KR101902029B1 - 감염성 질환, 자가면역 질환, 동종인자에 대한 면역 반응, 알레르기 질환, 종양, 이식편 거부 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 면역원성 펩티드 - Google Patents

감염성 질환, 자가면역 질환, 동종인자에 대한 면역 반응, 알레르기 질환, 종양, 이식편 거부 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 면역원성 펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감염성 질환, 자가면역 질환, 동종인자의 투여에 대한 면역 반응, 알레르기 질환, 종양 요법, 이식편 거부의 예방 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 단백질에 대한 면역화의 예방에 사용하기 위한 활성 증가를 목적으로 CD4+ 자연 킬러 T (NKT) 세포에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 신규한 펩티드를 기술한다.

Description

감염성 질환, 자가면역 질환, 동종인자에 대한 면역 반응, 알레르기 질환, 종양, 이식편 거부 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 면역원성 펩티드 {IMMUNOGENIC PEPTIDES FOR USE IN THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF INFECTIOUS DISEASES, AUTOIMMUNE DISEASES, IMMUNE RESPONSES TO ALLOFACTORS, ALLERGIC DISEASES, TUMORS, GRAFT REJECTION AND IMMUNE RESPONSES AGAINST VIRAL VECTORS USED FOR GENE THERAPY OR GENE VACCINATION}
본 발명은 면역원성 펩티드, 및 감염성 질환, 자가면역 질환, 동종인자(allofactor)에 대한 면역 반응, 알레르기 질환, 종양, 이식편 거부 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 치료하는 데 있어서의 상기 펩티드의 용도에 관한 것이다.
특이적인 의약이 없기 때문에 포유동물의 많은 질환에 대한 요법에는 한계가 있다.
세포내 병원체에 의해 유발된 감염에서, 감염은 감염된 세포를 인식하고 제거하는 면역 반응이 불충분하기 때문에 계속된다. 많은 병원체들은 상기 병원체에 의해 침습을 받은 세포에서 분자, 예컨대 I형 주 조직적합성 복합체 (I형 MHC)의 표면 발현을 감소시켜, CD8+ 계통의 T 림프구가 I형 MHC 제시 병원체 유래 에피토프를 인식하고 그에 의해 활성화되었을 때에 유도되는 세포용해 면역 반응을 유도할 수 있는 면역계의 능력을 감소시킨다. 세포용해 림프구가 병원체에 의해 침습을 받은 세포를 제거할 수 있는 대체 전략법이 더 바람직할 수 있다. 세포내 병원체로부터 유래되고, 티올-옥시도리덕타제 모티프에 커플링된, II형 제한 에피토프를 사용함으로써, 동족 에피토프를 제시하는 항원 제시 세포 (APC)의 아폽토시스를 유도하는 세포용해 CD4+ T 세포를 유도하는 것인, 상기와 같은 전략법이 제안된 바 있다 (EP 2 059 256). 그러나, 세포용해 T 세포의 대체 서브세트의 동원 및 활성화는 세포내 병원체로 감염된 세포의 제거를 증가시킬 수 있는 별개의 가능성을 나타낼 수도 있다.
동종인자의 투여에 대한 면역 반응에서와 같은 자가면역 질환 및 알레르기 질환에서는, 임의의 원치않는 면역 반응을 막고, 그로써 상기와 같은 원치않는 면역 반응과 관련된 질환을 예방하기 위해서 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐으로부터의 펩티드를 제시하는 세포를 제거하는 것이 이롭다. 그러한 상황하에서, 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐으로부터 유래된 에피토프는 주로 II형 MHC에 의해 제시되고, 에피토프와 II형 결정기 사이에 형성된 복합체가 CD4+ 계통의 T 림프구를 활성화시켰다. 이를 통해 B 림프구가 활성화되고, 상기 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐에 대한 항원이 생산된다. 세포용해에 의해 APC를 제거하는 방법은 CD4+ T 세포 활성화와 그에 따른 항체 생산이 일어나지 못하게 막을 것이다. 각각 티올-옥시도리덕타제 모티프에 부착된, 자가항원 또는 알레르겐, 또는 동종인자의 II형 제한 에피토프를 사용하는 상기와 같은 전략법이 제안된 바 있으며, 특허 출원 WO 2008/017517 A1에 기술되어 있다. 상기 모티프와 커플링된 II형 제한 에피토프에의 노출에 의해 유도된 세포용해 II형 제한 CD4+ T 세포는 동족 에피토프를 제시하는 APC의 아폽토시스를 유도한다. 그러나, 대체 세포용해 T 세포의 동원 및 활성화가 가치가 큰 대체 전략법을 나타낼 수 있다.
종양의 경우, 세포는 I형 및 II형 MHC 결정기의 표면 발현을 하향 조절시킴으로써 제거를 모면한다. 따라서, 종양 항원에 특이적인 세포용해 T 세포를 유도할 수 있는 임의의 전략법이 종양 치료에 매우 바람직한 전략법을 나타낼 수 있다. WO 2009/101205에는 종양 유래 항원의 II형 제한 제시에 의해 활성화된 세포용해 T 세포가 종양을 제거하는 데 유용하다고 교시되어 있다. 그러나, 이러한 접근법은 종양에 의한 II형 MHC 결정기의 발현이 충분하지 않기 때문에 한계가 있다.
이식편 거부에서, 이식편에 의해 방출되고, 수용자 항원 제시 세포에 의해 그/그녀 자신의 T 림프구에게 제시된 항원의 간접적인 제시에 의해 만성 거부 과정이 일어나게 된다. 간접적인 제시는 I형 및 II형 에피토프 둘 모두에 의한 이식편 유래 에피토프 제시에 의해 일어나게 된다. 이식편 항원의 I형 MHC 제시에 의해 활성화된 CD8 계통의 T 림프구는 이식편으로 이동하고, 여기서 이식된 세포 상에서 간접적으로 그의 동족 에피토프의 인식에 의해 거부를 매개한다. 그러나, CD8 세포의 활성화는, II형 MHC 결정기에 의한 이식편 유래 항원의 간접적인 제시에 의해 활성화된 CD4 세포로부터의 도움을 필요로 한다. WO 2009/100505에는 이식편으로부터 유래되고, 티올-옥시도리덕타제 모티프와 커플링된 II형 제한 T 세포 에피토프를 사용하면 간접적 제시에 참여하는 APC의 아폽토시스에 의한 제거가 이루어질 수 있다고 교시되어 있다. 그러나, 세포용해 T 세포의 또 다른 서브세트를 발생시킬 수 있는 대체 전략법이 더 바람직할 수 있다.
유사하게, 신규한 치료학적 접근법, 예컨대 유전자 요법 및 유전자 백신접종은 트랜스제네시스 또는 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 숙주의 면역 반응으로 인해 크게 제한을 받는다. 상기와 같은 둘 모두의 상황하에서, 바이러스 벡터로부터 유래된 항원은 벡터로 형질도입된 세포에 의해 방출되고, 숙주 APC, 즉, 간접 항원 제시에 의해 숙주 림프구에 제시된다. 많은 바이러스 벡터가 적응 면역계를 활성화시켜 특이적 항체의 생산 및 특이적 T 세포 활성화를 일으키지만, 상기 바이러스 벡터는 또한 선천 면역계도 활성화시킨다는 사실이 주목할 만하다. 선천 면역의 활성화가 적응 반응에 대한 아주반트로서의 역할을 한다. WO 2009/101204에는, 바이러스 벡터로부터 유래되고 티올-옥시도리덕타제 모티프에 커플링된 II형 제한 에피토프가 세포용해 II형 제한 CD4 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다고 교시되어 있다. 그러나, 선천 면역계의 활성화를 억제할 수 있는 대체 전략법이 고도로 바람직할 수 있다.
본원에 열거된 모든 일례에서, 항원 특이적 세포용해 T 세포를 유도할 수 있는 것으로서, 항원 특이적 방식으로 상기 특이적 항원을 제시하는 APC를 제거할 수 있는 대체 전략법의 가치가 크다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명은 그러한 전략법을 제공한다.
자연 킬러 T (NKT) 세포는 비고전적 MHC 복합체 분자 CD1d에 의해 제시되는 항원을 인식하는 비통상적 T 림프구의 별개의 서브세트를 구성한다. 이제 NKT 세포의 두 서브세트를 기술한다. 불변 NKT 세포(iNKT)로도 불리는 1형 NKT 세포가 가장 풍부하게 존재한다. 이는 마우스에서는 V알파14, 및 인간에서는 V알파24인 불변 알파 쇄로 구성된 알파-베타 T 세포 수용체 (TCR)의 존재를 특징으로 한다. 비록 베타 쇄의 개수는 제한되어 있기는 하지만, 상기 알파 쇄가 변수와 연관된다. 2형 NKT 세포는 다형성 알파 쇄도 포함하는 알파-베타 TCR을 가진다. 그러나, NKT 세포의 다른 서브세트가 존재하고, 그의 표현형에 대해서는 여전히 불완전하게 정의된 상태이며, 이는 CD1d 분자와 관련하여 제시된 당지질에 의해 활성화된다는 특징을 공유한다는 것은 자명하다.
NKT 세포는 전형적으로는 NKG2D 및 NK1.1을 비롯한, 자연 킬러 (NK) 세포 수용체의 조합을 발현한다. NKT 세포는, 완전한 이펙터 능력을 획득하기 전에 증대될 필요가 없다는 사실에 있어서 적응 면역계와 구별될 수 있는 것인 선천 면역계의 일부이다. 그의 매개인자들은 대부분은 미리 형성되고, 전사를 필요로 하지 않는다. NKT 세포는 세포내 병원체 및 종양 거부에 대한 면역 반응에 참여하는 주요 참가자인 것으로 나타났다. 자가면역 질환 및 이식 거부 제어에서의 그의 역할 또한 지지를 받는다.
인식 단위인 CD1d 분자는 베타-2 마이크로글로불린이 존재하는 것과 같이, I형 MHC 분자의 구조와 매우 유사한 구조를 가진다. 이는 두 알파 쇄에 인접해 있고, 고도로 소수성인 잔기를 포함하는 것으로서, 지질 쇄를 수용하는 것인 깊은 틈새를 특징으로 한다. 상기 틈새는 양 끝단 모두가 개방형인데, 이를 통해 보다 긴 장쇄를 수용할 수 있다. CD1d에 대한 정규 리간드는 합성 알파 갈락토실세라미드 (알파 GalCer)이다. 그러나, 당지질 및 인지질, 미엘린에서 발견되는 천연 지질 술파티드, 미생물 포스포이노시톨 만노시드 및 알파-글루쿠로노실세라미드를 비롯한, 천연의 대체 리간드들 다수가 기술되어 있다. CD1d는 오직 지질 쇄를 함유하는 리간드에만, 또는 일반적으로는 CD1d 내로 매립되어 있는 지질 테일 및 CD1d 밖으로 돌출되어 있는 당 잔기 헤드기로 이루어진 공통 구조체에만 결합한다는 것이 현재 당업계에서 일치되는 견해이다 (리뷰를 위해, 예컨대 문헌 [Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368] 및 [Godfrey et al, Nature reviews Immunology 2010, 11:197-206] 참조).
펩티드는 CD1d에 의한 제시를 통해 NKT를 활성화시킬 수 있는 것으로 간주되지 않는다. 그러나, 벌키한 아미노산 잔기를 포함하는 장쇄의 소수성 펩티드가 CD1d에 결합할 수 있다는 것이 제안되었다 (문헌 [Castano et al, Science 1995, 269: 223-226]). 정의된 생리학적 관련성이 없는 무작위 서열 펩티드를 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 관찰을 수행하고, 이를 통해 이론적 컨센서스 모티프를 확립할 수 있었다 (문헌 [Castano et al, Science 1995, 269: 223-226] 및 하기 참조).
실제로, 활성화된 세포는 NKT 세포가 아닌, CD8+ T 세포, 즉, I형 MHC 제한 세포라는 것이 카스타뇨(Castano) 등을 통해 밝혀졌다. 이러한 결과는, 소수성 펩티드가 CD1d 분자에 의해 제시된다는 증거는 없다는 것을 당업자에게 교시하는 것이다. 통상의 면역화 프로토콜하에서는 NKT 세포를 유도할 수 없었는 바, 카스타뇨 등이 주장한 생리학적 관련성에 대해 추가로 의문이 제기되었다 (문헌 [Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368] 및 [Brutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775]). 인공 시스템, 예컨대 CD1d를 과발현시키도록 형질감염되고 시험관내에서 오브알부민 유래 펩티드가 적재된 세포로 면역화시킨 결과, NKT 세포를 유도할 수 있었다. 유사하게, 뮤린 CD1d 및 공동자극 분자와 함께 플라스미드 DNA로 진피내로 면역화시키면, 세포용해 CD1d 제한 T 세포가 유도된다 (문헌 [Lee et al, Journal of Experimental Medicine 1998, 187: 433-438]). CD1d 분자의 각 말단에 위치하는 CD1d 소수성 포켓에의 결합을 위한 부착 잔기를 나타내는 것인, P1 및 P7 위치의 방향족 잔기, 및 P4 위치의 지방족 쇄로 이루어진 구조적 모티프를 포함하는 소수성 펩티드가 CD1d 결합 에피토프에 대한 중심 모티프를 포함하는 것으로 카스타뇨 등에 의해 주장되었다 (문헌 Science 269: 223, 1995]). 상기 기술된 바와 같이, 카스타뇨 등이 내린 결론은 데이터를 통해 뒷받침되지 않는다.
본 발명자들은, 소수성 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 실제로 NKT 세포의 활성화를 유도할 수 있다는 예상 밖의 결과를 얻게 되었다. 상기와 같은 서열의 예는 모티프 [FW]-xx-[ILM]-xx-[FW] (여기서, [FW]는 페닐알라닌 또는 트립토판으로부터 선택되는 아미노산이고, [ILM]은 이소류신, 류신 또는 메티오닌으로부터 선택되는 아미노산이다)로 나타내어진다. P7의 [FW]는 허용성을 띤다고 볼 수 있는데, 이는 F 또는 W 대신 T 또는 H로 치환될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명자들은 CD1d 결합 모티프가 티올-옥시도리덕타제 모티프에 커플링되었을 때에 NKT 활성을 조절함에 있어 특히 효율적이라는 것을 추가로 발견하게 되었다. 상기 모티프는 C-XX-C (여기서, C는 시스테인이고, X는 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판을 제외한 임의의 아미노산이다)인 일반 구조식을 나타낸다. 특허 출원 WO 2008/017517 A1에는 티올-옥시도리덕타제 모티프에 커플링된 II형 제한 T 세포 에피토프가 II형 제한 CD4 T 세포의 표현형 및 기능을 효능이 있는 세포용해 세포로 형질전환시켜 APC의 아폽토시스를 유도하는 특성을 획득한다고 교시되어 있다. 이러한 효과는 T 세포 표면에서의 CD4 분자의 감소 및 이성체화의 결과인, APC와 T 세포 사이의 시냅스 형성 증가에 기인하는 것이다.
