CN108289941B

CN108289941B - 用于消除对治疗剂的免疫应答的改进的方法和化合物

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Publication number: CN108289941B
Application number: CN201680068767.5A
Authority: CN
Inventors: 让-玛丽·圣-雷米; 卢克·范德·埃尔斯特; 文森特·卡利尔
Original assignee: Imcyse SA
Current assignee: Imcyse SA
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2036-09-23
Also published as: AU2016328582A1; HK1252695A1; AU2016328582B2; JP2018528237A; CA2995771A1; ES2874077T3; US20180258154A1; AU2023201135A1; EP3939606A3; WO2017050966A1; CN108289941A; EP3352782B1; US20240109951A1; EP3352782A1; JP7090335B2; EP3939606A2; US11787849B2

Abstract

本发明描述了多肽的多组分试剂盒，包含：a)肽，该肽包含：a1)MHC II类T细胞表位或CD1d‑限制性NKT细胞表位，和a2)紧邻所述表位或与所述表位隔开至多7个氨基酸的[CST]‑X(2)‑C[SEQ ID NO:7]或C‑X(2)‑[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原酶基序序列；和b)多肽，该多肽包含：b1)治疗性蛋白质和b2)在a1)中定义的表位，其中表位序列是与b1)的蛋白质的序列不同的序列。治疗性蛋白质与肽组合用于预防针对治疗性蛋白质的免疫应答。

Description

用于消除对治疗剂的免疫应答的改进的方法和化合物

技术领域

本发明涉及在替代疗法、基因疗法和基因疫苗接种(gene vaccination，基因免疫)中使用的经修饰的蛋白质。

本发明还涉及用于预防针对替代疗法、基因疗法和基因疫苗接种中使用的蛋白质的免疫应答的化合物和方法。

背景技术

用作治疗剂的蛋白质通常会引起免疫应答，从而阻碍进一步的使用。例子是血友病A患者的治疗中的因子VIII和对细胞因子(例如抗-TNF-α抗体)特异或对细胞表面标记物(例如抗-CD20抗体)特异的抗体。平均而言，用这种试剂治疗的患者中有30％在外周血中产生可检测浓度的抗体。此外，相当大比例的患者需要施用高于预期剂量的治疗剂，这表明低于检测浓度的抗体可中和试剂的活性和/或增加其从循环中的清除。在所有这些情况下，防止这些免疫应答是有利的。

基因疗法和基因疫苗接种依赖于用于进行转基因的病毒载体。然而，由这些载体表达的病毒蛋白引发免疫应答，降低转基因效率并防止转基因的再施用。避免这种响应将允许长期表达转基因，并且会减少实现功能性转基因或疫苗接种效率所需的病毒颗粒的数量。

专利申请WO2008017517描述了具有抗原和氧化还原基序序列的II类限制性T细胞表位的肽及其在治疗许多疾病中的用途。Carlier et al.(2012),PloS ONE7,e45366中公开了进一步的细节。此类肽的使用导致产生具有溶细胞特性的CD4+T细胞，其在与肽-MHCII类复合物同源相互作用后诱导抗原呈递细胞的凋亡(呈递在肽设计中使用的抗原)。

同一发明人的其他专利申请公开了使用该技术以避免针对治疗性蛋白质或抗体的免疫应答(WO2009101206)或针对由用于接种的基因疗法的病毒骨架编码的蛋白质的免疫应答(WO2009101204)。

针对多种抗原，已经描述了与多种MHC II类分子结合的混杂的MHCII类T细胞表位。

US2007184023中公开了VEGF和混杂的T辅助细胞表位的融合蛋白。

透明带蛋白和破伤风毒素混杂的T细胞表位的融合蛋白产生抗体，该抗体与内源性透明带蛋白结合并充当避孕药(Lou et al.(1995)J.Immunol.155,2715-2720)。

发明内容

本发明为以下问题提供解决方案。

在上述的现有技术方法中，在肽中使用的表位的序列由抗原的序列限定。

当分离并与氧化还原基序序列融合时，此类表位肽可能经历蛋白水解切割、可能难以溶解、或可能倾向于与氧化还原基序形成内部胱氨酸桥。

另外，将不同的肽用于不同的治疗性蛋白质使得难以设计标准程序，在这种标准程序中，可以以相同的浓度和相同的接种方案施用肽，而不管使用的治疗性蛋白质的类型如何。

MHC II类决定簇在人类中的大多态性使得难以使用来自一种蛋白质的单个或少量表位来匹配这种多态性。

只有那些含有混杂表位(promiscuous epitope)的抗原，或只有其中抗原的不同表位可以被识别以规避该多态性的那些抗原，有可能治疗任何不依赖于他/她的HLA类型的个体。

如果在蛋白质中存在，使用CD1d-限制性NKT细胞肽表位可以绕过HLA多态性，然而并不是所有的抗原蛋白质都含有这样的肽序列。

本发明允许解偶联含有T细胞表位的抗原之间的连接和使用相同表位以制备具有表位和氧化还原基序序列的肽。

本发明允许使用结合不同MHC II类蛋白质和等位基因的T细胞表位。

如从本申请中描述的医疗用途可以容易理解的，并且如下面更详细地描述，这些医疗用途需要第一施用包含表位和氧化还原酶基序的肽，以引出针对呈递表位的抗原呈递细胞(APC)的溶细胞CD4+群体。这之后是第二施用用于基因疗法的具有新引入的表位的治疗性蛋白质或载体。在本文中，治疗性蛋白质(或由载体编码的病毒载体蛋白质)含有与第一施用中使用的肽中存在的表位相同的表位。对例如治疗性蛋白质的最终免疫应答，将首先从APC呈递治疗性蛋白质的表位开始。APC不仅会呈递治疗性蛋白质本身中存在的表位，还会呈递已经引入的表位。因此，APC将被上述溶细胞杀死，阻止了抗原的清除。

本发明的医疗用途基于两种类型多肽的分开给予。因此，它们通过同义词“组合”、“组”或“多组分试剂盒(kit of parts，成套试剂盒，部分的试剂盒，试剂盒套件，试剂盒部件)”中的一个来引用。

本发明的一个方面涉及多肽的多组分试剂盒，包含：

a)肽，该肽包含：

a1)MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞表位，和

a2)紧邻所述表位或与所述表位隔开至多7个氨基酸的[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原酶基序序列，

和

b)多肽，该多肽包含：

b1)治疗性蛋白质，和

b2)在a1)中定义的表位，其中表位序列是与b1)的蛋白质的序列不同的序列。

本发明的一个方面涉及多组分试剂盒，包含：

a)肽，该肽包含：

a1)MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞表位，和

和

b)包含编码多肽的多核苷酸序列的表达载体，该多肽包含：

b1)治疗性蛋白质，和

本发明的一个方面涉及多组分试剂盒，包含：

a)肽，该肽包含：

a1)MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞表位，和

和

b)用于基因疗法或基因疫苗接种的病毒载体，其在骨架中包含编码蛋白质的多核苷酸序列，该蛋白质包含：

b1)用于载体的功能和维持的病毒载体蛋白质，

因此，表位的序列不出现在如现有技术治疗中使用的治疗性蛋白质或病毒载体蛋白的天然(或野生型或原生)序列中。本发明没有设想如下融合蛋白，其中蛋白质内的现有表位被重复为蛋白质的融合伴侣。本发明没有设想如下蛋白质，其中上述定义的a)的表位是从蛋白质的序列中切下的现有表位并且经由重组DNA技术通过缺失和插入而被插入到蛋白质的另一部分中。

在这些试剂盒的实施方式中，b)的蛋白质是融合蛋白，其包含以下各项作为融合伴侣：

b1)治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质，和

在这些试剂盒的实施方式中，氧化还原酶基序序列是C-X(2)-C[SEQID NO:2]。

在这些试剂盒的实施方式中，CD1d-限制性NKT细胞表位基序具有序列[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:1]。

在这些试剂盒的实施方式中，CD1d-限制性NKT细胞表位基序具有序列[FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY][SEQ ID NO:28]。

在这些试剂盒的实施方式中，所述MHC II类T细胞表位是与一个或多个HLA-DR1分子结合的混杂表位。

在这些试剂盒的实施方式中，MHC II类T细胞表位具有序列X1X2MATX6LLM[SEQ IDNO:29]，其中X1和X2独立地选自V、I、L、M、Y、H、F和W，并且X6是R或P。

本发明的一个方面涉及用作药物的上述试剂盒。

本发明的一个方面涉及多肽，该多肽包含：

b1)治疗性蛋白质，和

b2)MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位，其中表位序列是与b1的蛋白质的序列不同的序列；

在先前已经用肽治疗的个体中用作药物，肽包括：

a1)所述MHC II类T细胞表位或所述CD1d-限制性NKT细胞表位，和

a2)紧邻所述表位或与所述表位隔开至多7个氨基酸的具有[CST]-X(2)-C[SEQ IDNO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原酶基序序列的序列。

本发明的一个方面涉及编码多肽的表达载体，该多肽包含：

b1)治疗性蛋白质，和

在先前已经用肽治疗的个体中用作药物，肽包括：

a1)所述MHC II类T细胞表位或所述CD1d-限制性NKT细胞表位，和

本发明的一个方面涉及用于基因疗法或基因疫苗接种的病毒载体，其在骨架中包含编码蛋白质的多核苷酸序列，该蛋白质包含：

b1)用于载体的功能和维持的病毒蛋白质，和

b2)MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞表位，其中表位序列是与b1的蛋白质的序列不同的序列，

