CN103261218A - 免疫原性肽在预防和/或治疗感染性疾病、自体免疫性疾病、针对同种异体因子、变应性疾病、肿瘤、移植排斥的免疫应答和针对基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的免疫应答中的应用 - Google Patents

免疫原性肽在预防和/或治疗感染性疾病、自体免疫性疾病、针对同种异体因子、变应性疾病、肿瘤、移植排斥的免疫应答和针对基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的免疫应答中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明描述含有被CD4+自然杀伤T(NKT)细胞识别的表位以增加活性的新型肽，所述新型肽用于感染性疾病、自体免疫性疾病、针对给予同种异体因子的免疫反应、变应性疾病、肿瘤治疗、预防移植排斥以及预防针对基因治疗或基因疫苗接种所用病毒蛋白的免疫。

Description

免疫原性肽在预防和/或治疗感染性疾病、自体免疫性疾病、针对同种异体因子、变应性疾病、肿瘤、移植排斥的免疫应答和针对基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的免疫应答中的应用
技术领域
本发明涉及免疫原性肽及其在治疗感染性疾病、自体免疫性疾病、对同种异体因子、变应性疾病、肿瘤、移植排斥的免疫应答和针对基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的免疫应答中的应用。
背景技术
哺乳动物中许多疾病的治疗受限于特异性药物的缺乏。
感染在胞内病原体感染中持续，因为识别和消除受感染细胞的免疫应答不全。许多病原体减少受所述病原体入侵的细胞中的分子(例如I型主要组织相容性复合物(I型MHC))表面表达，从而降低免疫系统引起溶细胞性免疫应答的能力，所述溶细胞性免疫应答在CD8+谱系的T淋巴细胞识别并由呈递抗原源性表位的I型MHC激活时引起。非常需要通过替代策略使溶细胞性的淋巴细胞能够消除受病原体入侵的细胞。所述策略已被提出(EP2059256)，其中，使用源自细胞内病原体并且偶联硫醇-氧化还原酶基序的II型限制性表位来引起诱导呈递关联表位的抗原呈递细胞(APC)凋亡的溶细胞性CD4+T细胞。然而，溶细胞性T细胞的替代亚组的招募与激活会呈现不同的可能性以增加对受胞内病原体感染的细胞的清除。
在自体免疫性疾病中，比如在针对给予同种异体因子的免疫应答以及在变应性疾病中，消除呈递源自自体抗原、同种异体因子或变应原的肽的细胞是有利的，从而阻止任何不需的免疫应答及因而的与所述不需要免疫应答相关联的疾病。在该情况下，来自自体抗原、同种异体因子或变应原的表位主要由II型MHC以及所述表位和II型决定簇激活的CD4+谱系T淋巴细胞之间形成的复合物呈递。这导致B淋巴细胞的激活和针对所述自体抗原、同种异体因子或变应原的抗体生成。引起通过细胞裂解消除APC的方法会阻止CD4+T细胞的激活并因而阻止抗体生成。所述策略已在专利申请WO2008/017517A1中提出并描述，其中，分别使用连接硫醇-氧化还原酶基序的自体抗原或变应原或同种异体因子的II型限制性表位。通过暴露于偶联所述基序的II型限制性表位所引起的溶细胞性II型限制性CD4+T细胞诱导呈递关联表位的APC凋亡。然而，替代的溶细胞性T细胞的招募和激活会呈现有价值的选择性策略。
在肿瘤的情况中，细胞通过下调I型和II型MHC决定簇的表面表达来逃逸消除。因此，引起对肿瘤抗原特异的溶细胞性T细胞的任何策略将代表用于肿瘤治疗的更理想策略。WO2009/101205指导使用由肿瘤来源抗原的II型限制性呈递激活的溶细胞性T细胞来消除肿瘤。然而，该方法受限于肿瘤对MHC II型决定簇的弱表达。
在移植排斥中，慢性排斥过程由所述移植物脱落的抗原的间接呈递驱动，并由受体抗原呈递细胞向他/她自身的T淋巴细胞呈递。所述间接呈递通过呈递移植物来源的表位(I型和II型表位)而发生。由I型MHC的移植物抗原呈递激活的CD8谱系T淋巴细胞向所述移植物迁移，其中，它们通过识别其直接位于移植细胞上的关联表位来介导排斥。然而，CD8细胞的激活需要由间接呈递移植物来源抗原通过II型MHC决定簇激活的CD4细胞的协助。WO2009/100505指导使用源自移植物并偶联硫醇-氢化还原酶基序的II型限制性T细胞表位能通过参与间接呈递的APC凋亡而消除。然而，很需要能生成另一亚组溶细胞性T细胞的选择性策略。
类似地，新型治疗方法例如基因治疗和基因疫苗接种严重受限于宿主对用于转基因或疫苗接种的病毒载体的免疫应答。在这两种情况中，源自病毒载体的抗原由用所述载体转导的细胞脱落，并由宿主APC向宿主淋巴细胞呈递(称为间接抗原呈递)。应注意，许多病毒载体不仅激活适应性免疫应答，引起特异性抗体生成和特异性T细胞激活，所述病毒载体还激活先天免疫系统。先天免疫的激活用作适应性应答的佐剂。WO2009/101204指导，源自病毒载体并偶联硫醇-氧化还原酶基序的II型限制性表位能引起溶细胞性II型限制性CD4T细胞的激活。然而，非常需要抑制激活先天免疫系统的替代策略。
在本文所述的所有实施例中，本领域技术人员清楚了解能够引起抗原特异性溶细胞性T细胞并能以抗原特异性方式消除呈递所述特异性抗原的APC的替代策略是十分有价值的。
本发明给出这样一种替代策略。
自然杀伤T(NKT)细胞构成不同亚组的非传统T淋巴细胞，所述非传统T淋巴细胞识别由非经典MHC复合物分子CD1d呈递的抗原。现在描述NKT细胞的两个亚组。1型NKT细胞也称作非变异NKT细胞(iNKT)，是最为丰富的。它们的特征是具有由非变异α链、小鼠Valpha14和人Valpha24组成的α-βT细胞受体(TCR)。该α链与数量受限但变化的β链相关联。2型NKT细胞具有α-βTCR，但带有多态性α链。然而，显然存在NKT细胞的其它亚组而其表型仍未被完全定义，但其共有被CD1d分子中所存在糖脂激活的特征。
NKT细胞通常表达天然杀伤(NK)细胞受体的组合，其包括NKG2D和NK1.1。NKT细胞是先天免疫系统的一部分，可由先天免疫系统在获得完全效应能力之前不需要扩增而将其与适应性免疫系统区分开来。其调节剂中的大多数是预形成的，不需要转录。已显示NKT细胞在针对胞内病原体的免疫应答和肿瘤排斥中是主要的参与者。还主张其在控制自体免疫性疾病和移植排斥中的作用。
识别单位CD1d分子具有很类似MHC I型分子的结构,包括存在β2微球蛋白。其特征是接近两条α链的深裂缝及含有接受脂链的高度疏水残基。所述裂缝在两个末端都是开放的，允许容纳更长的链。CD1d的规范配体是合成的α半乳糖基神经酰胺(αGalCer)。然而，已经描述过许多天然的替代性配体，包括糖-和磷脂、髓磷脂中发现的天然脂质硫苷脂、微生物磷酸肌醇甘露糖苷和α-葡糖醛酸基神经酰胺。本领域中的目前共识(参见综述，例如Matsuda等，Current Opinion in Immunology2008,20:358-368和Godfrey等，Nature reviews Immunology2010,11:197-206)是CD1d仅结合含有脂链或由脂质尾部所构成一般常见结构的配体，所述脂质尾部埋入CD1d，而其糖残基的头部基团突出CD1d外。
人们认为肽无法通过由CD1d呈递而激活NKT细胞。然而，有人提示含有大体积氨基酸残基的长疏水肽能结合CD1d(Castano等,Science1995,269:223-226)。使用表达随机序列肽而没有明确生理相关性的噬菌体展示库完成的观察能建立理论上的共有基序(Castano等,Science1995,269:223-226以及参见下文)。
事实上，Castano等人指出，被激活的细胞是CD8+T细胞，称为MHC I型限制性细胞，而不是NKT细胞。这些发现指导本领域技术人员，并没有证据显示CD1d分子呈递疏水肽。由Castano等人提出的生理关联性进一步被质疑，因为在常规免疫方案下无法引起NKT细胞(Matsuda等,Current Opinion in Immunology2008,20:358-368和Brutkiewicz Journal of Immunology2006,177:769-775)。人造系统，例如用转染以过表达CD1d且于体外装载卵清蛋白源性肽的细胞进行免疫能够引起NKT细胞。类似地，用质粒DNA与鼠CD1d和共刺激分子一同进行皮内免疫诱导溶细胞性CD1d-限制性T细胞(Lee等,Journal of Experimental Medicine1998,187:433-438)。Castano等人称，含有由芳族残基在P1位和P7位构成的结构基序的疏水肽显示用于结合位于CD1d分子各末端的CD1d疏水口袋以及位于P4位的脂族链的锚定残基(Science269:223,1995)以包含CD1d结合表位的核心基序。如上所述，Castano等人得出的结论不被数据支持。
我们出乎预料地发现，含有疏水氨基酸序列的肽事实上能够引起NKT细胞的激活。所述序列的一个例子由以下基序表示：[FW]-xx-[ILM]-xx-[FW]，其中，[FW]是选自苯丙氨酸或色氨酸的氨基酸，而[ILM]是选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的氨基酸。P7位的[FW]据称是随意的，意味着F或W可以由T或H替代。
我们进一步发现，CD1d结合基序在偶联硫醇-氧化还原酶基序时，对调节NKT活性特别有效。该基序显示C-XX-C的一般结构，其中C是半胱氨酸，而X是除酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以外的任何氨基酸。专利申请WO2008/017517A1描述偶联硫醇-氧化还原酶基序的II型限制性T细胞表位具有将II型限制性CD4T细胞的表型和功能转化为有效溶细胞性细胞(包括APC凋亡)的性质。该作用归因于APC和T细胞之间增加的突触形成，这是位于T细胞表面的CD4分子减少和异构化的结果。
绝大部分的NKT细胞携带CD4共受体，但其功能尚不清楚。然而，最近的公开指示，CD4以与结合MHC II型相同的方式结合CD1d分子(Thedrez等,Blood110:251-258,2007)。此外，显示完全激活NKT细胞需要CD4的存在。
因此，本发明涉及有能力结合CD1d并因而能招募且激活NKT细胞，偶联硫醇-氧化还原酶基序的疏水肽的应用。所述肽确保抗原特异性，且代表用于以下治疗的有价值方法：
(1)有胞内病原体的传染性疾病，其中受感染细胞呈递源自所述病原体并结合CD1d的疏水肽。因而，增加的NKt招募和/或所述NKT细胞的活性能共作用以消除受感染的细胞；
(2)自体免疫性疾病，针对给予同种异体因子的免疫应答和变应性疾病，其中，与这三类疾病中每一种相关联的抗原生成由CD1d呈递的疏水肽。因此，抗原特异性NKT细胞的招募和/或活性增加能协助消除抗原呈递细胞，并因而消除不需要的免疫应答；
(3)肿瘤，因为肿瘤细胞通常表达携带肿瘤特异性抗原的CD1d，所述肿瘤特异性抗原能被NKT细胞识别。增加所述NKT细胞的活性和招募会引起肿瘤清除增加。
(4)移植排斥，因为宿主抗原呈递细胞在CD1d背景中呈递源自所述移植物的疏水肽。宿主NKT细胞对这些肽的识别将引起抗原呈递细胞的消除并中断慢性移植排斥过程；
(5)基因治疗和基因疫苗接种，其中，来自病毒载体且从转导细胞脱落的抗原由CD1d决定簇呈递。通过识别病毒载体抗原而消除宿主APC的NKT细胞的招募和激活将有利于转基因表达的持续性和所述转基因在基因疫苗接种中维持完全免疫原性。
除本发明在治疗方面的兴趣以外，我们意外地观察到，在CD1d表位侧翼残基内添加氧化还原酶基序增加TCR结合，这使得大幅改进了对CD4+NKT细胞的检测。本发明所述,包含天然CD1d-限制性表位和至少一个CxxC形式(其中C代表半胱氨酸，而x代表除半胱氨酸或大体积残基以外的任何氨基酸)的硫醇还原酶基序的肽因而在以下方面引起主要关注：
