BR112014028575B1 - Moléculas de fator de coagulação viii, seu uso e método para reduzir a imunogenicidade das mesmas - Google Patents
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Abstract
FATOR DE COAGULAÇÃO VIII COM IMUNOGENICIDADE REDUZIDA. A presente invenção refere-se às moléculas de fator VIII com uma capacidade reduzida para induzir a ativação das células NKT para a utilização no tratamento da hemofilia A congênita e / ou adquiri-da e de distúrbios hemorrágicos. A referida molécula de fator VIII pode ser obtida por meio de: a. identificação de, pelo menos, um epitopo de células NKT, em que o referido epitopo compreende os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos nas posições P1 e / ou P7 b. modificação do(s) referido(s) epitopo(s) através da eliminação de pelo menos um resíduo aminoácido hidrofóbico na posição P1 e / ou P7, substituindo pelo menos um resíduo aminoácido hidrofóbico na posição P1 e / ou P7 com um resíduo hidrofóbico ou a adição de um resíduo não hidrofóbico na posição P1 e / ou P7.
Description
[001] A presente invenção se refere às moléculas de fator de coagulação VIII com reduzida ou falta de imunogenicidade e a sua utilização na terapia de distúrbios de coagulação e, em particular, no tratamento da hemofilia de tipo A.
[002] O fator VIII é um fator de coagulação atuando como um cofator na geração de trombina, um componente essencial de coagulação. Na ausência ou insuficiência de fator VIII funcional, os pacientes sofrem de distúrbios hemorrágicos, chamados coletivamente de hemofilia A. Existem dois tipos de hemofilia A, dependendo de sua origem, seja genética (hemofilia espontânea) ou adquirida (hemofilia adquirida ou autoimune). A hemofilia espontânea A é uma doença que afeta os homens, devido à localização do gene de fator VIII no cromossoma X. As mulheres são portadoras, mas não sofrem de problemas de hemorragias, devido à presença de dois cromossomas X. A hemofilia espontânea é dividida em três subgrupos de pacientes, definidos de acordo com o nível de fator VIII circulante: hemofilia grave (menos de 1 % de fator VIII), hemofilia leve (de 1 a 5 % de fator VIII) e moderada (concentrações de fator VIII entre 5 e 10 %).
[003] Os pacientes que sofrem de hemofilia necessitam de uma substituição terapêutica por meio do fator VIII. Esta é uma terapia continuada para pacientes graves de hemofilia A, devido ao risco aumentado de espontânea, às vezes hemorragia fatal, ou intermitente em pacientes com hemofilia leve ou moderada, nos quais o fator VIII é necessário quando há um trauma ou cirurgia e uma demanda aguda das concentrações aumentadas do fator VIII.
[004] De longe, as principais complicações que pacientes que sofrem de hemofilia A têm de enfrentar é o surgimento de anticorpos em relação ao agente terapêutico (fator VIII) utilizado para restaurar a coagulação funcional. Existem atualmente dois tipos de fator VIII utilizados para a terapia de substituição, derivado de plasma e recombinante. O fator VIII derivado do plasma é produzido a partir de plasma humano e contém proteínas adicionais e em particular o acompanhante fisiológico do fator VIII, o fator von Willebrand. O fator VIII recombinante é produzido por meio de engenharia genética e produção de células de animais ou de origem humana. O fator VIII recombinante é puro e não contém o fator de von Willebrand. A controvérsia vívida está em andamento para determinar se existe uma diferença significativa no risco de provocar uma resposta imune antifator VIII ao usar a molécula derivada do plasma ou fator VIII recombinante. Seja qual for a situação, em média, 25% dos pacientes tratados com o fator VIII como um agente terapêutico criam anticorpos que inibem a atividade do agente de substituição. Tais anticorpos são chamados inibidores do fator VIII.
[005] Não há cura para os inibidores do fator VIII. Em termos empíricos, foi demonstrado que a administração de doses muito elevadas de fator VIII, em uma base diária pode resultar, em alguns casos, em um desaparecimento de inibidores. Esta terapia, chamada de indução de tolerância imunológica, não é fiável para o seu sucesso. A ausência de marcadores de substituição capaz de prever o resultado da tolerância imunológica, de fato, limita a sua utilização, em uma tentativa de eliminar a formação de inibidores do fator VIII. Além disso, o custo proibitivo relacionado com a indução de tolerância é tal que apenas alguns pacientes podem ser considerados para a indução de tolerância.
[006] Os inibidores do fator VIII são anticorpos específicos de elevada afinidade, o que implica a participação de linfócitos T na sua formação. A consequência disto é que a resposta imunitária é totalmente memorizada, deixando as populações de células B de memória, o qual após a estimulação, transformam-se em plasmócitos que produzem os anticorpos e as células T de memória, que mantêm a capacidade de montar mais resposta de anticorpos em cada exposição subsequente ao fator VIII. Os pacientes que se apresentam com inibidores de fator VIII não podem ser tratados com o fator VIII, não só porque os inibidores neutralizam a função do fator VIII e, provavelmente, aumentam a taxa de eliminação do fator VIII, mas também porque cada exposição posterior ao fator VIII aumenta as concentrações de tais inibidores.
[007] O pedido de patente WO 2009/101206 descreve um método através do qual é possível eliminar a produção de inibidores de atuar ao nível da imunidade adaptativa, nomeadamente ao nível da interação entre o fator VIII de células T e B específico. Este pedido de Patente descreve como o risco de produzir novos inibidores sobre o fator da exposição poder ser eliminado, mas também como inibidores já existentes podem ser erradicados. No entanto, foi-se inesperadamente descoberto que o fator VIII é um ativador muito potente da imunidade inata, que parece ser um pré-requisito para induzir uma resposta adaptativa e inibidores. Dado que o fator VIII tem que ser administrado em uma base regular (por exemplo, duas ou três vezes por semana para pacientes com hemofilia A grave), e que, por conseguinte, o risco de provocar uma nova produção de inibidores do fator VIII persiste, existe uma necessidade urgente para definir os métodos pelos quais as moléculas de fator VIII terapêuticos podem ser produzidas, os quais perderam a sua capacidade em ativar a imunidade inata.
[008] O pedido de patente PCT / EP2011 / 070911 descreve os métodos pelos quais as proteínas com capacidade de ativar as células NKT podem ser transformadas de modo a perder essa capacidade. Dessa maneira, as células NKT são parte do sistema imune inato, o que é convencionalmente definido como falta de memorização. No entanto, tal como descrito no pedido de patente PCT / EP2011 / 070911, as células NKT podem reconhecer e serem ativadas por meio da apresentação de peptídeos hidrofóbicos por meio da molécula CD1d. À medida que o peptídeo é derivado de um antígeno para o qual as células NKT são específicos, isto representa uma ativação do sistema imune inato específico de antígeno. O pedido PCT acima mencionado descreve os métodos pelos quais as proteínas que mostram a propriedade de ativar as células NKT específicos de antígenos podem ser modificadas por meio da substituição ou deleção de aminoácidos, eliminando, dessa maneira, a capacidade de se ligar a CD1d.
[009] A presente invenção descreve as moléculas de fator VIII obtidas por meio da metodologia descrita no pedido de patente PCT / EP2011 / 070911, as quais perderam a sua capacidade de ativar o sistema imune inato e, consequentemente, demonstram a falta ou a capacidade significativamente reduzida para ativar uma resposta imune adaptativa com a produção de inibidores. A presente invenção descreve ainda a utilização de tais moléculas de fator VIII para o tratamento de pacientes com necessidade de terapia de substituição e, em particular, os pacientes com hemofilia A grave. A presente invenção também descreve os métodos em que a terapia do gene utilizando as moléculas de fator VIII da presente invenção podem ser utilizados.
[0010] A presente invenção se refere à produção de moléculas de fator VIII com imunogenicidade reduzida.
[0011] A presente invenção também se refere à utilização das referidas moléculas de fator VIII para o tratamento de pacientes em necessidade de tal tratamento.