在先前已经用肽治疗的个体中用作药物，肽包括：

a1)所述MHC II类T细胞表位或所述CD1d-限制性NKT细胞表位，和

本发明的一个方面涉及肽，包括：

-a1)MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位，和

-a2)紧邻所述表位或与所述表位隔开至多7个氨基酸的具有[CST]-X(2)-C[SEQID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原酶基序序列的序列，

用于利用所述MHC II类T细胞表位或所述CD1d结合肽表位来预防针对治疗性蛋白质或针对病毒载体蛋白质的免疫应答(for preventing an immune response against atherapeutic protein or against a viral vector protein with said MHC class IIT cell epitope or said CD1d binding peptide epitope，用于预防针对治疗性蛋白质或针对病毒载体蛋白质与所述MHC II类T细胞表位或所述CD1d结合肽表位的免疫应答)，

-其中，所述表位具有在治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质的序列中不存在的序列。

本发明的一个方面涉及用于制备多肽的多组分试剂盒的方法，包括：

a)通过向蛋白质的序列中引入MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞表位的序列以制备经修饰的治疗性蛋白质，表位序列是在未经修饰的蛋白质中不存在的序列，

b)制备肽，该肽包含：

-a)的MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位，和

-紧邻所述表位或与所述表位隔开至多7个氨基酸的[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原酶基序序列。

本发明的一个方面涉及用于制备多组分试剂盒的方法，包括：

a)制备载体，该载体包含编码用于该载体的功能和维持的经修饰的病毒载体蛋白质或经修饰的治疗性蛋白质的多核苷酸序列，其通过向所述蛋白质的序列中引入MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位，表位序列是在未经修饰的蛋白质中不存在的序列，

b)制备肽，该肽包含：

-a)的MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位，和

本发明的一个方面涉及长度为12至100个氨基酸的肽，其包含：

-具有基序X1X2MATX6LLM[SEQ ID NO:29]的经修饰的CLIP序列，其中X1和X2独立地选自V、I、L、M、F、H、Y和W，并且其中X6为R或P，和

-紧邻所述经修饰的CLIP序列或与所述经修饰的CLIP序列隔开至多7个氨基酸的[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原酶基序序列。

在其实施方式中，CLIP序列选自由FFMATRLLM[SEQ ID NO:30]、WWMATRLLM[SEQ IDNO:31]、WFMATRLLM[SEQ ID NO:32]、FWMATRLLM[SEQ ID NO:33]、FFMATPLLM[SEQ ID NO:34]、WWMATPLLM[SEQ ID NO:35]、WFMATPLLM[SEQ ID NO:36]和FWMATPLLM[SEQ ID NO:37]组成的组。

本发明的一个方面涉及治疗性蛋白质或编码治疗性蛋白质或编码病毒载体蛋白质的多核苷酸，其特征在于存在MHC II类T细胞表位，该表位具有在治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质的序列中不存在的序列，其中所述MHC II类T细胞表位具有其中基序为X1X2MATX6LLM[SEQ ID NO:29]的序列，其中X1和X2独立地选自V、I、L、M、F、H、Y和W，并且其中X6为R或P。

本发明的一个方面涉及表达载体，其包含用于框内插入(in frame insertion)编码治疗性蛋白质的多核苷酸的多克隆位点，其特征在于存在编码混杂的MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞表位的核苷酸序列，以便在将所述治疗性蛋白质的所述多核苷酸插入所述表达载体时，编码并表达包含融合到所述混杂的MHC II类T细胞表位或所述CD1d-限制性NKT细胞表位的所述治疗性蛋白质的融合蛋白。

在其实施方式中，表达载体是哺乳动物表达载体。

在实施方式中，表达载体包含在框内编码治疗性蛋白质的序列与编码混杂的MHCII类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞表位的序列，在转录和翻译元件的控制下，允许表达融合蛋白，该融合蛋白包含融合到所述混杂的MHC II类T细胞表位或所述CD1d-限制性NKT细胞表位的所述治疗性蛋白质，其中所述表位具有与所述治疗性蛋白质的序列不同的序列。

在某些实施方式中，MHC II类T细胞表位具有其中基序为X1X2MATX6LLM[SEQ IDNO:29]的序列，其中X1和X2独立地选自V、I、L、M、F、H、Y和W，并且其中X6为R或P。

在其实施方式中，序列选自由FFMATRLLM[SEQ ID NO:30]、WWMATRLLM[SEQ ID NO:31]、WFMATRLLM[SEQ ID NO:32]、FWMATRLLM[SEQ ID NO:33]、FFMATPLLM[SEQ ID NO:34]、WWMATPLLM[SEQ ID NO:35]、WFMATPLLM[SEQ ID NO:36]和FWMATPLLM[SEQ ID NO:37]组成的组。

本发明涉及以下多肽的组合：

a)经修饰的治疗性蛋白质或经修饰的病毒载体蛋白质，其特征在于修饰是存在MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位，表位具有在治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列，

和

b)肽，该肽包含在a)中定义的MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位以及紧邻表位或与表位隔开至多7个氨基酸的具有[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原酶基序序列的序列。

在组合的实施方式中，a)中的蛋白质是治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质与MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位融合的融合蛋白。

在组合的实施方式中，a)中的蛋白质修饰有至少2个不同的表位，并且b)中的蛋白质存在至少2个肽，每个肽包含如a)中定义的表位。

在组合的实施方式中，氧化还原酶基序序列为C-X(2)-C[SEQ IDNO:2]。

在组合的实施方式中，在b)中，表位和氧化还原基序被至多4个氨基酸间隔开。

CD1d-限制性NKT细胞肽表位基序的实施方式是[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:1]、或[FWYH]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYH][SEQ ID NO:27]和[FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY][SEQ ID NO:28]。

在典型实施方式中，T细胞表位是与一个或多个HLA-DR1分子结合的混杂表位，其优选结合至少HLA-DR1*0101、HLA-DR1*0102和HLA-DR1*0302。

在特定的实施方式中，T细胞表位具有序列X₁X₂ MATX₆ LLM[SEQ ID NO:29]，其中X₁和X₂独立地选自V、I、L、M、Y、H、F和W，并且X₆为R或P。其例子是FFMATRLLM[SEQ ID NO:30]、WWMATRLLM[SEQ ID NO:31]、WFMATRLLM[SEQ ID NO:32]或FWMATRLLM[SEQ ID NO:33]。

本发明涉及用作药物的以上方面所述的多肽的组合。

本发明涉及经修饰的治疗性蛋白质或经修饰的病毒载体蛋白质，其中修饰是存在MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位，所述表位具有在治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列，在先前已使用以下肽治疗的个体中用作药物，该肽包含MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位以及紧邻表位或与表位隔开至多7个氨基酸的具有[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原酶基序序列的序列。

本发明涉及一种肽，该肽包含MHC II类T细胞表位或CD1d结合肽表位，并且包含紧邻表位或与表位隔开至多7个氨基酸的具有[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原酶基序序列的序列，用于利用MHC II类T细胞表位或CD1d结合肽表位预防针对治疗性蛋白质或针对病毒载体蛋白质的免疫应答，

-其中，表位具有在治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质的野生型序列中不存在的序列，并且任选地，

-其中，蛋白质在表位序列的N端或C端部分的7氨基序列中不含有具有[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]的序列。

本发明涉及用于制备经修饰的治疗性蛋白质或经修饰的病毒载体蛋白质的方法，包括步骤：向蛋白质的序列中引入MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位的序列，表位序列是未经修饰的蛋白质中不存在的序列。

典型地，将表位序列连接到蛋白质以获得融合蛋白。

本发明涉及长度为12至100个氨基酸的肽，其包含具有基序X₁X₂ MATX₆ LLM[SEQ IDNO:29]的经修饰的CLIP序列，其中X₁和X₂独立地选自V、I、L、M、F、H、Y和W，并且其中X₆为R或P。其例子是FFMATRLLM[SEQ ID NO:30]、WWMATRLLM[SEQ ID NO:31]、WFMATRLLM[SEQ IDNO:32]、FWMATRLLM[SEQ ID NO:33]、FFMATPLLM[SEQ ID NO:34]、WWMATPLLM[SEQ ID NO:35]、WFMATPLLM[SEQ ID NO:36]和FWMATPLLM[SEQ ID NO:37]。

在特定的实施方式中，这些肽进一步包含具有[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]氧化还原基序序列的序列，其中氧化还原基序序列和经修饰的clip序列被0至7个氨基酸或0至4个氨基酸或0至2个氨基酸间隔开。

基序的具体实施方式为C-X(2)-C[SEQ ID NO:2]。

本发明涉及经修饰的治疗性蛋白质或经修饰的病毒载体蛋白质，其特征在于修饰是存在MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位，所述表位具有在治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列。

具体实施方式

定义

术语“肽”和“蛋白质”之间的区别是任意的，因为二者都指通过肽键连接的多肽，但其可以包含非氨基酸结构(像例如连接或有机化合物)。多肽可以含有常规20种氨基酸或通过翻译后修饰获得的其修饰版本的任意一种，或者可以含有通过化学肽合成或通过化学或酶促修饰掺入的非天然存在的氨基酸(例如生理氨基酸)。如本文所使用的，将使用肽来指代包含2至多达20、30、50、75或100个氨基酸的氨基酸序列的分子。

如本文所用的术语“抗原”是指大分子的结构，典型地为蛋白质(有或没有多糖)，或包含一个或多个半抗原并且包含T细胞表位的蛋白质组合物。如本文所用的术语“抗原性蛋白质”是指包含一个或多个T细胞表位的蛋白质。如本文所用的自体抗原或自体抗原性蛋白质是指存在于体内的人或动物蛋白质，在同一人体或动物体内引发免疫应答。

