ES2584430T3 - Estrategias para prevenir y/o tratar las respuestas inmunitarias a los alofactores solubles - Google Patents

Estrategias para prevenir y/o tratar las respuestas inmunitarias a los alofactores solubles Download PDF

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Abstract

Un péptido inmunogénico aislado que comprende (i) un epítopo de célula T restringido al MHC clase II de un aloantígeno soluble y (ii) un motivo redox C-(X)2-[CST] o [CST]-(X)2-C, en donde dicho motivo es inmediatamente adyacente a dicho epítopo de célula T, o está separado de dicho epítopo de célula T por un conector de siete aminoácidos como máximo, para uso en la prevención o supresión, en un sujeto que espera recibir, que está recibiendo o que ha recibido dicho aloantígeno soluble, de las respuestas inmunitarias a dicho aloantígeno soluble.

Description

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o de forma posterior a la administración real de dicho alofactor soluble. Del mismo modo, dicho péptido inmunogénico o el medicamento que lo comprende, puede ser para uso como tratamiento terapéutico o inmunización de un sujeto que ha recibido (o está recibiendo) dicho alofactor soluble (terapéutico) con el fin de inducir la activación en dicho sujeto de células T CD4+ reguladoras específicas del alofactor soluble capaces de destruir las células que presentan dicho alofactor soluble. Dicha inducción puede tener lugar de forma simultánea con o después de la administración real de dicho alofactor soluble.
En cualquiera de los usos descritos anteriormente en la presente memoria, el sujeto o receptor es un mamífero, en particular un primate (no humano) o un ser humano.
En cualquiera de los usos anteriores, el alofactor soluble puede ser una proteína aplicada en terapia sustitutiva, o un factor de coagulación o fibrinolítico, o una hormona, o una citocina o un factor de crecimiento, o un anticuerpo utilizado para fines terapéuticos. Una lista no limitante de posibles alofactores incluye el factor VIII; factor IX, estafilocinasa, hormona del crecimiento, insulina, citocinas y factores del crecimiento (tales como interferón-alfa, interferón-gamma, GM-CSF y G-CSF), anticuerpos para la modulación de respuestas inmunitarias (incluyendo anticuerpos anti-IgE en enfermedades alérgicas, anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4 en rechazo de trasplantes y una variedad de enfermedades autoinmunitarias. anticuerpos anti-CD20 en linfomas no Hodgkin) y eritropoyetina en la insuficiencia renal.
Las células T reguladoras citotóxicas generadas por los péptidos inmunogénicos de la presente invención pueden suprimir las respuestas inmunitarias incluso contra los alofactores solubles (terapéuticos) complejos. Un requisito mínimo para que dichas células se activen es que reconozcan un péptido cognado presentado por determinantes del MHC de clase II, llevando a la apoptosis de las células presentadoras de antígeno, suprimiendo de este modo las respuestas de las células T (células T tanto CD4+ como CD8+) contra todos los epítopos de célula T presentados por la APC. Un mecanismo adicional por el cual las células T reguladoras citotóxicas pueden suprimir la respuesta inmunitaria global frente a los antígenos complejos es suprimiendo la activación de las células T espectadoras.
Se prevé que hay situaciones en las que más de un antígeno de alofactor soluble contribuye a una respuesta inmunitaria frente a un alofactor soluble. En tales circunstancias, la misma APC puede no presentar todos los antígenos de alofactores solubles relevantes, ya que algunos de dichos antígenos pueden ser captados por las APC potencialmente diferentes. Se puede prever por tanto que la combinación de dos o más péptidos inmunogénicos se puede utilizar para la prevención y supresión de las respuestas inmunitarias frente a dicho alofactor soluble.
En un aspecto adicional de la invención dicho péptido inmunogénico es reemplazado por células T CD4+ reguladoras sensibilizadas con dicho péptido inmunogénico, como se detalla en las reivindicaciones. En un aspecto adicional más, se prevén métodos tales como los descritos anteriormente en donde el péptido inmunogénico es reemplazado por una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido inmunogénico (p. ej. en la forma de DNA desnudo o un vector viral que se administra a un individuo en lugar del péptido inmunogénico). En adición, se puede usar una combinación de múltiples péptidos inmunogénicos, esto es, más de 1 (p. ej. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) en cualquiera de lo anterior. Estos aspectos de la invención, así como la modificación posterior del péptido inmunogénico se describen en detalle más adelante.