[0012] O pedido de patente PCT / EP2011 / 070911 descreve os métodos para se obter os peptídeos ou polipeptídeos com capacidade reduzida para ativar as células NKT. Dessa maneira, foi feita a descoberta inesperada de que uma proporção significativa de peptídeos ou polipeptídeos realizaram as sequências de aminoácidos que lhes permitem ligar e que serão apresentadas por meio dos determinantes CD1d para ativação de células T naturais assassinas (NKT). A ativação de tais células resulta na libertação de citocinas e, em alguns casos, em aquisição de ou no aumento de propriedades citolíticas.
[0013] A presente invenção se refere em um aspecto à utilização de pelo menos um polipeptídeo isolado utilizado como um alofator que foi modificado para eliminar, pelo menos, um resíduo de aminoácido hidrofóbico envolvido na formação de um epitopo reconhecido por meio das células NKT para a fabricação de um medicamento para a prevenção em um paciente das respostas imunitárias ao referido alofator.
[0014] Mais especificamente, a presente invenção se refere ao fator VIII e a utilização do fator VIII como um medicamento. O Fator VIII é um cofator do sistema de coagulação que participa da ativação da trombina, facilitando a formação de tenase, uma esterase serina que reúne o fator VIII, fator IX e fator X. O fator X carrega a atividade enzimática de conversão de trombina. Na ausência do fator VIII, a taxa de formação de tenase é drasticamente reduzida, deixando os pacientes em risco de hemorragias espontâneas, que são muitas vezes de risco de vida, e exige medidas terapêuticas rápidas. Quando a concentração de fator VIII é moderadamente reduzida (entre 5 e 10%), os pacientes geralmente sangram apenas sob o trauma ou cirurgia.
[0015] Os pacientes que sofrem de hemofilia A grave (menos de 1% de fator VIII) têm hemorragias espontâneas frequentes e necessitam de tratamento profilático ou em bólus ou administração contínua de injeção 2 ou 3 vezes por semana. Em complemento, os pacientes nos quais se observa um aumento do catabolismo do fator VIII, como no choque séptico, fibrinólise aguda, politraumatismo ou hemorragia cerebral, também estão em necessidade de administração de fator VIII.
[0016] O termo "peptídeo", quando utilizado na presente invenção, se refere a uma molécula que compreende uma sequência de aminoácidos de 2 a 200 aminoácidos, ligadas através de ligações peptídicas, mas que pode, em uma modalidade particular, compreender estruturas de não aminoácidos (como por exemplo, um composto de ligação orgânica). Os peptídeos de acordo com a presente invenção podem conter qualquer um dos 20 aminoácidos convencionais ou as versões modificadas do mesmo, ou pode conter aminoácidos de ocorrência não natural, incorporados por meio da síntese química de peptídeos ou através de modificação química ou enzimática. O termo "polipeptídeo", quando utilizado na presente invenção, se refere geralmente a peptídeos ou proteínas mais longos.
[0017] O termo "epitopo", quando utilizado na presente invenção, se refere a uma ou várias porções (que pode definir um epitopo conformacional) de uma proteína que é / são especificamente reconhecida e ligada por meio de um anticorpo ou uma porção do mesmo (Fab’, Fab2', etc) ou um receptor presente na superfície celular de um linfócito de células T ou B, e que é capaz, por meio da referida ligação, de induzir uma resposta imune.
[0018] O termo "antígeno", quando utilizado na presente invenção, se refere a uma estrutura de uma macromolécula que compreende um ou mais hapteno (s) e / ou compreendendo um ou mais epitopos de células T. Tipicamente, a referida macromolécula é uma proteína ou peptídeo (com ou sem polissacarídeos) ou feito de composição proteica e compreende um ou mais epitopos; a referida macromolécula pode, de uma maneira alternativa, ser referida na presente invenção como "proteína antigênica" ou "peptídeo antigênico".
[0019] O termo "epitopo de células T" ou "epitopo de célula T", no contexto da presente invenção, se refere a um epitopo de células T dominante , subdominante ou menor, ou seja, uma parte de uma proteína antigênica que é especificamente reconhecida e ligada por meio de um receptor na superfície celular de um linfócito T. Se um epitopo é dominante, subdominante, ou menor, depende da reação imunológica provocada contra o epitopo. A dominância depende da frequência com que estes epitopos são reconhecidos por meio das células T e são capazes de ativar os mesmos, entre todos os possíveis epitopos de células T de uma proteína. Em particular, um epitopo de células T é um epitopo ligado por meio do MHC de classe I ou por meio das moléculas MHC de classe II.
[0020] O termo "epitopo de células NKT" se refere a uma parte de uma proteína antigênica que é especificamente reconhecida e ligada por meio de um receptor na superfície celular de um linfócito T. Em particular, um epitopo de células NKT é um epitopo ligado por meio das moléculas CD1d.
[0021] O termo "células efetoras CD4 +" se refere a células que pertencem ao subconjunto de células CD4-positiva das células T, cuja função é fornecer uma ajuda para outras células, tais como, por exemplo, células B. Estas células efetoras são convencionalmente reportadas como células Th (para as células T auxiliares), com diferentes subconjuntos, tais como as células Th0, Th1, Th2 e Th17.
[0022] O termo "células NKT" se refere a células do sistema imune inato, caracterizadas pelo fato de que elas reconhecem epitopos apresentados por meio da molécula CD1d. No contexto da presente invenção, as células NKT podem pertencer tanto a um subconjunto 1 (invariante) (iTNK), ou qualquer outro subconjunto que for ativado através da apresentação de epitopos peptídicos por meio de CD1d. O termo "células NKT" também inclui as células NKT pertencentes a qualquer linhagem de células CD4 ou CD8. NKT muitas vezes carregam receptores, tais como NK1.1 e NKG2D.
[0023] A "molécula CD1d" se refere a uma molécula derivada não- MHC feita de três cadeias alfa e um conjunto antiparalelo das cadeias beta dispostas em um sulco profundo hidrofóbico aberto em ambos os lados e capaz de apresentar lipídios, glicolipídios ou peptídeos hidrofóbicos para as células NKT.
[0024] O termo "distúrbios imunes" ou "doenças imunes" se refere a doenças em que uma reação do sistema imune é responsável por ou sustenta uma situação de mau funcionamento ou não fisiológico em um organismo. Os distúrbios imunes, no contexto da presente invenção, referem-se à patologia induzida por meio dos agentes infecciosos e de vigilância de tumores.
[0025] O termo "alofator" ou "aloantígeno" se refere a uma proteína, peptídeo ou fator (ou seja, qualquer molécula) que exibe o polimorfismo quando comparados entre dois pacientes da mesma espécie e, mais em geral, qualquer proteína, peptídeo ou fator que induz uma (alorreativo) resposta imunológica no paciente que recebe o alofator. Por extensão, os alofatores também incluem as proteínas geneticamente modificadas utilizadas para a alimentação.
[0026] A presente invenção se refere às moléculas de fator VIII para prevenir um paciente de uma resposta imune no sentido das referidas moléculas de fator VIII.
[0027] O fator VIII tem uma sequência madura feita de 2332 aminoácidos com uma estrutura de domínio A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1- C2, em que A1, A2, B, A3, C1 e C2 representam os domínios e a1, A2 e A3 representam as regiões ácidas que ligam os referidos domínios. Após o processamento proteolítico, que ocorre após a secreção, o fator VIII está presente no plasma sob a forma principal que consiste em um comprimento variável de A1-a1-A2-a2-B (comprimento é condicionado pelo comprimento do domínio B) ligado de forma não covalente às cadeias leves que consiste em A3-C1-C2.
[0028] FVIII acelera a ativação do fator X pelo fator IX em uma superfície de fosfolipídio apropriada, amplificando, dessa maneira, o processo de coagulação. A forma ativa do fator VIII é feita de um heterotrímero que consiste em A1-A1, A2, A2 e A3-C1-C2.