(1)分析目的：在疫苗接种前检测NKT细胞前体频率，评价肽结合CD1d复合物的亲和性，在疫苗接种过程中或在免疫抑制下跟踪特定NKT细胞，鉴定与其生物活性无关的细胞，鉴定涉及疾病机制的细胞，消耗特定NKT细胞，以及原位(例如在器官活检中)检测NKT细胞；
(2)制备目的：制备用于评价功能的特定NKT细胞，以及制备用于培养和纯化的NKT细胞；
(3)旨在细胞治疗的细胞群质量控制；
(4)治疗性目的，包括在器官移植前消耗特异性CD4+NKT细胞。
发明内容
本发明涉及通过增加针对源自所述胞内病原体的特定抗原的免疫应答,使用经分离免疫原性肽来预防和/治疗对象中胞内病原体感染。
本发明还涉及经分离免疫原性肽在预防和治疗自体免疫应答、针对给予同种异体因子的免疫应答和针对暴露于变应原的免疫应答中的应用。
本发明还涉及经分离免疫原性肽在治疗肿瘤中的应用。
本发明还涉及经分离免疫原性肽在预防移植排斥中的应用。
本发明还涉及经分离免疫原性肽在预防针对基因治疗和/或基因疫苗接种所用病毒蛋白的免疫应答中的应用。
本发明还涉及用于检测、制备和消耗NKT细胞的肽。
一方面，本发明涉及包含(i)源自病原体相关抗原的NKT细胞表位和(ii)硫醇-氧化还原酶基序(简称硫氧还蛋白基序)的至少一种经分离免疫原性肽作为药物在预防和/或治疗对象内所述病原体感染中的应用。
另一方面，本发明还包括含(i)源自自体抗原、同种异体因子或变应原的NKT细胞表位和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离免疫原性肽作为药物在预防和/或治疗对象内针对自体抗原、同种异体因子和/或变应原的免疫应答中的应用。
另一方面，本发明还涵盖包含(i)源自肿瘤相关抗原的NKT细胞表位和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离免疫原性肽在治疗对象肿瘤中的应用。
另一方面，本发明还涵盖包含(i)源自同种异体抗原的NKT细胞表位和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离免疫原性肽作为药物在预防对象内移植排斥中的应用。
另一方面，本发明还涵盖包含(i)源自用于基因治疗或基因疫苗接种的病毒载体的NKT细胞表位和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离免疫原性肽作为药物在预防对象内针对所述病毒载体的免疫应答中的应用。
另一方面，本发明还涵盖包含(i)源自病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、同种异体抗原或病毒载体抗原的NKT细胞表位，和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离免疫原性肽作为药物用于在增加所述对象内CD4+NKT细胞的活化、细胞因子生成和溶细胞活性中的应用。
一般而言，本发明提供包含(i)源自病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、同种异体抗原或病毒载体抗原的NKT细胞表位，和(ii)硫氧还蛋白基序的免疫原性肽，用于通过增加CD4+NKt细胞在所述受体内的响应来预防或治疗受体中胞内病原体的感染，预防或治疗受体中针对自体抗原、同种异体因子、变应原的免疫应答，治疗受体肿瘤，预防受体中针对同种异体抗原或针对病毒载体抗原的免疫作用。
本发明还涉及NKT细胞的1型(iNKT)或2型亚组，以及不太确定特征的NKT亚组,其特征都为携带CD4共受体和能识别CD1d结合肽的TCRβ链。
本发明还涉及能结合CD1d以向NKT细胞呈递的疏水肽。
本发明涉及包含至少一个CD1d-限制性T细胞表位的疏水肽。CD1d分子的结构指示，需要疏水氨基酸残基以占据位于所述CD1d裂缝末端的两个疏水口袋，并且脂族残基应占据所述裂缝中间的位置。因此，作为CD1d结合序列的一般示例，可以使用基序[FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]，其中[FW]表示F或W可占据第一锚定残基(P1)，P4位可由I、L或M占据，而P7可由F、W、T或H占据。x在该一般模型基序中代表任何氨基酸。本领域技术人员应该清楚这些氨基酸残基的各种组合都是可能的。在一个具体实施方式中，所述一般模型基序可以表示为反向序列例如[FWTH]-xx-[ILM]-xx-[FW]。
所述硫氧还蛋白基序由共有序列([CST]-XX-[CST])构成，其中，[CST]是选自半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸的氨基酸，而X可以是除酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)和色氨酸(W)以外的任何氨基酸。将所述硫氧还蛋白基序添加至所述肽的氨基末端或羧基末端或各个末端，可能通过位于1～7个氨基间的接头与所述CD1d限制性T细胞表位分离。
在一个具体实施方式中，所述接头包括作为天然侧接残基一部分的氨基酸。
本发明还涉及用于获得或诱导上述NKT细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供分离的天然CD4+T细胞；
(ii)使那些细胞接触免疫原性肽，所述免疫原性肽含有由CD1d分子呈递的T细胞表位，以及临近所述T细胞表位或通过至多7个氨基酸的接头与其分隔的C-XX-[CST]或[CST]-XX-C基序；和
(iii)在IL-2/IL-15和/或IL-7存在下扩增所述细胞。
另一方面，本发明包括鉴定CD4+NKT细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供分离的天然CD4+T细胞；
(ii)提供疑似具有细胞毒性的CD4+T细胞；和
(iii)测定与(i)中提供的T细胞相比，(ii)中提供的T细胞显示上述特征。
在上述任何应用中，所述胞内病原体相关的抗原可以是源自具有细胞内生命周期的病毒、细菌、分枝杆菌或寄生虫的任何抗原。
在上文所述的任何内容中，所述自体抗原可以是与自体免疫性疾病相关联的任何抗原。所述疾病的例子是胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、重症肌无力和甲状腺炎。
在上文所述的任何内容中，所述同种异体因子是用于凝血缺陷或纤维蛋白溶解缺陷的替代治疗的多肽或蛋白质，包括因子VIII、因子IX和葡萄球菌激酶，激素例如胰岛素和生长激素，细胞因子和生长因子例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、GM-CSF和G-CSF，用于调节免疫应答的抗体，包括变应性疾病中的抗IgE抗体，移植排斥和多种自体免疫性疾病中的抗CD3、抗CD4和抗CD20抗体，风湿关节炎中的抗TNF-α抗体和肾功能不全中的促红细胞生成素。
在上文所述的任何内容中，所述变应原是空气传播的变应原，例如源自室内尘螨、花粉或家养动物的那些变应原，食物变应原例如花生、卵清蛋白、谷类、水果和豆类变应原，以及接触性抗原例如乳胶。以变应原致敏性为特征的疾病包括变应性哮喘、变应性鼻-鼻窦炎、过敏性休克、荨麻疹、特应性皮炎和接触性皮炎。
在上文所述的任何内容中，所述肿瘤相关的抗原是癌基因、原癌基因、病毒来源的蛋白、存活因子或克隆型决定簇，例如源于B细胞受体的独特型决定簇。
在上文所述的任何内容中，所述同种异体抗原是主要组织相容性抗原、次要组织相容性抗原或组织特异性抗原。所述抗原涉及细胞和组织移植排斥。
在上文所述的任何内容中，所述病毒载体源自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒。
在上文所述的任何应用中，所述硫氧还蛋白基序可以毗邻所述NKT细胞表位或与所述NKT细胞表位由一个接头隔开。在具体实施方式中，所述接头由至多7个氨基酸组成。
在上述应用中的所述免疫原性肽的其它实施方式中，所述硫氧还蛋白基序天然不出现在8个氨基酸的区域中，所述区域的N-或C-末端在所述病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、同种异体抗原或病毒载体抗原中临近NKT细胞表位。具体而言，所述硫氧还蛋白基序位于所述NKT细胞表位的N末端。
在上述应用的免疫原性肽的具体实施方式中，所述免疫原性肽还包含内吞靶序列。任何上述免疫原性肽可通过化学合成或通过重组表达来生成。
本发明的其它方法旨在获得NKT细胞群，所述方法包括以下步骤：
(i)提供免疫原性肽，所述免疫原性肽包含源自胞内病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、同种异体抗原或病毒载体抗原的NKT细胞表位，和(ii)硫氧还蛋白基序；
(ii)将所述免疫原性肽给予对象；和(在佐剂存在下)
(iii)获得CD4+NKT细胞群。
可通过上述方法获得的CD4+NKT细胞群以及其作为药物在对象体内预防或治疗所述胞内病原体感染，预防或治疗自体免疫性疾病、针对同种异体因子的免疫应答，预防或治疗变应性疾病，治疗肿瘤，预防移植排斥及预防针对基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的免疫应答中的应用也是本发明的一部分。
另一方面，本发明涉及某一免疫原性肽,所述免疫原性肽包含源自胞内病原体相关抗原或自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、同种异体抗原或病毒载体抗原的NKT细胞表位，和，临近所述NKT细胞表位或与所述NKT细胞表位由一个接头隔开的硫氧还蛋白基序。
另一方面，本发明还涉及分离肽，所述肽包含源自胞内病原体相关抗原或自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、同种异体抗原或病毒载体抗原的NKT细胞表位，和临近所述NKT细胞表位或与所述NKT细胞表位由一个接头隔开的硫氧还蛋白基序，用于检测、制备或消耗NKT细胞。
本发明还包括分离的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体包括含有NKT细胞表位的至少一种病原体相关的抗原，或至少一种自体抗原，或至少一种同种异体因子，或至少一种变应原，或至少一种肿瘤相关抗原，或至少一种同种异体抗原，或至少一种病毒载体抗原，以及临近所述NKT细胞表位或与所述NKT细胞表位由一个接头隔开的硫氧还蛋白基序。
更具体地，本发明提供分离的病毒载体，其特征在于，在至少一种所述病原体相关抗原，或自体抗原，或同种异体因子，或变应原，或肿瘤相关抗原，或同种异体抗原，或病毒载体抗原中存在的至少一个NKT细胞表位通过插入所述病毒相关抗原、所述自体抗原、所述同种异体因子、所述变应原、所述肿瘤相关抗原、所述同种异体抗原或所述病毒载体抗原而修饰，硫氧还蛋白基序临近所述NKT细胞表位或与所述NKT细胞表位由一个接头隔开。
定义
本文所用的术语“肽”指某一分子，所述分子包含2～200个氨基酸、由肽键连接的氨基酸序列，但其在具体实施方式中可不包含氨基酸结构(例如，连接有机化合物)。本发明所述的肽可包含任意20个常规氨基酸或其修饰形式，或可包含通过化学肽合成或通过化学或酶修饰掺入的非自然产生的氨基酸。
所述术语“肽”或“免疫原性肽”以其平常含意使用，但“免疫原性肽”一般优选用于治疗目的的肽，同时“肽”优选用于检测、制备和消耗NKT细胞。
本文所用的术语“表位”指蛋白的一个或数个部分(其可定义一个构象表位)，所述部分被抗体或其部分(Fab'、Fab2'等)或存在于B或T细胞淋巴细胞的细胞表面的受体特异性识别并结合，并能够通过所述结合来诱导免疫应答。
本文所用的术语“抗原”指包含一种或多种半抗原或包含一个或多个T细胞表位的大分子结构。通常，所述大分子是蛋白质或肽(有或没有多糖)或由蛋白成分组成且包含一个或多个表位；本文所述的大分子可替代性地指“抗原性蛋白质”或“抗原性肽”。