NKT 세포 대다수는 CD4 공동 수용체를 보유하는데, 이들의 역할은 불분명하다. 그러나, 최근의 공개 문헌을 통해 CD4는 그의 II형 MHC에의 결합과 동일한 방식으로 CD1d 분자에 결합한다는 것이 제안되었다 (문헌 [Thedrez et al Blood 110:251-258, 2007]). 추가로, NKT 세포의 완전한 활성화를 위해서는 CD4가 존재하여야 하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 티올-옥시도리덕타제 모티프에 커플링된, CD1d에 결합할 수 있고 이로써 NKT 세포를 동원하고 활성화시킬 수 있는 능력을 가진 소수성 펩티드의 용도에 관한 것이다. 상기 펩티드는 항원 특이성을 보장하고, 하기 (1) 내지 (5)의 치료를 위해 가치가 큰 접근법을 나타낸다:
(1) 감염된 세포가, 병원체로부터 유래되고 CD1d에 결합된 소수성 펩티드를 제시하는 것인, 세포내 병원체에 의한 감염성 질환. 따라서, NKT 동원 증가 및/또는 상기 NKT 세포의 활성 증가는 감염된 세포의 제거와 일치할 것이다;
(2) 자가면역 질환, 동종인자의 투여에 대한 면역 반응 및 알레르기 질환인 이들 3가지 유형의 질환 중 각각의 것과 관련된 항원이 CD1d에 의해 제시되는 소수성 펩티드를 생성하는 것인 자가면역 질환, 동종인자의 투여에 대한 면역 반응 및 알레르기 질환. 따라서, 항원 특이적 NKT 세포의 동원 및/또는 활성 증가는 항원 제시 세포를 제거하는 데 도움이 될 수 있고, 이로써 원치않는 면역 반응을 제거할 수 있다;
(3) 종양 세포가 대개 NKT 세포에 의해 인식될 수 있는 종양 특이적 항원을 보유하는 CD1d를 발현하는 바, 종양. 상기 NKT 세포의 활성 및 동원 증가는 종양 제거 증가를 유도할 것이다;
(4) 숙주의 항원 제시 세포가 CD1d와 관련하여 이식편으로부터 유래된 소수성 펩티드를 제시하는 바, 이식편 거부. 숙주의 NKT 세포에 의한 상기 펩티드의 인식을 통해 항원 제시 세포 제거가 일어나게 되고, 만성 이식편 거부 과정은 중단될 것이다;
(5) 바이러스 벡터로부터 유래되고 형질도입된 세포에 의해 방출된 항원이 CD1d 결정기에 의해 제시되는 것인 유전자 요법 및 유전자 백신접종. 바이러스 벡터 항원의 인식을 통해 숙주 APC를 제거하는 NKT 세포의 동원 및 활성화는 유전자 백신접종에서 트랜스진 발현을 지속시키고, 트랜스진의 완전한 면역원성을 유지시키는 것 둘 모두에 있어서 유익할 것이다.
본 발명의 치료학적인 관심사 이외에도, 본 발명자들은 CD1d 에피토프의 측면 잔기 내에 옥시도리덕타제 모티프를 부가하면 TCR 결합이 증가하게 되고, 이로써, CD4+ NKT 세포의 검출은 훨씬 더 개선될 수 있다는 예상 밖의 결과를 얻게 되었다. 따라서, 본 발명에 기술된 바와 같이, 천연 CD1d 제한 에피토프 및 CxxC 포맷 (여기서, C는 시스테인을 나타내고, x는 시스테인 또는 벌키한 잔기를 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다)의 하나 이상의 티오리덕타제 모티프를 포함하는 펩티드는 하기 (1) 내지 (4)의 목적을 위한 주된 관심의 대상이 된다:
(1) 분석 목적: 백신접종 이전의 NKT 세포 전구체 빈도 검출, CD1d 복합체에 대한 펩티드 결합 친화도 평가, 백신접종 과정 중 또는 면역억제하의 특이적 NKT 세포의 추적 검사, 그의 생물학적 활성과는 상관없는 세포 확인, 질환 메카니즘에 연루된 세포 확인, 특이적 NKT 세포 고갈, 계내, 예컨대 기관 생검 중 NKT 세포 검출;
(2) 제조 목적: 기능 평가를 위한 특이적 NKT 세포 제조 및 배양 및 정제를 위한 NKT 세포 제조;
(3) 세포 요법을 목표로 하는 세포 집단에 대한 품질 관리;
(4) 기관 이식 이전의 특이적 CD4+ NKT 세포 고갈을 비롯한 치료 목적.
본 발명의 개요
본 발명은 세포내 병원체로부터 유래된 특이적 항원에 대한 면역 반응을 증가시킴으로써 대상체에서 세포내 병원체에 의한 감염을 예방 및 치료하기 위한 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 자가면역 반응, 동종인자의 투여에 대한 면역 반응 및 알레르겐에의 노출에 대한 면역 반응의 예방 및 치료를 위한 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 종양 치료를 위한 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이식편 거부의 예방을 위한 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유전자 요법 및/또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 단백질에 대한 면역 반응의 예방을 위한 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 NKT 세포의 검출, 제조 및 고갈을 위한 펩티드에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 병원체에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 의약으로서의, (i) 병원체 관련 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티올-옥시도리덕타제 모티프 (약칭하여 티오레독스 모티프)를 포함하는 하나 이상의 단리된 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 대상체에서 자가항원, 동종인자 및/또는 알레르겐에 대한 면역 반응을 예방 및/또는 치료하기 위한 의약으로서의, (i) 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 대상체에서 종양을 치료하기 위한 의약으로서의, (i) 종양 관련 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 대상체에서 이식편 거부를 예방하기 위한 의약으로서의, (i) 동종항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 대상체에서 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 예방하기 위한 의약으로서의, (i) 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위한 바이러스 벡터로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 상기 대상체에서 CD4+ NKT 세포의 활성화, 시토카인 생산 및 세포용해 활성을 증가시키기 위한 의약으로서의, (i) 병원체 관련 항원, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 관련 항원, 동종항원 또는 바이러스 벡터 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
일반적으로, 본 발명은 수용자에서 CD4+ NKT 세포 반응을 증가시킴으로써 상기 수용자에서 세포내 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 데, 자가항원, 동종인자, 알레르겐에 대한 면역 반응을 예방 또는 치료하는 데, 종양을 치료하는 데, 동종항원에 대한 또는 바이러스 벡터 항원에 대한 면역을 예방하는 데 사용하기 위한, (i) 병원체 관련 항원, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 관련 항원, 동종항원, 또는 바이러스 벡터 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프, 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 면역원성 펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 모두가, CD1d 결합 펩티드를 인식할 수 있는 CD4 공동 수용체 및 TCR 베타 쇄를 보유하는 것을 특징으로 하는 것인, 1형 (iNKT) 또는 2형 서브세트로 이루어진 NKT 세포 뿐만 아니라, 특징이 덜 규명된 NKT 서브세트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 NKT 세포에의 제시를 위해 CD1d에 결합할 수 있는 소수성 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 하나 이상의 CD1d 제한 T 세포 에피토프를 포함하는 소수성 펩티드에 관한 것이다. CD1d 분자의 구조는, CD1d 틈새의 끝단에 위치하는 2개의 소수성 포켓이 점유되도록 하기 위해 소수성 아미노산 잔기가 필요하고, 틈새의 한가운데 위치를 지방족 잔기가 점유하여야 한다는 것을 나타낸다. 따라서, CD1d 결합 서열의 일반적인 예로서, 모티프 [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]가 사용될 수 있는데, 여기서 [FW]는, F 또는 W가 제1 부착 잔기 (P1)를 점유할 수 있고, P4 위치는 I, L 또는 M으로 점유될 수 있고, P7은 F, W, T 또는 H로 점유될 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 일반 모델 모티프에서, x는 임의의 아미노산을 나타낸다. 상기 아미노산 잔기의 다양한 조합이 가능하다는 것을 당업자는 확실히 알고 있어야 한다. 특정 실시양태에서, 일반 모델 모티프는 복귀 서열, 예컨대 [FWTH]-xx-[ILM]-xx-[FW]로서 제시될 수 있다.
상기 티오레독스 모티프는 컨센서스 서열 ([CST]-XX-[CST])로 이루어지는데, 여기서 [CST]는 시스테인, 세린 및 트레오닌으로부터 선택되는 아미노산이고, X는 티로신 (Y), 페닐알라닌 (F) 및 트립토판 (W)을 제외한, 임의의 아미노산일 수 있다. 상기 티오레독스 모티프는 잠재적으로는 1 내지 7개의 아미노산의 링커에 의해 상기 CD1d 제한 T 세포 에피토프로부터 분리되어 있는, 아미노-말단 또는 카르복시-말단 단부 또는 각 말단 단부 상의 펩티드에 첨가된다.
특정 실시양태에서, 상기 링커는 천연 측면 잔기의 일부인 아미노산을 포함한다.
본 발명은 추가로
(i) 단리된 천연 CD4+ T 세포를 제공하는 단계;
(ii) 상기 세포를, CD1d 분자에 의해 제시되는 T 세포 에피토프, 및 상기 T 세포 에피토프에 인접해 있거나 또는 7개 이하의 아미노산의 링커에 의해 그로부터 분리되어 있는 것인 C-XX-[CST] 또는 [CST]-XX-C 모티프를 포함하는 면역원성 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(iii) IL-2/IL-15 및/또는 IL-7의 존재하에서 상기 세포를 증대시키는 단계를 포함하는, 상기 기술된 바와 같은 NKT 세포 집단을 수득하거나 유도하는 방법에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은
(i) 단리된 천연 CD4+ T 세포를 제공하는 단계;
(ii) 세포독성일 것으로 의심되는 CD4+ T 세포를 제공하는 단계; 및
(iii) (i) 단계에서 제공된 T 세포와 비교하였을 때, (ii) 단계에서 제공된 T 세포가 상기 기술된 특징을 보이는지 측정하는 단계를 포함하는, CD4+ NKT 세포 집단을 확인하는 방법을 포함한다.
상기 용도 중 임의의 것에서, 상기 세포내 병원체 관련 항원은 세포내 생활환을 가지는 바이러스, 박테리아, 미코박테리아 또는 기생충으로부터 유래된 임의의 항원일 수 있다.
상기 중 임의의 것에서, 상기 자가항원은 자가면역 질환과 관련된 임의의 항원일 수 있다. 상기 질환의 예로는 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 중증 근무력증 및 갑상선염이 있다.
상기 중 임의의 것에서, 상기 동종인자는 인자 VIII, 인자 IX 및 스타필로키나제를 비롯한, 응고 결함 또는 피브린 용해 결함에 대한 대체 요법을 위해 사용되는 폴리펩티드 또는 단백질 및 인자, 호르몬, 예컨대 인슐린 및 성장 호르몬, 시토카인 및 성장 인자, 예컨대 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, GM-CSF 및 G-CSF, 알레르기 질환에서 항-IgE 항체, 이식편 거부 및 다양한 자가면역 질환에서 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD20 항체, 류마티스 관절염에서 항-TNF-알파 항체, 및 신부전에서 에리트로포이에틴을 비롯한, 면역 반응 조절을 위한 항체이다.
상기 중 임의의 것에서, 상기 알레르겐은 공기 매개 알레르겐, 예컨대 집 먼지 진드기로부터, 화분으로부터, 또는 가축으로부터 유래된 것, 식품 알레르겐, 예컨대 땅콩, 오브알부민, 시리얼, 과일 및 콩과 식물, 및 접촉성 항원, 예컨대 라텍스이다. 알레르겐 감작을 특징으로 하는 질환으로는 알레르기성 천식, 알레르기성 비부비동염, 아나필락시스 쇼크, 두드러기, 아토피 피부염 및 접촉성 피부염을 포함한다.
상기 중 임의의 것에서, 상기 종양 관련 항원은 종양유전자, 원종양유전자, 바이러스 유래 단백질, 생존 인자 또는 클론형 결정기, 예컨대 B 세포 수용체로부터 유래된 이디오타입 결정기이다.
상기 중 임의의 것에서, 상기 동종항원은 주 조직적합성 항원, 부 조직적합성 항원 또는 조직 특이적 항원이다. 상기 항원은 세포 및 조직 이식편 거부에 관여한다.
상기 중 임의의 것에서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로부터 유래된 것이다.
상기 용도 중 임의의 것에서, 상기 티오레독스 모티프는 상기 NKT 세포 에피토프에 인접해 있을 수 있거나, 또는 링커에 의해 상기 NKT 세포 에피토프로부터 분리되어 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 7개 이하의 아미노산으로 이루어진 것이다.
상기 용도에서의 면역원성 펩티드의 추가의 실시양태에서, 상기 티오레독스 모티프는 천연적으로는 상기 병원체 관련 항원, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 관련 항원, 동종항원 또는 바이러스 벡터 항원 중 NKT 세포 에피토프에 인접한, N- 또는 C-말단의 8개의 아미노산으로된 영역 내에 존재하지 않는다. 특히, 상기 티오레독스 모티프는 NKT 세포 에피토프의 N-말단에 위치한다.
상기 용도를 위한 면역원성 펩티드의 특정 실시양태에서, 면역원성 펩티드는 엔도솜성 표적 서열을 추가로 포함한다. 상기 면역원성 펩티드 중 임의의 것은 화학적 합성에 의해 또는 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 추가의 방법은 NKT 세포 집단 수득을 목표로 하며, 상기 방법은
(i) 세포내 병원체 관련 항원, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 관련 항원, 동종항원 또는 바이러스 벡터 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프, 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 면역원성 펩티드를 제공하는 단계;
(ii) (아주반트의 존재하에서) 대상체에게 면역원성 펩티드를 투여하는 단계; 및
(iii) CD4+ NKT 세포 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 의해 수득될 수 있는 CD4+ NKT 세포 집단 뿐만 아니라, 대상체에서 상기 세포내 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하고, 자가면역 질환, 동종인자에 대한 면역 반응을 예방 또는 치료하고, 알레르기 질환을 예방 또는 치료하고, 종양을 치료하고, 이식편 거부를 예방하고, 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 예방하기 위한 의약으로서의 용도 또한 본 발명의 일부가 된다.