术语“食物或药物抗原性蛋白质”是指食物或药物产品中(例如疫苗中)的抗原性蛋白质。

术语“表位”是指抗原性蛋白质的一个或几个部分(其可以定义构象表位)，其被抗体或其部分(Fab'、Fab2'等)或在B或T细胞淋巴细胞的细胞表面存在的受体特异性地识别并结合，并且其通过这种结合能够引起免疫应答。

在本发明上下文中的术语“T细胞表位”是指显性、亚显性或次要T细胞表位，即被T淋巴细胞的细胞表面的受体特异性识别并结合的抗原性蛋白质的一部分。表位为显性、亚显性还要次要的，取决于引起针对该表位的免疫反应。显性取决于在蛋白质的所有可能的T细胞表位中，此种表位被T细胞识别并能够激活他们的频率。T细胞表位是MHC II类分子识别的表位，其通常由9个氨基酸的序列组成，配合在MHC II分子的沟槽中(对于某些肽/MHCII复合物，配合在MHC II分子的沟槽中的肽的长度可以为8或10个氨基酸)。在代表9个氨基酸的T细胞表位的肽序列内，表位中的氨基酸编号为P1至P9，表位的N-末端氨基酸编号为P-1、P-2等，表位的C末端氨基酸编号为P+1、P+2等。

本文按照Prosite的格式编写氨基酸序列的“基序”(Sigrist et al.(2002)BriefBioinform.3,265-274)。符号X用于任何氨基酸都可被接受的位置。通过在方括号(‘[]’)之间列出对于给定位置可接受的氨基酸来指示替换物。例如：[CST]代表选自Cys、Ser或Thr的氨基酸。通过在大括号(‘{}’)之间列出来指示排除作为替代物的氨基酸。例如，{AM}代表除Ala和Met之外的任何氨基酸。基序中的不同元素通过连字符-相互分开。基序内相同元素的重复可以通过在该元素之后放置括号之间的数值或数值范围来指示。例如：X(2)对应于X-X，X(2,3)对应于X-X或X-X-X，A(3)对应于A-A-A。

术语“CD1d-限制性NKT细胞肽表位”或“CD1d-限制性NKT细胞肽表位”是指被表达在细胞表面并且被NKT细胞识别的CD1d分子特异性结合的抗原性蛋白质的一部分。该定义中的“肽”一词可用于强调与现有技术结合的CD1d结合化合物如神经酰胺的差异。

CD1d-限制性NKT细胞肽表位具有一般基序[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT][SEQ ID NO:1]。这种一般基序的替代版本在位置1和/或位置7处具有替代物[FWYH]。

这种一般基序的替代版本在位置1和/或位置7处具有替代物[FWYT]。

这种一般基序的替代版本在位置1和/或位置7处具有替代物[FWY]。

不管位置1和/或7的氨基酸，一般基序的替代版本在位置4处具有替代物[ILM]。

如本文参照本发明上下文使用的表位而使用的“同系物”是指与天然存在的表位具有至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸序列同一性的分子，从而维持表位结合抗体或B和/或T细胞的细胞表面受体的能力。表位的特定同系物对应于在最多三个、更特别是至多两个、最特别是一个氨基酸中修饰的天然表位。

如本文参照本发明的肽而使用的术语“衍生物”是指包含至少肽活性部分(即能够检测CD4+T细胞)的分子，并且除此之外，其还包含可以具有不同用途(诸如稳定肽或改变肽的药代动力学或药效学性质)的附加部分。

如本文使用的两个序列的术语“序列同一性”是指，当将所述两个序列对比时，具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以所述序列中较短序列的核苷酸或氨基酸的数目。序列同一性可以大于70％，大于80％，大于90％、大于95％，大于98％或大于99％。

如本文使用的术语“肽-编码多核苷酸(或核酸)”和“编码肽的多核苷酸(或核酸)”是指一种核苷酸序列，当在适合的环境中表达时，其导致生成相关肽序列或其衍生物或同系物。此类多核苷酸或核酸包括编码肽的正常序列，以及这些核酸的衍生物和片段，所述衍生物和片段能够表达具有所需活性的肽。例如，编码其肽片段的核酸是编码来源于哺乳动物或对应于哺乳动物的肽或其片段(最特别是人类肽片段)的序列。

术语“具有还原活性的有机化合物”在本发明的上下文中是指对蛋白质上的二硫键具有还原活性的化合物，更特别是氨基酸序列。

诸如在胰岛素溶解度测定中(其中胰岛素的溶解度在还原时被改变)或用荧光标记的胰岛素，可以检测有机化合物还原巯基的能力，以检测其还原活性。还原性有机化合物可以偶联在T细胞表位的氨基端侧或在T细胞表位的羧基端。通常，具有还原活性的有机化合物是肽序列。在硫醇还原酶中存在具有还原活性的肽片段，硫醇还原酶是小的二硫键还原酶，包括谷氧还蛋白、核氧还蛋白(nucleoredoxin)、硫氧还蛋白、和其他硫醇/二硫化物氧化还原酶(Holmgren(2000)Antioxid.Redox Signal.2,811-820；Jacquot et al.(2002)Biochem.Pharm.64,1065-1069)。它们是多功能的，普遍存在于并且发现于许多原核生物和真核生物中。它们通过保守的活性结构域共有序列内的氧化还原活性半胱氨酸对蛋白质(例如酶)上的二硫键施加还原活性，所述保守的活性结构域共有序列为：C-X(2)-C[SEQ IDNO:2]、C-X(2)-S[SEQ IDNO:3]、C-X(2)-T[SEQ IDNO:4]、S-X(2)-C[SEQ IDNO:5]、T-X(2)-C[SEQ IDNO:6](Fomenko et al.(2003)Biochem.42,11214-11225；Fomenko et al.(2002)Prot.Science 11,2285-2296)，其中，X代表任何氨基酸。这些结构域也存在于较大的蛋白质中，例如蛋白质二硫化物异构酶(PDI)和磷酸肌醇特异性磷脂酶C。

当提及本文的肽或序列时，术语“天然的”、“野生型”、“原生的”是指所述序列与天然存在的序列或其片段相同的事实。相比之下，术语“人工的”是指序列或肽，其本身在自然中不存在并且不同于上述天然/野生型/原生序列。任选地，人工序列通过有限修饰(例如改变天然存在序列内的一个或多个氨基酸或通过在天然存在序列的N-或C-末端添加氨基酸)而获自天然序列。在本文中以其全名、其三个字母缩写或其一个字母缩写来引用氨基酸。还可以通过化学修饰氨基酸侧链或通过包括非天然氨基酸来获得人工序列。

术语“主要组织相容性抗原”是指属于人类HLA系统的分子(H2在小鼠中)，它们被分为两大类。MHC I类分子由含有3个结构域(α1、2和3)的单个多态链构成，其在细胞表面与β2微球蛋白结合。I类分子由人类中称为A、B和C的3个基因座编码。此种分子将肽呈递给CD8+亚群的T淋巴细胞。II类分子由2个多态链组成，每个多态链含有2条链(α1和2以及β1和2)。这些II类分子由人类中3个基因座(DP、DQ和DR)编码。其中，HLA-DR分子是人类中最普遍的。不同民族和种族中等位基因的频率可以从http://www.allelefrequencies.net获得(Gonzalez-Galarza et al.(2015)Nucl.Acid Res.28,D784-D788。

“基因疗法”可以定义为将基因或多个基因体外或体内插入个体细胞或细胞组(诸如组织或器官)中，目的是提供缺失的基因或等位基因或用通过基因疗法递送的功能性拷贝替换突变基因或突变等位基因。通过称为载体的运送者来递送“治疗性基因”。最常见的载体是病毒载体。一旦用携带治疗性基因的病毒载体感染靶细胞之后，病毒载体将包括治疗性基因的遗传物质卸载到靶细胞中，随后产生由治疗性基因编码的功能性蛋白质。基因疗法靶向的细胞可以是体细胞或生殖细胞或细胞系。此外，基因疗法是指使用载体在体外或体内递送需要在细胞或细胞组中过表达或异位表达的基因。载体可以促进新基因在细胞核中的整合或可以导致该基因的附加体表达。

“基因疫苗接种”可以定义为向受试者施用功能性基因(即能够表达由基因编码的蛋白质)，其目的在于给受试者接种疫苗。因此，基因疫苗接种(或DNA疫苗接种)是用肽、蛋白质、减毒或杀死的细菌等更经典的接种的变体。基因疫苗接种可以使用裸DNA或(在本发明的上下文中特别令人感兴趣的)使用病毒载体进行。

当在本文中使用时，术语“病毒载体蛋白质”是指衍生自病毒载体本身的骨架并且是所述载体的功能和维持所需的任何蛋白质或肽。它不涉及克隆到载体中的治疗性基因。典型地，此种病毒载体蛋白质是抗原性的并且包含一个或多个表位如T细胞表位。众所周知的例子是衣壳蛋白。几种病毒目前被用于基因疗法(包括实验和人类)，包括RNA病毒(γ-逆转录病毒和慢病毒)和DNA病毒(腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和痘病毒)。

术语“同种异体因子”或“同种异体抗原”是指当在相同物种的2个个体中比较时显示多态性的蛋白质、肽或因子(即，任何分子)，并且更一般地说，在接受同种异体因子的受试者中诱导(同种异体反应性)免疫应答的任何蛋白质、肽或因子。

术语“同种异体反应性”是指针对移植物受体与供体之间的等位基因差异的免疫应答。同种异体反应性适用于抗体和T细胞。本发明完全依赖于T细胞同种异体反应性，其基于在MHC决定簇的背景下作为肽-MHC复合物呈现的同种异体抗原的T细胞识别。