[0029] Em particular, a presente invenção proporciona os meios para evitar a expansão e a atividade funcional de células NKT. Tais células são geralmente classificadas em subconjuntos distintos, a saber: tipo 1 para células NKT transportando uma cadeia alfa TCR invariante (Valfa14 no camundongo, Valfa24 em seres humanos), ou do tipo 2 NKT que se apresentam com um repertório diversificado de cadeia alfa e se presume específica para sulfatídeos. No entanto, evidências recentes sugerem que subconjuntos alternativos de células NKT não se encaixam na categoria de tipo 1 ou tipo 2. É o objetivo da presente invenção incluir as células NKT não convencionais, que pode levar quer ao correceptor CD4 quanto CD8. Após a apresentação de um antígeno ligado a CD1d, as células NKT são rapidamente ativadas e secretam uma série de citocinas que se pensa ser determinante para influenciar outras células de ambos os sistemas imune inatos e adaptativos. Em algumas circunstâncias, as referidas células NKT ativadas adquirem ou aumentam as propriedades citotóxicas.
[0030] No contexto da presente invenção, é feito a observação inesperada de que os peptídeos podem ser apresentados por meio da molécula CD1d. Uma característica da molécula CD1d é que ela é constituída por duas cadeias alfa antiparalelas que formam uma fenda no topo de uma plataforma feita de duas cadeias beta antiparalelas. A fenda é estreita e profunda e aceita apenas os resíduos hidrofóbicos, considerados classicamente ser apenas lipídios. A fenda pode acomodar uma sequência de sete aminoácidos caracterizados por um resíduo hidrofóbico na posição (P) 1 e 7, e um resíduo alifático em P4. P1 é um resíduo hidrofóbico obrigatório, tais como F, W, H ou Y. No entanto, P7 é permissivo e pode conter resíduos alternativos, desde que não sejam polares. Os resíduos em P4 são preferencialmente alifáticos, mas é opcional. A sequência geral para um motivo de ligação CD1d é, portanto, [FWTHY] - X2X3- [ILMV] -X5X6- [FWTHY]. Contudo, deve ser claro para aqueles que são versados na técnica que o padrão é simétrico e que P7 pode ser considerado como P1, e P1 pode ser considerado como P7. A sequência geral de um motivo de ligação CD1d é fornecida na presente invenção como uma indicação geral, sem qualquer intenção de limitação.
[0031] A presente invenção relaciona-se com a produção de moléculas de fator VIII e o método dos mesmos, o(s) referido(s) motivo(s) de ligação CD1d que contêm a molécula, o que lhes conferem a capacidade para ativar as células NKT e que são modificados por meio da eliminação e / ou substituição de resíduos hidrofóbicos no P1 e / ou com um resíduo P7 não hidrofóbico, com a condição de que F na posição 309 não é substituído por S e H na posição 317 não é substituído por A, e / ou a adição de um resíduo não hidrofóbico na posição P1 e / ou P7, com, opcionalmente, substituição ou eliminação de resíduos alifáticos em P4, ou qualquer combinação dos mesmos, o que resulta em uma perda ou redução significativa da capacidade de peptídeos ou polipeptídeos que se ligam a CD1d e, dessa maneira , resulta em uma perda ou redução significativa dos referidos peptídeos ou polipeptídeos para ativar as células NKT.
[0032] Por conseguinte, a presente invenção se refere a uma molécula de fator VIII, com uma estrutura de domínio A1-a1-A2-a2-B- a3-A3-C1-C2, em que A1, A2, B, A3, C1 e C2 representam os domínios e as regiões ácidas a1, a2 e a3 de ligação dos referidos domínios da referida molécula de fator VIII, com uma capacidade reduzida para ativar as células NKT, as referidas moléculas de fator VIII podem ser obtidas por:
[0033] a. identificação de, pelo menos, um epitopo de células NKT, em que o referido epitopo compreende os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos nas posições P1 e / ou P7
[0034] b. modificação do(s) referido(s) epitopo(s) através da eliminação de pelo menos um resíduo aminoácido hidrofóbico na posição P1 e / ou P7, substituindo pelo menos um resíduo aminoácido hidrofóbico na posição P1 e / ou P7 com um resíduo não hidrofóbico, ou adicionando um resíduo não hidrofóbico na posição P1 e / ou P7.
[0035] A presente invenção também se refere a métodos para a obtenção de uma molécula de fator VIII, com reduzida capacidade para ativar as células NKT, compreendendo as etapas de:
[0036] a. identificação de, pelo menos, um epitopo de células NKT em que o referido epitopo compreende os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos nas posições P1 e / ou P7
[0037] b. modificação do (s) referido (s) epitopo (s) através da eliminação de pelo menos um resíduo aminoácido hidrofóbico na posição P1 e / ou P7, substituindo pelo menos um resíduo aminoácido hidrofóbico na posição P1 e / ou P7 com um resíduo hidrofóbico ou adicionando um resíduo não hidrofóbico na posição P1 e / ou P7.
[0038] Em uma modalidade mais particular, F, W, T, H ou Y nas posições P1 e / ou P7 são substituídos por meio de um resíduo de aminoácido não hidrofóbico ou, opcionalmente, I, L, M ou V na posição P4 é substituído por um resíduo não alifático, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0039] Em ainda outra modalidade particular, os resíduos hidrofóbicos localizados na posição P1 e / ou P7 ou, opcionalmente, os resíduos alifáticos localizados em P4, ou qualquer combinação dos mesmos, são substituídos por meio de pelo menos um aminoácido não natural, diferente do F, W, T, H, Y não natural, ou por meio de um composto orgânico não aromático.
[0040] Em ainda outra modalidade particular, pelo menos um aminoácido é adicionado dentro do motivo de ligação CD1d, em qualquer local dentro da sequência P1 a P7, o que perturba o motivo, impede a sua capacidade para se ligar a CD1d e assim a sua capacidade para ativar as células NKT.
[0041] Em uma modalidade preferida, os aminoácidos não naturais são D-aminoácidos.
[0042] A presente invenção também se relaciona com as moléculas de fator VIII contendo o(s) motivo(s) de ligação CD1d, o que lhes conferem a capacidade de ativar as células NKT , e que são modificadas por meio da eliminação, pelo menos um resíduo aminoácido hidrofóbico na posição P1 e / ou P7, substituindo pelo menos um resíduo aminoácido hidrofóbico na posição P1 e / ou P7 com um resíduo não hidrofóbico, ou a adição de um resíduo não hidrofóbico na posição P1 e / ou P7 e, adicionalmente, através de deleção de resíduos alifáticos em P4, ou qualquer combinação dos mesmos, o que resulta em uma perda ou redução significativa da capacidade de peptídeos ou polipeptídeos que se ligam a CD1d e, dessa maneira , resulta em uma perda ou uma redução significativa dos referidos peptídeos ou polipeptídeos para ativar as células NKT.
[0043] Após a administração a um paciente, tais moléculas de fator VIII não são carregadas no CD1d e assim são impedidas de ativação das células NKT.
[0044] Em um outro aspecto, a presente invenção abrange também a utilização de moléculas de fator VIII que compreendem, pelo menos, uma substituição ou uma eliminação de F, W, T, H ou Y em posições P1 P7 ou para a prevenção em um paciente de uma resposta imune para o fator VIII.
[0045] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção abrange a utilização de moléculas de fator VIII que compreendem, pelo menos, uma substituição ou uma eliminação de F, W, T, H ou Y ou em posições P1 P7 para prevenir em um paciente a ativação das células NKT relativamente ao fator VIII .
[0046] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção abrange também a utilização de moléculas de fator VIII que compreendem, pelo menos, uma substituição ou uma eliminação de F, W, T, H ou Y em posições P1 P7 ou para a fabricação de um medicamento para a prevenção de um paciente resposta imune para o fator VIII.
[0047] O número de motivos de ligação CD1d, quando presentes em um peptídeo ou polipeptídeo, é muito limitado. Exemplos de tais peptídeos ou polipeptídeos são fornecidos a seguir para o fator VIII. Tipicamente, um polipeptídeo apresenta de 1 a 5 destes motivos.