本发明内容中的术语“T细胞表位”或“T-细胞表位”指显性、亚显性或隐性T细胞表位，即，被T淋巴细胞的细胞表面受体特异性识别并结合的抗原性蛋白质的部分。表位是显性、亚显性或是隐性取决于针对所述表位引起的免疫反应。显性取决于所述表位在蛋白质的所有可能T细胞表位中被T细胞识别以及能够激活T细胞的频率。具体而言，T细胞表位是由MHC I型或MHC II型分子结合的表位。
所述术语“NKT细胞表位”指由位于T淋巴细胞的细胞表面的受体特异性识别并结合的抗原性蛋白部分。具体而言，NKT细胞表位是由CD1d分子结合的表位。
所述术语“CD4+效应细胞”指属于T-细胞的CD4阳性亚组的细胞，其功能是为其它细胞(例如，B-细胞)提供帮助。这些效应细胞被常规地报道为Th细胞(用于T辅助细胞(T helper cells))，有不同亚组例如Th0、Th1、Th2和Th17细胞。
所述术语“NKT细胞”指先天免疫系统的细胞，其特征在于，所述细胞携带受体例如NK1.1和NKG2D，并且识别CD1d分子呈递的表位。本发明内容中，NKT细胞可属于1型(非变异)或2型亚组，或属于不太确定特征的具有比1型或2型NKT细胞更多多态性T细胞受体的任何NKT细胞。
所述“CD1d分子”指非MHC来源的分子，所述分子由3条α链和排列成两侧开放的深疏水槽的β链反平行组构成，其能够呈递脂质、糖脂或疏水肽至NKT细胞。
所述术语“免疫紊乱”或“免疫疾病”指生物体内免疫系统的反应引起或维持失常或非生理状况的疾病。在本发明内容中，免疫紊乱指由感染性试剂和肿瘤监控诱导的病理学。
所述术语“同种异体因子”指在相同物种的两个个体间比较时显示多态性的蛋白质、肽或因子(即，任何分子)，更一般地，指在接受所述同种异体因子的对象内诱导(同种异体反应性)免疫应答的任何蛋白质、肽或因子。
本文所用的术语“同种异体抗原”或“同种异体移植抗原”指源自(脱落自和/或存在于)细胞或组织的抗原，所述细胞或组织从供者转移至受体时能被所述受体的B或T-细胞受体的抗体识别并结合。同种异体抗原通常是多态性基因的产物。同种异体抗原是在比较供者和受体(属于同一物种)时，显示轻微结构差异的蛋白质或肽。受体机体内存在所述供体抗原能引起所述受体内的免疫应答。所述同种异体反应性免疫应答特异于同种异体抗原。
本文所用的术语“硫醇-氧化还原酶基序”、“硫醇还原酶基序”、“硫氧还蛋白基序”或“氧还基序”是同义术语，其指由[CST]-XX-[CST]构成的一般序列的基序，其中C代表半胱氨酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸，X代表除酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸以外的任何氨基酸。
具体实施方式
本发明提供在对象内预防或治疗胞内病原体感染的方法。本发明还提供用于预防和治疗自体免疫性疾病、给予同种异体因子或变应原之后的免疫应答的方法。本发明还提供用于治疗肿瘤，用于预防移植排斥以及用于预防针对病毒载体的免疫应答的方法。
具体而言，本发明提供增加CD4+NKT细胞的扩增和功能活性的方法。所述细胞通常被归类为两个不同亚组，即携带非变异TCRα链(小鼠Valpha14、人Valpha24)的1型NKT细胞，或具有不同α链库的2型NKT细胞。然而，近期证据显示不适合所述1型或2型种类的替代NKT细胞亚组。本发明的目的包括这些非常规NKT细胞，前提是其携带CD4共受体。对于结合DC1d的抗原呈递，NKT细胞被快速激活并分泌许多视作决定簇的细胞因子以影响来自先天和适应性免疫系统的其它细胞，并赋予CD1d+抗原呈递细胞的有效杀伤活性。认为该机制不仅对抵抗胞内因子所致的感染至关重要，对肿瘤细胞监视和肿瘤消除而言也是至关重要的。所述相同机制对于控制不需要的免疫应答起作用，因为其出现在自体免疫疾病、针对同种异体因子或变应原的免疫反应中。
在移植排斥中，脱落自移植物的同种异体抗原通过间接通路被呈递至所述受体对象的免疫系统。这意味着脱落的同种异体移植物抗原被所述宿主抗原呈递细胞摄取，所述抗原呈递细胞以CD1d限制性方式向所述宿主T细胞呈递所述同种异体抗原。因此，在由CD4+NKT细胞关联识别后通过杀伤损毁所述宿主抗原呈递细胞的机制对所述移植物受体有利。
在针对基因治疗和基因疫苗接种所用病毒载体的免疫应答中，脱落自转导细胞的抗原被所述宿主抗原呈递细胞摄取，随后如移植排斥情况中的间接呈递。
当NKT细胞被修饰成含有硫醇还原酶活性的肽激活时，后者显著增强NKT细胞的性质，并从而增加对所述携带胞内微生物的细胞以及肿瘤细胞的杀伤。抗原特异性CD4+NKT细胞对呈递自体抗原、同种异体因子或变应原的细胞的杀伤抑制针对所述自体抗原、同种异体因子或变应原的免疫应答。对呈递源自移植物或转导细胞的抗原的宿主细胞的杀伤分别中断对所述病毒载体抗原的排斥或响应。
因此，证实NKT细胞在越来越多的感染性疾病中的重要性。这些感染性疾病包括分枝杆菌(包括结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis))、寄生虫例如利什曼原虫(Leishmania)、细菌例如单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门菌(salmonella)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和疏螺旋体(Borrelia)，以及病毒例如单纯疱疹病毒(Chiba等,Journal of Immunology181:2292-2302,2008；Mattner等,Nature434:525529,2005；Tupin等,Nature Reviews.Microbiology5:405-417,2007)的感染。除了直接杀伤受感染的细胞，NKT细胞通过其生成高浓度细胞因子(具体是IFN-γ)的能力可在受感染细胞内触发非特异性杀伤机制。这些机制包括诱导吲哚胺氧化酶、一氧化氮合酶，以及生成活性氧物质。
NKT细胞参与控制自体免疫性疾病中的免疫应答或针对同种异体因子或变应原的免疫应答已被报道多次(Jahng等,Journal of experimental Medicine199:947-957,2004；Van Belle和von Herrath,Molecular Immunology47:8-11,2009)，但是相对难以描述。在本发明的内容中，我们意外地观察到肽可由CD1d分子呈递。CD1d分子的特点是，其由2条反平行α链在两条反平行β链构成的平台顶部形成裂缝而构成。所述裂缝窄且深，并仅接受疏水残基，通常认为仅为脂质。事实上，含疏水残基的肽具有结合至CD1d裂缝的能力。此外，由于所述裂缝在两侧皆开放，可容纳长于7个氨基酸的肽。在自体抗原、同种异体因子和变应原中发现携带CD1d基序的疏水肽，从而赋予所述自体抗原、同种异体因子或变应原激活CD4+NKT细胞的能力。通过杀伤呈递所述自体抗原、同种异体因子或变应原的细胞的直接消除可去除其引起针对这些抗原/因子的免疫应答的能力。
已证明NKT细胞参与对抗肿瘤的防御，这是间接通过生成能够增加对肿瘤细胞的先天和适应性应答的细胞因子，或者直接通过杀伤呈递NKT细胞所识别脂质表位的肿瘤细胞(Crowe等,Journal of experimental Medicine196:119-127,2002；Tachibana等,Clinical Cancer Research11:7322-7327,2005；Dhodapkar等,Journal ofexperimental Medicine197:1667-1676,2003；Song等,Journal of clinical Investigation119:15241536,2009)。直接杀伤涉及粒酶和穿孔蛋白的生成。已显示NKT细胞抑制实验肿瘤例如通过致癌试剂或通过删除p53肿瘤抑制基因而诱导的肉瘤，以及自生肿瘤例如骨髓瘤。易受本发明治疗影响的肿瘤包括表达以下的那些：癌基因例如在一些黑素瘤中鉴定的MAGE，或酪氨酸激酶例如在外胚层来源的癌中鉴定的ALK(间变性淋巴瘤酶)，原癌基因例如软组织癌上表达的细胞周期蛋白D1，如肾脏或副甲状腺以及多发性骨髓瘤中的那些，病毒来源的蛋白质例如一些癌和一些霍奇金氏淋巴瘤中EB病毒的那些，存活因子例如存活或bcl2因子，以及克隆型决定簇例如源于滤泡性淋巴瘤或多发性骨髓瘤中B细胞受体的独特型决定簇或T细胞恶性肿瘤中的T细胞受体决定簇。
作为移植物(组织移植物或细胞移植物)一部分的细胞，不携带或仅最小限度地携带所述CD1d分子。在基因治疗或基因疫苗接种中转导的细胞也同样如此。在这两种情况中，不需要的免疫应答导致移植排斥或针对所述病毒载体的免疫，所述应答通过宿主抗原呈递细胞对宿主T细胞间接抗原呈递而引发。在与NKT细胞的相关相互作用之后通过杀伤宿主抗原呈递细胞的直接消除可去除引起针对同种异体抗原或病毒载体抗原的免疫应答的能力。
本发明涉及生成包含疏水残基的肽，所述疏水残基赋予所述肽结合CD1d分子的能力。给予后，所述肽被APC摄取，指向晚期内体(其加载至CD1d上)并呈递至所述APC表面。所述疏水肽的特征是与一般序列[FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]或[FWTH]-xx-[ILM]-xx-[FW,]对应的基序，其中P1位和P7位由疏水残基例如苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)占据。然而，P7在某种意义上能够接受替代苯丙氨酸或色氨酸的疏水残基，例如苏氨酸(T)或组氨酸(H)。所述P4位由脂族残基例如异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)占据。
国际申请WO2009/101206公开能够引发主要组织相容性II型限制性CD4+细胞活性的免疫原性肽，包括肽CGHCGGFTNMFATWSPSK。由WO2009/101206无法得知肽具有结合CD1d分子的能力。因此，本发明涉及结合CD1d并激活NKT细胞的肽，前提是所述肽不是CGHCGGFTNMFATWSPSK。
本发明涉及由CD1d结合基序自然组成的疏水残基构成的肽。在一些实施方式中，所述基序的氨基酸残基经修饰，通常通过用增加结合CD1d能力的残基取代。在特定的实施方式中，修饰基序以更紧密地匹配所述一般基序[FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]。更具体地，生成在第7位含有F或W的肽。
本发明的肽还包含临近所述疏水残基或与所述残基隔开一个接头的硫醇还原酶基序。一旦由CD1d分子呈递，所述硫醇还原酶基序增强激活NKT细胞的能力，从而增强其抗感染和/或抗肿瘤活性及其抑制针对自体抗原、同种异体因子、变应原、同种异体移植物抗原和源自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原的免疫应答的能力。
因此，根据所述硫醇还原酶基序可以加入氨基末端或羧基末端的事实，所述完全基序的一般说明可以是[CST]-XX-[CST]-接头-[FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]或[FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]-接头-[CST]-XX-[CST]。接头的添加是可选的。存在时，所述接头可为1到至多7个氨基酸。本领域技术人员应清楚，提供该一般说明仅用于综合理解本发明。
本发明还涉及就再次被动给予宿主而言获取并在体外激活的NKT细胞，以增加其能力从而清除受病原体感染的细胞、呈递源自自体抗原、同种异体因子或变应原的细胞、肿瘤细胞、呈递脱落自移植物或基因治疗/基因疫苗接种所用病毒蛋白的同种异体抗原的细胞。作为对通过CD1d阳性APC体外刺激NKT细胞的替代，本发明还应用于转染或转导APC的方法，使用能够驱动所述免疫原性肽在晚期内体中表达以载至CD1d分子上的基因构建物。
