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ_５Ｘ_６−［ＦＷＴＨＹ］である、請求項１８に記載の方法。
20. ＶＩＩＩ因子分子の免疫原性を低下させるための、下記の工程を含む方法：
    ａ．少なくとも１つのＮＫＴ細胞エピトープであって、位置Ｐ１および／またはＰ７に疎水性アミノ酸残基を含むエピトープを同定する；
    ｂ．位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を除去するか、位置Ｐ１および／またはＰ７の少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を非疎水性残基で置換するか、あるいは位置Ｐ１および／またはＰ７に非疎水性残基を付加することにより、そのエピトープ（単数または複数）を修飾する。
21. ＮＫＴ細胞エピトープが［ＦＷＴＨＹ］−Ｘ_２Ｘ_３−［ＩＬＭＶ］−Ｘ_５Ｘ_６−［ＦＷＴＨＹ］である、請求項２０に記載の方法。
22. Ｐ１および／またはＰ７位に隣接する位置Ｐ−２、Ｐ−１、Ｐ２、Ｐ６、Ｐ８および／またはＰ９に存在する少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基が非疎水性残基で置換されていることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の方法。
    

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