[0048] Uma vantagem adicional da presente invenção é que a molécula CD1d apresenta um grau muito limitado de polimorfismo. Por conseguinte, é óbvio para uma pessoa que é versada na técnica que as mesmas substituições, deleções ou adições de aminoácido de acordo com a presente invenção fornecem os peptídeos ou polipeptídeos úteis para a totalidade ou uma grande maioria dos pacientes. Isto está em nítido contraste com o peptídeo ou polipeptídeo de motivos de ligação a moléculas de classe II do MHC, em que um grande número de peptídeos pode ser delimitado que contêm a sequência apropriada. Isto é devido às limitações impostas mínimas para classe II de MHC e peptídeos de ligação ao grande polimorfismo de moléculas de classe II.
[0049] As moléculas de fator VIII, que são objeto da presente invenção, são identificadas como se segue:
[0050] (1) opcionalmente, a sequência de aminoácidos de fator VIII é avaliada para a presença de pelo menos um motivo CD1d contendo um resíduo hidrofóbico, em P1 e P7, e um resíduo alifático em P4. A sequência geral, tal como [FWTHY] - X2X3- [ILMV] -X5X6- [FWTHY], pode ser utilizada para os algoritmos bem conhecidos na técnica, tais como http://expasy.org/tools/scanprosite/
[0051] Esta sequência geral deve ser considerada como uma ferramenta para ajudar a identificar qual(is) sequência(s) no referido peptídeo ou polipeptídeo contêm um motivo que poderia permitir que o referido peptídeo ou polipeptídeo pudesse ativar as células NKT.
[0052] (2) a capacidade do peptídeo ou polipeptídeo de se ligar a CD1d é testada in vitro utilizando uma linhagem de células que expressa a molécula CD1d. Exemplos de tais linhagens de células são conhecidos na técnica e utilizados para produzir os exemplos no presente pedido de patente (por exemplo, células JAWS2 e células U937). Em uma modalidade preferida, a linhagem de célula não apresenta as moléculas MHC de classe II e é transduzida para hiperexpressão da CD1d utilizando um vetor viral que contém a sequência de DNA de CD1d ou quaisquer outros meios conhecidos na técnica para introduzir um gene em uma célula. Os métodos para a transdução de células são conhecidos na técnica. A linhagem de células é colocada em cultura com o peptídeo ou polipeptídeo, ou com um peptídeo sintético que abrange a sequência correspondente. Tais peptídeos sintéticos podem ser facilmente produzidos por meio da síntese, utilizando, por exemplo, a síntese em fase sólida de Fmoc bem conhecida na técnica. A apresentação eficaz do peptídeo, polipeptídeo ou peptídeo sintético correspondente por meio da molécula CD1d é depois avaliada através da medição da ativação das células NKT. Tais células podem ser obtidas a partir do sangue periférico por meio de, por exemplo, a separação magnética, e mantida em cultura na presença de citocinas, tais como IL-2, IL-15 ou IL-7. Estes métodos estão descritos na técnica (vide, por exemplo, Godfrey et al, Nature Reviews Immunology 2010, 11 : 197 a 206). A ativação de células NKT é avaliada através de métodos como a avaliação da produção de citocinas.
[0053] De uma maneira alternativa, os peptídeos apresentados, na verdade, por meio das células apresentadoras de antígenos em moléculas CD1d, podem ser eluídos e separados por meio de vários métodos, como a cromatografia. Descrição completa de tal metodologia pode ser encontrada em Scott et al, Immunity 12 : 711 a 720, 2000 . Os referidos peptídeos são então sequenciados para identificar os resíduos de aminoácido que se encontram em P1 e P7.
[0054] De uma maneira alternativa, os referidos peptídeos sintéticos podem ser carregados em dímeros, tetrâmeros ou polímeros da molécula CD1d para detectar as células NKT específicas para este peptídeo. Uma possibilidade é a utilização de tetrâmeros marcados com fluorescência e de detecção de um sistema de separação de células ativadas por fluorescência (FACS).
[0055] (3) as sequências de aminoácidos identificadas como sendo capazes de ativar as células NKT e, opcionalmente, identificadas por meio de algoritmos, em seguida, são modificadas por meio da substituição ou supressão. Em uma modalidade preferida, M, W, T, H ou Y em posições P1 e / ou P7 são substituídos por, pelo menos, um aminoácido diferente de F, W, T, H, Y. Os aminoácidos naturais podem ser modificados por meio de modificações pós-transcricionais ou substituídos com grupos químicos, tais como grupos metila. Em uma outra modalidade preferida, M, W, T, H ou Y em posições P1 e / ou P7 são substituídos por meio de qualquer aminoácido não natural alternativo adequado. Exemplos de resíduos de aminoácidos não naturais, são D-aminoácidos. Em ainda outra modalidade, F, W, T, H ou Y em posições P1 e / ou P7 são substituídos por, pelo menos, um aminoácido diferente de F, W, T, H, Y. Em uma outra modalidade preferida, M, W, T , H ou Y na posição P1 é substituído por, pelo menos, um aminoácido diferente de F, W, T, H, Y, por meio de qualquer aminoácido não natural alternativo adequado ou por meio de um composto orgânico não aromático. Tal substituição de aminoácidos é obtida usando métodos bem conhecidos na técnica. Em ainda uma outra modalidade preferida, M, W, T, H ou Y na posição P1 é suprimido. Em ainda outra modalidade, F, W, T, H ou Y em posições P1 e P7 são excluídos. Métodos para levar a cabo as referidas supressões são bem conhecidos na técnica. Em ainda outra modalidade particular, pelo menos um aminoácido é adicionado dentro do motivo de ligação CD1d, em qualquer local dentro da sequência P1 a P7.
[0056] (4) opcionalmente, pode ser vantajoso substituir os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos adjacentes à primeira (P1) ou e a última (P7) posição por meio dos resíduos não hidrofóbicos. Os referidos resíduos hidrofóbicos podem estar localizados nas regiões flanqueadoras do epitopo ou dentro da própria sequência de epitopo nas posições (P2 ou P6). As Posições P-2 e P-1, P2 e / ou P6, P8 e P9, localizadas na extremidade amino-terminal ou na extremidade carbóxi- terminal do epitopo, respectivamente, são vantajosamente ocupadas pelos resíduos não hidrofóbicos, isto é, diferente de aminoácidos F, W, T, H ou Y, que reduzem ainda mais a afinidade do epitopo para CD1d e, dessa maneira, a capacidade do epitopo para células NKT ativadas.
[0057] (5) as células NKT são então testadas quanto à sua reatividade com os peptídeos modificados como descrito em (3). De uma maneira alternativa, a proteína de comprimento completo a partir do qual o peptídeo é derivado pode ser produzida com a modificação da sequência, tal como descrito em (3). Vários métodos podem ser utilizados para determinar se as células NKT se perderam ou reduziram a sua capacidade para reagir com o peptídeo ou a proteína modificados. Estes métodos são conhecidos na técnica. A proliferação de células NKT pode ser avaliada por meio da incorporação de timidina radioativa ou por meio da avaliação da concentração de citocinas produzidas no meio de cultura. De uma maneira alternativa, as células NKT podem ser avaliadas por ELISPOT utilizando uma variedade de anticorpos direcionados através das moléculas ou citocinas com as propriedades citolíticas das células, tais como a granzima B. De uma maneira alternativa, as células NKT podem ser avaliadas para os casos precoces de sinalização, tais como a fosforilação de Fyn ou marcadores de ativação de superfície.