La presente invención se basa en el hallazgo de que un péptido inmunogénico que comprende un epítopo de célula T derivado de un alofactor soluble (terapéutico) y una secuencia peptídica, que tiene actividad reductora, es capaz de generar una población de células T CD4+ reguladoras, que tienen un efecto citotóxico sobre las células presentadoras de antígeno. Se basa adicionalmente en el hallazgo de que dicho péptido inmunogénico es capaz de prevenir la activación de las células T CD8+ específicas del alofactor soluble y/o de las células T CD4+ efectoras.
Por consiguiente, la invención se refiere a péptidos inmunogénicos, que comprenden al menos un epítopo de célula T de un alofactor soluble (terapéutico) con un potencial para desencadenar una reacción inmunitaria, acoplado a un compuesto orgánico que tiene una actividad reductora, tal como un motivo de secuencia de tiorreductasa como se describe en las realizaciones. El epítopo de célula T y el compuesto orgánico están separados por una secuencia conectora de siete aminoácidos como máximo. En otras realizaciones opcionales el péptido inmunogénico comprende adicionalmente una secuencia de direccionamiento endosómico (p. ej. secuencia de direccionamiento endosómico tardío) y/o secuencias “flanqueantes” adicionales.
Los péptidos inmunogénicos de la invención se pueden representar esquemáticamente como A-L-B o B-L-A, en donde A representa un epítopo de célula T de un antígeno (propio o no propio) con un potencial para desencadenar una reacción inmunitaria, L representa un conector y B representa un compuesto orgánico que tiene una actividad reductora.
La actividad reductora de un compuesto orgánico se puede valorar por su capacidad para reducir un grupo sulfhidrilo tal como en el ensayo de solubilidad de la insulina conocido en la técnica, en donde la solubilidad de la insulina es alterada después de la reducción, o con una insulina marcada con fluorescencia. El compuesto orgánico reductor se puede acoplar en el lado amino-terminal del epítopo de célula T o en el carboxi-terminal del epítopo de célula T.
En general, el compuesto orgánico con actividad reductora es una secuencia peptídica. Los fragmentos peptídicos con actividad reductora se encuentran en las tiorreductasas que son pequeñas enzimas reductoras de disulfuro que
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presente memoria de 4 aminoácidos, un conector de 4 aminoácidos y un péptido epitópico de célula T de 9 aminoácidos. En realizaciones particulares, los péptidos inmunogénicos de la invención consisten en entre 12 aminoácidos y 20 hasta 25, 30, 50, 75, 100 o 200 aminoácidos. En una realización más particular, los péptidos consisten en entre 10 y 20 aminoácidos. Más particularmente, el compuesto reductor es un motivo redox como se describe en la presente memoria, y la longitud del péptido inmunogénico que comprende el epítopo y el motivo opcionalmente conectado por un conector es de 19 aminoácidos o menos, por ejemplo 12, 13, 14, 15, 16,17, 18 o 19 aminoácidos.
Como se ha detallado antes, los péptidos inmunogénicos para uso en el contexto de la presente invención comprenden un motivo reductor como se describe aquí conectado a una secuencia de epítopo de célula T. Según una realización particular, los epítopos de células T se derivan de alofactores solubles que no comprenden dentro de su secuencia natural nativa, una secuencia de aminoácidos con propiedades redox dentro de una secuencia de 11 aminoácidos adyacente en el N o C terminal al epítopo de célula T de interés. Más particularmente, la invención abarca la generación de péptidos inmunogénicos a partir de alofactores solubles que no comprenden una secuencia seleccionada de C-X(2)-S, S-X(2)-C, C-X(2)-C, S-X(2)-S, C-X(2)-T, T-X(2)-C dentro de una secuencia de 11 aminoácidos adyacente en el N o C terminal a la secuencia del epítopo, como se detalla en las reivindicaciones. En realizaciones particulares adicionales, la presente invención proporciona péptidos inmunogénicos de alofactores solubles que no comprenden las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente con propiedades redox dentro de su secuencia, como se detalla en las reivindicaciones.