术语“混杂”是指携带能够结合不同MHC II类分子的性质的表位，从而能够覆盖相当大百分比的预期群体。所述相当大百分比为预期群体的至少50％，或至少60％，至少75％，至少90％或甚至至少95％。

预期群体可以定义为一个或多个国家或一个或多个地区或大陆的个体，或者定义为族群的成员。

或者，混杂表位可以定义为结合预期群体中15个最普遍HLA DR等位基因中的至少7、8、9或10个。

混杂表位可以是抗原中存在的天然序列，或者通过替换抗原中存在的天然序列的一个或多个氨基酸(2、3或4)而修饰的天然序列，或完全人工的序列，包括非生理性氨基酸、含有修饰侧链的氨基酸或小化合物。

本领域中也存在术语“通用表位”。然而，这涉及在不同抗原中遇到的表位序列。这种通用表位可能或可能不结合不同的MHC分子和等位基因。

本发明的一个方面涉及修饰版本的治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质，其具有添加的MHC II类T细胞表位或添加的CD1d-限制性NKT细胞肽表位。这通常通过产生抗原和表位序列的融合蛋白来完成，尽管表位序列也可以引入到蛋白质本身中。

在本文中，9氨基酸T细胞表位或7氨基酸CD1d-限制性NKT细胞肽表位序列不是野生型治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质的片段。

这可以通过修饰如在治疗性蛋白质/病毒载体蛋白中存在的表位序列来实现，或通过使用在另一种抗原(人类或非人类)中存在的表位序列或通过使用经设计的与任何现有的抗原表位序列具有低序列同一性或无序列同一性的序列来实现。

MHC II类T细胞表位可以是混杂表位。稍后会有更详细地解释这种选择的基本原理。

如果在经修饰的治疗性蛋白质/病毒载体蛋白质中，[CST]-X(2)-C[SEQ IDNO:7]C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]基序序列里所引入的II类T细胞表位或所引入的CD1d-限制性NKT细胞肽表位的序列在4(典型地7)个氨基酸内，该经修饰的治疗性蛋白质/病毒载体蛋白质本身可以引起CD4+细胞毒性细胞的产生。除了引入的表位序列之外，当所述修饰还包括引入的氧化还原酶序列时，这也会发生。在其野生型序列中含有氧化还原酶序列的某些蛋白质中，可以将该蛋白质工程化以在天然存在的氧化还原酶序列附近(相隔至多7个或至多4个氨基酸)包含表位序列。

如果经修饰的治疗性蛋白质/病毒载体蛋白质不需要这种活性，所述修饰可以限于表位序列的引入。如果经修饰的治疗性蛋白质/病毒载体蛋白质在其野生型序列中含有氧化还原酶序列，所添加的表位序列被引入到该经修饰的蛋白质中，使得所述添加的表位和现有的氧化还原酶基序相隔至少4或至少7个氨基酸。

取决于添加的表位序列对蛋白质功能的影响，表位可以发生在抗原的融合蛋白N末端或抗原的C末端。在特定的实施方式中，向抗原添加两个或多个不同的表位。

如果合适的话，可以在表位序列和原生抗原的序列之间插入接头序列。

还设想生成经修饰版本的抗原，其中表位序列在序列内部在对蛋白质功能不重要的区域内融合。在替代性实施方式中，通过在抗原序列内突变和/或添加一个或多个氨基来生成外源表位序列。

具有引入的表位序列(添加为融合蛋白或在内部)的蛋白质的长度主要由抗原限定，并且不是限制性特征。在肽激素的情况下，抗原可以非常小。在较短的蛋白质中，蛋白质内突变的影响可能更大，并且对于长度小于100或小于250个氨基酸的蛋白质，鼓励考虑融合蛋白。

本发明的治疗剂包括用于补偿不存在的生理药剂或用于改变、修改、停止或减缓疾病进程的任何肽或蛋白质剂。

此类治疗剂包括：

1.用于凝血缺陷(包括因子VIII、因子IX和因子X缺陷)的替代剂，施用因子VII以校正缺陷，或者在外伤、手术、心力衰竭中作为治疗剂，或在受血友病影响并且产生阻止缺失因子(因子VIII或因子IX)施用的抑制性抗体的患者治疗中用作治疗剂；

2.纤维蛋白溶解剂，包括在中风和心肌梗塞中施用的葡萄球菌激酶或组织纤溶酶原激活剂(tPA)；

3.激素，诸如生长激素或胰岛素，用来治疗矮小和胰岛素依赖性糖尿病；

4.细胞因子和生长因子，诸如干扰素-α、干扰素-γ、GM-CSF和G-CSF；细胞因子受体，诸如在类风湿关节炎的治疗中的IL-6受体和IL-1b受体；

5.用于调节免疫应答的抗体，包括过敏性疾病中的抗-IgE抗体，移植排斥反应和各种自身免疫性疾病中的抗-CD3和抗-CD4抗体，非霍奇金淋巴瘤中的抗-CD20抗体，抗细胞因子或细胞因子受体(例如抗-IL6R)。

除了表位结合位点(CDRs)外，人源化治疗性抗体是人类的，通常来源于小鼠序列。本发明旨在消除对抗体的非人部分产生响应的能力。

6.肾功能不全中的促红细胞生成素。

7.用酶的替代疗法，所述酶包括α-半乳糖苷酶A(法布里病)，β-葡萄糖脑苷脂酶(1型戈谢病)和α-葡萄糖苷酶(庞皮病)。

除了以上章节关于具有添加的MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位的蛋白质，本发明的另一方面涉及如上所述的蛋白质与另一肽的组合，该另一肽包含4氨基酸氧化还原酶序列并且包含已经添加到所述治疗性蛋白质或病毒载体中的相同表位序列。

在这一肽中，氧化还原酶序列具有基序[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:7]或C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:8]。该基序包括替代物C-X(2)-C[SEQ ID NO:2]、S-X(2)-C[SEQ ID NO:5]、T-X(2)-C[SEQ ID NO:6]、C-X(2)-S[SEQ ID NO:3]和C-X(2)-T[SEQ ID NO:4]。基序的一个特殊选择是C-X(2)-C[SEQ ID NO:2]。

在还原化合物的基序中，C代表半胱氨酸或另一种具有巯基的氨基酸，例如巯基缬氨酸、高半胱氨酸或具有巯基官能团的其他天然或非天然氨基酸。为了具有还原活性，存在于基序中的半胱氨酸不应发生为胱氨酸二硫桥的一部分。氧化还原中的氨基酸X可以是任何天然氨基酸，或者可以是非天然氨基酸。X可以是具有小侧链的氨基酸，诸如Gly、Ala、Ser或Thr。在特定的版本中，氧化还原基序中至少有一个X是His、Pro或Tyr。在特定的版本中，X不是Cys，在另一特定版本中，X不是W、F或Y。

在特定的条件下，提供了包含一个表位序列和一个基序序列的肽。基序可以在肽中出现一次或多次(2、3、4或甚至更多次)，例如作为可以通过一个或多个氨基酸彼此间隔开的基序的重复，作为彼此相邻的重复，或作为彼此重叠的重复。

表位序列和4个氨基酸的氧化还原酶序列不重叠并且通过7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的接头序列间隔开或者彼此紧邻(因此不存在接头序列或0个氨基酸的接头)。典型0至2个氨基酸的接头，0至4个氨基酸的接头，或0-7个氨基酸的接头。

当肽中的表位序列是抗原的片段时，接头中的氨基酸通常是位于抗原中的表位侧翼的氨基酸。或者，接头中的氨基酸是Gly和/或Ser。

氧化还原基序也可以在表位序列的N末端或C末端。

具有氧化还原基序序列和表位序列的肽，对于具有MHC II类T细胞表位的肽，其可以短至12或13个氨基酸，或者对于具有CD1d-限制性NKT细胞肽表位的肽，其可以短至11个氨基酸，取决于表位和氧化还原酶基序之间的氨基酸数目以及“表位+接头+氧化还原基序”序列或“氧化还原基序+接头+表位”序列N和/或C末端的侧翼氨基酸的数目，其可长达20、30、40、50、75或100个氨基酸。

因此，取决于选择的实施方式，表位是MHC II类表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位。CD1d-限制性NKT细胞肽表位可以被用来通过NKT细胞生成溶细胞CD4+T细胞。

CD1d-限制性NKT细胞肽表位具有这样的优点，即它们将在所有个体中结合CD1d结合，因为这种蛋白质没有多态性。

使用具有添加的MHC II类T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位与包含这种表位和氧化还原基序的肽的组合的蛋白质，允许在抗原本身内解偶联用于从表位序列引发溶细胞CD4+细胞群的表位序列。

对融合至表位的蛋白质的融合蛋白尤其如此，因为这不需要修饰蛋白质本身的序列。修饰治疗性蛋白质以包含新的表位序列是必须针对每种蛋白质优化的任务。

将表位序列与抗原序列解偶联允许设计定制的表位序列。该序列可以被优化以提高溶解度和稳定性，降低降解等。除了在序列中选择某些氨基酸外，还可以设想其他改变，如在肽合成期间掺入非天然氨基酸或D-氨基酸，或翻译后修饰如瓜氨酸化、乙酰化和硫酸化。

还可以对表位序列进行优化，以确保MHC II类T细胞表位会结合不同的HLA蛋白，使得可以被大部分受试者中的CD4+T细胞识别。这样的表位在本领域中被称为混杂表位。