[0058] Em particular, a análise da sequência do domínio A1 do fator VIII identificou duas regiões que contêm motivos que permitem o fator VIII de se ligarem à molécula CD1d, de acordo com os métodos descritos acima. Estas duas regiões abrangem os resíduos de aminoácidos 190-209 e 309-323, e de preferência 309-316, com sequência: 190-209: QTLHKFILLFAVFDEGKSWH (SEQ ID 1) 309-323: FCHISSHQHDGMEAY (SEQ ID2)
[0059] Os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos estão sublinhados e cada uma das duas sequências de ligação contêm dois motivos CD1d, a saber: H193-F199 F195-V201 (P7 é permissivo e pode acomodar valina) F309-H315 H317-Y323
[0060] De acordo com a presente invenção, os medicamentos são previstos para o tratamento de doenças em que é necessária a administração de fator VIII, tal como na deficiência congênita ou adquirida de fator VIII, e em doenças em que é benéfico administrar o fator VIII, por exemplo, em distúrbios de hemorragia associados com consumo agudo de fator VIII como observado no choque séptico, politraumatismo e fibrinólise aguda, ou hemorragia descontrolada associada com hemorragia cerebral.
[0061] O medicamento, de acordo com a presente invenção, é geralmente, embora não necessariamente, uma formulação (farmacêutica) compreendendo como ingrediente ativo de pelo menos uma das moléculas de fator VIII da presente invenção ou um vetor de terapia de gene capaz de expressar a referida moléculas de fator VIII. Além do(s) ingrediente(s) ativo(s), tal formulação compreenderá, pelo menos, um de um diluente (farmaceuticamente aceitável).
[0062] Em geral, a administração de moléculas de fator VIII da presente invenção impede a ativação do sistema imune inato, mais particularmente a ativação das células NKT, mais particularmente a produção de citocinas associadas com a ativação das células NKT.
[0063] A identificação de um epitopo de células NKT no contexto da presente invenção, é conhecida de uma pessoa que é versada na técnica. Por exemplo, as sequências de peptídeos isolados a partir da molécula de fator VIII são testadas, por exemplo, as técnicas de biologia das células NKT, para determinar se as sequências de peptídeos induzem a uma resposta de células NKT. Estas sequências de peptídios foram encontradas para induzir uma resposta de células NKT as quais são definidas como tendo atividade de estimulação de células NKT. A atividade de estimulação de células NKT humana pode ainda ser testada por meio da cultura de células NKT obtidas a partir de um paciente sensibilizado com o fator VIII, e determinar se a proliferação de células NKT ocorre em resposta ao peptídeo / epitopo tal como medido, por exemplo, através da incorporação celular de timidina tritiada. Os índices de estimulação para as respostas de células NKT de peptídeos / epitopos podem ser calculados como o CPM máximo em resposta a um peptídeo / epitopo dividido por meio do CPM de controle. Um índice de estimulação das células NKT (SI) igual ou superior a duas vezes o nível de fundo é considerado "positivo". Os resultados positivos são utilizados para calcular o índice de estimulação média para cada peptídeo / epitopo para o grupo de peptídeos / epitopos testado. Um peptídeo imunogênico possuindo um índice de estimulação de células NKT maior ou igual a 2 é considerado útil como um candidato para efetuar a substituição ou deleção de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, tal como descrito na presente invenção.
[0064] Um peptídeo ou polipeptídeo da presente invenção é dito ter uma capacidade reduzida para ativar as células NKT quando o SI é menor do que duas vezes o nível de fundo, ou quando os níveis de citocinas produzidos por meio da estimulação é inferior a 50 % do que produzido quando a estimulação é efetuada com o peptídeo natural, ou sequência de polipeptídeo, ou quando os níveis de agentes citolíticos, tais como a granzima B é reduzida em, pelo menos, duas vezes, em comparação com os peptídeos ou polipeptídeos de sequência natural.
[0065] As moléculas CD1d solúveis são obtidas e feitas tetraméricas por meio da síntese e / ou conjugação química. A molécula CD1d é purificada por meio da cromatografia de afinidade. As moléculas CD1d solúveis são incubadas com um peptídeo de referência marcado com biotina produzidas de acordo com a sua forte afinidade de ligação para a referida molécula CD1d. Os peptídeos a serem avaliados quanto à ligação CD1d são então incubados a diferentes concentrações e da sua capacidade para deslocar o peptídeo de referência a partir do seu local de ligação CD1d é calculada por meio da adição de neutravidina. Os métodos podem ser encontrados em, por exemplo, em Texier et al., (2000) J. Immunology 164, 3.177 a 3.184 para peptídeos apresentados por meio da classe de determinantes de MHC II, mas o método pode ser facilmente aplicado a epitopos de células-CD1d restritas NKT.
[0066] Se duas ou mais sequências de aminoácidos que partilham uma área de sobreposição no peptídeo ou polipeptídeo de sequência nativa são encontradas a ter atividade de estimulação da célula NKT humana, tal como determinado por meio das técnicas de biologia da célula T, a mutação ou deleção de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos pode ser realizada por meio dos resíduos pertencentes a uma ou a ambas as sequências.
[0067] A via de administração para moléculas de fator VIII da presente invenção pode variar de acordo com a indicação. Exemplos são a injeção intravenosa ou subcutânea do fator VIII, mas a presente invenção abrange também as vias alternativas de administração, tais como intranasal, oral, sublingual, percutânea ou por via intramuscular.
[0068] As moléculas de fator VIII da presente invenção podem ser produzidas utilizando os métodos conhecidos na técnica para a produção de proteínas recombinantes, utilizando os sistemas de expressão, tais como as células bacterianas, células de leveduras, células de insetos, células de plantas ou células de mamíferos.
[0069] As moléculas de fator VIII da presente invenção podem ser produzidas por meio da expressão recombinante em, por exemplo, as células bacterianas (por exemplo, Escherichia coli), células de levedura (por exemplo, espécies Pichia, espécies Hansenula, espécies Schizosaccharomyces ou Saccharomyces), células de insetos (por exemplo, a partir de células de Spodoptera frugiperda ou Trichoplusia ni), células de plantas ou células de mamíferos (por exemplo, células CHO, COS). A construção dos vetores de expressão adequados, por conseguinte, necessários (incluindo outras informações, tais como as sequências de promotor e de terminação) envolve as técnicas de DNA recombinante padrão, entretanto. As moléculas de fator VIII da presente invenção podem ser derivadas a partir de uma proteína precursora maior, por exemplo, produzida por via recombinante, através de clivagem enzimática de locais de clivagem da enzima inseridos adjacentes à extremidade do terminal N e / ou C do peptídeo ou polipeptídeo, seguido de purificação adequada.
[0070] A presente invenção também se refere a sequências de ácidos nucleicos que codificam as moléculas de fator VIII da presente invenção e os métodos para a sua utilização, por exemplo, para a expressão recombinante ou em terapia genética. Em particular, as referidas sequências de ácidos nucleicos são capazes de expressar as moléculas de fator VIII da presente invenção.