본 발명의 추가의 측면은 세포내 병원체 관련 항원으로부터, 또는 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 관련 항원, 동종항원 또는 바이러스 벡터 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프, 및 NKT 세포 에피토프에 인접해 있거나 링커에 의해 NKT 세포 에피토프로부터 분리되어 있는 티오레독스 모티프를 포함하는 단리된 면역원성 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 세포내 병원체 관련 항원으로부터, 또는 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 관련 항원, 동종항원 또는 바이러스 벡터 항원부터 유래된 NKT 세포 에피토프, 및 NKT 세포 에피토프에 인접해 있거나 링커에 의해 NKT 세포 에피토프로부터 분리되어 있는 티오레독스 모티프를 포함하는, NKT 세포의 검출, 제조, 및 고갈을 위한 단리된 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 NKT 세포 에피토프, 및 NKT 세포 에피토프에 인접해 있거나 링커에 의해 NKT 세포 에피토프로부터 분리되어 있는 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 병원체 관련 항원, 또는 하나 이상의 자가항원, 또는 하나 이상의 동종인자, 또는 하나 이상의 알레르겐, 또는 하나 이상의 종양 관련 항원, 또는 하나 이상의 동종항원, 또는 하나 이상의 바이러스 벡터 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 바이러스 벡터를 포함한다.
더욱 특히, 본 발명은 병원체 관련 항원 중 하나 이상에, 또는 자가항원 중 하나 이상에, 또는 동종인자 중 하나 이상에, 또는 알레르겐 중 하나 이상에, 또는 종양 관련 항원 중 하나 이상에, 또는 동종항원 중 하나 이상에, 또는 바이러스 벡터 항원 중 하나 이상에 존재하는 하나 이상의 NKT 세포 에피토프가 상기 병원체 관련 항원, 상기 자가항원, 상기 동종인자, 상기 알레르겐, 상기 종양 관련 항원, 상기 동종항원, 또는 상기 바이러스 벡터 항원 중의 삽입에 의해 변형되어 있고, 티오레독스 모티프가 NKT 세포 에피토프에 인접해 있거나 링커에 의해 상기 NKT 세포 에피토프로부터 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 단리된 바이러스 벡터를 제공한다.
정의
본원에서 사용되는 바, "펩티드"라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된, 2 내지 200개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하나, 특정 실시양태에서는 비아미노산 구조 (예를 들어, 연결 유기 화합물)를 포함할 수 있는 것인 분자를 의미한다. 본 발명에 따른 펩티드는 20가지의 일반 아미노산 중 임의의 것, 또는 그의 변형된 버전을 포함할 수 있거나, 또는 화학적 펩티드 합성 또는 화학적 또는 효소적 변형에 의해 도입된 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함할 수 있다.
"펩티드" 또는 "면역원성 펩티드"라는 용어는 차별없이 사용되지만, 보통은 치료학적 목적을 위해 사용되는 펩티드의 경우에는 "면역원성 펩티드"가 선호되는 반면, NKT 세포의 검출, 제조, 및 고갈에 대해서는 "펩티드"가 선호된다.
본원에서 사용되는 바, "에피토프"라는 용어는 B 또는 T 세포 림프구의 세포 표면에 제시된 항체 또는 그의 일부 (Fab', Fab2' 등), 또는 수용체에 의해 특이적으로 인식되고, 그에 결합되며, 상기 결합에 의해 면역 반응을 유도할 수 있는 것인, 단백질의 하나의 또는 수개의 일부 (수개의 일부는 입체형태적 에피토프를 정의할 수 있다)를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "항원"이라는 용어는 하나 이상의 합텐(들)을 포함하고/거나, 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 거대분자 구조체를 의미한다. 전형적으로, 상기 거대분자는 (다당류를 포함하거나, 포함하지 않는) 단백질 또는 펩티드이거나, 단백질성 조성물로 구성된 것이고, 하나 이상의 에피토프를 포함한다; 별법으로, 본원에서 상기 거대분자는 "항원성 단백질" 또는 "항원성 펩티드"로 지칭될 수 있다.
본 발명과 관련하여, "T 세포 에피토프" 또는 "T-세포 에피토프"라는 용어는 우성, 준-우성 또는 소수 T 세포 에피토프, 즉, T 림프구의 세포 표면에 있는 수용체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 항원성 단백질의 일부를 의미한다. 에피토프가 우성, 준-우성 또는 소수인지 여부는 에피토프에 대해 유도되는 면역 반응에 달려있다. 우성성은 단백질의 가능한 T 세포 에피토프 중의, 상기 에피토프가 T 세포에 의해 인식되고, 그를 활성화시킬 수 있는 빈도에 달려있다. 특히, T 세포 에피토프는 I형 MHC 또는 II형 MHC 분자에 의해 결합되는 에피토프이다.
"NKT 세포 에피토프"라는 용어는 T 림프구의 세포 표면에 있는 수용체에 의해 특이적으로 인식되고 결합되는 항원성 단백질의 일부를 의미한다. 특히, NKT 세포 에피토프는 CD1d 분자에 의해 결합되는 에피토프이다.
"CD4 + 이펙터 세포"라는 용어는 그의 기능이 다른 세포, 예컨대 B-세포에 도움이 되는 것인, T-세포의 CD4-양성 서브세트에 속하는 세포를 의미힌다. 이러한 이펙터 세포는 통상 (T 헬퍼 세포의 경우) Th 세포와 같이 기록되며, 다른 서브세트로는, 예컨대 Th0, Th1, Th2, 및 Th17 세포가 있다.
"NKT 세포"라는 용어는 수용체, 예컨대 NK1.1 및 NKG2D를 보유하고, CD1d 분자에 의해 제시되는 에피토프를 인식한다는 사실을 특징으로 하는 선천 면역계의 세포를 의미한다. 본 발명과 관련하여, NKT 세포는 1형 (불변) 또는 2형 서브세트에 속할 수 있거나, 또는 1형 또는 2형 NKT 세포보다 더 많은 다형성 T 세포 수용체를 보유하는 것인, 특징 규명이 덜 이루어진 NKT 세포 중 임의의 것에 속할 수 있다.
"CD1d 분자"는 양측이 개방되어 있는 깊은 소수성 그루브 내로 정렬되고 지질, 당지질 또는 소수성 펩티드를 NKT 세포로 제시할 수 있는 것인, 3개의 알파 쇄, 및 베타 쇄의 역평행 세트로 구성된 비MHC 유래 분자를 의미한다.
"면역 장애" 또는 "면역 질환"은 유기체에서 면역계의 반응이 기능장애 또는 비생리학적 상황의 원인이 되거나, 그를 지속시키는 것인 질환을 의미한다. 본 발명과 관련하여 면역 장애란 감염제 및 종양 감시에 의해 유도되는 병적 이상을 의미한다.
"동종인자"라는 용어는 같은 종의 두 개체를 비교하였을 때, 다형성을 보이는 단백질, 펩티드 또는 인자 (즉, 임의의 분자), 및 더욱 일반적으로는 동종인자를 받은 대상체에서 (동종반응성) 면역 반응을 유도하는 임의의 단백질, 펩티드 또는 인자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "동종항원" 또는 "동종이식편 항원"이라는 용어는 공여자로부터 수용자에게로 전달되었을 때, 수용자의 B 또는 T-세포 수용체의 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 세포 또는 조직으로부터 유래 (그로부터 방출 및/또는 그에 존재하는) 항원을 의미한다. 동종항원은 전형적으로는 다형성 유전자의 생성물이다. 동종항원은 (같은 종에 속하는) 공여자와 수용자를 비교하였을 때, 구조상 약간의 차이를 보이는 단백질 또는 펩티드이다. 상기 공여자의 항원이 수용자의 체내에 존재하면, 수용자에서 면역 반응이 유도될 수 있다. 그러한 동종반응성 면역 반응은 동종항원에 대하여 특이적이다.
"티올 - 옥시도리덕타제 모티프," "티오리덕타제 모티프, "티오레독스 모티프" 또는 "레독스 모티프"라는 용어는 본원에서 동의어로서 사용되며, 이는 [CST]-XX-[CST] (여기서, C는 시스테인을, S는 세린, T는 트레오닌을 및 X는 티로신, 페닐알라닌 또는 트립토판을 제외한 임의의 아미노산을 나타낸다)로 이루어진 일반 서열의 모티프를 의미한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 대상체에서 세포내 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 자가면역 질환, 동종인자 투여 후의 면역 반응 또는 알레르겐에 대한 면역 반응을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 종양을 치료하고, 이식편 거부를 예방하고, 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 예방하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 CD4+ NKT 세포의 증대 및 기능적 활성을 증강시키는 방법을 제공한다. 상기 세포는 일반적으로 2개의 상이한 서브세트로, 즉, 불변 TCR 알파 쇄 (마우스에서, V알파14, 인간에서 V알파24)를 보유하는 NKT 세포인 1형, 또는 다양한 알파 쇄 레퍼토리를 가지는 2형 NKT 세포로 분류된다. 그러나, 최근 증거를 통해 1형 또는 2형 카테고리에 맞지 않는 대체 서브세트의 NKT 세포가 존재한다는 것이 제안되었다. 본 발명의 목적은 이들 비통상적 NKT 세포가 CD4 공동 수용체를 보유한다면, 이들도 포함하고자 하는 것이다. CD1d에 결합된 항원 제시시, NKT 세포는 신속하게 활성화되고, 선천 및 적응 면역계 둘 모두로부터의 다른 세포에 영향을 주고, CD1d+ 항원 제시 세포의 효능이 있는 살해 활성을 발휘하는 결정 인자인 것으로 사료되는 다수의 시토카인을 분비한다. 이러한 메카니즘은 세포내 작용제에 대한 방어를 위해서 뿐만 아니라, 종양 세포 감시 및 종양 제거에서도 중요한 것으로 간주된다. 같은 메카니즘은 자가면역 질환, 동종인자에 대한 또는 알레르겐에 대한 면역 반응에서도 일어나는 바, 이는 원치않는 면역 반응을 제어하는 데 역할을 한다.
이식편 거부에서, 이식편으로부터 방출된 동종항원은 간접 경로에 의해 수용자 대상체의 면역계에 제시된다. 이는 방출된 동종이식편 항원이 숙주 항원 제시 세포에 의해 흡수되고, 이 세포가 CD1d 제한 방식으로 상기 동종항원을 숙주 T 세포에 제시한다는 것을 의미한다. 따라서, CD4+ NKT 세포의 동족 인식 후, 살해에 의해 상기 숙주 항원 제시 세포가 파괴되는 메카니즘은 이식편 수용자에게 있어 유익할 것이다.
유전자 요법 및 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응에서, 형질도입된 세포로부터 방출된 항원은 숙주 항원 제시 세포에 의해 흡수되고, 이어서 이식편 거부의 경우와 같이 간접적으로 제시된다.
NKT 세포가 티오리덕타제 활성을 포함하도록 변형된 펩티드에 의해 활성화되었을 때, 상기 펩티드는 NKT 세포의 특성을 현저하게 증가시키고, 이로써 세포내 미생물을 보유하는 세포 뿐만 아니라, 종양 세포의 살해를 증가시킨다. 항원 특이적 CD4+ NKT 세포에 의한 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐을 제시하는 세포의 살해는 상기 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐에 대한 면역 반응을 억제한다. 이식편으로부터 유래된, 또는 형질도입된 세포로부터 유래된 항원을 제시하는 숙주 세포의 살해는 각각 거부 또는 바이러스 벡터 항원에 대한 반응을 중단시킨다.
따라서, 감염성 질환의 수가 점점 증가하면서 NKT 세포의 중요성이 입증되었다. 이는 미코박테리아 (미코박테리움 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis)), 기생충, 예컨대 레이슈마니아(Leishmania), 박테리아, 예컨대 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 살모넬라(salmonella), 슈도모나스 애루기노사(pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 뉴모니아에(streptococcus pneumoniae) 및 보렐리아(Borrelia), 및 바이러스, 예컨대 헤르페스 심플렉스 바이러스 (문헌 [Chiba et al Journal of Immunology 181:2292-2302, 2008]; [Mattner et al Nature 434: 525529, 2005]; [Tupin et al Nature Reviews. Microbiology 5:405-417, 2007])에 의한 감염을 포함한다. 감염된 세포의 직접적인 살해 이외에도, NKT 세포는 고농도의 시토카인, 및 특히 IFN-감마를 생산할 수 있는 그의 능력에 의해 감염된 세포 내에서 비특이적 살해 메카니즘을 일으킬 수 있다. 이러한 메카니즘은 인돌아민 옥시다제, 산화질소 신타제 유도, 및 활성 산소종 생산을 포함한다.
자가면역 질환에서의 면역 반응, 또는 동종인자 또는 알레르겐에 대한 면역 반응을 제어하는 데 NKT 세포가 참여한다는 것이 수차례에 걸쳐 보고되었지만 (문헌 [Jahng et al Journal of Experimental Medicine 199: 947-957, 2004]; [Van Belle and von Herrath, Molecular Immunology 47: 8-11, 2009]), 기술하기는 상대적으로 어렵다. 본 발명과 관련하여, 본 발명자들은 펩티드가 CD1d 분자에 의해 제시될 수 있다는 예상 밖의 결과를 얻게 되었다. CD1d 분자의 특징은 2개의 역평행 베타 쇄로 이루어진 플랫폼의 상부에 놓여있는 틈새를 형성하는 2개의 역평행 알파 쇄로 이루어져 있다는 것이다. 틈새는 좁고 깊으며, 고전적으로는 오직 지질로 간주되는 것인, 오직 소수성 잔기만을 수용한다. 실제로, 소수성 잔기를 가진 펩티드는 CD1d 틈새에 결합할 수 있는 능력이 있다. 또한, 틈새 양측 모두가 개방형인 바, 7개의 아미노산보다 더 긴 장쇄의 펩티드가 수용될 수 있다. CD1d 모티프를 보유하는 소수성 펩티드는 자가항원, 동종인자 및 알레르겐에서 발견되고, 이로써 상기 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐에 CD4+ NKT 세포를 활성화시킬 수 있는 능력을 부여한다. 상기 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐을 제시하는 세포를 직접적으로 살해함으로써 상기 항원/인자에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 능력을 제거한다.