此种混杂表位的例子可以在诸如麻疹或丙型肝炎、分枝杆菌、肿瘤相关病毒抗原或甚至在自体蛋白质中的病毒剂中发现。确定表位序列与HLA分子或等位基因的结合并鉴定蛋白质序列中的混杂表位的算法是已知的。候选混杂表位可以在不同的MHC分子上进行测试。

作为替代或除了使用混杂MHC II类T细胞表位之外，可以混合两种或更多种肽用于疫苗接种，每种都含有硫代还原酶基序和MHC II类T细胞表位，以涵盖尽可能多的MHC II类决定簇。在这种情况下，抗原也将携带用于肽混合物中的两个或更多个表位序列(通常以融合蛋白的形式)。

在特定的实施方式中，使用MHC II类T细胞表位和CD1d-限制性NKT细胞肽表位的组合。

在特定的实施方式中，混杂表位来源于通过不变链的蛋白水解切割获得CLIP(II类相关的不变链肽(KM₁R₂MATP₆LLMQAL)[SEQ ID NO:9]序列。CLIP保护MHC II类分子的疏水性肽-结合沟槽，直到它被与更高亲和力的肽竞争所取代。CLIP保护DR、DP或DQ家族的所有新生MHCII类分子，并且因此是混杂表位的最具说明性的例子。然而，CLIP对II类分子的亲和力较弱，因此在抗原呈递细胞表面不存在具有CLIP的MHCII类分子。DM蛋白质催化用替代肽代替CLIP进行表面呈递(Pos et al.(2012)Cell 151,1557-1568)。

本发明的一个方面是，用疏水性残基(诸如F、W、H或Y或V、I、L或M)取代位于MHC II类分子P1袋中的第一个CLIP氨基酸残基，足以防止替代肽的完全替代并且允许在抗原呈递细胞表面呈递经修饰的CLIP。这导致CD4+T细胞的活化。在替代版本中，CLIP的MHC结合片段的第二个氨基酸残基也被疏水性残基取代。

另外，位于6位的脯氨酸残基可以从P突变为R，以进一步增加其结合亲和力。

因此，本发明提供了包含由通用序列基序[VILMFWYH]₁[RVILMFWYH]₂MAT[PR]₆LLM[SEQ IDNO:10]表示的Clip肽的MHC II类结合区的修饰版本的肽。

在这种经修饰的Clip肽中，P1彼此独立地可以为[FWHY][FWH]或[FW]，P2可以为[RFWHY]、RFW或R，P6可以为P。

在具体的实施方式中，P1和P6用上述其中一种可能性进行修饰，并且P2精氨酸未被修饰。

肽可以完全人工地使用与大多数MHC II类分子密切配合的序列制成。PADRE肽提供了其中的一个例子(aKXVAAWTLKAAaZC(a＝D-丙氨基酸，X＝l-环己基丙氨酸，Z＝氨基己酸)[SEQ IDNO:11](Alexander et al.(2000)J.Immunol.64,1625-1633)。考虑到氨基酸残基的性质和MHC II类分子的性质，可以由计算机算法制备这种人工混杂肽以获得最佳配合。ProPred提供了这种算法的一个例子(Sigh and Raghava(2001),Bioinformatics 17,1236-1237)。以下给出了算法的其它例子。

在破伤风类毒素肽(830-843)或流感血凝素HA(307-319)中也遇到了混杂表位。

Mustafa et al.(2014)PLoS One 9,e103679；Grzybowska-kowalczyk(2015)Thorax 69,335–345；Grabowska et al.(2014)Int.J.Cancer 224,1–13；Fraser et al.(2014).Vaccine 32,2896–2903中描述了通过计算机模拟和基于细胞的测定法检测混杂表位的方法。

任选地可以进一步测试非天然(或经修饰的)T细胞表位对MHC II类分子的结合亲和力。这可以以不同的方式执行。例如，可溶性HLA II类分子是通过裂解对于给定II类分子为纯合的细胞获得的。通过亲和层析纯化来纯化后者。将可溶性II类分子与生物素-标记的参照肽一起温育，所述参照肽根据其对II类分子的强结合亲和力来产生。然后在不同浓度下温育要评估II类结合的肽，并且通过添加中性抗生物素蛋白来计算从其II类结合中置换参考肽的能力。例如，在Texier et al.(2000)J.Immunol.164,3177-3184可以找到方法。

附加地和/或替代地，可以使用一种或多种计算机模拟算法来鉴定蛋白质内的T细胞表位序列。合适的算法包括但不限于以下网站上的算法：

-http://cvc.dfci.harvard.edu/balbc/

-http://www.syfpeithi.de/

-http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/SVMHC

-http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html；

-http://www.ddg-pharmfac.net/mhcpred/MHCPred/

-http://www.immunax.dfci.harvard.edu(PEPVAC)

-http://www.epivax.com/epimatrix/

更特别地，这样的算法允许预测在抗原蛋白质内的一个或多个会配合MHC II分子的沟槽的九肽序列。

WO2015/033140中描述了确定MHC II类肽的混杂性质的例子，使用Stumiolo etal.(1999)Nat.Biotechnol.17,555-561)开发的方法，可在www.iedb.org上获得。本文中考虑用于分析的HLA II类等位基因是HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01、DRA*01:01/HLA-DRB1*03:01、DRA*01:01/HLA-DRB1*04:01、DRA*01:01/HLA-DRB1*07:01、DRA*01:01/HLA-DRB1*08:02、DRA*01:01/HLA-DRB1*11:01、DRA*01:01/HLA-DRB1*13:01和DRA*01:01/HLA-DRBl*15:01，它们分别被视为HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR8、HLA-DR11、HLA-DR13和HLA-DR15抗原组的代表性成员。

本发明的进一步方面是，天然的或人工的II类限制性表位可以被用作疫苗引起溶细胞性CD4+T细胞。随后施用于添加了不具有硫醇还原酶基序的同一表位的治疗性蛋白质导致通过疫苗接种获得的溶细胞性CD4+T细胞的活化。这导致了对治疗剂的免疫应答的预防。

本发明的方法涉及组合疗法，其中将具有还原性基序和T细胞表位或CD1d-限制性NKT细胞肽表位的肽用来分别生成细胞毒性CD4+T或细胞毒性CD4+NKT细胞的群体，它们杀死呈递含有在具有氧化还原基序的肽中使用的表位序列的抗原的抗原呈递细胞。以这种方式，对受试者进行疫苗接种，并且防止了针对随后施用的具有表位的抗原性蛋白质的免疫应答。

因此，本发明的一个方面是，混杂II类限制性T细胞表位和CD1d结合肽表位在施用治疗剂之前用于疫苗接种的用途。含有与用于疫苗接种相同的表位但不具有硫氧还蛋白基序的治疗剂是本发明这一方面的一部分。

肽和治疗剂被用来治疗需要治疗剂的受试者。因此，在本发明的一个应用中，用包含混杂表位和硫醇还原酶基序的肽对受试者进行免疫。典型地，这种免疫通过皮下施用吸附或溶解在佐剂中的肽进行。然后使用他/她需要的治疗剂对经免疫的受试者进行治疗，所述治疗剂含有与用于疫苗接种的肽中包含混杂表位的相同混杂表位但不具有硫醇还原酶基序。由于疫苗接种程序已经引出了对混杂表位特异的溶细胞性CD4+T细胞，所以针对治疗剂的免疫应答被疫苗接种程序阻止。

含有硫氧还蛋白基序的肽的施用可以通过直接免疫来完成。或者，施用可以在于从需要治疗剂的受试者获得的细胞，将细胞在体外暴露于所述肽中以引发和扩大溶细胞性CD4+T细胞并且再将其施用到受试者。

认为本发明的T细胞表位通过在硫醇还原酶基序和CD4分子之间产生二硫桥增加突触形成的强度来发挥其性质。这种作用机制通过实验数据得以证实(参见下面的例子)，但是并不旨在将本发明限制为这种特定的作用机制。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，根据必须施用的治疗剂类型和频率以及需要治疗剂的受试者的临床状况，可以描绘这一事件序列的多种变化。

在这些变化之一中，可能更合适的是，首先在体外细胞培养物中将他/她自身的细胞暴露于含有硫醇还原酶基序的表位，之后通过输注此种细胞来治疗该受试者。这可能是免疫抑制治疗受试者的优选方法，这将预防对与佐剂一起施用的肽发生免疫应答。可以通过任何途径设想肽施用，优选的途径是皮下。

肽可以通过化学合成来制备，其允许并入非天然氨基酸和/或化学修饰的氨基酸。在病理状况下会遇到化学修饰的氨基酸的例子，例如类风湿性关节炎中表位的糖基化和瓜氨酸化，脂泻病中的脱酰胺和胰岛素依赖性糖尿病中表位内二硫桥的形成。但是，有许多修饰氨基酸侧链的可能性，并且上述实施例并不意味着是详尽的。

可以使用重组DNA技术在细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中产生多肽。通过化学合成可以制备较短长度的肽，其中通过将不同的氨基酸彼此偶联来制备肽。化学合成特别适用于纳入例如D-氨基酸、具有非天然存在的侧链的氨基酸或具有修饰侧链的天然氨基酸，例如甲基化半胱氨酸。

化学肽合成方法已有详细描述，并且肽可以从Applied Biosystems等公司获得。肽合成可以以固相肽合成(SPPS)或与溶液相肽合成相反的方式进行。最著名的SPPS方法是t-Boc和Fmoc固相化学。在肽合成过程中使用了多种保护基团。例如，羟基和羧基官能团被叔丁基保护，赖氨酸和色氨酸被t-Boc基团保护，并且天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和组氨酸被三苯甲基保护，以及精氨酸被pbf基团保护。在某些情形下，在合成之后可以将此种保护基团留在肽上。