[0071] Em terapia genética, as moléculas de ácidos nucleicos recombinantes que codificam a moléculas de fator VIII da presente invenção podem ser utilizadas como DNA nu, ou em lipossomas, ou outros sistemas de lipídios para a entrega às células alvo. Outros métodos para a transferência direta de DNA de plasmídeo em células são bem conhecidos por meio daqueles que são versados na técnica para utilização em terapia de gene humana e envolvem o direcionamento de DNA para receptores em células através da complexação do DNA do plasmídeo para as proteínas. Na sua forma mais simples, a transferência de genes pode ser realizada simplesmente injetando quantidades pequenas de DNA no núcleo de uma célula, através de um processo de microinjeção. Uma vez que os genes recombinantes são introduzidos em uma célula, eles podem ser reconhecidos pelos mecanismos normais das células para a transcrição e tradução, e um produto do gene será expresso. Outros métodos também têm sido tentados para a introdução de DNA em grandes números de células. Estes métodos incluem: transfecção, em que o DNA é precipitado com fosfato de cálcio e feito em células por meio da pinocitose ; eletroporação, em que as células são expostas a grandes impulsos de tensão para introduzir buracos na membrana) ; lipofecção / fusão de lipossomas, em que o DNA é empacotado em vesículas que se fundem em lipofílicos com uma célula alvo ; e bombardeamento de partículas utilizando o DNA ligado a pequenos projéteis. Outro método para introduzir DNA em células é acoplar o DNA a proteínas modificadas quimicamente. Proteínas de adenovírus são capazes de desestabilizar endossomas e aumentam a absorção de DNA em células. A mistura de adenovírus com soluções que contêm complexos de DNA ou a ligação de DNA a polilisina ligada de forma covalente a adenovírus utilizando agentes de reticulação de proteínas melhora substancialmente a absorção e expressão do gene recombinante. Os vetores de vírus adeno-associados podem também ser utilizados para a entrega de genes. Tal como utilizado na presente invenção, "transferência de genes" significa o processo de introduzir uma molécula de ácido nucleico estranho em uma célula, o qual é normalmente realizado para permitir a expressão de um produto particular codificado por meio do gene. O referido produto pode incluir uma proteína, polipeptídeo, DNA ou RNA antissenso , ou RNA enzimaticamente ativo. A transferência de genes pode ser realizada em células em cultura ou por meio da administração direta nos mamíferos. Em uma outra modalidade, um vetor que compreende uma sequência de molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de fator VIII de acordo com a presente invenção é fornecido. Em modalidades específicas, o vetor é gerado de tal modo que a sequência da molécula de ácido nucleico é expressa apenas em tecidos específicos. Os métodos de obtenção de expressão de genes específicos de tecido são bem conhecidos na técnica, por exemplo, colocando a sequência de codificação de uma molécula de fator VIII da presente invenção sob o controle de um promotor, que dirige a expressão da referida molécula especificamente em um ou mais tecidos(s) ou órgão(s). Os vetores de expressão derivados de vírus, tais como retrovírus, vírus vaccinia, adenovírus, vírus adeno-associado, vírus do herpes, vírus de RNA e vírus de papiloma bovino, podem ser utilizados para a entrega de sequências de nucleotídeos (por exemplo, cDNA) que codifica os peptídeos homólogos, ou seus derivados de acordo com a presente invenção para os tecidos alvo ou população de células. Os métodos que são bem conhecidos daqueles que são versados na técnica podem ser utilizados para construir os vetores virais recombinantes que contenham tais sequências de codificação. De uma maneira alternativa, as células modificadas contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica para um peptídeo ou polipeptídeo de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas em terapia de gene.
[0072] O fator VIII da presente invenção pode ser modificado por meio dos métodos conhecidos na técnica.
[0073] As moléculas de fator VIII podem abranger toda a sequência de aminoácidos do fator VIII ou apenas partes dos mesmos. Um exemplo é proporcionado pelo domínio B suprimido por meio das moléculas de fator VIII. O domínio B é dispensável para a função do fator VIII e, por conseguinte, pode ser eliminado sem afetar a função do fator VIII. Os domínios A2 e A3 são normalmente ligados por meio da sequência de aminoácidos que pode ser artificial ou pode representar as sequências do próprio domínio B. As moléculas de fator VIII podem ser modificadas por meio da adição e / ou substituição de aminoácidos, de modo a aumentar a estabilidade do fator de VIII, por exemplo, reduzindo a taxa de chamariz do domínio A2, ou através do aumento da resistência ao fator VIII para as enzimas proteolíticas. As moléculas de fator VIII podem ser estabilizadas por meio do acoplamento da parte Fcgama dos anticorpos, por exemplo, para aumentar a sua reciclagem através do receptor FcRn. O fator VIII pode ser estabilizado por meio da redução da sua degradação usando os resíduos de polietilenoglicol (derivados PEG) ou substituição química alternativa. Todas essas modificações são consideradas como estando dentro do âmbito da presente invenção.
[0074] A técnica anterior (Swaroop et al, The Journal of Biological Chemistry, vol 272, pp 24121 a 24124, 1997 ; Cerullo et al, Molecular Therapy, vol 15, pp 2080 a 2087, 2007) verificou que a mutação de F309 (SEQ ID 2) aumenta a taxa de produção do fator VIII por meio das moléculas de células transfectadas com um constructo de fator VIII. Cerullo et al. Observou-se uma redução não significativa da produção de anticorpos inibidores no fator VIII de camundongos KO tratados com o mutante F309, ensinando a uma pessoa que é versada na técnica a partir da utilização de tal mutante para reduzir a imunogenicidade do fator VIII. Além disso, na referida técnica anterior, não há nenhuma menção que F309 poderia ser parte de um motivo de ligação CD1d.
[0075] O medicamento, de acordo com a presente invenção, é geralmente, mas não necessariamente, uma formulação (farmacêutica) que compreende, como ingrediente ativo, pelo menos, uma molécula de fator VIII da presente invenção, um vetor de terapia de gene capaz de expressar a referida molécula de fator VIII. Além do(s) ingrediente(s) ativo(s), tal formulação compreenderá, pelo menos, um de um diluente (farmaceuticamente aceitável). Tipicamente, os compostos farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados em, por exemplo, um manual de farmacopeia (por exemplo, US-, ou European- Internacional Pharmacopeia). A composição ou medicamento farmacêutico da presente invenção normalmente compreende uma quantidade (profilaticamente ou terapeuticamente) eficaz do(s) ingrediente(s) ativo(s) em que a eficácia é relativa à condição ou distúrbio a ser prevenida ou tratada.
[0076] A composição farmacêutica ou medicamento da presente invenção pode, em uma modalidade preferida, apresentar a necessidade de ser administrada a um paciente com essa necessidade, como parte de um regime profiláctico ou terapêutico que compreende múltiplas administrações do referido medicamento ou composição. As referidas administrações múltiplas geralmente ocorrem sequencialmente e o intervalo de tempo entre duas administrações pode variar e será ajustado para a natureza do ingrediente ativo e da natureza da condição a ser tratada ou prevenida. A quantidade de ingrediente ativo para um determinado paciente em necessidade de uma única administração pode também variar e irá depender de fatores tais como o estado físico do paciente (como por exemplo, peso e idade), o estado da doença a ser prevenida ou tratada, e a experiência do tratamento médico, médico assistente ou enfermeiro.
[0077] O termo "diluentes" se refere, por exemplo, às soluções salinas fisiológicas. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa qualquer material ou substância com o qual o ingrediente ativo é formulado a fim de facilitar a sua aplicação ou disseminação no local a ser tratado, por exemplo, dissolvendo, dispersando ou difundindo a referida composição, e / ou para facilitar a sua armazenagem, transporte ou manuseio, sem prejudicar a sua eficácia. Eles incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos (por exemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotônicos (tais como açúcares ou cloreto de sódio) e semelhantes. Os ingredientes adicionais podem ser incluídos, a fim de controlar a duração da ação do ingrediente ativo na composição. O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um sólido ou um líquido ou um gás que tenha sido comprimido para formar um líquido, isto é, as composições da presente invenção podem ser adequadamente utilizadas como concentrados, emulsões, soluções, granulados, pós, sprays, aerossóis, suspensões, pomadas, cremes, comprimidos, pastilhas ou pós. Os veículos farmacêuticos adequados para uso nas referidas composições farmacêuticas e as suas formulações são bem conhecidos daqueles que são versados na técnica, e não há nenhuma restrição em particular à sua seleção no âmbito da presente invenção. Eles também podem incluir aditivos, tais como agentes de umidificação, agentes de dispersão, autocolantes, adesivos, agentes emulsionantes, solventes, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos (por exemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotônicos (tais como açúcares ou cloreto de sódio) e similares, desde que os mesmos sejam compatíveis com a prática farmacêutica, ou seja, os veículos e aditivos que não criam danos permanentes aos mamíferos. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas de qualquer maneira conhecida, por exemplo, misturando homogeneamente, revestindo e / ou moendo os ingredientes ativos, em um procedimento de uma etapa ou multietapas, com o material de veículo selecionado e, sempre que necessário, os outros aditivos, tais como agentes tensoativos. Eles também podem ser preparados por meio da micronização, por exemplo, com vista a obtê-los na forma de microsferas usualmente tendo um diâmetro de cerca de 1 a 10 μm, nomeadamente para a fabricação de microcápsulas para libertação controlada ou prolongada dos ingredientes ativos.