En realizaciones particulares adicionales, los péptidos inmunogénicos de la invención son péptidos que comprenden epítopos de células T, en donde los epítopos de células T no comprenden una secuencia de aminoácidos con propiedades redox dentro de su secuencia natural, como se detalla en las reivindicaciones. Sin embargo, en realizaciones alternativas, un epítopo de células T que se une a la hendidura del MHC puede comprender un motivo redox tal como se describe en la presente memoria dentro de su secuencia epitópica; los péptidos inmunogénicos según la invención que comprenden dicho epítopo de célula T deben comprender además otro motivo redox acoplado (adyacente o separado por un conector) en el N o C terminal con respecto al epítopo de tal manera que el motivo unido puede asegurar la actividad reductora (al contrario del motivo presente en el epítopo, que se oculta dentro de la hendidura).
Otro aspecto de la presente invención se refiere a métodos para generar péptidos inmunogénicos de la presente invención descritos en esta memoria. Tales métodos incluyen la identificación de epítopos de células T en un alofactor soluble de interés; en la técnica se conocen modos para la identificación in vitro e in silico de epítopos de células T y a partir de ahora se desarrollan algunos aspectos. Los péptidos inmunogénicos generados se pueden evaluar opcionalmente en cuanto a la capacidad para inducir células T CD4+ reguladoras específicas de alofactores solubles que son citotóxicas para las células que presentan (partes de) el alofactor soluble de interés.
Los péptidos inmunogénicos según la invención se generan partiendo del epítopo o epítopos de células T del alofactor o alofactores solubles de interés. En particular, el epítopo de célula T utilizado puede ser un epítopo de célula T dominante. La identificación y selección de un epítopo de célula T de un alofactor soluble, para su uso en el contexto de la presente invención, se realiza por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias peptídicas aisladas de un alofactor soluble se ensayan, por ejemplo, mediante técnicas de biología celular de células T, para determinar si las secuencias peptídicas provocan una respuesta de células T. Aquellas secuencias peptídicas que se encuentra que provocan una respuesta de células T se definen como poseedoras de actividad estimulante de células T. La actividad estimulante de células T humanas se puede ensayar además cultivando células T obtenidas de un individuo sensibilizado frente a un alofactor soluble con un péptido/epítopo derivado del alofactor soluble y determinando si la proliferación de células T se produce o no en respuesta al péptido/epítopo que se mide, por ejemplo, mediante la captación celular de timidina tritiada. Los índices de estimulación para respuestas por células T a péptidos/epítopos se pueden calcular como el CPM máximo en respuesta a un péptido/epítopo dividido por el CPM control. Un índice de estimulación (S.I.) de células T igual o mayor a dos veces el nivel de fondo se considera "positivo." Los resultados positivos se utilizan para calcular el índice de estimulación medio para cada péptido/epítopo para el grupo de péptidos/epítopos ensayados. Los epítopos de células T no naturales (o modificados) se pueden ensayar además opcionalmente en cuanto a su afinidad de unión a moléculas de MHC clase II. La unión de epítopos de células T no naturales no naturales (o modificados) con moléculas de MHC clase II se puede realizar de diferentes maneras. Por ejemplo, las moléculas del HLA clase II solubles se obtienen por lisis de células homocigóticas para una molécula de clase II determinada. La última se purifica por cromatografía de afinidad. Las moléculas de clase II solubles se incuban con un péptido de referencia marcado con biotina producido de acuerdo con su fuerte actividad de unión para esa molécula de clase II. Los péptidos a evaluar para la unión con la clase II se incuban entonces a diferentes concentraciones y se calcula su capacidad para desplazar al péptido de referencia de su unión con la clase II por la adición de neutravidina. Los métodos se pueden encontrar, por ejemplo, en Texier et al., (2000) J. Immunology 164, 3177-3184). Los péptidos inmunogénicos de la invención tienen un índice medio de estimulación de células T mayor que o igual a 2,0. Un péptido inmunogénico que tiene un índice de estimulación de células T mayor que o igual a 2,0 se considera útil como agente profiláctico o terapéutico. Más particularmente, los péptidos inmunogénicos según la invención tienen un índice medio de estimulación de células T de al menos 2,5, al menos 3,5, al menos 4,0, o incluso al menos 5,0. Además, dichos péptidos tienen normalmente un índice de positividad (P.I.) de al menos aproximadamente 100, al menos 150, al menos aproximadamente 200 o al menos aproximadamente 250. El índice de positividad de un
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En otra realización, se proporciona un vector que comprende una secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico según la invención. En realizaciones particulares, el vector se genera de tal manera que la secuencia de la molécula de ácido nucleico se expresa solamente en un tejido específico. Los métodos para conseguir la expresión génica específica de tejido son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, colocando la secuencia que codifica un péptido inmunogénico de la invención bajo el control de un promotor, que dirige la expresión del péptido específicamente en uno o más tejidos u órganos. Los vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, vaccinia virus, adenovirus, virus adenoasociados, herpes virus, virus de ARN o papilomavirus bovino, se pueden utilizar para la administración de secuencias de nucleótidos (por ejemplo, ADNc) que codifican péptidos, homólogos o derivados de los mismos según la invención en los tejidos o en la población de células diana. Se pueden utilizar métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores virales recombinantes que contienen dichas secuencias codificantes. Alternativamente, en terapia génica se pueden utilizar células modificadas genéticamente que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico según la invención.