NKT 세포는 종양 세포에 대한 선천 및 적응 반응 둘 모두를 증가시킬 수 있는 시토카인을 생산함으로써 간접적으로, 또는 NKT 세포에 의해 인식되는 지질 에피토프를 제시하는 종양 세포를 살해함으로써 직접적으로, 종양에 대한 방어에 참여하는 것으로 입증되었다 (문헌 [Crowe et al, Journal of Experimental Medicine 196: 119-127, 2002]; [Tachibana et al, Clinical Cancer Research 11:7322-7327, 2005]; [Dhodapkar et al, Journal of Experimental Medicine 197:1667-1676, 2003]; [Song et al, Journal of clinical Investigation 119: 15241536, 2009]). 직접적인 살해는 그랜자임 및 퍼포린 생산을 포함한다. 실험적 종양, 예컨대 발암성 작용제에 의해, 또는 p53 종양 억제 유전자의 결실에 의해 유도된 육종 뿐만 아니라, 자연발생 종양, 예컨대 골수종은 NKT 세포에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 본 발명에 의해 쉽게 치료될 수 있는 종양으로는 종양유전자를 발현하는 것, 예컨대 일부 흑색종에서 확인되는 MAGE 또는 티로신 키나제, 예컨대 외배엽 기원의 암종에서 확인되는 ALK (역형성 림프종 키나제)를 발현하는 것, 원종양유전자를 발현하는 것, 예컨대 연조직 암종, 예컨대 신장 또는 부갑상선의 것 뿐만 아니라, 다발성 골수종에서 발현되는 시클린 D1을 발현하는 것, 바이러스 유래 단백질을 발현하는 것, 예컨대 일부 암종 및 일부 호지킨 유형의 림프종에서 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스의 것을 발현하는 것, 생존 인자, 예컨대 서바이빈 또는 bcl2를 발현하는 것, 및 클론형 결정기, 예컨대 소포성 림프종 또는 다발성 골수종에서 B 세포 수용체로부터 유래된 이디오타입 결정기 또는 T 세포 악성 종양에서 T 세포 수용체 결정기를 발현하는 것을 포함한다.
조직 이식편 또는 세포 이식편 중 어느 것이든 이식편의 일부인 세포는 CD1d 분자을 보유하지 않거나, 또는 단지 최소로 보유한다. 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 형질도입된 세포에 대해서도 상기의 것이 적용된다. 상기 두 상황들 모두에서, 이식편 거부 또는 바이러스 벡터에 대한 면역화를 이끄는 원치않는 면역 반응인 반응은 숙주 항원 제시 세포에 의한 숙주 T 세포에의 간접적인 항원 제시에 의해 유도된다. NKT 세포와의 동족 상호작용 이후, 숙주 항원 제시 세포의 살해에 의한 직접적인 제거는 동종항원 또는 바이러스 벡터 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 능력을 제거한다.
본 발명은 CD1d 분자에 결합할 수 있는 능력을 부여하는 소수성 잔기를 포함하는 펩티드의 제조에 관한 것이다. 투여시, 상기 펩티드는 APC에 의해 흡수되고, 이는 CD1d 상에 적재되고, APC의 표면에 제시되는 곳인 말기 엔도솜으로 지정된다. 상기 소수성 펩티드는 일반 서열 [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH] 또는 [FWTH]-xx-[ILM]-xx-[FW] (여기서, P1 및 P7 위치는 소수성 잔기, 예컨대 페닐알라닌 (F) 또는 트립토판 (W)에 의해 점유된다)에 상응하는 모티프를 특징으로 한다. 그러나, P7은 페닐알라닌 또는 트립토판에 대한 대체 소수성 잔기, 예컨대 트레오닌 (T) 또는 히스티딘 (H)을 수용한다는 점에서 허용성을 띤다고 볼 수 있다. P4 위치는 지방족 잔기, 예컨대 이소류신 (I), 류신 (L) 또는 메티오닌 (M)에 의해 점유된다.
국제 출원 WO 2009/101206에는 펩티드 CGHCGGFTNMFATWSPSK를 비롯한, 주 조직적합성 II형 제한 CD4+ 세포의 활성화를 유도할 수 있는 면역원성 펩티드가 개시되어 있다. 펩티드가 CD1d 분자에 결합할 수 있는 능력이 있는지에 대해서는 WO 2009/101206으로부터 알 수 없다. 따라서, 본 발명은 CD1d에 결합하고, NKT 세포를 활성화시키는 펩티드이되, 단, 상기 펩티드는 CGHCGGFTNMFATWSPSK가 아닌 것인 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 천연적으로 CD1d 결합 모티프를 구성하는 소수성 잔기로 이루어진 펩티드에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 모티프의 아미노산 잔기는 일반적으로는 CD1d에 결합할 수 있는 능력을 증가시키는 잔기로 치환됨으로써 변형된다. 구체적인 실시양태에서, 모티프는 일반 모티프 [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]와 더욱 밀접하게 맞도록 변형된다. 더욱 특히, 펩티드는 7번 위치에 F 또는 W를 포함하도록 제조된다.
본 발명의 펩티드는 또한 소수성 잔기에 인접해 있거나 또는 링커에 의해 상기 잔기로부터 분리되어 있는 티오리덕타제 모티프를 포함한다. 일단 CD1d 분자에 의해 제시되고 나면, 티오리덕타제 모티프는 NKT 세포를 활성화시킬 수 있는 능력을 증진시켜 그의 항-감염 및/또는 항-종양 활성, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 동종이식편 항원 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 벡터로부터의 항원에 대한 면역 반응을 억제할 수 있는 그의 능력을 증가시킨다.
따라서, 티오리덕타제 모티프는 아미노-말단 또는 카르복시-말단 단부에 부가될 수 있다는 사실에 따라, 전체 모티프에 대한 일반적 표현은 [CST]-XX-[CST]-링커-[FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH] 또는 [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]-링커-[CST]-XX-[CST]일 수 있다. 링커의 부가는 임의적이다. 존재할 경우, 상기 링커는 1 내지 7개 이하의 아미노산일 수 있다. 상기 일반적 표현은 단지 본 발명의 일반적인 이해를 돕기 위한 목적으로 제공되는 것임을 당업자는 명백히 알아야 한다.
본 발명은 또한 병원체에 의해 감염된 세포, 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐으로부터 유래된 펩티드를 제시하는 세포, 종양 세포, 이식편으로부터, 또는 유전자 요법/유전자 백신접종에 사용되는 바이러스 단백질로부터 방출된 동종항원을 제시하는 세포를 제거할 수 있는 그의 능력을 증가시키기 위한 목적으로 숙주에서 수동적으로 재투여하기 위한, 시험관내에서 수득되고 활성화된 NKT 세포에 관한 것이다. CD1d 양성 APC에 의한 NKT 세포의 시험관내 자극에 대한 대안으로서, 본 발명은 또한 CD1d 분자 상에 적재하기 위해 면역원성 펩티드의 발현을 말기 엔도솜으로 구동시킬 수 있는 유전자 구축물을 사용하는 APC의 형질감염 또는 형질도입 방법에 적용된다.
특히, 본 발명은 특이적 NKT 세포를 증대시켜, 그 결과로서,
(i) 시토카인 생산 증가,
(ii) 항원 제시 세포의 접촉성- 및 가용성 인자-의존성 제거 증가를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 따라서, 상기 결과는 세포내 병원체, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 세포에 대해서는 더욱 효율적인 반응이고, 이식편 및 유전자 요법/유전자 백신접종에 사용되는 바이러스 단백질에 대한 면역 반응을 더욱 효율적으로 억제할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 체액 또는 기관에서 필요한 특성을 가진 NKT 세포를 확인하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 NK1.1, CD4, NKG2D 및 CD244를 비롯한, NKT 세포의 표면 표현형에 의해 NKT 세포를 확인하는 것을 포함한다. 이어서, 세포를, CD1d 분자에 의해 제시될 수 있는 펩티드로서 정의된 NKT 세포 에피토프와 접촉시킨다. 이어서, 세포를 IL-2 또는 IL-15 또는 IL-7의 존재하에 시험관에서 증대시킨다.
따라서, 본 발명은 CD1d 결합 모티프 및 티오리덕타제 모티프를 포함하는, NKT 세포의 검출, 제조, 및 고갈을 위한 펩티드를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 펩티드는 단량체로, 또는 바람직하게는, 다량체로 단리된 CD1d 분자 상에 적재된다. CD1d 분자는 가용성 형태일 수 있거나, 고체 지지체에 부착되어 있을 수 있다.
본 발명은 감염되었을 때, 또는 이미 종양이 존재할 때에 실시되는 치유 요법으로서 간주되어야 한다. 이는 NKT 세포가 기억 사이클 내로 진입하는 것으로 간주되지 않는다는 사실 때문이다. NKT 세포가 활성화되었을 때, 상기 세포는 몇일 동안에 걸쳐 증대되고, 이어서 그 집단은 수축기 및 가능한 단기간의 무반응기에 진입한다. 그러나, 경우에 따라서는, 예방적 상황하에 본 발명의 펩티드를 사용하는 능동적 면역화에 의해 상기 요법을 실시하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 예로는 감염된 개체와 접촉한 직후인 것과 같은, 감염성 질환에 걸릴 위험이 매우 높은 환자가 있다. 따라서, 본 발명은 또한 능동적 백신접종에 의한, 또는 수동적 세포 전달에 의한 상기 요법의 예방적 용법을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 병원체에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 의약으로서의, (i) 병원체 관련 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오-옥시도리덕타제 모티프 (약칭하여 티오레독스 모티프)를 포함하는, 하나 이상의 단리된 소수성 면역원성 펩티드의 용도에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 대상체에서 자가항원, 동종인자 및/또는 알레르겐에 대한 면역 반응을 예방 및/또는 치료하기 위한 의약으로서의, (i) 자가항원, 동종인자 또는 및 알레르겐으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 소수성 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 대상체에서 종양을 치료하기 위한 의약으로서의, (i) 종양 관련 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 소수성 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 대상체에서 이식편 거부를 예방하기 위한 의약으로서의, (i) 동종항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 소수성 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 대상체에서 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 예방하기 위한 의약으로서의, (i) 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위한 바이러스 벡터로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 소수성 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한 상기 대상체에서 CD4+ NKT 세포의 활성화, 시토카인 생산 및 세포용해 활성을 증가시키기 위한 의약으로서의, (i) 병원체 관련 항원, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 관련 항원, 동종항원 또는 바이러스 벡터 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프 및 (ii) 티오레독스 모티프를 포함하는 하나 이상의 단리된 면역원성 펩티드의 용도를 포함한다.
본 발명의 추가의 이점은 CD1d 분자의 다형성 정도가 극히 제한된다는 점에 관한 것이다. 이를 통해 비근교계 집단, 예컨대 인간 또는 동물들이 요법을 위한단일의 또는 제한된 개수의 펩티드를 사용할 수 있게 된다. 추가로, 한 공여자로부터 유도된 NKT 세포는 다수의 수용자에서 수동 전달을 위해 사용될 수 있다. 이는 펩티드가 I형 MHC 또는 II형 분자에 의해 제시되고, 그의 다형성으로 인해 단일 펩티드가 다수의 수용자에 대해 사용되지 못하게 되는 것인 상황과는 매우 큰 대조를 이룬다.
NKT 세포 에피토프의 일반 구조는 P1 및 P7 위치에 소수성 잔기를 포함하고, 여기서 P4 위치는 지방족 쇄에 점유된다. 따라서, 일반 구조는 결국 [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY] (여기서 x는 임의의 아미노산을 나타낸다)로서 정의될 수 있다. P1, P4 및 P7 위치에는 열거된 임의의 아미노산이 존재할 수 있다. 아미노산은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 비천연 아미노산의 예로는 D-아미노산을 포함한다.
일반적으로, 환원 활성을 가진 유기 화합물은 펩티드 서열이다. 환원 활성을 가진 펩티드 단편은 글루타레독신, 뉴클레오레독신, 티오레독신 및 다른 티올/디술피드 옥시도리덕타제를 비롯한, 소형 디술피드 환원 효소인 티오리덕타제에서 접하게 된다. 이는 보존되는 활성 도메인 컨센서스 서열: C-XX-C, C-XX-S, C-XX-T, S-XX-C, T-XX-C (여기서 X는 임의의 아미노산을 나타난다) (문헌 [Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225]) 내의 레독스 활성 시스테인을 통해 단백질 (예컨대, 효소) 상의 디술피드 결합에 대해 환원 활성을 발휘한다. 상기 도메인은 또한 보다 큰 단백질, 예컨대 단백질 디술피드 이소머라제 (PDI) 및 포스포이노시티드 특이적 포스포리파제 C에서도 발견된다. 특히, 면역원성 펩티드는 레독스 모티프로서 티오리덕타제 서열 모티프 [CST]-XX-[CST]를 포함하고, 그에 대한 추가의 실시양태에서, 상기 [CST]-XX-[CST] 모티프는 T-세포 에피토프의 N-말단에 위치한다. 더욱 구체적으로, 상기 레독스 모티프에서 [CST] 위치 중 하나 이상이 Cys에 의해 점유되고; 따라서, 모티프는 [C]-XX-[CST] 또는 [CST]-XX-[C]이다. 본 출원에서, 상기 테트라펩티드는 "모티프" 또는 "레독스 모티프"라고 지칭될 것이다. 더욱 특히, 면역원성 펩티드는 서열 모티프 [C]-XX-[CS] 또는 [CS]-XX-[C]를 포함할 수 있다. 더욱더 특히, 면역원성 펩티드는 서열 모티프 C-XX-S, S-XX-C 또는 C-XX-C를 포함한다.
상기 면역원성 펩티드에서 모티프는 펩티드 내의 에피토프 서열 바로 옆에 인접하게 배치되거나, 또는 링커에 의해 T 세포 에피토프로부터 분리되어 있다. 더욱 특히, 링커는 7개 이하의 아미노산으로 된 아미노산 서열을 포함한다. 가장 특히, 링커는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산을 포함한다. 링커에 사용되는 전형적인 아미노산은 세린 및 트레오닌이다. 본 발명에 따른 링커를 포함하는 펩티드의 예는 C-XX-C-G-에피토프, C-XX-C-GG-에피토프 C-XX-C-SSS-에피토프 C-XX-C-SGSG-에피토프 등이다. 추가의 또 다른 특정 실시양태에서, 링커 서열은 CD1d-결합 모티프가 유래되는 폴리펩티드 서열 중에 천연적으로 존재하는 아미노산을 포함한다. 다양한 개수의 상기와 같은 천연 아미노산이 펩티드의 아미노- 또는 카르복시-말단 단부 중 어느 하나에 또는 양쪽 단부 모두에 포함될 수 있다.