[0078] As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por meio de qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica da farmácia.
[0079] Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar a presente invenção. Contudo, não há intenção de limitar a presente invenção a estes exemplos. Exemplo 1: A ligação do peptídeo de SEQ ID 1 aos tetrâmeros CD1d
[0080] Um peptídeo compreendendo a SEQ ID 1 foi obtido por meio da síntese química. Este peptídeo foi utilizado para carregar os tetrâmeros CD1d (ProImmune) por meio da incubação durante a noite.
[0081] As células NKT foram preparadas a partir do baço de camundongos ingênuos por depleção de todas as células CD4 (-) utilizando contas magnéticas.
[0082] As células CD4 + foram então incubadas com tetrâmeros CD1d carregados por meio do peptídeo de SEQ ID 1 (P28 WT na Figura 1), que corresponde à sequência de aminoácido 190 a 209.
[0083] A Figura 1 mostra que foram detectados ± 1 % de células T CD4 +. Além disso, o peptídeo de SEQ ID 1 foi separado em duas partes e os peptídeos sintéticos abrangendo a sequência 190 a 200 (SEQ ID3, P28 A na Figura 1) e 200 a 210 (SEQ ID4, P28 B na Figura 1) foram produzidos.
[0084] Sequência do peptídeo de SEQ ID3 é :
[0085] QTLHKFILLFA (correspondente à sequência de aminoácido 190 a 200)
[0086] Sequência do peptídeo de SEQ ID4 é :
[0087] AVFDEGKSWHS (correspondente à sequência de aminoácido 200-210)
[0088] A figura indica que um grande motivo de ligação CD1d está localizado na SEQ ID3, e limitada embora significativamente a % de células NKT que foram detectadas por meio do peptídeo de SEQ ID4.
[0089] Por conseguinte, concluiu-se que um grande motivo de ligação CD1d foi localizado em peptídeo da SEQ ID3. Exemplo 2: A ativação de células NKT por meio da imunização com células JAWS2 carregadas com peptídeo de SEQ ID 1
[0090] As células JAWS2 expressam CD1d, mas não os determinantes MHC de classe II. Estas células foram utilizadas para demonstrar que a apresentação do peptídeo de SEQ ID 1 pode ocorrer através de CD1d.
[0091] As células JAWS2 foram incubadas durante 2 h a 37 °C com o peptídeo da SEQ ID 1 (10 μg / mL) e lavadas cuidadosamente duas vezes. As células foram então tratadas com mitomicina para bloquear a divisão celular e lavadas quatro vezes para eliminar a mitomicina. Uma suspensão de células contendo células as 2x106 em soro fisiológico foi injetada por via intraperitoneal em cada uma de uma série de três camundongos ingênuos do fator VIII KO. Como um controle, os camundongos KO ingênuos 3 do Fator VIII receberam o mesmo número de células JAWS2 que não tinham sido incubadas com o peptídeo da SEQ ID 1.
[0092] Cinco dias após a injeção IP, os camundongos foram sacrificados e o baço preparado como acima, utilizando contas magnéticas para eliminar todas as células CD4 (-).
[0093] As células T CD4 + foram então incubadas com tetrâmeros carregados com o peptídeo da SEQ ID 1.
[0094] A Figura 2 mostra que uma proporção significativa de células NKT (8 %) presentes no repertório naturais é específica para o peptídeo da SEQ ID 1 e que essa proporção é dobrada (16 %) quando o peptídeo de SEQ ID 1 é apresentado por meio das células JAWS2.
[0095] A especificidade da detecção de células NKT é mostrada pela falta de detecção NKT com tetrâmeros descarregados, bem como tetrâmeros que foram carregados com um peptídeo não relacionado com o peptídeo da SEQ ID 1.
[0096] Por conseguinte, concluiu-se que a apresentação de peptídeos de SEQ ID1 ocorreu via apresentação CD1d e que essa apresentação foi suficiente como para ligar e ativar as células NKT. Exemplo 3: A administração de fator VIII mutado reduz a formação de anticorpos para o fator VIII
[0097] Para determinar se a mutação que visa eliminar os motivos de ligação CD1d no fator VIII pode reduzir a concentração de anticorpos antifator VIII do tipo selvagem, ou o fator VIII mutado foram clonados no plasmídeo pGC5AM-PT. As mutações em posições F309 e H315, cada vez em uma alanina, foram introduzidas na sequência do fator VIII através de PCR e o fatiamento por meio da extensão de tecnologia de sobreposição (SOE-PCR).
[0098] Os plasmídeos contendo tanto as sequências nativas quanto as mutadas foram verificados por meio da sequenciação e preparados por maxiprep.
[0099] Os plasmídeos (100 μg em 2 mL) foram administrados diretamente nos camundongos KO C57BL / 6 ingênuos de fator VIII (3 camundongos por grupo), utilizando o método de pressão hidrodinâmico (injeção feita em menos de 7 segundos), conhecido na técnica para direcionar os plasmídeos essencialmente para o fígado. Os camundongos de controle foram injetados com o mesmo método, mas com o plasmídeo nu (n = 3).
[00100] Um total de 3 injeções foram feitas a intervalos de 10 dias.
[00101] Dez dias após a última injeção, as concentrações plasmáticas de anticorpos para o fator VIII e a concentração de anticorpos que inibem a função do fator VIII, foram medidas por ELISA e ensaio cromogênico, respectivamente.
[00102] A Figura 3a indica que uma redução de 3,6 vezes de anticorpos foi observada em camundongos injetados com o fator VIII mutante F309A-H315A. A Figura 3b mostra uma redução de 3,8 vezes de anticorpos que inibem a função do fator VIII.
[00103] Estes dados mostraram que a eliminação de um único motivo de ligação CD1d na molécula do fator VIII é suficiente para significantemente reduzir a concentração de anticorpos específicos, incluindo os da inibição da função do fator VIII. Exemplo 4: O aumento da expressão de CD1d em células apresentadoras de antígenos humanos após incubação com um peptídeo contendo um motivo de ligação CD1d
[00104] Para determinar se as células apresentadoras de antígenos humanos tiveram a capacidade de processar e apresentar um epitopo peptidico no contexto da molécula CD1d, foi utilizada a linhagem de célula de macrófago humano U937. Estas células não expressam a classe II de grandes complexos de histocompatibilidade e são utilizados para avaliar a apresentação por CD1d.
[00105] A porcentagem de células U937 em repouso expressam que CD1d é baixo, como detectado com um anticorpo anti-CD1d específico. Ele foi fundamentado que, se as células U937 foram incubadas com um peptídeo com o motivo de sequência que lhe permite ligar-se a CD1d, então esta deve ser detectada por meio de um aumento da expressão na superfície da célula CD1d. Tal como observado para peptídeos englobando os epitopos de MHC de classe II, a ligação de um peptídeo estabiliza a conformação da molécula (classe II, ou CD1d, no presente caso), permitindo que o complexo pudesse ser fixado na superfície da célula e reduz a sua reciclagem intracelular.
[00106] As células U937 (7x105 células) foram incubadas durante 24 horas a 37°C, com 5 μg de peptídeo abrangendo os motivos CD1d ou controles de ligação. As células foram então lavadas e incubadas com anticorpos marcados por meio da fluorescência específica para CD1d e o número de células positivas avaliadas utilizando um sistema FACS.
[00107] A Figura 4 mostra que a porcentagem de células que expressam CD1d aumenta de 6 % em experiências de controle para 13% quando foram utilizados os peptídeos que contêm as sequências de ligação CD1d. Os dados apresentados como histogramas são meio de medições em triplicata, com asterisco identificando os resultados significativamente mais elevados do que os valores de controle (p < 0,05).