或者，可以通过使用核酸分子合成肽，所述核酸分子在包含编码核苷酸序列的适当表达载体中编码本发明的肽。使用自动化的DNA合成仪和遗传密码的众所周知的密码子-氨基酸关系可以容易地制备此种DNA分子。使用寡核苷酸探针和常规杂交方法，此种DNA分子也可以以基因组DNA或cDNA的形式获得。此种DNA分子可以被并入到包含质粒的表达载体中，它们适用于在合适的宿主中表达DNA和产生多肽，所述宿主如细菌，如大肠杆菌、酵母细胞、动物细胞或植物细胞。

在本发明的实施方式中，提供了表达载体，其中MHC II类表位或CD1d-限制性NKT细胞肽被克隆到载体中，通常在市售表达载体的多克隆的上游或下游。编码治疗性蛋白质的DNA的框内插入允许表位标记的蛋白质的表达，与例如His标记的蛋白或HA标记的蛋白相当。可以使用标准分子生物学技术产生此种经修饰的表达载体。

表位标签的附着产生用于替代疗法选择的表位与治疗性蛋白质的融合蛋白。单一载体可用于任何治疗性蛋白质。

为了向患者施用蛋白质，可以用细菌、酵母、植物或哺乳动物载体表达蛋白质。表达系统类型的选择取决于不同的蛋白质，其对于大多数治疗性蛋白质是已知的。相应地注射经分离的蛋白质。

或者，将编码融合到表位的治疗性蛋白质的DNA克隆到适用于人类基因疗法的哺乳动物表达载体中。

检查目标肽的物理化学性质(例如溶解性、稳定性)以确定该肽是否适用于本发明所定义的应用。通常这是通过调整肽的序列来优化的。任选地，在合成后，可以使用本领域已知的技术来修饰肽(化学修饰，例如添加/去除官能团)。任选地，可以通过翻译后改变来修饰肽。这样的例子是单个多个氨基酸残基的乙酰化、硫酸化、瓜氨酸化或磷酸化。

现在通过以下实施例来说明本发明，但不是将本发明限制于这些实施例。

实施例1：治疗性抗体

许多病毒含有通用的II类限制性T细胞表位，一个例子是丙型肝炎病毒。肽序列1247至1261(QGYK VLVLNPSVAA T)[SEQ ID NO:12]和1535至1550(TTVRLRA YMNTPGLPV)[SEQ ID NO:13]同时覆盖超过15个DRB单体型中的12个，占超过一般群体的85％。

因此，建立了一种疫苗接种策略，其使用涵盖II类限制性表位的最小结合序列和一种硫醇还原酶基序的两种肽的混合物。

肽1247-1261在位置1251-1260处含有MHC II类结合序列(SEQ ID NO:12中带下划线部分)。

肽1535-1550在位置1542-1550处含有最小限度的MHC II类结合序列(SEQ ID NO:13中带下划线部分)。

制备了用于疫苗接种的两种肽，其中由VR二肽接头间隔开氧化还原基序和表位序列：

CPYC-VR-VLVLNPSVAA[SEQ ID NO:14]，和

CPYC-VR-YMNTPGLPV[SEQ ID NO:15]。

吸附在氢氧化铝上的这两种肽的混合物的施用引发具有溶细胞特性的特定CD4+T细胞。

针对CD20的抗体是非霍奇金淋巴瘤公认的治疗方法。然而，在相当大百分比的患者中，这种施用引发特异性抗体，其排除进一步给药或使功效降至最低。

本发明提供了一种预防这种不需要的免疫的疫苗接种策略。

上述来自丙型肝炎病毒的2个序列，即SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13，是根据抗-CD20抗体产生的并且位于重链的氨基末端[SEQ ID NO:16]。当施用这种抗-CD20抗体时，先前通过疫苗接种引发的溶细胞性CD4+T细胞被活化并且通过凋亡消除来自治疗性抗体的决定簇的呈递，从而预防针对抗-CD20的免疫。

实施例2：促红细胞生成素

促红细胞生成素(EPO)是一个166个氨基酸残基长度的多肽，是低氧诱导红血球生成的主要介质，在成年中由肾脏产生(±80％)。缺氧导致EPO产量的增加，然后EPO在血浆中循环并结合在红细胞祖细胞上表达的受体，导致这些前体的终末分化和红血球增加。

尽管人重组EPO是弱免疫原，但其在例如肾功能不全中的重复使用、糖基化或在制备程序中的细微差异可导致产生特异性中和抗体。由于EPO是由于缺氧引起的红血球生成的唯一介质，所以中和免疫应答的存在被认为是戏剧性的事件。

一种防止发生这种不必要的免疫应答的方法，是使用与位于表位侧翼区内的硫醇还原酶基序连接的混杂II类限制性T细胞表位对需要EPO的个体进行接种。这引发具有细胞溶解性质的表位特异性CD4+T细胞。与相同混杂表位偶联的EPO分子的施用激活溶细胞CD4+T细胞，其通过凋亡消除呈递EPO的细胞抗原呈递细胞，从而消除对EPO产生免疫应答的能力。

不变链包含作为混杂T细胞表位的CLIP序列，其以相对较低的亲和力结合新生MHCII类分子。通过与显示更高亲和力的肽竞争，CLIP从其II类结合中释放。在表位的这一交换过程中，DM分子保护处于CLIP和新肽之间的瞬时状态的II类分子的第一锚定袋。

突变版本的CLIP(其中对II类结合显示出弱亲和力的前2个氨基酸被两个疏水残基替换)将保持其混杂性，同时增加了对II类分子的亲和力。此外，位于6位的残基可以从P突变为R以进一步增加其结合亲和力。因此，分别使序列KM₁R₂ MATP₆ LLMQAL[SEQ ID NO:9]中位于位置1和2的第二个或第三个氨基酸(分别为M和R)以及位置6的P突变，得到KF₁F₂ MATR₆ LLMQAL[SEQ ID NO:17]。

通过在N末端添加硫醇还原酶基序和Val Arg接头序列产生肽，得到全序列：CPYC-VR-FFMATRLLMQAL[SEQ ID NO:18]。

使用吸附在氢氧化铝上并通过SC注射施用的肽的标准程序，通过施用肽[SEQIDNO:18]对需要EPO注射的患者进行疫苗接种。已知该程序引发表位特异性溶细胞性CD4+T细胞，如专利申请WO200817517中所描述的。

将序列KFFMATRLLMQAL[SEQ ID NO:17]添加在EPO的末端与EPO序列间隔两个甘氨酸，总共有181个氨基酸。这种修饰的EPO[SEQ ID NO:19]在施用后保留了其全部活性并且激活通过疫苗接种获得的溶细胞性CD4+T细胞，由此排除了任何有害的免疫应答。

CLIP-修饰的表位的混杂性质使得可以将相同的疫苗和相同的EPO分子用于需要这种疗法的任何患者。

实施例3：α-半乳糖苷酶

法布里病是由于不存在α-半乳糖苷酶(一种溶酶体水解酶)而在各种组织中积聚糖鞘脂的溶酶体贮积病。其是一种X连锁基因缺陷疾病，每100,000个个体中有±1受到影响。目前法布里病的治疗包括定期输注α-半乳糖苷酶。然而，超过25％进行此种治疗的患者对酶产生免疫应答，阻碍了此种酶的进一步使用并且使患者陷入各种并发症(包括中风)的风险中。

可以修饰重组α-半乳糖苷酶以包含添加在分子的氨基末端的II类限制性混杂T细胞表位的序列。将此修饰的α-半乳糖苷酶分子施用到个体(其先前接种有含硫醇还原酶基序的这种混杂表位，由此引发肽特异性溶细胞性CD4+T细胞的产生)不会引发对α-半乳糖苷酶的免疫应答。

通过化学合成生产对应于氨基酸1277至1290的序列LFLKSDGRVKYTLN[SEQ ID NO:20](其中P1被L1296(带下划线)占据)的载脂蛋白B-100的混杂表位，其与硫醇还原酶基序一起产生序列CPYC-LF-LKSDGRVKYTLN[SEQ ID NO:21]。

此种序列在位置P6含有1个精氨酸(R)。该R残基被瓜氨酸取代，瓜氨酸是通过肽基精氨酸脱亚胺酶的作用获得的氨基酸。这种修饰导致正电荷的丧失，导致与P6处的MHC II类锚定残基的更高相互作用。

因此，用于疫苗接种的肽的最终序列是CPYC-LF-LKSDG-瓜氨酸-VKYTLN[SEQ IDNO:22]。

使用吸附在氢氧化铝上并通过SC注射施用的肽的标准程序，用SEQ ID NO:21的肽对受法布里病影响的患者进行免疫。然后产生表位特异性溶细胞性CD4+T细胞。

然后，向此种接种疫苗的患者施用经修饰以含有混杂表位[SEQ IDNO:23]的LFLKSDGRVKYTLN序列[SEQ ID NO:20]的重组α-半乳糖苷酶。

实施例4：细胞疗法

处在免疫抑制治疗下的患者可以从施用治疗性抗体中受益，但是在这种情况下使用包含II类限制性表位的肽的主动接种可能是困难的。

然而，可以从这些患者的外周血中收集细胞，制备用于体外转化成溶细胞性细胞的幼稚CD4+T细胞，然后可以以严格的自体方式将溶细胞性细胞重新施用于患者。通过这样做，患者立即受到保护，使其不对所考虑的治疗剂产生不需要的免疫应答。这种情况的一个代表性例子是多发性硬化症，处于免疫抑制治疗状态的患者可以受益于施用的抗体，如抗-CD52特异性抗体(Campath-1H，阿仑单抗)。