Cuando la administración de uno o más péptidos según la invención se asegura a través de la transferencia génica (es decir la administración de un ácido nucleico que asegura la expresión de péptidos según la invención in vivo después de la administración), la dosificación apropiada del ácido nucleico se puede determinar basándose en la cantidad de péptido expresado como resultado del ácido nucleico introducido.
Un aspecto adicional de la invención contempla medicamentos que son normalmente, pero no necesariamente, una formulación (farmacéutica) que comprende como ingrediente activo al menos uno de los péptidos inmunogénicos de la invención, una (población de) Tregs específica para dicho péptido inmunogénico o un vector génico terapéutico capaz de expresar dicho péptido inmunogénico. Aparte del ingrediente o ingredientes activos, dicha formulación comprenderá al menos uno de un diluyente, vehículo o adyuvante (farmacéuticamente aceptable). Normalmente, los compuestos farmacéuticamente aceptables (tales como diluyentes, vehículos y adyuvantes) se pueden encontrar, por ejemplo, en un manual de Farmacopea (por ejemplo, Farmacopea de Estados Unidos, Farmacopea Europea o Farmacopea Internacional). El medicamento o composición farmacéutica de la invención normalmente comprende una cantidad (profilácticamente o terapéuticamente) eficaz del ingrediente o ingredientes activos, en donde la eficacia es en relación con la afección o trastorno a prevenir o tratar. En particular, las composiciones farmacéuticas de la invención son vacunas para aplicación profiláctica o terapéutica.
Puede ser necesario que el medicamento o composición farmacéutica de la invención sea administrado a un sujeto que lo necesite como parte de un régimen profiláctico o terapéutico que comprende administraciones múltiples de dicho medicamento o composición. Dichas administraciones múltiples normalmente tienen lugar secuencialmente y el intervalo de tiempo entre dos administraciones puede variar y se ajustará a la naturaleza del ingrediente activo y a la naturaleza de la afección a prevenir o tratar. La cantidad de ingrediente activo administrada a un sujeto que lo necesite en una única administración también puede variar y dependerá de factores tales como el estado físico del sujeto (por ejemplo, peso, edad), el estado de la afección a prevenir o tratar, y la experiencia del médico o enfermero que le trata.
El término "diluyentes" se refiere, por ejemplo, a soluciones salinas fisiológicas. El término "adyuvante" normalmente se refiere a un agente farmacológico o inmunológico que modifica (preferiblemente aumenta) el efecto de otros agentes (por ejemplo, fármacos, vacunas) al mismo tiempo que tiene pocos, si los hubiera, efectos directos cuando se administran por sí mismos. Como un ejemplo de adyuvante, se da el hidróxido de aluminio (alumbre), en el que un péptido inmunogénico de la invención puede ser adsorbido. Además, se conocen en la técnica muchos otros adyuvantes y se pueden utilizar con la condición de que faciliten la presentación del péptido en la presentación del MHC de clase II y la activación de células T. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa cualquier material o sustancia con la que se formula el ingrediente activo con el fin de facilitar su aplicación o diseminación en el sitio a tratar, por ejemplo, disolviendo, dispersando o difundiendo dicha composición, y/o para facilitar su almacenamiento, transporte o manipulación sin alterar su eficacia. Estos incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos (por ejemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol) agentes isotónicos (tales como azúcares o cloruro de sodio) y similares. Se pueden incluir ingredientes adicionales para controlar la duración de la acción del ingrediente activo en la composición. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido o un líquido o un gas que haya sido comprimido para formar un líquido, es decir, las composiciones de esta invención se pueden utilizar adecuadamente como concentrados, emulsiones, soluciones, granulados, polvos, pulverizaciones, aerosoles, suspensiones, pomadas, cremas, comprimidos, gránulos o polvos. Los vehículos farmacéuticos adecuados para su uso en dichas composiciones farmacéuticas y sus formulaciones, son bien conocidos por los expertos en la técnica y no hay ninguna restricción particular para su selección dentro de la presente invención. Ellos pueden incluir también aditivos tales como agentes humectantes, agentes dispersantes, gomas, adhesivos, agentes emulsionantes, disolventes, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos (por ejemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotónicos (tales como azúcares o cloruro de sodio) y similares, siempre que los mismos sean conformes con la práctica farmacéutica, es decir, vehículos y aditivos que no creen un daño permanente a los mamíferos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar de cualquier manera conocida, por ejemplo, mezclando, recubriendo y/o moliendo de manera homogénea los ingredientes activos, en un procedimiento de una sola etapa o de múltiples etapas, con el material vehículo seleccionado y, cuando sea apropiado, con el resto de aditivos tales como agentes tensioactivos. También se pueden preparar por micronización, por ejemplo, con el fin
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Como las células B transgénicas expresan también epítopos de células T derivados de BCR, se utiliza el mismo sistema para determinar si una respuesta inmunitaria continua contra un aloantígeno dado puede ser suprimida mediante la generación de células T reguladoras citotóxicas para los determinantes idiotípicos.
Como los BCR transgénicos se derivan del anticuerpo anti-factor VIII humano BO2C11, la línea de células B transgénicas presenta los mismos determinantes idiotípicos que los descritos en el ejemplo 1 y por lo tanto se pueden utilizar los clones de células T usados en el ejemplo 1.
Las células B transgénicas se incuban con factor VIII y se lavan. Después, las células son co-cultivadas con los clones de células T del ejemplo 1 pre-activadas con el péptido de la SEQ ID NO: 1 (determinante idiotípico natural) o con el péptido de la SEQ ID NO: 2 (determinante idiotípico modificado). Se evaluó el efecto de las diferentes células T activadas sobre las células B transgénicas.
Ejemplo 5. Inducción a la apoptosis de células T CD4+ efectoras específicas del factor VIII mediante supresión de las espectadoras inducida por las células T CD4+ citolíticas específicas del factor VIII generadas in vivo
Se obtuvieron células T CD4+ efectoras policlonales del bazo de los ratones KO de factor VIII inmunizados con 2 U.I. de FVIII recombinante humano (CD4 (F8-)) y se purificaron utilizando perlas magnéticas anti-CD4. Después se marcaron las células con CFSE.
La inducción de la apoptosis como se mide por las células marcadas con CFSE, se midió después por la anexina V y tinción con 7-AAD después de la incubación de dichas células con APC (células B de bazo) cargadas con 5 µg/ml de FVIII humano y péptido 1 µM de la SEQ ID NO: 5 (CGHCGGFTNMFATWSPSK, que corresponde a la secuencia de 2196-2207 aminoácidos del dominio C2 del factor VIII humano, modificada por adición de un motivo tiorreductasa (subrayado) separado por 2 glicinas del epítopo de células T del Factor VIII). La apoptosis se midió después de 72 h de cultivo a 37 ºC.
Cuando las células CD4(F8-) marcadas con CFSE se co-cultivaron con células T CD4+ obtenidas de ratones inmunizados con un péptido sintético de la SEQ ID NO: 5 (células T CD4+ citolíticas), se indujo una apoptosis significativa. La figura 2 muestra que dos preparaciones independientes de las células T CD4+ citolíticas produjeron el 6,6 % y el 8,4 % de la apoptosis, respectivamente ("CD4(F8+) conjunto 1" y "CD4(F8+) conjunto 2" en la Figura 2). Cuando las células CD4(F8-) marcadas con CFSE fueron co-cultivadas en presencia de doble número de células CD4(F8-) no marcadas, no se indujo la apoptosis (leyenda “CD4(F8-)” en la Figura 2). La mortalidad de la línea base se restó de los porcentajes de muerte celular. Estos resultados indican que las respuestas inmunitarias a alofactores solubles que dependen de las células T CD4+ efectoras pueden ser eliminadas por las células T CD4 + citolíticas generadas utilizando un epítopo de células T derivado de un alofactor modificado según la invención.
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