[00108] Os controles incluem (da esquerda para a direita) U937 descarregados, as células incubadas com alfa-gal-ceramida e um epitopo de classe II restrito convencional (MHCII-MOG). O experimento inclui as sequências de fator VIII de qualquer ser humano (SEQ5 ID) ou camundongo (ID SEQ 6) correspondente à origem de aminoácidos 188204 da sequência de fator VIII.
[00109] Por conseguinte, conclui-se que as células apresentadoras de antígenos humanos estabilizam os complexos de peptídeos e CD1d na sua superfície, quando incubadas com os referidos peptídeos. Exemplo 5: Células de mononúcleo periféricas sanguíneos humanas (PBMC) contêm células NKT específicas para epitopos peptídicos ligados a CD1d
[00110] A fim de determinar se PBMC humano continha as células reagindo com um peptídeo de epitopo de ligação de CD1d, as células NKT invariantes (iNKT) foram preparadas a partir de um creme leucocitário utilizando as contas magnéticas revestidas com um anticorpo específico para a cadeia Valfa24-Jalfa18 do receptor de células T (assim chamada cadeia invariante).
[00111] As referidas células iNKT humanas (105 / condição) foram então incubadas com U937 tratado com mitomicina C (Proporção 1: 1) carregadas com 5 μg de qualquer dos peptídeos que engloba os resíduos de aminoácidos 188 a 204 do fator VIII humano (SEQ ID 5), ou com o controle peptídeo (MHCII-MOG). A incubação foi realizada durante 2 semanas a 37°C em meio RPMI contendo 10% de soro fetal de vitelo e 50 U / mL de IL-2 recombinante humana.
[00112] As placas de cultura foram examinadas por olho nu para a presença de agregados de células. Observou-se que aglomerados de células foram com U937 carregado com o peptídeo de SEQ ID 5, na mesma medida que a alfa-gal-ceramida, mas não com o peptídeo controle (MHCII-MOG). A figura 5 ilustra a média de três campos de contagem microscópicos desta observação (mínimo 10 células / agrupamento).
[00113] Por conseguinte, conclui-se que repertório de células periféricas humanas contém células definidas como células NKT da cadeia invariante que reagem com um peptídeo apresentado por CD1d. Exemplo 6: Resíduos de flanqueamento localizados fora da fenda de ligação CD1d são importantes para a eficiente apresentação de superfície celular
[00114] A experiência apresentada no Exemplo 1 indica que um peptídeo de SEQ ID 3, correspondente aos aminoácidos de fator VIII 190-200 humanos, liga-se aos tetrâmeros CD1d e permite a detecção de células NKT, indicando que este continha a sequência motivo de ligação para CD1d mínima.
[00115] Para determinar se este motivo era suficiente para a apresentação eficiente de células, o ensaio descrito no exemplo 4 foi repetido com o peptídeo de SEQ ID 3.
[00116] A Figura 6 mostra que o peptídeo de SEQ ID 3 não aumentou a expressão de CD1d na superfície de células U937, em contraste com os peptídeos de SEQ ID 5 apresentados na Figura 4.
[00117] Por conseguinte, conclui-se que uma carga eficaz in vivo de um peptídeo que contém um motivo de ligação CD1d requer a presença de resíduos de flanqueamento localizados fora da fenda CD1d. Exemplo 7: As células NKT específicas para o epitopo do fator VIII de ligação a CD1d pertencem a linhagens tanto de CD4 + quanto de CD8 +
[00118] Para determinar a linhagem de célula para a qual as células NKT pertencem, uma experiência foi realizada como descrita no Exemplo 2. Dessa maneira, as células foram carregadas com JAWS2 tanto os peptídeos de SEQ ID 3, o fator VIII excluído do domínio B, alfa- gal-ceramida quanto mantidos descarregados antes da injeção intraperitoneal (IP) em camundongos KO de fator VIII (2x106 células por rato). Cinco dias após as injeções intraperitoneais, os camundongos foram sacrificados e os esplenócitos preparados. As suspensões celulares foram então feitas reagir com tetrâmeros CD1d descarregados ou carregados com peptídeo de SEQ ID3 ou com alfa-gal-ceramida.
[00119] Para análise po FACS, as células de ligação dos tetrâmeros CD1d foram marcadas com anticorpos específicos DX5- e CD160- e ambos os anticorpos anti-CD4 e anti-CD8. A tabela resume os resultados.
[00120] Estas experiências mostram que • o repertório natural das células NKT contém um número significativo de células que reagem com o peptídeo da SEQ ID N 3, em ambas as linhagens de células CD4 + e CD8 + (linha 3) • esta população de células pode ser expandida através de imunização com o peptídeo da SEQ ID3, novamente nas linhagens CD4 + e CD8 + (linha 6) • imunização com fator VIII é ainda mais eficiente em expandir essas populações de células (linha 9) • imunização com alfa-gal-ceramida aumenta um pouco o número de células T CD4 + específicas para o peptídeo de SEQ ID3, mas não o número de células T CD8 +
[00121] Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a imunização com o fator VIII provoca uma expansão das células que pertencem à linhagem de NKT e ambos os fenótipos CD4 + e CD8 +. Sequências ID1 QTLHKFILLFAVFDEGKSWH (190-209 humano) ID2 FCHISSHQHDGMEAY (309-323 humano) ID3 QTLHKFILLFA (190-200 humano) ID4 AVFDEGKSWHS (200-210 humano) ID5 KTQTLHKFILLFAVFDE (188-204 humano) ID6 RTQMLYQFVLLFAVFDE (188-204 camundongo)
Claims (10)
1. Molécula de fator VIII, caracterizada pelo fato de que possui uma estrutura de domínio A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, em que A1, A2, B, A3, C1 e C2 representam domínios e regiões ácidas a1, a2 e a3 ligando os referidos domínios da referida molécula de fator VIII, com uma capacidade reduzida para ativar as células NKT e que pode ser obtida por meio de: a. identificação de, pelo menos, um epitopo de células NKT, em que o referido motivo do epítopo é [FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6- [FWTHY] b. modificação do(s) referido(s) epitopo(s) através da substituição dos aminoácidos F, W, T, H, Y nas posições P1 e P7 com resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, sendo que pelo menos um epítopo da referida célula NKT está localizado dentro da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.
2. Molécula de fator VIII, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido epitopo de célula NKT compreende um resíduo alifático em P4 e o referido resíduo alifático é I, L, M.
3. Molécula de fator VIII, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos um de F, W, T, H, Y na posição P1 e / ou P7 é substituído por pelo menos um aminoácido natural não hidrofóbico, aminoácido não natural ou resíduos de aminoácido não aromático, em que o referido aminoácido é diferente de F, W, T, H, Y.
4. Molécula de fator VIII, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos hidrofóbicos localizados nas posições P-2, P1, P2, P6, P8 e/ou P9, adjacentes às posições P1 e/ou P7 são substituídos por resíduos de aminoácidos não hidrofóbicos.
5. Molécula de fator VIII, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a referida molécula é ainda modificada por deleção do domínio B.
6. Molécula de fator VIII, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a referida molécula é produzida por expressão recombinante.
7. Molécula de fator VIII, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento.
8. Molécula de fator VIII, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento no tratamento de hemofilia A congênita ou adquirida, ou no tratamento de pacientes com distúrbios hemorrágicos, tais como choque séptico, fibrinólise aguda, politraumatismo ou hemorragia cerebral.
9. Método para reduzir a imunogenicidade de uma molécula de fator VIII, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. identificação de, pelo menos, um epitopo de células NKT, em que o referido motivo do epitopo é [FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6- [FWTHY]; b. modificação do(s) referido(s) epitopo(s) através da substituição dos aminoácidos F, W, T, H, ou Y nas posições P1 e P7 com um resíduo de aminoácido não hidrofóbico, sendo que pelo menos um epítopo da referida célula NKT é a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um resíduo hidrofóbico localizado nas posições P-2, P-1, P2, P6, P8 e / ou P9, adjacentes às posições P1 e / ou as P7 é substituído por resíduos de aminoácidos não hidrofóbicos.
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