具体而言，本发明提供扩增特定NKT细胞且最终活性增强的方法，所述方法包括但不限于：
(i)增加细胞因子生成
(ii)增加抗原呈递细胞的接触和可溶因子依赖性清除。
因此，结果是对胞内病原体、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤细胞的更有效响应，以及对针对移植物和用于基因治疗/基因疫苗接种的病毒蛋白的更有效抑制。
本发明还涉及利用体液或器官内的所需性质鉴定NKT细胞。所述方法包括通过NKT细胞表面的表型优势(包括NK1.1、CD4、NKG2D和CD244的表达)来鉴定NKT细胞。然后，使细胞接触NKT细胞表位，所述表位定义为能够被CD1d分子呈递的肽。然后，在IL-2或IL-15或IL-7存在下体外扩增细胞。
因此，本发明提供含有CD1d结合基序和用于检测、制备和消耗NKT细胞的硫醇还原酶基序的肽。在一个优选实施方式中，所述肽以单体形式或优选以多亚基形式装载在分离的CD1d分子上。所述CD1d分子可以是可溶形式，或与固体支持物结合。
本发明应视作接触感染或肿瘤已存在时施予的治愈性治疗。这归因于NKT细胞被认为不进入记忆循环的事实。当NKT细胞被激活时，其在数天的时间内扩增，然后所述细胞群进入收缩阶段并可能是短期无反应性的。然而，在一些情况下，其可用于在预防性设置中通过使用本发明的肽主动免疫以给予治疗。这些情况的例子是接触感染性疾病风险高(例如直接接触受感染个体之后)的患者。因此，本发明还涉及通过主动疫苗接种或被动细胞转移进行治疗的预防性应用。
一方面，本发明涉及包含(i)源自病原体相关抗原的NKT细胞表位和(ii)硫醇-氧化还原酶基序(简称硫氧还蛋白基序)的至少一种经分离疏水免疫原性肽作为药物在预防和/或治疗对象内所述病原体感染中的应用。
另一方面，本发明还涵盖包含(i)源自自体抗原、同种异体因子和/或变应原的NKT细胞表位和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离疏水免疫原性肽作为药物在预防和/或治疗对象内针对自体抗原、同种异体因子和/或变应原的免疫应答中的应用。
另一方面，本发明还涵盖包含(i)源自肿瘤相关抗原的NKT细胞表位和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离疏水免疫原性肽在治疗对象肿瘤中的应用。
另一方面，本发明还涵盖包含(i)源自同种异体抗原的NKT细胞表位和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离疏水免疫原性肽作为药物在预防对象移植排斥中的应用。
另一方面，本发明还涵盖包含(i)源自用于基因治疗或基因疫苗接种的病毒载体的NKT细胞表位和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离疏水免疫原性肽作为药物在预防对象内针对所述病毒载体的免疫应答中的应用。
另一方面，本发明还涵盖包含(i)源自病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、同种异体抗原或病毒载体抗原的NKT细胞表位和(ii)硫氧还蛋白基序的至少一种经分离免疫原性肽作为药物在增加所述对象内CD4+NKT细胞的活化、细胞因子生成和溶细胞活性中的应用。
本发明的另一个优势是非常有限程度的CD1d分子的多态性。这允许单一或有限数量的肽用于治疗远系杂交群例如人类或动物。而且，由一个供体引起的NKT细胞可以用于多个受体内的被动转移。这与肽由MHC I型或II型分子呈递的情况(其多态性妨碍单一肽用于多个受体的应用)形成很大对比。
NKT细胞表位的一般结构包括P1位和P7位的疏水残基，且P4位由脂链占据。因此，最终所述一般结构可定义为[FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY]，其中，x代表任何氨基酸。在P1位、P4位和P7位中可以存在任何所列出的氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。非天然氨基酸的例子包括D-氨基酸。
通常，具有还原活性的有机化合物是肽序列。具有还原活性的肽段遇到硫醇还原酶，所述硫醇还原酶是小的二硫化物还原酶，包括谷氧还蛋白、核氧还蛋白(nucleoredoxins)、硫氧还蛋白和其它硫醇/二硫化物氧化还原酶。其通过保守活性结构域共有序列内的氧化还原活性半胱氨酸来减少蛋白质(例如酶)上二硫键的活性，所述保守活性结构域共有序列为C-XX-C、C-XX-S、C-XX-T、S-XX-C、T-XX-C(Fomenko等.(2003)Biochemistry42,11214-11225)，其中X代表任何氨基酸。在较大蛋白例如二硫化物异构酶(PDI)和磷酸肌醇特异性磷脂酶C中也发现所述结构域。具体而言，免疫原性肽包含氧化还原基序硫醇还原酶序列基序[CST]-XX-[CST]，在另一个实施方式中，所述[CST]-XX-[CST]基序位于所述T细胞表位的N-末端。更具体地，在所述氧化还原基序中，至少一个[CST]位置由Cys占据；因此所述基序是[C]-XX-[CST]或[CST]-XX-[C]。本申请中所述四肽称为“所述基序”或“氧化还原基序”。更具体地，所述免疫原性肽可包含序列基序[C]-XX-[CS]或[CS]-XX-[C]。甚至更具体地，所述免疫原性肽包含序列基序C-XX-S、S-XX-C或C-XX-C。
上述免疫原性肽中的基序位置直接毗邻所述肽内的所述表位序列，或与所述T细胞表位由一个接头隔开。更具体地，所述接头包括7个或更少氨基酸的氨基酸序列。最具体地，所述接头包含1、2、3或4个氨基酸。接头中所用的典型氨基酸是丝氨酸和苏氨酸。如本发明所述含有接头的肽示例是C-XX-C-G-表位、C-XX-C-GG-表位、C-XX-C-SSS-表位、C-XX-C-SGSG-表位等。在另一个具体实施方式中，所述接头序列包含获得CD1d结合基序的多肽序列中天然存在的氨基酸。各种数量的所述天然氨基酸可以包括在所述肽的氨基末端或羧基末端或两个末端。
所述免疫原性肽可包括额外的短氨基酸序列，在所述(人造)序列的N或C末端包含所述NKT细胞表位和还原化合物(基序)。所述氨基酸序列在本文中一般指“侧接序列”。所述免疫原性肽中的侧接序列可以位于所述氧化还原基序和/或所述T细胞表位的N末端和/或C末端。当所述免疫原性肽包含内体靶序列时，侧接序列可存在于所述表位和内体靶序列之间和/或位于所述还原化合物(例如，基序)和内体靶序列之间。更具体地，侧接序列是具有至多10个氨基酸，或在1～7个氨基酸的序列，例如2个氨基酸的序列。更具体地，所述侧接序列包含用于使所述肽在CD1d分子内稳定的大体积氨基酸残基。
在本发明的具体实施方式中，所述免疫原性肽内的氧化还原基序位于所述表位的N-末端。
如上所详述，所述免疫原性肽包含如本文所述连接NKT细胞表位序列的还原基序。在具体情况中，所述NKT细胞表位源自在其天然序列中不含具有氧化还原性质的氨基酸序列的蛋白质，所述序列位于11个氨基酸序列内，N-或C-末端与感兴趣的NKT细胞表位相邻。
在具体的实施方式中，所述NKT细胞表位源自胞内病原体。所述病原体可以是病毒、细菌或寄生虫。病毒包括ssDNA、dsDNA和RNA病毒，例子有疱疹病毒(Herpesviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)和小核糖核酸病毒(Picornaviridae)、流感病毒、麻疹病毒和免疫缺陷病毒。细菌和分枝杆菌包括结核分枝杆菌、人或动物的其它致病性分枝杆菌、耶尔森氏菌(Yersiniosis)、布鲁氏菌(Brucella)、衣原体、支原体、立克次体、沙门氏菌(Salmonellae)和志贺氏菌(Shigellae)。寄生虫包括疟原虫、利什曼病(Leishmanias)、锥虫、弓形虫、李斯特菌(Listeria)、组织胞浆菌(Histoplasma)。
在具体的实施方式中，所述NKT细胞表位源自自体抗原，包括甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、甲状腺疾病中的TSH受体；胰岛素(胰岛素原)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、酪氨酸磷酸酶IA-2、热激蛋白HSP65、1型糖尿病中的胰岛特异性葡糖6磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)；自体免疫肾上腺炎中的21-OH羟化酶；自体免疫多内分泌综合症中的17-α羟化酶、组氨酸脱羧酶、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶；自体免疫胃炎或恶性贫血中的H+/K+ATP酶内在因子；多发性硬化中的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白质(PLP)；重症肌无力中的乙酰胆碱受体；自体免疫眼部综合症中的视黄醇结合蛋白(RBP)；自体免疫内耳疾病中的II型和IX型胶原；乳糜泻中的组织谷氨酰胺转移酶；炎性肠病中的pANCA组蛋白H1蛋白；热激蛋白HSP60和动脉粥样硬化中的氧基-光密度脂蛋白以及帕金森病中的突触核蛋白。
在具体的实施方式中，所述NKT细胞表位源自同种异体因子，包括所用的任何肽或多肽：(1)用于凝血缺陷或纤维蛋白溶解缺陷的替代性治疗，包括因子VIII、因子IX和葡萄球菌激酶；(2)激素，例如生长激素或胰岛素；(3)细胞因子和生长因子，例如干扰素-α、干扰素-γ、GM-CSF和G-CSF；(4)用于调节免疫应答的抗体，包括变应性疾病中的抗IgE抗体，移植排斥和多种自体免疫疾病中的抗CD3和抗CD4抗体，以及非霍奇金淋巴瘤中的抗CD20抗体；(5)肾功能不全中的促红细胞生成素，以及；(6)基因修饰的抗原。
在具体的实施方式中，所述NKT细胞表位源自变应原，包括空气传播的变应原例如源自室内尘螨、源自花粉或源自家养动物的那些变应原，食物变应原例如花生、卵清蛋白、谷类、水果和豆类变应原，以及接触性变应原，例如乳胶。以变应原致敏为特征的疾病包括变应性哮喘、变应性鼻-鼻窦炎、过敏性休克、荨麻疹、特应性皮炎和接触性皮炎。
在具体的实施方式中，所述NKT细胞表位源自肿瘤，包括源自以下的任何肽或多肽：(1)癌基因，例如在一些黑素瘤中鉴定的MAGE；(2)原癌基因，例如软组织癌上表达的细胞周期蛋白D1,例如肾脏或副甲状腺以及多发性骨髓瘤中的那些；(3)病毒来源的蛋白质，例如来自一些癌和一些霍奇金型淋巴瘤中EB病毒的那些；(4)存活因子，其为抗凋亡因子，如存活素或bcl2；(5)克隆型决定簇，例如源自滤泡性淋巴瘤或多发性骨髓瘤中B细胞受体的独特型决定簇或T细胞恶性肿瘤中的T细胞受体决定簇。
在具体的实施方式中，所述NKT细胞表位源自同种异体抗原，包括源自主要组织相容性I型或II型决定簇、次要组织相容性复合物或组织相关的抗原的任何肽或多肽。所述肽或多肽可涉及细胞或实体器官的排斥。细胞移植物包括脐带血细胞移植物、干细胞移植物或胰腺胰岛细胞移植物。实体器官移植物包括肾、肺、心、肝、胰、骨、皮肤或软组织。
在具体的实施方式中，所述NKT细胞表位源自用于基因治疗或基因疫苗接种的病毒载体，包括RNA病毒(γ-逆转录病毒和慢病毒)或DNA病毒(腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和痘病毒)的任何肽或多肽。
由本发明的免疫原性肽引发并激活的NKT细胞甚至能由于复合抗原而抑制发病。激活所述细胞的最低要求是，识别由CD1d分子呈递的关联肽，导致杀伤载有病原体的细胞或杀伤呈递所述自体抗原、同种异体因子或变应原的APC，或杀伤肿瘤细胞，或杀伤呈递所述同种异体抗原的APC或呈递源自病毒载体的抗原的APC。