면역원성 펩티드는 NKT 세포 에피토프 및 환원성 화합물 (모티프)을 포함하는 (인공) 서열의 N 또는 C 말단에 추가의 짧은 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기와 같은 아미노산 서열은 일반적으로 본원에서 '측면 서열'로서 지칭된다. 측면 서열은 면역원성 펩티드 중 레독스 모티프의, 및/또는 T-세포 에피토프의 N- 및/또는 C-말단에 배치될 수 있다. 면역원성 펩티드가 엔도솜성 표적 서열을 포함할 경우, 측면 서열은 상기 에피토프와 엔도솜성 표적 서열 사이에, 및/또는 환원성 화합물 (예컨대, 모티프)과 엔도솜성 표적 서열 사이에 존재할 수 있다. 더욱 특히, 측면 서열은 10개 이하의 아미노산으로 된, 또는 1 내지 7개의 아미노산으로 된 서열, 예컨대 2개의 아미노산으로 된 서열이다. 더욱 특히, 측면 서열은 CD1d 분자 내로 펩티드를 안정화시키는 데 유용한 벌키한 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 면역원성 펩티드 중의 레독스 모티프는 에피토프로부터 N-말단에 위치한다.
상기에서 상세하게 설명된 바와 같이, 면역원성 펩티드는 NKT 세포 에피토프 서열에 연결된, 본원에 기술되어 있는 것과 같은 환원성 모티프를 포함한다. 특별한 경우에, NKT 세포 에피토프는 그의 본래의 천연 서열 내에서 관심의 대상이 되는 NKT 세포 에피토프의 N- 또는 C-말단에 인접한 11개의 아미노산으로 된 서열 내에 레독스 특성을 가진 아미노산 서열을 포함하지 않는 단백질로부터 유래된 것이다.
특정 실시양태에서, NKT 세포 에피토프는 세포내 병원체로부터 유래된 것이다. 상기 병원체는 바이러스, 박테리아 또는 기생충일 수 있다. 바이러스로는 ssDNA, dsDNA 및 RNA 바이러스를 포함하고, 그의 예로는 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae) 및 피코나비리다에(Picornaviridae), 인플루엔자(influenza), 홍역 및 면역 결핍 바이러스가 있다. 박테리아 및 미코박테리아로는 미코박테리움 투베르쿨로시스, 인간 또는 동물에 대한 다른 미코박테리아 병원체, 예르시니오시스(Yersiniosis), 브루셀라(Brucella), 클라미디아에(Chlamydiae), 미코플라즈마(Mycoplasma), 리켓치아에(Rickettsiae), 살모넬라 및 시겔라에(Shigellae)를 포함한다. 기생충으로는 플라스모디움(Plasmodium), 레이슈마니아, 트리파노조마(Trypanosoma), 톡소플라즈마 곤디이(Toxoplasma gondii), 리스테리아(Listeria), 히스토플라즈마(Histoplasma)를 포함한다.
특정 실시양태에서, NKT 세포 에피토프는 갑상선 질환에서 티로글로불린, 갑상선 퍼옥시다제, TSH 수용체; 1형 당뇨병에서 인슐린 (프로인슐린), 글루탐산 데카르복실라제 (GAD), 티로신 포스파타제 IA-2, 열 충격 단백질 HSP65, 췌도 특이적 글루코스6-포스파타제 촉매 서브유닛 관련 단백질 (IGRP); 자가면역 부신염에서 21-OH 히드록실라제; 자가면역성 다선 증후군에서 17-알파 히드록실라제, 히스티딘 데카르복실라제, 트립토판 히드록실라제, 티로신 히드록실라제; 자가면역성 위염 및 악성 빈혈에서 H+/K+ ATPase 고유 인자; 다발성 경화증에서 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG), 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 단백지질 단백질 (PLP); 중증 근무력증에서 아세틸콜린 수용체; 자가면역성 눈 증후군에서 레티놀 결합 단백질 (RBP); 자가면역성 내이 질환에서 II형 및 IX형 콜라겐; 복강 질환에서 조직 트랜스글루타미나제; 염증성 장 질환에서 pANCA 히스톤 H1 단백질; 아테롬성동맥경화증에서 열 충격 단백질 HSP60 및 옥시-광밀도 지질단백질; 및 파킨슨병에서 시뉴클레인을 비롯한, 자가항원으로부터 유래된 것이다.
특정 실시양태에서, NKT 세포 에피토프는 (1) 응고 결함 또는 피브린 용해 결함용의 대체 요법에서 사용되는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드, (인자 VIII, 인자 IX 및 스타필로키나제 포함); (2) 호르몬, 예컨대 성장 호르몬 또는 인슐린; (3) 시토카인 및 성장 인자, 예컨대 인터페론-알파, 인터페론-감마, GM-CSF 및 G-CSF; (4) 면역 반응 조절을 위한 항체 (알레르기 질환에서 항-IgE 항체, 이식편 거부 및 다양한 자가면역 질환에서 항-CD3 및 항-CD4 항체, 및 비호지킨 림프종에서 항-CD20 항체 포함); (5) 신부전에서 에리트로포이에틴; 및 (6) 유전적으로 변형된 항원을 비롯한, 동종인자로부터 유래된 것이다.
특정 실시양태에서, NKT 세포 에피토프는 공기 매개 알레르겐, 예컨대 집 먼지 진드기로부터, 화분으로부터, 또는 가축으로부터 유래된 것, 식품 알레르겐, 예컨대 땅콩, 오브알부민, 시리얼, 과일 및 콩과 식물, 및 접촉성 알레르겐, 예컨대 라텍스를 비롯한, 알레르겐으로부터 유래된 것이다. 알레르겐 감작을 특징으로 하는 질환으로는 알레르기성 천식, 알레르기성 비부비동염, 아나필락시스 쇼크, 두드러기, 아토피 피부염 및 접촉성 피부염을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKT 세포 에피토프는 (1) 종양유전자, 예컨대 일부 흑색종에서 확인된 MAGE; (2) 원종양유전자, 예컨대 연조직 암종, 예컨대 신장 또는 부갑상선 암종 뿐만 아니라, 다발성 골수종에서 발현되는 시클린 D1; (3) 바이러스 유래 단백질, 예컨대 일부 암종에서 및 일부 호지킨 유형의 림프종에서 엡스타인-바 바이러스로부터 유래된 것; (4) 항-아폽토시스 인자인 생존 인자, 예컨대 서바이빈 또는 bcl2; (5) 클론형 결정기, 예컨대 소포성 림프종 또는 다발성 골수종에서 B 세포 수용체로부터 유래된 이디오타입 결정기 또는 T 세포 악성 종양에서 T 세포 수용체 결정기로부터 유래된 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 비롯한, 종양으로부터 유래된 것이다.
특정 실시양태에서, NKT 세포 에피토프는 주 조직적합성 I형 또는 II형 결정기, 부 조직적합성 복합체 또는 조직 관련 항원으로부터 유래된 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 비롯한, 동종항원으로부터 유래된 것이다. 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 세포 또는 고형 기관의 거부에 관여할 수 있다. 세포 이식편으로는 제대혈 세포 이식편, 줄기 세포 이식편, 또는 췌장 췌도 세포 이식편을 포함한다. 고형 기관 이식편으로는 신장, 폐, 심장, 간, 췌장, 뼈, 피부, 또는 연조직을 포함한다.
특정 실시양태에서, NKT 세포 에피토프는 RNA 바이러스 (감마-레트로바이러스 및 렌티바이러스) 또는 DNA 바이러스 (아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스바이러스)의 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 비롯한, 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터로부터 유래된 것이다.
본 발명의 면역원성 펩티드에 의해 유도되고 활성화된 NKT 세포는 심지어 복합체 항원에 기인하여서도 발병기전을 억제할 수 있다. 상기 세포를 활성화시키는 데 필요한 최소한의 요건은 CD1d 분자에 의해 제시된 동족 펩티드를 인식하는 것이고, 이로써 병원체가 적재된 세포의 살해, 또는 자가항원, 동종인자 또는 알레르겐을 제시하는 APC의 살해, 또는 종양 세포의 살해, 또는 동종항원을 제시하는 APC, 또는 바이러스 벡터로부터 유래된 항원을 제시하는 APC의 살해로 이어진다.
상기의 모든 상황하에서, 상기 면역원성 펩티드는 시토카인, 예컨대 IFN-감마 생산을 활성화시키는데, 이는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 비롯한 다른 이펙터 세포를 활성화시킬 것이다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두 세포내 병원체, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 항원, 동종항원 또는 바이러스 벡터 유래의 항원을 제시하는 세포의 제거에 참여할 수 있다.
하나 초과의 항원이 대상체에 존재하는 상황하에서, 상기 항원은 잠재적으로 상이한 APC에 의해 흡수될 수 있는 바, 같은 APC가 모든 관련된 항원을 제시할 수는 없다. 그러므로, 질환의 예방 또는 치료를 위해 2개 이상의 면역원성 펩티드의 조합이 사용될 수 있을 것으로 예상된다. 상기 면역원성 펩티드의 임의의 조합이 구상된다는 것을 당업자는 명백히 알아야 한다. 그러한 조합의 예로는 동종인자, 예컨대 응고 경로의 인자 VIII에 대한 항체 생산을 억제하는 펩티드와 혈우병 A (기능성 인자 VIII의 부재)의 유전자 요법을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 억제하기 위한 펩티드를 포함한다. 다른 예로는 병원체, 예컨대 HIV에 의한 감염과 미코박테리아 감염의 조합을 포함한다.
본 발명과 관련하여 사용하기 위한 면역원성 펩티드는 당업자로부터 공지된 방법에 의해 확인된다. 바람직한 실시양태에서, 일반 서열 [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY]를 포함하는 펩티드가 확인될 수 있다. 상기 펩티드는 온라인상에서 접근가능한 알고리즘을 사용함으로써 당업자에 의해 공지된 방법으로 확인된다. 예를 들어, 펩티드는 하기 웹사이트:
http://www. expasy .ch/to ols / scanprosite / 상에서 서열을 입력함으로써 확인될 수 있다.
이어서, 예를 들어, 당업계에 주지된 fmoc 고체상 합성법을 사용함으로써 합성에 의해 펩티드를 제조할 수 있다.
그러나, 본원에서 제공하는 일반 서열은 펩티드가 CD1d 결합 모티프를 포함한다는 표시로서 간주되어야 한다. 이어서, 상기 펩티드를 NKT 세포와의 반응성에 대하여 시험관내에서 시험하여야 한다. 이를 위해, CD1d+ APC를 동물 또는 인간 공급원으로부터 제조한다. 이어서, 상기 세포를 관심의 대상이 되는 펩티드 및 NKT 세포의 공급원과 함께 인큐베이션시킨다. NKT 세포의 활성화는 증식, 시토카인, 예컨대 IFN-감마 및 IL-4 및 표면 마커의 생산에 의해 확인할 수 있다. 상기 방법은 당업계에 잘 기술되어 있다. 추가로, CD1d 분자의 사량체는 본 발명의 펩티드에 특이적인 NKT 세포를 검출하기 위하여 상기 펩티드를 적재한 후에 사용될 수 있다. 한가지 가능성은 형광 표지된 사량체를 사용할 수 있고, 형광 분류 시스템 (facs)을 사용하여 검출할 수 있다는 점이다.
본 발명의 면역원성 펩티드는 발현 시스템, 예컨대 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포를 사용하여 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따라, 세포내 병원체에 의한 감염 치료용, 자가면역 질환, 동종인자에 대한 또는 알레르겐에 대한 면역 반응 치료용, 종양 치료용, 이식편 거부 치료용, 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응 치료용의 의약이 구상된다. 상기와 같은 많은 상황하에서, 치료는 예방적 요법으로서 구상될 수 있다. 본 발명의 의약은 반드시 그러한 것은 아니지만, 일반적으로는 활성 성분으로서 본 발명의 면역원성 펩티드, 상기 면역원성 펩티드에 대한 NKT 세포 집단 또는 상기 면역원성 펩티드를 발현할 수 있는 유전자 치료 벡터 중 하나 이상을 포함하는 (제약) 제제이다. 활성 성분(들) 외에도, 상기 제제는 (제약상 허용되는) 희석제, 담체 또는 아주반트 중 하나 이상을 포함할 것이다. 특히, 본 발명의 제약 조성물은 예방 또는 치료 적용을 위한 백신이다.
본 발명에 따라, 자가면역 질환 치료용, 동종인자에 대한 면역 반응 치료용, 알레르기 질환 치료용, 종양 치료용, 이식편 거부 치료용 및 유전자 요법 및 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대하여 유도되는 면역 반응 치료용의 의약이 구상된다.
따라서, 본 발명은 서열 [CST]-XX-[CST]의 티오리덕타제 모티프에 커플링된, 병원체 관련 항원, 자가항원, 알레르겐, 동종인자, 종양 항원, 이식편으로부터 방출된, 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 벡터로부터 유래된 항원의 하나 이상의 NKT 세포 에피토프를 포함하는, 면역원성 펩티드에 관한 것이다.
모티프에서 아미노 말단 시스테인은 표적 단백질 상의 디술피드 가교에 대하여 친핵성 공격을 가한다. 디술피드 가교는 환원되고, 모티프의 제2 시스테인과의 전자 교환을 통해 환원된 형태의 표적 단백질이 유리되고, 이어서 표적 단백질의 이성체화 및/또는 동종이량체화가 이루어진다. 일부 경우에서는, 상이한 단백질과의 전자 교환에 의해 이종이량체화가 일어날 수 있다. 최종 결과는 표적 단백질 입체배치 변화 (이성체화)이거나, 또는 이량체 또는 고차 중합체 형성이다. 본원에서는 제한하고자 하는 어떤 의도없이, 일례로서 상기와 같은 메카니즘을 제공한다.
NKT 세포 에피토프 및 티오리덕타제 모티프는 임의로 링커에 의해 분리되어 있을 수 있다. 추가의 임의적 실시양태에서, 면역원성 펩티드는 추가로 엔도솜 표적 서열 (예컨대, 말기 엔도솜성 표적 서열) 및/또는 추가의 "측면" 서열을 포함한다.