从此类患者中采集50ml外周血样本并且通过磁珠吸附制备幼稚CD4+T细胞。使用本领域已知的方法从相同血液采样中获得的单核细胞衍生树突细胞。

选择分枝杆菌细胞进入蛋白的混杂II类限制性表位Mce2，DPIELNATLSAVA[SEQ IDNO:24](氨基酸163至175)(Panigada(2002)Infect.Immun.70,79-85)。

在这种肽的氨基末端添加硫醇还原酶基序以生成序列CPYC-DP-IELNATLSAVA[SEQID NO:25]。

将树突状细胞装载SEQ ID NO:25的肽，并且将幼稚CD4+T细胞用这些树突细胞刺激4次，持续7天以产生溶细胞性CD4+T细胞。

通过IV途径向细胞供体施用5x10⁶个溶细胞性细胞。

通过基因工程获得抗-CD52特异性抗体，其含有添加到分子氨基末端的序列DPIELNATLSAVA[SEQ ID NO:24]，具有2个甘氨酸残基作为接头[SEQ ID NO:26]。

将这种经修饰的抗-CD52抗体施用到已接受了用SEQ ID NO:25的肽体外活化的自体CD4+T细胞的个体，导致溶细胞性CD4+T活化至肽DPIELNATLSAVA[SEQ ID NO:24]，由此预防引起针对治疗性抗体的免疫应答的任何可能性。

实施例5：用于表达与经修饰的CLIP混杂表位融合的蛋白质的载体

将具有巨细胞病毒启动子的哺乳动物表达载体pCMV工程化以允许在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞中表达用于替代疗法中使用的任何蛋白质，该蛋白质与实施例2中描述的混杂CLIP-衍生的表位融合[SEQ ID NO:17]。首先，通过施用包含硫醇还原酶基序和实施例中所述的经修饰的CLIP-衍生的表位的肽[SEQ ID NO:18]，对需要注射替代疗法用蛋白质的患者进行疫苗接种。已知这种免疫可以引发表位特异性溶细胞性CD4+T细胞，如专利申请WO200817517所述。

侧翼为CLIP序列的融合蛋白形式的目标治疗性蛋白质在施用后保留了其全部活性并且激活通过疫苗接种获得的溶细胞性CD4+T细胞，由此排除任何有害的免疫应答。CLIP-修饰的表位的混杂性质使得能够将相同的疫苗和相同的EPO分子用于需要此种疗法的任何患者，而与其HLA概况无关。

为了获得这种表达载体，工程化衔接子，其由CLIP-衍生的表位组成，前面是由2个甘氨酸构成的接头并且被限制酶特异性序列Xho-I/Nhe-I包围，如下所示：

将所述衔接子克隆到市售的表达载体pCMV中，创造具有多个用于插入促红细胞生成素(EPO)cDNA的多克隆位点的经修饰的表达pCMV-CLIP。为此，使用由EPO特异性序列和之前为KOZAK序列的Age-I特异性序列组成的正向引物以及由EPO特异性序列和SaI-I特异性序列制成的反向引物，通过PCR扩增用于编码EPO的序列。消化Age-I/Sal-I后，将EPO构建体插入用Age-I和Xho-I预消化的pCMV-CLIP中。在DH5-α大肠杆菌中转化并扩增质粒。纯化和线性化后，将用于EPO-CLIP融合蛋白的表达载体转染到CHO细胞中。然后在氨苄青霉素上选择转染的CHO细胞，并且选出选择较高水平的EPO-CLIP的克隆用于量产具有SEQ ID NO:40(带下划线的经修饰的CLIP序列)的重组融合蛋白。

MGVHECPAWL WLLLSLLSLP LGLPVLGAPP RLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPD TKVNFYAWKR MEVGQQAVEV WQGLALLSEA VLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLR SLTTLLRALR AQKEAISPPD AASAAPLRTI TADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRT GDRVEGGKFF MATRLLMQAL S[SEQ ID NO:40]

实施例6：本申请中公开的序列：

序列表

<110> 易姆赛斯股份公司（ImCyse S.A.）

让-玛丽·圣-雷米（Saint-Remy, Jean-Marie）

文森特·卡利尔（Carlier, Vincent）

卢克·范德·埃尔斯特（Vander Elst, Luc）

<120> 用于消除对治疗剂的免疫应答的改进的方法和化合物

<130> IMC3209PCT

<150> EP15186845.2

<151> 2015-09-25

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> Cd1d结合肽基序

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> Xaa为Phe, Trp, Tyr, His或Thr

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> Xaa为Val, Ile, Leu或Met

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> VARIANT

<222> (7)..(7)

<223> Xaa为Phe, Trp, Tyr, His或Thr

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> C-X(2)-C氧化还原基序

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 2

Cys Xaa Xaa Cys

1

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> C-X(2)-S氧化还原基序

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 3

Cys Xaa Xaa Ser

1

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> C-X(2)-T氧化还原基序

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 4

Cys Xaa Xaa Thr

1

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> S-X(2)-C氧化还原基序

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 5

Ser Xaa Xaa Cys

1

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> T-X(2)-C氧化还原基序

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 6

Thr Xaa Xaa Cys

1

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> [CST]-X(2)-C氧化还原基序

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> Xaa为Cys, Ser或Thr

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<400> 7

Xaa Xaa Xaa Cys

1

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> C-X(2)-[CST]氧化还原基序

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> Xaa为Cys, Ser或Thr

<400> 8

Cys Xaa Xaa Xaa

1

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> CLIP肽

<400> 9

Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu

1 5 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> Xaa为Val, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr或His

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(2)

<223> Xaa为Arg, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr或His

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> Xaa为Pro或Arg

<400> 10

Xaa Xaa Met Ala Thr Xaa Leu Leu Met

1 5

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> Padre肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> D_丙氨酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> I-环己基丙氨酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> D_丙氨酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> α氨基己酸

<400> 11

Ala Lys Ala Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Lys Cys

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 丙型肝炎片段1247-1261

<400> 12

Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 丙型肝炎片段1535-1550

<400> 13

Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val

1 5 10 15

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> CxxC氧化还原基序 + 丙型肝炎表位

<400> 14

Cys Pro Tyr Cys Val Arg Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> CxxC氧化还原基序 + 丙型肝炎表位

<400> 15

Cys Pro Tyr Cys Val Arg Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val

1 5 10 15

<210> 16

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 丙型肝炎片段和抗CD20抗体的融合蛋白

<400> 16

Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Thr

1 5 10 15

Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Gln

20 25 30

Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

35 40 45

Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn

50 55 60

Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly

65 70 75 80

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

85 90 95

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

100 105 110

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

115 120 125

Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala

130 135 140

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

145 150 155 160

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

165 170 175

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

180 185 190

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

195 200 205

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

210 215 220

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

225 230 235 240

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

245 250 255

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

260 265 270

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

275 280 285

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

290 295 300

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

305 310 315 320

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

325 330 335

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

340 345 350

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

355 360 365

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

370 375 380

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

385 390 395 400

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

405 410 415

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

420 425 430

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

435 440 445

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

450 455 460

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470 475 480

Gly Lys

<210> 17

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<400> 17

Lys Phe Phe Met Ala Thr Arg Leu Leu Met Gln Ala Leu

1 5 10

<210> 18

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> CxxC氧化还原基序 + 经修饰的clip肽

<400> 18

Cys Pro Tyr Cys Val Arg Phe Phe Met Ala Thr Arg Leu Leu Met Gln

1 5 10 15

Ala Leu

<210> 19

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> EPO + 经修饰的clip肽

<400> 19

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

20 25 30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Gly Lys Phe Phe Met Ala Thr Arg Leu

165 170 175

Leu Met Gln Ala Leu

180

<210> 20

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 载脂蛋白B-100肽序列

<400> 20

Leu Phe Leu Lys Ser Asp Gly Arg Val Lys Tyr Thr Leu Asn

1 5 10

<210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> CxxC +氧化还原基序载脂蛋白B-100表位

<400> 21

Cys Pro Tyr Cys Leu Phe Leu Lys Ser Asp Gly Arg Val Lys Tyr Thr

1 5 10 15

Leu Asn

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 瓜氨酸版本的SEQ IDN O 21

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> 瓜氨酸

<400> 22

Cys Pro Tyr Cys Leu Phe Leu Lys Ser Asp Gly Arg Val Lys Tyr Thr

1 5 10 15

Leu Asn

<210> 23

<211> 411

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 载脂蛋白B-100表位+α半乳糖苷酶

<400> 23

Leu Phe Leu Lys Ser Asp Gly Arg Val Lys Tyr Thr Leu Asn Asp Asn

1 5 10 15

Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu Arg Phe

20 25 30

Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile Ser Glu

35 40 45

Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly Trp Lys

50 55 60

Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met Ala Pro

65 70 75 80

Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg Phe Pro

85 90 95

His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly Leu Lys

100 105 110

Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly Phe Pro

115 120 125

Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala Asp Trp

130 135 140

Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser Leu Glu

145 150 155 160

Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn Arg Thr

165 170 175

Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met Trp Pro

180 185 190

Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn His Trp

195 200 205

Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys Ser Ile

210 215 220

Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val Ala Gly

225 230 235 240

Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn Phe Gly

245 250 255

Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala Ile Met

260 265 270

Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser Pro Gln

275 280 285

Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn Gln Asp

290 295 300

Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn Phe Glu

305 310 315 320

Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala Met Ile

325 330 335

Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala Val Ala

340 345 350

Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile Thr Gln

355 360 365

Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr Ser Arg

370 375 380

Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln Leu Glu

385 390 395 400

Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu

405 410

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 分枝杆菌细胞进入蛋白

<400> 24

Asp Pro Ile Glu Leu Asn Ala Thr Leu Ser Ala Val Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 氧化还原基序 + 分枝杆菌细胞进入蛋白质表位