在所有上述情况中，所述免疫原性肽激活细胞因子(例如IFN-γ)生成，所述细胞因子能激活包括CD4+T细胞和CD8+T细胞在内的其它效应细胞。CD4+和CD8+T细胞皆能参与消除呈递所述胞内病原体、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤抗原、同种异体抗原或源自病毒载体的抗原的细胞。
在对象内存在多于一种抗原的情况中，由于所述抗原可能被不同APC摄取，所以相同的APC可能不呈递所有相关抗原。因此预计两种或多种免疫原性肽的组合可用于预防或治疗疾病。本领域技术人员应清楚了解，可以考虑所述免疫原性肽的任何组合。所述组合的例子包括用以抑制抗同种异体因子(例如凝固途径的因子VIII)的抗体生成的肽，以及用于抑制针对基因治疗A型血友病(无功能性因子VIII)所用病毒载体的免疫应答的肽。其它例子包括病原体例如HIV感染和分枝杆菌感染的组合。
用于本发明内容的免疫原性肽通过本领域技术人员已知的方法鉴定。在一个优选实施方式中，可鉴定含有一般序列[FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY]的肽。所述肽通过本领域技术人员已知的方法使用在线可用算法鉴定。例如，肽可以通过在下方网站输入序列来鉴定。
http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/
然后，肽可以通过使用例如本领域熟知的Fmoc固相合成法合成而生成。
然而，本文提供的一般序列应视作指示肽含有CD1d结合基序。然后，应在体外测试所述肽和NKT细胞的反应性。为此，制备来自动物或人来源的CD1d+APC。然后，使所述细胞和所述感兴趣的肽以及一种NKT细胞来源一起孵育。后者的活化可通过增殖、生成细胞因子(例如IFN-γ和IL-4和表面标志物)来鉴定。这些方法都是本领域公知的。此外，所述CD1d分子的四聚体可在装载本发明的肽之后使用，以检测对所述肽特异的NKT细胞。一个可能是使用荧光标记的四聚体，并使用荧光分选系统(facs)检测。
本发明的免疫原性肽可使用表达系统例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，通过重组技术生成。
按照本发明，考虑药物用于治疗胞内病原体感染，用于治疗自体免疫性疾病、针对同种异体或变应原的免疫应答，用于治疗肿瘤，治疗移植排斥，或治疗针对基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的免疫应答。在许多这些情况中，所述治疗可考虑作为预防性治疗。本发明的药物通常(尽管非必需)是(药物)制剂，所述制剂包括作为活性成分的至少一种本发明免疫原性肽、用于所述免疫原性肽的NKT细胞群或能够表达所述免疫原性肽的基因治疗载体。除了所述一种或多种活性成分之外，所述制剂还包括至少一种(药学上可接受的)稀释剂、运载体或佐剂。具体而言，本发明的药物组合物是用于预防或治疗应用的疫苗。
根据本发明，考虑药物用于治疗自体免疫性疾病，治疗针对同种异体因子的免疫应答，治疗变应性疾病，治疗肿瘤，治疗移植排斥以及治疗针对基因治疗和基因疫苗接种所用病毒载体引发的免疫应答。
因此，本发明涉及免疫原性肽，其包含病原体相关抗原、自体抗原、变应原、同种异体因子、肿瘤抗原、脱落自移植物或源自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原的至少一个NKT细胞表位，所述表位与硫醇还原酶基序序列[CST]-XX-[CST]偶联。
所述基序中的氨基末端半胱氨酸对靶蛋白上的二硫桥发动亲核攻击。所述二硫桥被还原，并与所述基序的第二个半胱氨酸交换电子，释放出还原形式的靶蛋白，随后所述靶蛋白异构化和/或异二聚化。在一些情况中，异二聚化可以通过与不同蛋白质交换电子而出现。最终结果是靶蛋白构象改变(异构化)或二聚体或更高级多聚体的形成。本文提供该机制作为例子，不意在构成任何限制。
所述NKT细胞表位和所述硫醇还原酶基序可选地由接头序列分隔。在另一个可选的实施方式中，所述免疫原性肽另外包括内体靶序列(例如，晚期内体靶序列)和/或额外的“侧接”序列。
如进一步详细解释，本发明的免疫原性肽可以通过化学合成来生成，其允许掺入非自然氨基酸。因此，所述硫醇还原酶基序的半胱氨酸残基可由带有硫醇基团的其它氨基酸替代，例如巯基缬氨酸、高半胱氨酸，或具有硫醇功能的其它天然或非天然氨基酸。为了具有还原活性，半胱氨酸残基应不作为半胱氨酸二硫桥的部分出现。不过，半胱氨酸残基可以(例如通过甲基化)被修饰，由于甲基化的半胱氨酸在体内转换为含游离硫醇基团的半胱氨酸。
本发明的免疫原性肽中包含上述硫醇还原酶基序，所述基序如下定位，从而当所述表位适合进入CD1d槽中时，所述基序保留在CD1d结合槽的外部。所述基序的位置直接毗邻所述肽内的毗邻所述表位序列，或与所述T细胞表位由一个接头隔开。更具体地，所述接头包括7个或更少氨基酸的氨基酸序列。最具体地，所述接头包含1、2、3或4个氨基酸。在所述基序毗邻所述表位序列的本发明所述肽的那些具体实施方式中，这毗邻表示为相较所述表位序列的P-4～P-1或P+1～P+4位。除肽接头以外，可使用其它有机化合物作为接头来使所述免疫原性肽部分相互连接。
在本发明的具体实施方式中，所述免疫原性肽内的硫醇还原酶基序位于所述表位的N-末端。
如上所述，本发明所述的免疫原性肽除硫醇还原酶基序以外还包含源自病原体相关抗原、自体或同种异体因子、变应原、肿瘤源性抗原、脱落自移植物的抗原或获自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原的NKT细胞表位。蛋白质序列中的NKT细胞表位可通过功能性实验和/或一种或多种模拟预测实验来鉴定。NKT细胞表位序列中的氨基酸根据其在CD1d蛋白的结合槽中的位置来编号。在具体的实施方式中，本发明肽内存在的所述NKT细胞表位由7～25个氨基酸组成，然而更具体地，由7～16个氨基酸组成，然而最具体地，由7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸组成。在一个更具体的实施方式中，所述NKT细胞表位由7个氨基酸的序列组成。在另一个具体的实施方式中，所述NKT细胞表位是由CD1d分子向NKT细胞呈递的表位。在本发明的具体实施方式中，所述NKT细胞表位序列是匹配进入CD1d蛋白裂缝的序列，更具体地，是匹配进入CD1d裂缝的7个氨基酸的肽。本发明免疫原性肽的NKT细胞表位可以对应蛋白质的天然表位序列，或者可以是其修饰形式，前提是修饰的NKT细胞表位与天然NKT细胞表位序列相似，保留其在CD1d裂缝内结合的能力。修饰的NKT细胞表位就CD1d蛋白而言可具有与天然表位相同的结合亲和性，但也可以具有较低亲和性。在具体的实施方式中，经修饰肽的结合亲和性相较原始肽降低不小于10倍，更优选降低不小于5倍。本发明发现，本发明的肽具有稳定蛋白复合物的作用。因此，所述肽-CD1d复合物的稳定作用补偿了所述经修饰表位与CD1d分子的亲和性降低。
在具体的实施方式中，本发明的免疫原性肽还包括便于所述肽被摄取进入(次级)内体以加工并在CD1d决定簇内呈递的氨基酸序列(或其他有机化合物)。所述晚期内体的靶向由蛋白质的胞质尾内存在的信号介导，并对应良好鉴定的肽基序，例如基于双亮氨酸的基序[DE]XXXL[LI]或DXXLL基序(例如DXXXLL)、基于酪氨酸的YXX
Figure BDA00003244161900221
基序或所谓酸性簇基序。所述标志
Figure BDA00003244161900222
代表具有大体积疏水侧链(例如Phe、Tyr和Trp)的氨基酸残基。所述晚期内体靶向序列允许加工以及由CD1d分子有效呈递抗原源性T细胞表位。所述内体靶向系列包含在(例如)gp75蛋白、(Vijayasaradhi等.(1995)J Cell Biol130,807-820)、人CD3γ蛋白、HLA-BMβ(Copier等.(1996)J.Immunol.157,1017-1027)、DEC205受体的胞质尾(Mahnke等.(2000)J Cell Biol151,673-683)的内部。作为内体分选信号的肽的其它例子公开于Bonifacio和Traub(2003)Annu.Rev.Biochem.72,395-447的综述。或者，所述序列可以是源自蛋白质的亚优势或次要T细胞表位序列，其促进晚期内体中的摄入，而不需要克服针对以下的NKT细胞响应：病原体相关来源的NKT细胞表位、自体或同种异体因子来源的NKT细胞表位、变应原来源的NKT细胞表位、肿瘤抗原来源的NKT细胞表位，或源自移植物脱落的同种异体抗原或来自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原的NKT细胞表位。
在另一个具体实施方式中，本发明的免疫原性肽是包含NKT细胞表位的肽，其在天然序列中不包含硫醇还原酶基序。然而，在另一个实施方式中，与CD1d裂缝结合的NKT细胞表位可以包含其表位序列内的硫醇-氧化还原酶基序，例如本文所述；包含所述NKT细胞表位的本发明所述免疫原性肽还必须包含另一个N-或C-末端与所述表位偶联(毗邻或由一个接头隔开)的游离硫醇-氧化还原酶基序，从而所述连接的残基能确保还原活性(与所述表位中存在的埋入所述裂缝内的硫醇-氧化还原酶基序相反)。
本发明的另一个方面涉及用于生成本文所述免疫原性肽的方法。所述方法包括鉴定来自病原体相关抗原、来自自体抗原或感兴趣的同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、脱落自移植物的同种异体抗原或源自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原的NKT细胞表位。用于体外和计算机模拟鉴定NKT细胞表位的方法是本技术领域熟知的，此后就一些方面详细阐述。所述方法还包括生成本发明的免疫原性肽，包括鉴定的NKT细胞表位和硫醇还原酶基序(含或不含接头)、侧接序列或内体靶向序列。接着评估所生成的免疫原性肽针对病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤源性抗原、脱落自移植物的同种异体抗原或源自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原诱导CD4+NKT细胞的能力。
本发明所述的免疫原性肽由病原体相关抗原，或自体抗原，或同种异体因子，或变应原，或肿瘤，或同种异体抗原，或基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的NKT细胞表位开始生成。