추가로 상세하게 설명되는 바와 같이, 본 발명의 면역원성 펩티드는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있고, 이를 통해 비천연 아미노산을 도입시킬 수 있다. 따라서, 티오리덕타제 모티프의 시스테인 잔기는 티올기를 가진 또 다른 아미노산, 예컨대 티올 관능기를 가진 머캅토발린, 호모시스테인 또는 다른 천연 또는 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 환원 활성을 가지도록 하기 위해서는 시스테인 디술피드 가교의 일부로서 시스테인 잔기가 존재하지 않아야 한다. 그럼에도 불구하고, 메틸화된 시스테인은 생체내에서 유리 티올기를 포함하는 시스테인으로 전환될 수 있는 바, 시스테인 잔기는 예컨대 메틸화를 통해 변형될 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 티오리덕타제 모티프를 포함하는 본 발명의 면역원성 펩티드에서, 상기 모티프는 에피토프가 CD1d 그루브에 꼭 들어맞았을 때, 상기 모티프가 CD1d 결합 그루브의 바깥 쪽에 남아있도록 위치한다. 상기 모티프는 펩티드 내의 에피토프 서열 바로 옆에 인접하게 배치되거나, 또는 링커에 의해 T 세포 에피토프로부터 분리되어 있다. 더욱 특히, 링커는 7개 이하의 아미노산으로 된 아미노산 서열을 포함한다. 가장 특히, 링커는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산을 포함한다. 상기 모티프가 에피토프 서열에 인접해 있는 경우인 본 발명의 펩티드의 특정 실시양태에서, 그 위치는 에피토프 서열과 비교하여 P-4 내지 P-1 또는 P+1 내지 P+4 위치로 표시된다. 펩티드 링커 이외에도, 다른 유기 화합물이 면역원성 펩티드의 일부를 서로 연결시켜 주는 링커로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 면역원성 펩티드 중의 티오리덕타제 모티프는 에피토프로부터 N 말단에 위치한다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드는 티오리덕타제 모티프 이외에도, 병원체 관련 항원, 자가- 또는 동종인자, 알레르겐, 종양 유래 항원, 이식편에 의해 방출된 항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 벡터로부터 유래된 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프를 포함한다. 단백질 서열 중의 NKT 세포 에피토프는 기능적 검정법 및/또는 하나 이상의 인실리코 예측 검정에 의해 확인될 수 있다. NKT 세포 에피토프 서열 중의 아미노산은 CD1d 단백질의 결합 그루브 중의 그의 위치에 따라 번호매김된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 내에 존재하는 NKT 세포 에피토프는 7 내지 25개의 아미노산으로 구성되고, 추가로, 더욱 특히, 7 내지 16개의 아미노산으로 구성되고, 추가로, 가장 특히, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 아미노산으로 구성된다. 더욱 특정의 실시양태에서, NKT 세포 에피토프는 7개의 아미노산으로 된 서열로 구성된다. 추가의 특정 실시양태에서, NKT 세포 에피토프는 CD1d 분자에 의해 NKT 세포에게 제시되는 에피토프이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, NKT 세포 에피토프 서열은 CD1d 단백질의 틈새에 꼭 들어맞는 에피토프 서열, 더욱 특히 CD1d 틈새에 꼭 들어맞는 7개의 아미노산 펩티드이다. 본 발명의 면역원성 펩티드의 NKT 세포 에피토프는 단백질의 천연 에피토프 서열에 상응할 수 있거나, 또는 변형된 NKT 세포 에피토프가 천연 NKT 세포 에피토프 서열과 유사하게 CD1d 틈새 내에 결합할 수 있는 그의 능력을 보유한다면, 그의 변형된 버전일 수 있다. 변형된 NKT 세포 에피토프는 CD1d 단백질에 대하여 천연 에피토프와 동일한 결합 친화도를 가질 수 있지만, 이는 또한 저하된 친화도 또한 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 펩티드의 결합 친화도는 원래의 펩티드보다 10배 이상 더 낮고, 더욱 특히 5배 이상 더 낮다. 본 발명의 펩티드는 단백질 복합체를 안정화시키는 효과를 발휘한다는 것이 본 발명의 발견이다. 따라서, 펩티드-CD1d 복합체의 안정화 효과가 CD1d 분자에 대한 변형된 에피토프의 저하된 친화도를 보상한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 펩티드는 추가로 프로세싱 및 CD1d 결정기 내의 제시를 위한 펩티드의 (말기) 엔도솜으로의 흡수를 촉진시키는 아미노산 서열 (또는 또 다른 유기 화합물)을 포함한다. 말기 엔도솜 표적은 단백질의 세포질 테일에 존재한 신호에 의해 매개되고, 잘 확인된 펩티드 모티프, 예컨대 디류신 기반 [DE]XXXL[LI] 또는 DXXLL 모티프 (예컨대, DXXXLL), 티로신 기반 YXXØ 모티프 또는 소위 산성 클러스터 모티프라는 것에 상응한다. 기호 Ø는 벌키한 소수성 측쇄를 가진 아미노산 잔기, 예컨대 Phe, Tyr 및 Trp를 나타낸다. 말기 엔도솜 표적 서열을 통해 프로세싱될 수 있고, CD1d 분자에 의해 항원 유래 T 세포 에피토프는 효율적으로 제시될 수 있다. 상기 엔도솜성 표적 서열은 예를 들어, gp75 단백질 (문헌 [Vijayasaradhi et al. (1995) J Cell Biol 130, 807-820]), 인간 CD3 감마 단백질, HLA-BM β (문헌 [Copier et al. (1996) J. Immunol . 157, 1017-1027]), DEC205 수용체의 세포질 테일 (문헌 [Mahnke et al. (2000) J Cell Biol 151, 673-683]) 내에 포함되어 있다. 엔도솜으로의 분류 신호로서 작용하는 펩티드의 다른 예는 문헌 [Bonifacio and Traub (2003) Annu . Rev . Biochem . 72, 395-447]의 리뷰에 개시되어 있다. 별법으로, 서열은 단백질로부터의 준우성 또는 소수 T 세포 에피토프의 것일 수 있는데, 이는 병원체 관련 유래 NKT 세포 에피토프, 자가- 또는 동종인자 유래 NKT 세포 에피토프, 알레르겐 유래 NKT 세포 에피토프, 종양 항원 유래 NKT 세포 에피토프, 또는 이식편에 의해 방출된 동종항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 벡터로부터의 항원으로부터 유래된 NKT 세포 에피토프에 대한 NKT 세포 반응을 극복하지 못한 상태로, 말기 엔도솜에서의 흡수를 촉진시킨다.
추가의 특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 펩티드는 그의 천연 서열 내에 티오리덕타제 모티프를 포함하지 않는 NKT 세포 에피토프를 포함하는 펩티드이다. 그러나, 대체 실시양태에서, CD1d 틈새에 결합하는 NKT 세포 에피토프는, 예컨대 본원에 기술된 바와 같이, 그의 에피토프 서열 내에 티오-옥시도리덕타제 모티프를 포함할 수 있고; 상기 NKT 세포 에피토프를 포함하는 본 발명에 따른 면역원성 펩티드는 (틈새 내에 매립되어 있는, 에피토프 중에 존재하는 티오-옥시도리덕타제 모티프에 반하여) 부착된 잔기가 환원 활성을 보장할 수 있도록 상기 에피토프의 N- 또는 C-말단에 커플링된 (그에 인접해 있거나 또는 링커에 의해 분리되어 있는) 또 다른 유리 티오-옥시도리덕타제 모티프를 추가로 포함하여야 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 본 발명의 면역원성 펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 병원체 관련 항원으로부터, 관심의 대상이 되는 자가항원 또는 동종인자, 알레르겐, 종양 관련 항원, 이식편으로부터 방출된 동종항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 벡터로부터 유래된 항원으로부터 NKT 세포 에피토프를 확인하는 것을 포함한다. NKT 세포 에피토프의 시험관내 및 인실리코 확인 방법은 당업계에 충분하게 알려져 있고, 일부 측면에서 하기에서 상술된다. 상기 방법은 추가로 확인된 NKT 세포 에피토프 및 티오리덕타제 모티프 (링커(들) 포함 또는 비포함), 측면 서열(들) 또는 엔도솜성 표적 서열을 포함하는 본 발명의 면역원성 펩티드를 생성하는 것을 포함한다. 이어서, 생성된 면역원성 펩티드를 병원체 관련 항원, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 유래 항원, 이식편으로부터 방출된 동종항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터로부터 유래된 항원에 대한 CD4+ NKT 세포를 유도할 수 있는 능력에 관하여 평가한다.
병원체 관련 항원의, 또는 자가항원의, 또는 동종인자의, 또는 알레르겐의, 또는 종양의, 또는 동종항원의, 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터의 NKT 세포 에피토프(들)로부터 출발하여 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 생성한다.
특히, 사용되는 NKT 세포 에피토프는 우성 NKT 세포 에피토프일 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용하기 위한 NKT 세포 에피토프를 병원체 관련 항원으로부터, 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 종양 유래 항원, 이식편에 의해 방출된 동종항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 벡터로부터 유래된 항원으로부터 확인 및 선택하는 것은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 병원체 관련 항원으로부터, 자가항원 또는 동종인자, 알레르겐, 종양 유래 항원, 이식편에 의해 방출된 동종항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 벡터로부터 유래된 항원으로부터 단리된 펩티드 서열을 예를 들어, T 세포 생물학 기법에 의해 시험함으로써 펩티드 서열이 NKT 세포 반응을 유도하는지 여부를 측정한다. NKT 세포 반응을 유도하는 것으로 밝혀진 상기 펩티드 서열은 NKT 세포 자극 활성을 가지는 것으로 정의된다. 병원체 관련 항원, 자가항원 또는 동종인자, 알레르겐, 종양 유래 항원, 이식편에 의해 방출된 동종항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 벡터로부터 유래된 항원에 대해 감작된 개체로부터 수득된 NKT 세포를 상기 항원으로부터 유래된 펩티드/에피토프와 함께 배양하고, 예컨대 삼중 수소 티미딘의 세포 흡수에 의해 측정되는 바에 따른 것으로서, 상기 펩티드/에피토프에 대한 반응으로 NKT 세포가 증식되었는지 여부를 확인함으로써 인간 NKT 세포 자극 활성을 추가로 시험할 수 있다. NKT 세포의 펩티드/에피토프에 대한 반응에 관한 자극 지수는 펩티드/에피토프에 대한 반응의 최대 CPM을 대조군 CPM으로 나눔으로써 계산할 수 있다. 배경 수준과 동일하거나, 배경 수준의 2배보다 더 큰 NKT 세포 자극 지수 (S.I.)는 "양성"인 것으로 간주된다. 양성 결과를 사용하여 시험된 펩티드/에피토프 군에 대한 각 펩티드/에피토프의 평균 자극 지수를 계산한다. 비천연 (또는 변형된) NKT 세포 에피토프를 추가로 임의로 CD1d 분자에 대한 그의 결합 친화도에 대하여 시험할 수 있다. 비천연 (또는 변형된) NKT 세포 에피토프의 CD1d 분자에의 결합은 다른 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 가용성 CD1d 분자를 수득하고, 합성에 의해 또는 화학적 커플링에 의해 사량체로 제조한다. 친화성 크로마토그래피에 의해 CD1d 분자를 정제한다. 가용성 CD1d 분자를 상기 CD1d 분자에 대한 그의 강한 결합 친화도에 따라 제조된 비오틴으로 표지된 참조 펩티드와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, CD1d 결합에 대하여 평가하고자 하는 펩티드를 상이한 농도로 인큐베이션시키고, 뉴트라비딘를 첨가함으로써 참조 펩티드를 그의 CD1d 결합으로부터 참조 펩티드를 제거할 수 있는 그의 능력을 계산한다. 상기 방법은 예를 들어, 문헌 [Texier et al., (2000) J. Immunology 164, 3177-3184]에서 살펴볼 수 있다. 본 발명의 면역원성 펩티드의 평균 NKT 세포 자극 지수는 2.0 이상이다. NKT 세포 자극 지수가 2.0 이상인 면역원성 펩티드는 예방제 또는 치료제로서 유용한 것으로 간주된다. 더욱 특히, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드의 평균 NKT 세포 자극 지수는 2.5 이상, 3.5 이상, 4.0 이상, 또는 심지어 5.0 이상이다. 추가로, 상기 펩티드의 확신 지수 (P.I.)는 전형적으로 약 100 이상, 150 이상, 약 200 이상 또는 약 250 이상이다. 펩티드에 대한 확신 지수는 평균 NKT 세포 자극 지수에, 바이러스 벡터 항원에 대해 감수성인 개체 집단 (예컨대, 개체수 9명 이상, 개체수 16명 이상, 또는 29 또는 30명 이상, 또는 그보다 많은 개체수) 중의, 펩티드에 대해 반응하는 NKT 세포를 가지는 개체의 비율(%)을 곱함 (따라서, 펩티드/에피토프의 무차별적 성질에 의해 증대된 SI에 상응)으로써 측정된다. 따라서, 확신 지수는 펩티드에 대한 NKT 세포의 반응 강도 (S.I.) 및 바이러스 벡터 항원에 대해 감수성인 개체 집단 중 펩티드에 대한 NKT 세포의 반응 빈도 둘 모두를 나타낸다. 예를 들어, 우수한 지도화 기법에 의해 최적의 NKT 세포 에피토프를 결정하기 위해, T 세포 자극 활성을 가지고 따라서 T 세포 생물학 기법에 의해 확인된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드를 펩티드의 N- 또는 C-말단에서 아미노산 잔기를 부가하거나 결실시킴으로써 변형시키고, 변형된 펩티드에 대한 NKT 세포 반응성의 변화를 측정하는 시험을 수행한다. T 세포 생물학 기법에 의해 결정되는 바, 본래의 단백질 서열 중에서 중첩 영역을 공유하는 2개 이상의 펩티드가 인간 NKT 세포 자극 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다면, 상기 펩티드 모두 또는 그의 일부를 포함하는 추가의 펩티드를 제조할 수 있고, 이러한 추가의 펩티드를 유사한 방법에 의해 시험할 수 있다. 상기 기법 수행 후, 펩티드를 선별하고, 재조합적으로 또는 합성적으로 제조한다. 펩티드/에피토프에 대한 NKT 세포의 반응 강도 (예컨대, 자극 지수) 및 개체 집단 중 펩티드에 대한 NKT 세포의 반응 빈도를 비롯한, 다양한 인자에 기초하여 NKT 세포 에피토프 또는 펩티드를 선별한다.
병원체 관련 항원으로부터, 자가항원 또는 동종인자, 알레르겐, 종양 유래 항원, 이식편에 의해 방출된 동종항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 벡터로부터 유래된 항원으로부터 확인하는 데 사용되는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 위치 클로닝 또는 발현 클로닝 전략법을 사용하여 후보 항원을 확인할 수 있다. 상기 방법론에 관한 전체적인 설명을 위해서, 예를 들어, 문헌 [Mendoza et al, Immunity, 7: 461-472, 1997]을 참조할 수 있다. 별법으로, CD1d 분자에서 APC에 의해 실제로 제시되는 펩티드를 다양한 크로마토그래피 방법에 의해 용리시키고 분리할 수 있다. 상기 방법론에 관한 전체적인 설명은 문헌 [Scott et al, Immunity, 12: 711-720, 2000]에서 살펴볼 수 있을 것이다. 하나 이상의 시험관내 알고리즘에 의해 후보 항원을 스크리닝함으로써 항원성 단백질 내의 NKT 세포 에피토프 서열을 확인할 수 있다. 적합한 알고리즘으로는 하기 웹사이트:
http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/ 상에서 발견되는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
더욱 특히, 상기 알고리즘을 통해 항원성 단백질 내의, CD1d 분자의 그루브에 꼭 들어맞는 하나 이상의 펩티드 서열을 예측할 수 있다.