<400> 25

Cys Pro Tyr Cys Asp Pro Ile Glu Leu Asn Ala Thr Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Ala

<210> 26

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 分枝杆菌细胞进入蛋白+抗CD52特异性抗体

<400> 26

Asp Pro Ile Glu Leu Asn Ala Thr Leu Ser Ala Val Ala Gly Gly Gln

1 5 10 15

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr

20 25 30

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe Tyr

35 40 45

Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly

50 55 60

Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro Ser

65 70 75 80

Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

85 90 95

Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> CD1d结合肽

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是Phe, Trp, Tyr或His

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是Val, Ile, Leu或Met

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> VARIANT

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是Phe, Trp, Tyr或His

<400> 27

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> CD1d 结合肽

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是Phe, Trp或Tyr

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是Val, Ile, Leu或Met

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何氨基酸

<220>

<221> VARIANT

<222> (7)..(7)

<223> Xaa是Phe, Trp或Tyr

<400> 28

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(2)

<223> Xaa是Val, Ile, Leu, Met, Tyr, His, Phe或Trp

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> Xaa 为 Arg 或Pro

<400> 29

Xaa Xaa Met Ala Thr Xaa Leu Leu Met

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<400> 30

Phe Phe Met Ala Thr Arg Leu Leu Met

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<400> 31

Trp Trp Met Ala Thr Arg Leu Leu Met

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<400> 32

Trp Phe Met Ala Thr Arg Leu Leu Met

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<400> 33

Phe Trp Met Ala Thr Arg Leu Leu Met

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<400> 34

Phe Phe Met Ala Thr Pro Leu Leu Met

1 5

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<400> 35

Trp Trp Met Ala Thr Pro Leu Leu Met

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<400> 36

Trp Phe Met Ala Thr Pro Leu Leu Met

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 经修饰的clip肽

<400> 37

Phe Trp Met Ala Thr Pro Leu Leu Met

1 5

<210> 38

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> misc_feature

<223> 用于克隆具有混杂表位的融合蛋白的DNA载体片段

<400> 38

gcacggctcg agggcggaaa gtttttcatg gccaccagac tgctgatgca ggcgctgagc 60

tagctagttc 70

<210> 39

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 混杂MHC II类T细胞表位

<400> 39

Gly Gly Lys Phe Phe Met Ala Thr Arg Leu Leu Met Gln Ala Leu Ser

1 5 10 15

<210> 40

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221> MUTAGEN

<223> 红细胞生成素和混杂MHC II类表位的融合蛋白

<400> 40

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65 70 75 80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

100 105 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

115 120 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu

130 135 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile

145 150 155 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

165 170 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

180 185 190

Arg Val Glu Gly Gly Lys Phe Phe Met Ala Thr Arg Leu Leu Met Gln

195 200 205

Ala Leu Ser

210

Claims

1.一种多肽的多组分试剂盒，包括：

a)第一肽，所述第一肽由下述组成：

a1)能够与不同MHC II类分子结合的混杂的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位，所述NKT细胞表位由与CD1d结合的[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT]基序组成，其中，[FWYHT]指示F、W、Y、H或T能占据所述基序中的对应残基，[VILM]指示V、I、L或M能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，和

a2)硫醇还原酶[CST]-X(2)-C或C-X(2)-[CST]基序，其中，[CST]指示C、S或T能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，所述基序紧邻所述表位或与所述表位隔开至多4个氨基酸的接头，

和

b)第二多肽，所述第二多肽包括：

b1)治疗性蛋白质，和

b2)融合至所述治疗性蛋白质的在a1)中定义的混杂的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位，其中，所述表位具有在b1)的治疗性蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列。

2.一种多组分试剂盒，包括：

a)肽，所述肽由下述组成：

和

b)包括编码多肽的多核苷酸序列的表达载体，所述多肽包括：

b1)治疗性蛋白质，和

3.一种多组分试剂盒，包括：

a)肽，所述肽由下述组成：

和

b)用于基因疗法或基因疫苗接种的病毒载体，所述病毒载体在骨架中包括编码蛋白质的多核苷酸序列，所述蛋白质包括：

b1)用于所述载体的功能和维持的病毒载体蛋白质，

b2)在a1)中定义的混杂的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位，其中，所述表位具有在b1)的蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多组分试剂盒，其中，b)的蛋白质是包括以下各项作为融合伴侣的融合蛋白：

b1)治疗性蛋白质或病毒载体蛋白质，和

b2)在a1)中定义的表位，其中，所述表位具有在b1)的蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的多组分试剂盒，其中，所述NKT细胞表位由与CD1d结合的[FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY]基序组成。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的多组分试剂盒，其中，所述MHCII类T细胞表位具有在SEQ ID NO:29中示出的序列X₁X₂MATX₆LLM，其中，X₁和X₂独立地选自V、I、L、M、Y、H、F和W，并且X₆为R或P。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的多组分试剂盒，

用作用于消除针对治疗性蛋白质或针对病毒载体蛋白质的免疫应答的药物。

8.一种多肽，包括：

b1)治疗性蛋白质，和

b2)融合至所述治疗性蛋白质、能够与不同MHC II类分子结合的混杂的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位，所述NKT细胞表位由与CD1d结合的[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT]基序组成，其中，[FWYHT]指示F、W、Y、H或T能占据所述基序中的对应残基，[VILM]指示V、I、L或M能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，并且其中，所述表位具有在b1)的治疗性蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列，

所述多肽在先前使用肽治疗的个体中用作用于消除针对治疗剂的免疫应答的药物，所述肽包括：

a1)所述MHC II类T细胞表位或所述NKT细胞表位，和

a2)硫醇还原酶[CST]-X(2)-C或C-X(2)-[CST]基序，其中，[CST]指示C、S或T能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，所述基序紧邻所述表位或与所述表位隔开至多4个氨基酸的接头。

9.一种编码多肽的表达载体，所述多肽包括：

b1)治疗性蛋白质，和

b2)能够与不同MHC II类分子结合的混杂的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位，所述NKT细胞表位由与CD1d结合的[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT]基序组成，其中，[FWYHT]指示F、W、Y、H或T能占据所述基序中的对应残基，[VILM]指示V、I、L或M能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，并且其中，所述表位具有在b1)的治疗性蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列，

所述表达载体在先前使用肽治疗的个体中用作药物，所述肽包括：

a1)所述MHC II类T细胞表位或所述NKT细胞表位，和

10.一种用于基因疗法或基因疫苗接种的病毒载体，所述病毒载体在骨架中包括编码蛋白质的多核苷酸序列，所述蛋白质包括：

b1)用于所述载体的功能和维持的病毒蛋白质，和

b2)能够与不同MHC II类分子结合的混杂的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位，所述NKT细胞表位由与CD1d结合的[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT]基序组成，其中，[FWYHT]指示F、W、Y、H或T能占据所述基序中的对应残基，[VILM]指示V、I、L或M能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，并且其中，所述表位具有在b1)的蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列，

所述病毒载体在先前使用肽治疗的个体中用作药物，所述肽包括：

a1)所述MHC II类T细胞表位或所述NKT细胞表位，和

11.一种肽，包括：

-a1)能够与不同MHC II类分子结合的混杂的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位，所述NKT细胞表位由与CD1d结合的[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT]基序组成，其中，[FWYHT]指示F、W、Y、H或T能占据所述基序中的对应残基，[VILM]指示V、I、L或M能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，和

-a2)硫醇还原酶[CST]-X(2)-C或C-X(2)-[CST]基序，其中，[CST]指示C、S或T能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，所述基序紧邻所述表位或与所述表位隔开至多4个氨基酸的接头，

所述肽用于利用所述MHC II类T细胞表位或CD1d结合肽表位来预防针对治疗性蛋白质或针对病毒载体蛋白质的免疫应答，

-其中，所述表位具有在所述治疗性蛋白质或所述病毒载体蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列。

12.一种用于制备多肽的多组分试剂盒的方法，包括：

a)通过向治疗性蛋白质的序列中引入能够与不同MHC II类分子结合的混杂的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位的序列来制备经修饰的治疗性蛋白质，所述NKT细胞表位由与CD1d结合的[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT]基序组成，其中，[FWYHT]指示F、W、Y、H或T能占据所述基序中的对应残基，[VILM]指示V、I、L或M能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，并且其中，所述表位具有在所述治疗性蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列，

b)制备肽，所述肽包括：

-a)的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位，和

-硫醇还原酶[CST]-X(2)-C或C-X(2)-[CST]基序，其中，[CST]指示C、S或T能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，所述基序紧邻所述表位或与所述表位隔开至多4个氨基酸的接头。

13.一种用于制备多组分试剂盒的方法，包括：

a)通过向病毒载体蛋白质或治疗性蛋白质的序列中引入能够与不同MHC II类分子结合的混杂的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位的序列来制备载体，所述NKT细胞表位由与CD1d结合的[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT]基序组成，其中，[FWYHT]指示F、W、Y、H或T能占据所述基序中的对应残基，[VILM]指示V、I、L或M能占据所述基序中的相应残基，并且“X”各自独立地表示任何氨基酸，并且其中，所述载体包括编码用于所述载体的功能和维持的经修饰的病毒载体蛋白质或经修饰的治疗性蛋白质的多核苷酸序列，所述表位具有在所述蛋白质的未经修饰的序列中不存在的序列，

b)制备肽，所述肽包括：

-a)的MHC II类T细胞表位或NKT细胞表位，和