具体地，所用NKT细胞表位可以是优势NKT细胞表位。来自病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤源性抗原、脱落自移植物的同种异体抗原或源自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原以用于本发明内容的NKT细胞表位的鉴定和选择为本领域技术人员已知。例如，分离自病原体相关抗原、自体抗原或同种异体因子、变应原、肿瘤源性抗原、脱离自移植物的同种异体抗原或源自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原的肽序列通过例如T细胞生物技术来测试，以测定所述肽序列是否引起NKT细胞响应。发现引起NKT细胞响应的那些肽序列被界定为具有NKT细胞刺激活性。人NKT细胞刺激活性还可通过以下方法测试：培养获自个体的对病原体相关抗原、自体抗原或同种异体因子、变应原、肿瘤源性抗原、脱落自移植物的同种异体抗原或源自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原敏感的NKT细胞以及源自所述抗原的肽/表位，并测定NKT细胞的增殖是否显示对所检测肽/表位的响应，例如，通过氚化胸腺嘧啶的细胞摄取来测定。NKT细胞对肽/表位响应的刺激指数可以由响应肽/表位的最大CPM除以对照CPM来计算。等于所述背景水平或大于其两倍的NKT细胞刺激指数(S.I.)被认为是“阳性”的。使用阳性结果来计算就测试肽/表位组而言各肽/表位的平均刺激指数。还能可选地测试非天然(或修饰的)NKT细胞表位结合CD1d分子的能力。非天然(或修饰的)NKT细胞表位对CD1d分子的结合可以不同方式实行。例如，可溶性CD1d分子可获取并通过合成或化学偶联制成四聚体。所述CD1d分子通过亲和色谱纯化。可溶性CD1d分子与根据其对该CD1d分子的强结合亲和性生成的经生物素标记参比肽一起孵育。然后，待评估CD1d结合性的肽以不同浓度孵育，而其将所述参比肽从CD1d结合中置换出来的能力通过添加中性链亲和素来计算。方法可参见例如Texier等,(2000)J.Immunology164,3177-3184)。本发明免疫原性肽的平均NKT细胞刺激指数大于或等于2.0。NKT细胞刺激指数大于或等于2.0的免疫原性肽被认为可用作预防或治疗试剂。更具体地，本发明免疫原性肽的平均NKT细胞刺激指数是至少2.5，至少3.5，至少4.0或甚至至少5.0。此外，所述肽通常具有的阳性指数(P.I.)是至少约100，至少150，至少约200或至少约250。在对病毒载体抗原敏感的个体群中(例如，至少9个个体，至少16个个体或至少29或30个个体或更多)，所述个体含有响应所述肽的NKT细胞(从而对应于SI乘以所述肽/表位的混杂特性)，肽的阳性指数通过使平均NKT细胞刺激指数乘以个体百分数来测定。因此，所述阳性指数既代表NKT细胞响应肽(S.I.)的强度，也代表NKT细胞在对病毒载体抗原敏感的个体群中响应肽的频率。为了通过例如精细制图技术测定最优NKT细胞表位，具有T细胞刺激活性且因而包含如T细胞生物技术所测至少一个T细胞表位的肽通过在所述肽的N-或C-末端添加或删除氨基酸残基进行修饰和测试，以测定NKT细胞对所述修饰肽的反应性变化。若发现两种或多种共有天然蛋白序列中重叠区域的肽具有人NKT细胞刺激活性，如T细胞生物技术所测定，可以生成包含所有或部分所述肽的额外肽，并且这些额外的肽可通过类似的方法测试。按照该技术选择并通过重组或合成生成肽。NKT细胞表位或肽的选择基于多种因素，包括NKT细胞对所述肽/表位响应的强度(例如，刺激指数)以及所述NKT细胞在个体群中对所述肽响应的频率。
用于鉴定来自自体抗原或同种异体因子、变应原、肿瘤源性抗原、由移植物脱落的同种异体抗原或源自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原的病原体相关抗原的方法为本领域已知。因此，可以使用阳性克隆或表达克隆策略来鉴定候选抗原。为了完全描述该方法，参见例如Mendoza等,Immunity,7:461-472,1997。或者，CD1d分子中由APC实际呈递的肽可以通过各种色谱方法洗脱并分离。对所述方法的完全描述可参见Scott等,Immunity,12:711-720,2000。候选抗原可以通过一种或多种体外算法筛选，以鉴定抗原蛋白内的NKT细胞表位序列。合适的算法包括但不限于在下列网站发现的那些算法：
http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/
更具体地，所述算法能预测抗原蛋白内匹配进入CD1d分子槽的一条或多条肽序列。
本发明的免疫原性肽可以在例如细菌细胞(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母细胞(例如，毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、昆虫细胞(例如，来自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、植物细胞或哺乳动物细胞(例如，CHO、COS细胞)中通过重组表达来生成。因而获得的合适表达载体的构建(包括其它信息例如启动子和终止序列)涉及当时标准的重组DNA技术。重组生成的本发明免疫原性肽可源自较大前体蛋白，例如，通过酶促切割在毗邻所述免疫原性肽N-和/或C-末端插入的酶切割位点，然后进行合适的纯化。
由于本发明免疫原性肽的长度受限，其可以通过化学肽合成来制备，其中，通过使不同的氨基酸相互偶联来制备肽。化学合成特别适合内含例如D-氨基酸、含有非天然产生侧链的氨基酸或含有经修饰侧链的氨基酸例如甲基化半胱氨酸。已详细描述化学肽合成方法，肽可以购自例如应用生物公司(Applied Biosystems)和其它公司。肽合成能以固相肽合成(SPPS)方式或与之相反的溶液相肽合成方式来实行。最有名的SPPS方法是t-Boc和Fmoc固相化学法，所述方法为本领域技术人员熟知。此外，如Kent最初描述的(Schnolzer和Kent(1992)Int.J.Pept.Protein Res.40,180-193)和例如Tam等人综述的(Tam等.(2001)Biopolymers60,194-205)，使用连接策略可以使肽彼此相连以形成较长的肽(化学选择性偶联两个未保护肽段)。这为实现超越SPPS范围的蛋白合成提供了巨大潜力。许多大小为100～300残基的蛋白已通过该方法成功合成。由于在SPPS方面的巨大进步，合成肽持续地在生物化学、药理学、神经生物学、酶学和分子生物学中起到日益增加的重要作用。
检测感兴趣免疫原性肽的物理和化学性质(例如，溶解性、稳定性)以测定所述肽是否/是否会合适用于治疗性组合物。通常，通过调整所述肽的序列来最优化。可选地，可在合成后使用本领域已知的技术修饰所述肽(化学修饰，例如，添加/删除官能团)。
因此，本发明的另一个方面提供用于体内或体外(离体)生成病原体相关的抗原特异性CD4+NKT细胞，或自体抗原特异性或同种异体因子特异性CD4+NKT细胞、或变应原特异性CD4+NKT细胞，或肿瘤抗原特异性CD4+NKT细胞、或脱落自移植物的同种异体抗原特异性CD4+NKT细胞，或基因治疗或基因疫苗接种所用病毒蛋白的抗原特异性CD4+NKT细胞的方法。具体而言，所述NKT细胞对呈递所述抗原的任何细胞以强增殖性质响应，并且能以细胞群形式获得。此外，具体地，所述NKT细胞对呈递自体或同种异体抗原、变应原、脱落自移植物或源自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒蛋白的抗原的任何细胞以强抑制性质响应，并且能以细胞群形式获得。
本发明涵盖通过本文所述方法可获得的所述抗原特异性CD4+NKT细胞(群)。
在一个实施方式中，所提供的方法包括分离外周血细胞，通过使本发明所述免疫原性肽接触所述分离的外周血细胞而在体外刺激所述细胞群，以及扩增所述经刺激的细胞群，更具体地，在IL-2或IL-15和IL-7存在下扩增。本发明所述的方法具有以下优势：生成较高数量的CD4+NKT细胞，所述生成的细胞可特异于病原体相关抗原，或自体或同种异体抗原、变应原、肿瘤相关抗原、脱落自移植物的抗原或来自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒蛋白的抗原(通过使用含有抗原特异性表位的肽)。
在另一个实施方式中，CD4+NKT细胞可以在体内生成，即，通过向对象给予本文提供的免疫原性肽，并收集在体内生成的CD4+NKT细胞。
通过上述方法可得的病原体相关抗原特异性CD4+NKT细胞受到特别关注以作为药物用于在对象内预防与病毒、细菌或寄生虫感染相关的发病和/或死亡。通过上述方法可得的自体抗原或同种异体因子特异性CD4+NKT细胞受到特别关注以作为药物用于抑制与自体免疫性疾病或针对同种异体因子的反应相关的发病和/或死亡。通过上述方法可得的变应原特异性CD4+NKT细胞受到特别关注以作为药物用于抑制与变应性疾病相关的发病和/或死亡。通过上述方法可得的肿瘤抗原特异性CD4+NKT细胞受到特别关注以作为药物用于抑制与肿瘤相关的发病和/或死亡。通过上述方法可得的移植物同种异体抗原特异性CD4+NKT细胞受到特别关注以用于预防移植排斥。通过上述方法可得的病毒蛋白特异性CD4+NKT细胞受到特别关注以作为药物用于抑制与基因治疗或基因疫苗接种相关的发病和/或死亡。
对于本发明免疫原性肽的任何上述应用，所述肽可以由所述CD4+NKT细胞替代。既考虑同种异体基因又考虑自体细胞的应用。包括向需要的对象给予所述抗原特异性CD4+NKT细胞的任何方法(例如，用于预防与胞内病原体感染相关的患病，预防或治疗与自体免疫性疾病、针对同种异体因子的反应、变应原接触、肿瘤、移植排斥和针对病毒载体抗原的反应相关的发病)都是本发明的一部分。
本发明还涉及编码本发明免疫原性肽的核酸序列，以及其应用方法，例如，用于重组表达或基因治疗。具体而言，所述核酸序列能够表达本发明的免疫原性肽。
可以通过使用任何合适的基因治疗方法向需要的对象给予本发明免疫原性肽。在本发明用于预防与病原体相关的发病/死亡或者用于抑制针对自体抗原或同种异体因子的免疫响应的任何应用或方法中，采用本发明免疫原性肽的免疫可以与过继细胞转移联用。在联用时，所述免疫、过继细胞转移和基因治疗可以同时使用，或以任何可能的组合依次使用。
在基因治疗中，编码所述免疫原性肽的重组核酸分子可以裸露DNA或以脂质体或用于递送至靶细胞的其它脂质系统形式使用。用于直接转移质粒DNA进入细胞的其它方法为人基因治疗应用领域的技术人员熟知，并且涉及通过复合所述质粒DNA至蛋白来使所述DNA靶向细胞上的受体。以其最简单形式，基因转移可以用微注射方法通过简单注射微量DNA进入细胞核来实行。一旦重组基因被引入细胞，它们能够被转录和翻译的细胞常规机制识别，从而会表达基因产物。也有其它方法试图将DNA引入更大数量的细胞。这些方法包括：转染，其中DNA用磷酸钙沉淀，并通过胞饮被摄入细胞；电穿孔，其中细胞暴露于大电压脉冲以将孔引入膜；脂质转染/脂质体融合,其中DNA包装进入亲脂小泡，其与靶细胞融合；以及使用结合至小射弹的DNA的粒子轰击。用于将DNA引入细胞的另一个方法是使所述DNA与化学修饰的蛋白偶联。腺病毒蛋白能够打破内体的稳定从而增强摄取DNA进入细胞。将腺病毒混合至含有DNA复合物的溶液，或者使用大幅促进所述重组基因摄取和表达的蛋白交联剂使DNA结合共价连接腺病毒的聚赖氨酸。腺相关病毒载体也可用于递送基因进入血管细胞。本文所用的“基因转移”指将外源核酸分子引入细胞的过程，其常规进行以使由所述基因编码的特定产物得以表达。所述产物可包括蛋白、多肽、反义DNA或RNA，或者酶活性RNA。基因转移可以在培养的细胞中或通过直接给予哺乳动物来实行。在另一个实施方式中，提供含有编码本发明所述免疫原性肽的核酸分子序列的载体。在具体的实施方式中，生成所述载体从而所述核酸分子序列仅在特定组织中表达。实现组织特异性基因表达的方法为本领域熟知，例如，通过将编码本发明免疫原性肽的序列置于启动子控制下，所述启动子指导所述肽在一种或多种组织或器官中特异性表达。源自病毒的表达载体可以用于递送编码本发明所述肽及其同源物或衍生物的核苷序列(例如，cDNA)进入靶标组织或细胞群，所述病毒例如反转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、RNA病毒或牛乳头状瘤病毒。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建含有所述编码序列的重组病毒载体。或者，可以在基因治疗中使用含有编码本发明所述免疫原性肽的核酸分子的工程细胞。
本领域技术人员应该清楚了解，用于基因治疗的肽或多肽可以是获得所述肽或多肽的全抗原一部分。
当通过基因转移确保给予一种或多种本发明所述的肽时(即，给予的核酸在给予后确保表达本发明所述的肽)，所述核酸的合适剂量可以基于所引入核酸最终表达的肽量来确定。
本发明的药物通常但不必须是(药物)制剂，所述制剂包括作为活性成分的至少一种本发明免疫原性肽、所述免疫原性肽的CD4+NKT细胞(群)或能够表达所述免疫原性肽的基因治疗载体。除了所述一种或多种活性成分之外，所述制剂还包括至少一种(药学上可接受的)稀释剂、运载体或佐剂。通常，药学上可接受的化合物(例如，稀释剂、运载体和佐剂)可参见例如Pharmacopeia handbook(《药典手册》)(例如，美国、欧洲或国际药典)。本发明的药物或药物组合物常规上包含(预防或治疗上)有效量的一种或多种活性成分，其中，所述有效性与待预防或治疗的病症和疾病相关。具体而言，本发明的药物组合物是用于预防或治疗应用的疫苗。