본 발명의 면역원성 펩티드는, 예컨대 박테리아 세포 (예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)), 효모 세포 (예컨대, 피치아(Pichia) 종, 한세눌라(Hansenula) 종, 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 종), 곤충 세포 (예컨대, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로부터의 것), 식물 세포 또는 포유동물 세포 (예컨대, CHO, COS 세포)에서의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 한편, 그에 따라 요구되는 적합한 발현 벡터의 구축 (추가 정보, 예컨대 프로모터 및 종결 서열 포함)은 표준 재조합 DNA 기법을 포함한다. 재조합적으로 제조된 본 발명의 면역원성 펩티드는, 예컨대 면역원성 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 인접하게 삽입된 효소 절단 부위의 효소적 절단에 이은, 적합한 정제를 통해 보다 큰 전구체 단백질로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 면역원성 펩티드의 길이가 제한되어 있다는 점을 고려하여, 상기 펩티드는 화학적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 펩티드는 상이한 아미노산의 서로 간의 커플링에 의해 제조된다. 화학적 합성은 특히, 예컨대 D-아미노산, 비천연적으로 발생된 측쇄를 가진 아미노산, 또는 변형된 측쇄를 가진 천연 아미노산, 예컨대 메틸화된 시스테인을 포함하는 경우에 적합하다. 화학적 펩티드 합성 방법은 잘 기술되어 있고, 펩티드는 회사, 예컨대 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 및 다른 회사로부터 주문할 수 있다. 펩티드 합성은 고체상 펩티드 합성(SPPS) 또는 다르게는, 용액상 펩티드 합성으로서 수행될 수 있다. 가장 잘 알려진 SPPS 방법은 t-Boc 및 Fmoc 고체상 화학법으로서, 이는 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 추가로, 원래 켄트(Kent)에 의해 기술되고 (문헌 [Schnolzer & Kent (1992) Int . J. Pept . Protein Res . 40, 180-193]), 예를 들어 문헌 [Tarn et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205]에 리뷰되어 있는 바와 같이, 펩티드는 결찰 전략법 (2개의 비보호 펩티드 단편의 화학선택적 커플링)을 사용하여 서로 연결됨으로써 보다 장쇄의 펩티드를 형성할 수 있다. 이는 SPPS 범주를 훨씬 능가하는, 단백질 합성을 달성할 수 있는 방대한 잠재능을 제공한다. 크기가 100-300개의 잔기인 다수의 단백질을 상기 방법에 의해 성공적으로 합성하였다. SPPS에서의 엄청난 진전에 기인하여, 합성 펩티드는 계속해서 생화학, 약리학, 신경생리학, 효소학 및 분자생물학 연구 분야에서 계속 증가하는 중요한 역할을 수행해오고 있다.
관심의 대상이 되는 면역원성 펩티드의 물리적 및 화학적 특성 (예컨대, 가용성, 안정성)을 조사하여 펩티드가 치료 조성물에서 사용하기에 적합한지/적합할 수 있는지 여부를 확인한다. 전형적으로, 펩티드의 서열을 조절함으로써 이를 최적화시킨다. 임의로, 합성 후에 당업계에 공지된 기법을 사용하여 펩티드를 변형시킬 수 있다 (화학적 변형, 예컨대 관능기 부가/결실).
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 생체내 또는 시험관내 (생체외)에서 병원체 관련 항원 특이적 CD4+ NKT 세포, 또는 자가항원- 또는 동종인자 특이적 CD4+ NKT 세포, 또는 알레르겐 특이적 CD4+ NKT 세포, 또는 종양 항원 특이적 CD4+ NKT 세포, 또는 이식편으로부터 방출된 동종항원에 대해 특이적인 CD4+ NKT 세포, 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 단백질로부터의 항원에 대해 특이적인 CD4+ NKT 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 특히, 상기 NKT 세포는 상기 항원을 제시하는 임의의 세포에 대하여 강한 증식 특성을 보이며 반응하고, 세포 집단으로서 수득될 수 있다. 추가로, 특히 상기 NKT 세포는 자가- 또는 동종항원, 알레르겐, 이식편으로부터 방출된 항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 단백질로부터 유래된 항원을 제시하는 임의의 세포에 대하여 강한 억제 특성을 보이며 반응하고, 세포 집단으로서 수득될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 수득될 수 있는 상기 항원 특이적 CD4+ NKT 세포 (집단)으로 증대된다.
한 실시양태에서, 말초 혈액 세포를 단리시키고, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 단리된 말초 혈액 세포와 접촉시켜 시험관내에서 세포 집단을 자극시키고, 더욱 특히, IL-2 또는 IL-15 및 IL-7의 존재하에서 자극받은 세포 집단을 증대시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 더 많은 개수의 CD4+ NKT 세포가 생산되고, (항원 특이적 에피토프를 포함하는 펩티드를 사용함으로써) 병원체 관련 항원에 대해, 또는 자가- 또는 동종-항원, 알레르겐, 종양 관련 항원, 이식편으로부터 방출된 항원 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에 사용되는 바이러스 단백질로부터의 항원에 특이적인 상기 세포가 생성될 수 있다는 이점을 가진다.
대체 실시양태에서, 생체내에서, 즉, 대상체에게 본원에서 제공하는 면역원성 펩티드를 투여하고, 생체내에서 생성된 CD4+ NKT 세포를 수집함으로써 CD4+ NKT 세포를 생체내에서 생성할 수 있다.
상기 방법에 의해 수득될 수 있는 병원체 관련 항원 특이적 CD4+ NKT 세포는 대상체에서 바이러스, 박테리아 또는 기생충에 의한 감염과 관련된 이환 및/또는 사망을 예방하기 위한 예방용 의약으로서의 용도로 특히 관심의 대상이 된다. 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 자가항원 또는 동종인자 특이적 CD4+ NKT 세포는 자가면역 질환 또는 동종인자에 대한 반응과 관련된 이환 및/또는 사망을 억제하기 위한 의약으로서의 용도로 특히 관심의 대상이 된다. 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 알레르겐 특이적 CD4+ NKT 세포는 알레르기 질환과 관련된 이환 및/또는 사망을 억제하기 위한 의약으로서의 용도로 특히 관심의 대상이 된다. 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 종양 항원 특이적 CD4+ NKT 세포는 종양과 관련된 이환 및/또는 사망을 억제하기 위한 의약으로서의 용도로 특히 관심의 대상이 된다. 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 이식편 동종항원 특이적 CD4+ NKT 세포는 이식편 거부를 예방하기 위한 것으로 특히 관심의 대상이 된다. 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 바이러스 단백질 특이적 CD4+ NKT 세포는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종과 관련된 이환 및/또는 사망을 억제하기 위한 의약으로서의 용도로 특히 관심의 대상이 된다.
본 발명의 면역원성 펩티드의 상기 기술된 용도 중 임의의 것을 위해, 상기 펩티드는 상기 CD4+ NKT 세포에 의해 치환될 수 있다. 동종이형 및 자가 세포의 용도 둘 모두가 구상된다. (즉, 세포내 병원체에 의한 감염과 관련된 이환을 예방하기 위해, 자가면역 질환, 동종인자에 대한 반응, 알레르겐 노출, 종양, 이식편 거부 및 바이러스 벡터 항원에 대한 반응과 관련된 이환을 예방 또는 치료하기 위해) 그를 필요로 하는 대상체에게 상기 항원 특이적 CD4+ NKT 세포를 투여하는 것을 포함하는 임의의 방법이 본 발명의 일부가 된다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 예컨대 재조합 발현 또는 유전자 요법에서의 상기 핵산 서열의 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 핵산 서열은 본 발명의 면역원성 펩티드를 발현할 수 있다.
본 발명의 면역원성 펩티드는 임의의 적합한 유전자 요법 방법에 의해 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 병원체와 관련된 이환/사망의 예방을 위한, 또는 자가항원 또는 동종인자에 대한 면역 반응의 억제를 위한 본 발명의 임의의 용도 또는 방법에서, 본 발명의 면역원성 펩티드를 사용하는 면역화를 입양 세포 전달과 병용할 수 있다. 병용할 경우, 상기 면역화, 입양 세포 전달 및 유전자 요법은 동시에, 또는 임의의 가능한 조합으로 순차적으로 사용될 수 있다.
유전자 요법에서, 면역원성 펩티드를 코딩하는 재조합 핵산 분자는 표적 세포로의 전달을 위해 네이키드 DNA로서, 또는 리포솜 또는 다른 지질 시스템 중에서 사용될 수 있다. 인간 유전자 요법에서 사용하기 위한 것으로 플라스미드 DNA를 세포 내로 직접적으로 전달하는 다른 방법이 당업자에게 주지되어 있고, 이는 단백질에의 플라스미드 DNA의 복합체를 형성함으로써 세포 상의 수용체에 DNA를 표적화하는 것을 포함한다. 그의 가장 간단한 형태로, 간단하게는 미세주사 공정을 거쳐 미세량의 DNA를 세포의 핵 내로 주사함으로써 유전자 전달을 수행할 수 있다. 일단 재조합 유전자가 세포 내로 도입되고 나면, 상기 유전자는 세포의 정상적인 전사 및 번역 메카니즘에 의해 인식될 수 있고, 유전자 생성물로 발현될 것이다. DNA를 더 많은 수의 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법들도 시도되어 왔다. 이러한 방법으로는 DNA를 인산칼슘으로 침전시키고, 세포흡수작용에 의해 세포 내로 흡수시키는 형질감염; 세포를 고전압 펄스에 노출시켜 구멍을 막에 도입하는 전기천공; 표적 세포와 융합하는 친유성 소포체 내로 DNA를 패킹하는 리포펙션/리포솜 융합; 및 소형 추진체에 결합된 DNA를 사용한 입자 충격을 포함한다. DNA를 세포 내로 도입시키는 또 다른 방법은 DNA를 화학적으로 변형된 단백질에 커플링시키는 것이다. 아데노바이러스 단백질은 엔도솜을 탈안정화시킬 수 있고, 세포 내로의 DNA 흡수를 증진시킬 수 있다. DNA 복합체를 함유하는 용액에 아데노바이러스를 혼합하거나, 또는 단백질 가교제를 사용하여 아데노바이러스에 공유적으로 부착된 폴리리신에 DNA를 결합시키면, 실질적으로 재조합 유전자의 흡수 및 발현은 개선된다. 아데노 관련 바이러스 벡터는 또한 혈관 세포 내로 유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "유전자 전달"이란 외래 핵산 분자를 세포 내로 도입시키는 과정을 의미하는 것으로, 이러한 과정이 수행됨으로써 보통은 상기 유전자에 의해 코딩되는 특정 생성물이 발현될 수 있다. 상기 생성물로는 단백질, 폴리펩티드, 안티센스 DNA 또는 RNA, 또는 효소적으로 활성을 띠는 RNA를 포함할 수 있다. 유전자 전달은 배양 세포에서, 또는 포유동물 내로의 직접적인 투여에 의해 수행될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 코딩하는 핵산 분자 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 핵산 분자 서열이 오직 특이적 조직에서만 발현되도록 생성된다. 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 방법, 예컨대 특이적으로 하나 이상의 조직(들) 또는 기관(들)에서 펩티드의 발현을 지시하는 프로모터의 제어하에 본 발명의 면역원성 펩티드를 코딩하는 서열을 배치함은 당업계에 주지되어 있다. 본 발명에 따른 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (예컨대, cDNA), 그의 상동체 또는 유도체를 표적화된 조직 또는 세포 집단으로 전달하기 위해 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, RNA 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 사용될 수 있다. 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 상기 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 구축할 수 있다. 별법으로, 본 발명에 따른 면역원성 펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조작된 세포가 유전자 요법에서 사용될 수 있다.
유전자 요법에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 펩티드 또는 폴리펩티드가 유래된 된 전체 항원의 일부일 수 있다는 것을 당업자는 확실히 알고 있어야 한다.
유전자 전달을 통해 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드가 확실하게 투여되는 경우 (즉, 투여되었을 때, 생체내에서 본 발명에 따른 펩티드가 활실하게 발현될 수 있도록 핵산이 투여되는 경우), 핵산의 적절한 투여량은 도입된 핵산의 결과로서 발현되는 펩티드의 발현량에 기초하여 결정될 수 있다.
본 발명의 의약은 반드시 그러한 것은 아니지만, 일반적으로는 활성 성분으로서 본 발명의 면역원성 펩티드, CD4+ NKT 세포 면역원성 펩티드 (집단) 또는 상기 면역원성 펩티드를 발현할 수 있는 유전자 치료 벡터 중 하나 이상을 포함하는 (제약) 제제이다. 활성 성분(들) 외에도, 상기 제제는 (제약상 허용되는) 희석제, 담체 또는 아주반트 중 하나 이상을 포함할 것이다. 전형적으로, 제약상 허용되는 화합물 (예컨대, 희석제, 담체 또는 아주반트)는, 예컨대 약전 편람(Pharmacopeia handbook) (예컨대 미국, 유럽 또는 국제 약전)에서 살펴볼 수 있다. 본 발명의 의약 또는 제약 조성물은 보통 (예방학상 또는 치료학상) 유효량의 활성 성분(들)을 포함하며, 여기서 유효라는 것은 예방 또는 치료하고자 하는 병증 또는 장애에 대하여 상대적인 것이다. 특히, 본 발명의 제약 조성물은 예방 또는 치료 적용을 위한 백신이다.
본 발명의 의약 또는 제약 조성물은 상기 의약 또는 조성물의 다중 투여를 포함하는 예방학적 또는 치료학적 요법의 일부로서 그를 필요로 필요로 하는 대상체에게 투여되어야 할 필요가 있을 수 있다. 상기 다중 투여는 보통 순차적으로 이루어지고, 2회에 걸친 투여 사이의 시간 간격은 활성 성분의 성질 및 예방 또는 치료되는 병증의 성질에 따라 달라질 수 있고, 그에 맞게 조정될 수 있다. 단일 투여에서 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 활성 성분의 양 또한 달라질 수 있으며, 이는 인자, 예컨대 대상체의 신체 상태 (예컨대, 체중, 연령), 예방 또는 치료하고자 하는 병증의 상태, 및 치료의, 의사 또는 간호사의 경험에 의존할 것이다.