本发明的药物或药物组合物可能需要作为包含多次给予所述药物或组合物的预防性或治疗性方案一部分给予需要的对象。所述多次给药通常依次进行，而两次给药之间的时间间隔可不同，且可根据所述活性成分的性质和待预防或治疗的病症性质予以调整。在单次给药中给予需要对象的活性成分量也可以不同，且将取决于例如所述对象的身体状况(例如，体重、年龄)、待预防或治疗的病症状况以及实施治疗的医生、医师或护士的经验等因素。
所述术语“稀释剂”指例如生理盐水溶液。所述术语“佐剂”通常指药理学或免疫学试剂，所述试剂改变(优选增加)其它试剂(例如药物、疫苗)的作用，然而其在自身给予时几乎没有任何直接作用(如果有)。作为一个例子给予佐剂氢氧化铝(明矾)，该佐剂能吸附本发明的免疫原性肽。此外，本领域已知许多其它佐剂且可使用,前提是其促进CD1d中的肽呈递和NKT细胞激活。所述术语“药学上可接受的运载体”指配制所述活性成分的任何材料或物质以促进其应用或(例如通过溶解、分散或扩散所述成分)散布至待治疗位置和/或在不影响其有效性的情况下促进其储存、运输或操作。其包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌试剂(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等渗剂(例如糖或氯化钠)等。可以包括其它的成分以控制所述组合物中活性成分作用的持续时间。所述药学上可接受的运载体可以是固体或液体或已压缩形成液体的气体，即，本发明的组合物可适于用作浓缩剂、乳剂、溶液、颗粒、粉尘、喷雾、气溶胶、混悬液、软膏、乳膏、片剂、丸剂或粉末使用。用于所述药物组合物和其制剂的合适药物运载体为本领域技术人员熟知，其在本发明范围内的选择没有特殊限定。其还可包括添加剂例如湿润剂、分散剂、黏着剂、粘合剂、乳化剂、溶剂、包衣、抗细菌和抗真菌试剂(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等渗剂(例如糖或氯化钠)等，只要与药学实践一致,即，对哺乳动物不产生永久损伤的运载载体或添加剂。本发明的药物组合物能以任何已知的方式制备，例如，通过一步或多步程序，用所选载体材料和(若合适)其它添加剂例如表面活性剂均质混合、包覆和/或磨碎所述活性成分。本发明的药物组合物还可通过微粉化来制备，例如以获得其微球体形式(直径通常是1～10μm)，即制造用于控制或持续释放所述活性成分的微胶囊。
本发明所述的免疫原性肽及其同源物或衍生物(及其生理学上可接受的盐或药物组合物皆包含于所述术语“活性成分”)可以通过任何适于待预防或治疗病症和适合所述化合物(在此是免疫原性蛋白质)的途径给予。可能的途径包括区域性、全身性、口服(固体形式或吸入)、直肠、鼻腔、局部(包括眼部、口颊和舌下)、阴道和胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)。给药的优选途径可以随例如受体的状况或随待预防或治疗的病症而变化。
所述制剂可以作为单位剂型方便地提供，且可通过药学领域熟知的任何方法制造。本发明适于口服给药的制剂可以是各种含有预定量活性成分的独立单位形式，例如胶囊、扁胶囊或片剂；粉末或颗粒；溶于水性液体或非水性液体的溶液或悬液；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。该活性成分也可制成大丸剂、药糖剂或糊剂。片剂可以通过与任选的一种或多种辅助成份压缩或模塑来制作。制备压缩片剂可通过在合适的机器中压缩诸如粉末或颗粒等自由流动形式的活性成份,任选与粘结剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。制备模塑片剂可通过在合适的机器中对用惰性液态稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物进行模塑。片剂可任选地包衣或刻痕，并可配制成能够缓释或控释其中活性成分。
本发明的另一个方面涉及分离的免疫原性肽,所述肽包含源自病原体相关抗原、自体抗原或同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、脱落自移植物的同种异体抗原或来自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒的抗原的NKT细胞表位，毗邻所述NKT细胞表位或与所述NKT细胞表位由一个接头隔开的硫醇还原酶基序。
用于基因治疗或基因疫苗接种目的的病毒载体对通过重组核酸技术进行修饰是高度适宜的。根据上文，技术人员能进一步方便考虑修饰所述病毒载体NKT细胞表位以应用于所述免疫原性肽，而其根据本发明所述的应用可以病毒载体本身直接引入。如此，用免疫原性肽接种可能变得多余,所述免疫原性肽包含病原体相关抗原、自体抗原或同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、来自移植物的同种异体抗原或基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原的NKT细胞表位，以及硫醇还原酶基序(和/或对应的基因疫苗接种和/或对应的过继细胞转移)，因为采用修饰的病毒载体可以获得相同的有利效果。因此，本发明还包括修饰的病毒载体，其定义为分离的病毒载体，其特征在于，至少一种所述病毒载体蛋白中存在的至少一个NKT细胞表位通过在所述病毒载体蛋白内毗邻所述NKT细胞表位或与所述NKT细胞表位由一个接头隔开处插入硫醇还原酶基序而修饰。在又一个实施方式中，所述病毒载体还具有以下特征：所述修饰的NKT细胞表位能够被CD1d分子呈递。在另一个实施方式中，所述分离的病毒载体还具有以下特征：其细胞转导性质相较于未携带所述NKT细胞表位修饰的相同病毒载体没有显著变化。
本发明现将通过以下实施例来说明，提供以下实施例但不意在构成任何限制。此外，本文所述的所有参考文献通过引用明确纳入本文。
实施例
实施例1
通过用含有CD1d限制性T细胞表位和侧接残基内的硫醇还原酶基序的肽免疫来控制因子VIII特异性II型限制性CD4+T细胞的活化
用50μg肽2196对BALB/c因子VIII KO小鼠(组A)免疫四次(间隔一周)，所述肽2196含有CD1d限制性NKT细胞表位和侧接残基(SEQ ID1)内的C-XX-C硫醇还原酶基序。
SEQ ID1:CGH CGG FTN MFA TWS PSK
然后，通过皮下途径使用10IU/注射来注射人因子VIII五次(间隔一周)。在最后一次免疫后10天处死小鼠，并通过磁性细胞分选制备脾CD4+T细胞。用所述免疫原性肽和FVIII体外刺激所述细胞两次，然后通过测量IL-4和IFN-γ生成来评估其活化状态。按相同方法(但不接受肽疫苗)处理对照组(B)。
结果(图1)显示由从用所述肽免疫的小鼠所获取因子VIII特异性CD4+T细胞的IL-4生成比对照组减少了10倍，而IFN-γ生成减少了7倍。
结果显示为平均值+SEM。
实施例2
用含有CD1d限制性NKT细胞表位和硫醇还原酶基序的肽免疫来抑制抗Ad5IgG抗体反应
通过以1周间隔四次皮下注射含50μg SEQ ID2肽的明矾来免疫C57BL/6小鼠(n=6)。
SEQ ID2:CHG CGG FIGLMYY
所述肽含有腺病毒5(Ad5)的六邻体蛋白的CD1d限制性NKT细胞表位和侧接残基中的硫醇还原酶基序。对照组(n=6)的小鼠接受含生理血清的明矾，而不是肽。然后，所有小鼠通过IV途径接受两次109Ad5病毒颗粒注射，每次间隔一周。在最后一次Ad5注射后10天，对小鼠放血并通过直接结合ELISA检测针对Ad5颗粒的总IgG抗体浓度。简言之，使Ad5病毒颗粒在聚苯乙烯板上不溶解，然后用稀释的小鼠血清洗并孵育。第二次清洗后，通过添加山羊抗小鼠IgG血清检测小鼠抗Ad5抗体的结合。用肽预处理的小鼠(黑色柱状图；图2)不产生显著量的抗体，同时未免疫小鼠(空心柱状)在第二次Ad5注射后产生活跃的响应。
结果以任意单位通过平均+SEM形式给出。
**表示显著性为p<0.001。
实施例3
通过使用包括含硫醇还原酶基序的CD1d限制性NKT表位的肽免疫小鼠引起CD4+NKT细胞，诱导肿瘤细胞凋亡
通过以1周间隔四次皮下注射含50μg SEQ ID3肽的明矾来免疫C57BL/6小鼠(n=6)。
SEQ ID3:CGH CGG FDKLPGF
所述肽含有源于卵清蛋白的CD1d限制性NKT细胞表位和侧接残基中的硫醇还原酶基序。对照组(n=6)的小鼠接受含生理血清的明矾，而不是肽。在最后一次免疫后10天处死小鼠，并通过磁性细胞分选制备脾CD4+T细胞。用所述免疫肽体外刺激所述细胞两次，然后通过测量IL-4和IFN-γ生成来评估其活化状态。
然后，体外测定CD4+NKT细胞系杀伤EG7肿瘤细胞的能力。EG7肿瘤细胞(H-2b)获自转导有ova结构的胸腺瘤。所述细胞中存在CD1d限制性ova表位，其已知不足以触发NKT活化和肿瘤细胞杀伤。
EG7细胞用1μM DiOC18(来自英杰公司(Invitrogen)的3,3'-双十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐)在膜水平标记。然后，在NKT细胞系存在下以比率1/1～1/5(EG7细胞相比NKT细胞)37°C孵育EG7细胞(1x105/孔)18h。用装载了SEQ ID3肽的抗原呈递细胞首次体外刺激所述NKT细胞系4h。18h之后，收获细胞并按生产商说明书(凋亡检测试剂盒；BD生物科学公司(BD Biosciences))用Annexin V和7-AAD染色，并在FACSCantoII流式细胞仪(BD生物科学公司(BD Biosciences))上分析。
结果显示，与获自用SEQ ID3肽免疫小鼠的NKT细胞系一起孵育的EG7细胞经诱导凋亡，而与获自接受生理血清而不是肽的对照小鼠的NKT细胞一起孵育的EG7细胞没有诱导显著程度的肿瘤细胞凋亡。
实施例4
使用CD1d分子四聚体来检测MOG特异性CD4+NKT淋巴瘤细胞
多发性硬化是慢性脱髓鞘疾病，其中，针对自体抗原例如髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的CD4+NKT细胞可能具有关键作用。使用其实验等价物即模拟大多数人类疾病标志的EAE(实验性自体免疫脑脊髓炎)来理解发病机制并描述新型治疗。
因此，列举MOG特异性CD4+NKT细胞能预测疾病发生。
通过联合算法和上述功能性实验鉴定所述小鼠MOG蛋白中的CD1d结合表位，对应于序列200～206。
从C57BL/6小鼠的脾制备CD4+NKT细胞，其中已诱导EAE。首先使用磁珠从所述脾细胞悬液去除CD4(-)细胞。
按本领域已知方法制备CD1d分子(H-2b)的四聚体，所述四聚体包括荧光标签例如藻红素。
通过过夜孵育CGPCGGFLRVPCWKI(SEQ ID4)生成合成肽，所述肽包含CD1d限制性MOG NKT细胞表位和硫醇还原酶基序，SEQ ID4包含连接所述硫醇还原酶基序(CGPC)和所述CD1d结合基序的接头。
四聚体在室温下过夜加载SEQ ID4肽。然后，清洗加载的四聚体并在37°C与CD4+T细胞孵育2h。然后，用荧光活化细胞分选系统读取所述悬液，并评估对MOG肽特异的NKT细胞部分。
实施例5
通过用源自间变性淋巴瘤激酶(ALK)的CD1d限制性NKT细胞表位引起的NKT细胞直接杀伤H-2b肿瘤细胞(R113)
所述间变性淋巴瘤激酶是跨膜受体酪氨酸激酶，其在许多细胞的个体发育过程中表达，但仅在成年阶段的外胚层来源的肿瘤细胞上表达。因此，如动物模型和人肿瘤中所示，其被认为是与所有外胚层来源肿瘤直接相关的基因。例如，至多60%人乳腺癌表达ALK。可以获得并使小鼠来源的用ALK+肿瘤细胞系来评价本发明的ALK特异性溶细胞性CD4+T细胞是否能杀伤肿瘤细胞。
获自首次接受试验小鼠的脾的CD4T细胞(C57BL/6，H-2b背景)用载有ALK的CD1d限制性NKT细胞表位的自体树突细胞刺激四次，所述ALK在侧接残基内添加了CxxC形式的硫醇还原酶基序。(SEQ ID5:CHGCGGWLQIVTWWGPGS的肽(硫醇还原酶基序有下划线，两个甘氨酸用作所述基序和所述CD1d限制性表位间的接头))。
由于NKT细胞本身具有溶细胞活性，我们在平行实验中包括通过接触天然序列内相同CD1d限制性NKT表位(没有硫醇氧还蛋白基序(WLQIVTWWGPGS))而被刺激的细胞。
在最后一次刺激后10天，CD4T细胞经清洗并添加至含有比例为2/1(CD4与肿瘤细胞)的104R113肿瘤细胞的细胞培养微孔板。R113是获自C57BL/6小鼠的肿瘤B细胞系，其组成型表达ALK。
共培养20h后，用作为细胞凋亡标志的Annexin V结合来评价R113细胞。
图3显示，在用序列1的肽培养NKT细胞时，肿瘤细胞的死亡(18%；居中柱状图)相较单独培养的肿瘤细胞(3.8%；左侧柱状图)增长4.5倍。如所预料，通过与CD1d和天然序列中肽的关联相互作用而激活的NKT细胞显示中等%的细胞死亡(11%，右侧柱状图)。平均值±SD(三重实验)。
因此得出以下结论：
(1)肽可以在CD1d决定簇环境中呈递；
(2)通过接触由CD1d限制性表位关联识别激活所得的NKT细胞可诱导真肿瘤细胞凋亡；
(3)当NKT细胞通过接触侧接残基内含有硫醇还原酶基序的CD1d限制性NKT细胞表位而激活时，有显著较大比例的肿瘤细胞经诱导凋亡。
在第二个实验中，从首次接受试验小鼠的脾获得来自另一个遗传背景的未处理CD4T细胞(BALB/c小鼠，H-2d背景)，所述细胞用载有SEQ ID5的自体树突细胞刺激四次。
如上所述，与BALB/c来源的ALK+肿瘤细胞系(VAC)进行共培养。通过由FACS评价Annexin-V结合来检测肿瘤细胞凋亡。
图4显示在序列1肽培养的NKT细胞存在下，肿瘤死亡(25%；居中柱状图)相较单独培养的肿瘤细胞(5.6%；左侧柱状图)或存在天然序列的肽时(15%；右侧柱状图)有显著增加。平均值±SD(三重实验)。
这些数据指示，当接触NKT细胞时，第二个不相关的肿瘤细胞系可被诱导进入凋亡，而在NKT细胞已经通过暴露于侧接残基内含有硫醇还原酶基序的CD1d限制性表位而受刺激时，该作用显著增加。
实施例6
通过使用含有CD1d结合和硫醇还原酶基序的肽的预免疫来防止EAE
EAE(实验自体免疫脑脊髓炎)是模型疾病，其中发生中枢神经系统脱髓鞘，这被认为是多发性硬化的实验等价物。少量自体抗原被认为参与引发和维持疾病，其中有MOG(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)。可以使用含有MOG氨基酸35～55的CD4+T细胞表位通过MOG免疫在C57BL/6小鼠内引发疾病。
MOG含有结合CD1d的序列并激活NKT细胞。因此，生成序列PHFLRVPCWKI的肽是通过合成和含有硫醇还原酶的序列CHGCGGFLRVPCWKI的肽(SEQ ID6的肽，其中硫醇还原酶基序带有下划线，在所述基序和CD1d结合基序之间有两个谷氨酸的接头)。
用SEQ ID6的肽或用天然序列的肽(作为对照)皮下免疫(50μg)C57BL/6小鼠组四次。在最后一次免疫后10天，通过皮下注射100μg MOG35-55肽/400μg乳酪分枝杆菌(Mycobacterium butyricum)(CFA中)并IP注射300ng百日咳博得氏杆菌(Bortetella pertussis)(NaCl中)来诱导所有小鼠患病，包括一组首次接受试验、未免疫动物。在+2天，给予第二次百日咳博得氏杆菌(B.pertussis)注射。
随时间跟踪EAE征兆。观察到用SEQ ID6肽预免疫的小鼠不发展出EAE，而首次接受试验的对照小鼠和用天然序列的肽预免疫的小鼠发展出显著疾病征兆。
实施例7
用GAD65衍生肽预防和抑制自发性胰岛素依赖型糖尿病
非肥胖糖尿病(NOD)小鼠构成自发性胰岛素依赖型糖尿病的合适动物模型。在所述动物中(如同在人类中)，在可见胰岛炎的时期观察到针对自体抗原谷氨酸脱羧酶(GAD65)的早期免疫应答，从中所述应答通过分子内和分子间扩散而延伸。通过向新生儿给予所述蛋白来诱导针对GAD65的免疫耐受可预防糖尿病发病。
GAD65包含能够结合CD1d的氨基酸序列。因此，通过合成生成对应于GAD65中氨基酸501～507的序列PQHTNVCFWFV，以及其在侧接残基中包含硫醇还原酶基序的对应物：SEQ ID7:CHGCGGHTNVCFWFV的肽(所述硫醇还原酶基序以下划线表示，在所述基序和CD1d结合基序间有2个甘氨酸的接头)。
雌性NOD小鼠从4周龄开始通过4次皮下注射SEQ ID7或天然序列的肽来免疫，相比未免疫组，所述各组中伴随血糖症。观察到用SEQ ID7的肽预免疫的NOD小鼠免于高血糖症，而用天然序列的肽处理的小鼠和未免疫动物在第14周后开始发展高血糖症。
实施例8
预防由暴露于变应原Der p1诱导的哮喘
来自室内尘螨的变应原屋尘螨(D.pteronyssinus)常常涉及过敏性哮喘。Der p1是屋尘螨(D.pteronyssinus)的主要变应原。Der p1的序列包含CD1d结合基序，对应于氨基酸序列38～44。通过合成生成序列WAFSGVAATES的肽及其包含硫醇还原酶基序的对应物。因此，SEQ ID8CGPCGGFSGVAATES的肽包含硫醇还原酶基序(下划线)和所述基序与CD1d结合基序间两个甘氨酸的接头。
过敏性哮喘可通过在BALB/c小鼠内连续三天经鼻滴注给予100μg Der p1来诱导。哮喘的特点是支气管高敏性和吸引嗜酸性粒细胞浸润肺。
BALB/c小鼠通过4次注射50μg SEQ ID8的肽或自然序列的肽(作为对照)来免疫。在最后一次免疫后10天通过经鼻滴注给予Der p1。可以观察到，用SEQ ID8的肽预免疫的小鼠对乙酰甲胆碱的吸入不发展出气道反应，并且使用嗜酸性粒细胞不显示肺浸润。

Claims (16)

1.一种源自抗原蛋白的分离的免疫原性肽，所述免疫原性肽包含人工序列，所述人工序列包含：
(1)所述抗原蛋白的自然杀伤T(NKT)细胞表位；和
(2)硫醇氧化还原酶基序，所述基序毗邻所述表位，或与所述表位由至多7个氨基酸的接头隔开；
条件是所述肽不是CGHCGGFTNMFATWSPSK。
2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述NKT细胞表位具有一般序列[FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY]，其中x代表任何氨基酸，且在P1位、P4位和P7位中可以存在任何所列的氨基酸。
3.如权利要求2所述的肽，其特征在于，所述NKT细胞表位具有一般序列[FW]-xx-[ILMV]-xx-[FW]。
4.如权利要求1～3所述的肽，其特征在于，所述硫醇氧化还原酶基序具有一般序列C-XX-C，其中X代表除酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸以外的任何氨基酸。
5.如权利要求1～4中任一项所述的肽，其特征在于，所述抗原蛋白是胞内病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤源性抗原、同种异体抗原或病毒载体抗原，所述胞内病原体相关抗原源自病毒、细菌、分枝杆菌或寄生虫，所述自体抗原是甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、TSH受体、胰岛素、谷氨酸脱羧酶、酪氨酸磷酸酶IA-2、热激蛋白HSP35、胰岛特异性葡萄糖6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、21-OH羟化酶、17-α羟化酶、组氨酸脱羧酶、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、H+/K+ATP酶内在因子、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白质(PLP)、乙酰胆碱受体、视黄醇结合蛋白、II型和IX型胶原、组织谷氨酰胺转移酶、pANCA组蛋白H1蛋白、热激蛋白(HSP60)、氧基-光密度脂蛋白(LDL)或突触核蛋白，所述同种异体因子是凝血因子或纤溶因子、激素、细胞因子或生长因子，或用于治疗目的的抗体，所述变应原是空气传播的变应原，包括源自室内尘螨、源自花粉或源自家养动物的那些变应原，食物变应原例如花生、卵清蛋白、谷类、水果和豆类变应原，或包括乳胶在内的接触性变应原，所述肿瘤相关的抗原是癌基因、原癌基因、病毒来源的蛋白质、存活因子或克隆型试剂例如独特型决定簇，所述同种异体抗原是主要组织相容性复合物、次要组织相容性复合物或组织相关的抗原，所述病毒载体抗原是源自腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、逆转录病毒或慢病毒。
6.如权利要求1～5所述的任何肽作为药物的应用。
7.如权利要求1～6所述的任何肽作为药物的应用，所述应用用于在哺乳动物内预防或治疗胞内病原体所致的感染、自体免疫性疾病、针对同种异体因子或变应原接触、肿瘤、同种异体移植排斥或基因治疗或基因疫苗接种所用的病毒载体的免疫应答。
8.如权利要求1～7所述的任何肽作为药物的应用，所述应用用于诱导哺乳动物NKT细胞活化。
9.如权利要求1～8中任一项所述的应用，其特征在于，所述免疫原性肽通过化学合成或通过重组表达生成，或其中所述免疫原性肽以编码序列核酸形式给予。
10.如权利要求1～9中任一项所述的应用，其特征在于，所述肽以核酸序列形式给予哺乳动物。
11.如权利要求1～5所述的任何肽在检测、制备和消耗CD4+T淋巴细胞中的应用。
12.一种用于制备能引起NKT细胞活化的抗原蛋白肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提供由所述抗原蛋白的NKT细胞表位组成的肽序列，和
(2)使所述肽序列连接包含基序C-XX-C的序列，从而所述基序和所述表位彼此毗邻或被至多7个氨基酸的接头隔开。
13.一种用于获得抗原特异性NKT细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
·提供外周血细胞
·使所述细胞体外接触免疫原性肽，所述免疫原性肽包含(1)NKT细胞表位，所述NKT细胞表位源自胞内病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、脱落自移植物的同种异体抗原或来自基因治疗或基因疫苗接种所用的病毒载体的抗原，和(2)C-XX-[CST]或[CST]-XX-C基序；和
·在IL-2或IL-15或IL-7存在下扩增所述细胞。
14.一种用于获得抗原特异性NKT细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
·提供免疫原性肽，所述免疫原性肽包含(1)NKT细胞表位，所述NKT细胞表位源自胞内病原体相关抗原、自体抗原、同种异体因子、变应原、肿瘤相关抗原、脱落自同种异体移植物的抗原或来自基因治疗或基因疫苗接种所用病毒载体的抗原，和(2)C-XX-[CST]或[CST]-XX-C基序；
·将所述免疫原性肽给予对象，和
·从所述对象获得所述抗原特异性NKT细胞的所述群。
15.一种可通过如权利要求13或14所述的方法获得的抗原特异性NKT细胞群。
16.如权利要求15所述的抗原特异性NKT细胞群作为药物的应用，所述应用用于预防或治疗所述病原体感染、预防或治疗自体免疫应答、针对同种异体因子的免疫反应或针对变应原的免疫应答，用于抑制肿瘤生长，用于预防同种异体移植排斥和用于预防或抑制针对基因治疗或基因疫苗接种所用病毒蛋白的免疫应答。
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