예를 들어, "희석제"라는 용어는 생리학적 염수 용액을 의미한다. "아주반트"라는 용어는 일반적으로, 제공되었을 때, 혼자서는 설령 있다 해도, 직접적인 효과를 거의 발휘하지 않으면서, 다른 작용제 (예컨대, 약물, 백신)의 효과를 개지시키는 (바람직하게, 증가시키는) 약리학적 또는 면역학적 작용제를 의미한다. 아주반트의 일례로서, 수산화알루미늄 (알룸)이 제공되는데, 여기에 본 발명의 면역원성 펩티드가 흡착될 수 있다. 추가로, 다른 아주반트들이 다수 당업계에 알려져 있으며, 이것이 단, CD1d에서 펩티드 제시 및 NKT 세포 활성화를 촉진시키는 한, 사용될 수 있다. "제약상 허용되는 담체"라는 용어는, 예를 들어, 상기 조성물을 용해시키거나, 분산시키거나, 또는 확산시킴으로써 치료하고자 하는 장소에 활성 성분을 적용시키거나 보급하는 것을 촉진시키기 위해서, 및/또는 활성 성분의 효능은 손상시키지 않으면서 그의 보관, 수송 또는 취급을 촉진시키기 위해서, 활성 성분과 함께 제제화되는 임의의 재료 또는 물질을 의미한다. 이는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제 (예를 들어, 페놀, 소르브산, 클로로부탄올), 등장화제 (예컨대, 당 또는 염화나트륨) 등을 포함한다. 조성물 중 활성 성분의 작용 지속 기간을 제어하기 위해 추가의 성분을 포함시킬 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 고체 또는 액체 또는 액체로 압착된 기체일 수 있고, 즉, 본 발명의 조성물은 농축액, 에멀젼, 액제, 과립제, 더스트, 분무제, 에어로졸, 현탁제, 연고제, 크림제, 정제, 펠릿제 또는 분제로서 적합하게 사용될 수 있다. 상기 제약 조성물 및 그의 제제에서 사용하기에 적합한 제약 담체는 당업자에게 주지되어 있고, 본 발명 내에서의 그의 선택에 있어 특별한 제한은 없다. 이는 또한, 상기 둘 모두가 제약업계의 관행과 일관된다면, 즉, 담체 및 첨가제가 포유동물에게 영구적으로 손상을 가하지 않는다면, 첨가제, 예컨대 습윤제, 분산제, 스티커, 점착제, 유화제, 용매, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제 (예를 들어, 페놀, 소르브산, 클로로부탄올), 등장화제 (예컨대, 당 또는 염화나트륨) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 임의의 공지된 방식으로, 예를 들어, 1단계 또는 다단계 방법으로 활성 성분을 선택된 담체 재료, 및 적절하게는, 다른 첨가제, 예컨대 계면활성제와 함께 균일하게 혼합, 코팅 및/또는 분쇄함으로써 제조될 수 있다. 상기 조성물은 또한 예를 들어, 일반적으로는 그 직경이 약 1 내지 10 ㎛인 미소구 형태로 그를 얻기 위해, 즉, 활성 성분의 방출 조절형 또는 서방형 미소캡슐 제조를 위해 이를 고려하여 미분화에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 펩티드, 그의 상동체 또는 유도체 (및 그의 생리학상 허용되는 염 또는 제약 조성물, 이들 모두 "활성 성분"이라는 용어에 포함된다)는 예방 또는 치료하고자 하는 병증에 적절한, 및 투여되는 화합물, 여기서 면역원성 단백질에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 가능한 경로로는 국소, 전신, 경구 (고체 제형 또는 흡입용), 직장, 비강, 국부 (눈, 협측, 및 설하 포함), 질 및 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 진피내, 동맥내, 경막내 및 경막외 포함)를 포함한다. 바람직한 투여 경로는 예를 들어, 수용자의 상태에 따라, 또는 예방 또는 치료하고자 하는 병증에 따라 달라질 수 있다.
제제는 편리하게 단위 투여 제형으로 제공될 수 있고, 약학 분야에 주지된 방법들 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 경구 투여용으로 적합한 본 발명의 제제는 각각 소정량의 활성 성분을 함유하는 것인 개별 단위, 예컨대 캡슐제, 카세제 또는 정제로서; 분제 또는 과립제로서; 수성 액체 또는 비수성 액체 중 액제 또는 현탁제로서; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 활성 성분은 또한 볼루스, 지제 또는 페이스트로서 제공될 수 있다. 정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압착 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압착된 정제는 적합한 장치에서 활성 성분을 자유 유동성 형태로, 예컨대 분제 또는 과립제로 압착시키고, 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 계면활성제 또는 분산제와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤된 분말형 화합물의 혼합물을 적합한 장치에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제는 임의로 코팅되거나 스코어링될 수 있고, 그 안의 활성 성분이 느리게, 또는 방출 조절형으로 방출되도록 제제화될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 병원체 관련 항원으로부터의, 자가항원 또는 동종인자로부터의, 알레르겐, 종양 관련 항원, 이식편으로부터 방출된 동종항원으로부터의, 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스로부터 유래된 항원으로부터 NKT 세포 에피토프, 및 상기 NKT 세포 에피토프에 인접해 있거나 또는 링커에 의해 상기 NKT 세포 에피토프로부터 분리되어 있는 티오레독스 모티프를 포함하는 단리된 면역원성 펩티드에 관한 것이다.
유전자 요법 또는 유전자 백신접종용의 바이러스 벡터는 재조합 핵산 기술에 의해 매우 쉽게 변형될 수 있다. 상기를 고려하여, 당업자는 본 발명에 따른 면역원성 펩티드 및 그의 용도에서 적용되는 바와 같이 바이러스 벡터 NKT 세포 에피토프에 대한 변형은 바이러스 벡터 그 자체에 직접 도입될 수 있다는 것을 추가로 쉽게 예상할 수 있을 것이다. 따라서, 병원체 관련 항원, 자가항원 또는 동종인자, 알레르겐, 종양과 관련된 항원, 이식편으로부터의 동종항원, 또는 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터의 항원의 NKT 세포 에피토프 및 티오리덕타제 모티프를 포함하는 면역원성 펩티드를 사용하는 백신접종 (및/또는 상응하는 유전자 백신접종 및/또는 상응하는 입양 세포 전달)은, 변형된 바이러스 벡터를 사용함으로써 같은 유익한 효과를 얻을 수 있는 바, 불필요하게 중복될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 바이러스 벡터 단백질 중 하나 이상에 존재하는 하나 이상의 NKT 세포 에피토프가 상기 바이러스 벡터 단백질 중의 삽입에 의해 변형되고, 티오레독스 모티프가 상기 NKT 세포 에피토프에 인접해 있거나 또는 링커에 의해 상기 NKT 세포 에피토프로부터 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 단리된 바이러스 벡터로서 정의되는 변형된 바이러스 벡터를 포함한다. 그에 대한 한 실시양태에서, 상기 바이러스 벡터는 추가로 상기 변형된 NKT 세포 에피토프가 CD1d 분자에 의해 제시될 수 있다는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단리된 바이러스 벡터는 추가로 NKT 세포 에피토프 변형을 보유하지 않는 같은 바이러스 벡터와 비교하였을 때, 그의 세포 형질도입 특성이 현저하게 변경되지 않은 것을 특징으로 한다.
이제 본 발명은 하기 실시예를 수단으로 설명되겠지만, 여기서 실시예는 제한하고자 하는 어떤 의도없이 제공되는 것이다. 추가로, 본원에서 기술된 모든 참고 문헌은 본원에서 참고로 분명하게 포함된다.
실시예
실시예 1
CD1d 제한 T 세포 에피토프 및 측면 잔기 중에 있는 티오리덕타제 모티프를 포함하는 펩티드를 사용하는 면역화에 의한, 인자 VIII에 특이적인 II형 제한 CD4+ T 세포의 활성화 조절
BALB/c 인자 VIII KO 마우스 (A군)를, CD1d 제한 NKT 세포 에피토프 및 측면 잔기 내의 C-XX-C 티오리덕타제 모티프를 포함하는 (서열 번호 1), 50 ㎍의 펩티드 2196으로 1주간의 간격을 두고 4회에 걸쳐 면역화시켰다.
서열 번호 1: CGH CGG FTN MFA TWS PSK
이어서, 인간 인자 VIII을 1주간의 간격을 두고 5회에 걸쳐 1회 주사당 10 IU씩을 사용하여 피하 경로에 의해 주사하였다. 최종 면역화 후 10일이 경과하였을 때, 마우스를 희생시키고, 자기 세포 분류에 의해 비장 CD4+ T 세포를 제조하였다. 시험관내에서 펩티드 및 FVIII로 면역화시킴으로써 2회에 걸쳐 상기 세포를 자극시킨 후, IL-4 및 IFN-감마 생산에 의해 측정되는 바에 따른 그의 활성화 상태를 평가하였다. 대조군 (B)은 같은 프로토콜에 따라 처리되었지만, 펩티드 백신접종은 받지 않았다.
그 결과 (도 1), 펩티드로 면역화된 마우스로부터 수득된 인자 VIII 특이적 CD4+ T 세포에 의한 IL-4 생산은 대조군과 비교하였을 때, 10배 감소된 것으로 나타났고, IFN-감마 생산은 7배 감소된 것으로 나타났다.
결과는 평균 + SEM으로서 제시되었다.
실시예 2
CD1d 제한 NKT 세포 에피토프 및 티오리덕타제 모티프를 포함하는 펩티드를 사용하여 면역화에 의한 항-Ad5 IgG 항체 반응 억제
1주간의 간격을 두고 수행되는, 알룸 중 50 ㎍의 서열 번호 2의 펩티드의 4회에 걸친 피하 주사에 의해 C57BL/6 마우스 (n=6)를 면역화시켰다.
서열 번호 2 : CHG CGG FIGLMYY
상기 펩티드는 아데노바이러스 5 (Ad5)의 헥손 단백질의 CD1d 제한 NKT 세포 에피토프 및 측면 잔기 중에 있는 티오리덕타제 모티프를 포함하였다. 대조군 (n=6)의 마우스는 펩티드 대신 알룸 중 생리학적 혈청을 받았다. 이어서, 모든 마우스는 109개의 Ad5 바이러스 입자를 1주간의 간격을 두고 IV 경로에 의해 2회에 걸쳐 주사맞았다. 최종 Ad5 주사 후 10일이 경과하였을 때, 마우스를 출혈시키고, Ad5 입자에 대한 전체 IgG 항체의 농도를 직접 결합 ELISA로 측정하였다. 간략하면, Ad5 바이러스 입자를 폴리스티렌 플레이트 상에 불용화시킨 후, 세척하고, 마우스 혈청 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 2차 세척 후, 염소 항혈청을 마우스 IgG에 첨가함으로써 마우스 항-Ad5 항체의 결합을 검출하였다. 펩티드로 전처리된 마우스 (검은색 히스토그램; 도 2)는 유의적인 양의 항체를 생산하지 못한 반면, 면역화되지 않은 마우스 (개방형 히스토그램)는 2차 Ad5 주사 후 빠르게 반응하였다. 결과는 임의 단위로 평균 + SEM으로서 제시되었다.
** 표시는 p<0.001인 유의도를 나타낸다.
실시예 3
티오리덕타제 모티프와 함께 CD1d 제한 NKT 에피토프를 포함하는 펩티드를 사용하는 마우스의 면역화에 의해 유도된 CD4+ NKT 세포에 의한 종양 세포의 아폽토시스 유도
1주간의 간격을 두고 수행되는, 알룸 중 50 ㎍의 서열 번호 3의 펩티드의 4회에 걸친 피하 주사에 의해 C57BL/6 마우스 (n=6)를 면역화시켰다.
서열 번호 3: CGH CGG FDKLPGF
상기 펩티드는 오브알부민으로부터 유래된 CD1d 제한 NKT 세포 에피토프 및 측면 잔기 중에 있는 티오리덕타제 모티프를 포함하였다. 대조군 (n=6)의 마우스는 펩티드 대신 알룸 중 생리학적 혈청을 받았다. 최종 면역화 후 10일이 경과하였을 때, 마우스를 희생시키고, 자기 세포 분류에 의해 비장 CD4+ T 세포를 제조하였다. 시험관내에서 펩티드로 면역화시킴으로써 2회에 걸쳐 상기 세포를 자극시킨 후, IL-4 및 IFN-감마 생산에 의해 측정되는 바에 따른 그의 활성화 상태를 평가하였다.
이어서, CD4+ NKT 세포주를, EG7 종양 세포를 살해할 수 있는 그의 능력에 대하여 시험관내에서 평가하였다. EG7 종양 세포 (H-2b)는 ova 구축물이 형질도입된 가슴샘종으로부터 유래된 것이었다. CD1d 제한 ova 에피토프는 상기 세포에 의해 제시되는데, 이는 NKT 활성화 및 종양 세포 살해를 일으키기에는 불충분한 것으로 알려져 있다.
EG7 세포를 막 수준에서 1 μM DiOC18 (3,3'-디옥타데시클록사카르보시아닌 퍼클로레이트 (인비트로겐(Invitrogen)으로부터 입수))로 표지하였다. 이어서, EG7 세포 (웰당 1x105개)를 1/1 내지 1/5 (EG7 세포 대 NKT 세포) 비율의 NKT 세포주의 존재하에 37℃에서 18 h 동안 배양하였다. 1차로 먼저 NKT 세포주를 서열 번호 3의 펩티드가 적재된 항원 제시 세포로 시험관내에서 4 h 동안 자극시켰다. 18 h 후, 세포를 수거하고, 제조사의 설명서 (아폽토시스 검출용 키트(Apoptosis Detection kit); BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 따라 아넥신(Annexin) V 및 7-AAD로 염색하고, FACSCantoII 유세포 분석기 (BD 바이오사이언시스) 상에서 분석하였다.
그 결과, 서열 번호 3의 펩티드로 면역화된 마우스로부터 수득된 NKT 세포주와 함께 인큐베이션된 EG7 세포에서는 아폽토시스가 유도된 반면, 펩티드 대신 생리학적 혈청을 받은 대조군 마우스로부터 수득된 NKT 세포는 종양 세포 아폽토시스를 유의적인 정도로 유도하지 못했다.
실시예 4
MOG 특이적 CD4+ NKT 림프구 검출을 위한 CD1d 분자의 사량체의 용도
다발성 경화증은, 자가항원, 예컨대 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)에 대한 CD4+ NKT 세포가 중요한 역할을 할 수 있는 가능성이 있는 것인 만성 탈수초 질환이다. 그의 실험상의 등가물인 EAE (실험적 자가면역 뇌척수염)가 인간 질환의 특징들 대부분을 모방하며, 이는 병인론적 메카니즘을 이해하고, 새로운 치료법을 설명하기 위해 사용된다.
그러므로, MOG 특이적 CD4+ NKT 세포를 열거함으로써 질환의 결과를 예측할 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 알고리즘 및 기능적 검정법의 조합에 의해, 서열 200 내지 206에 상응하는 CD1d 결합 에피토프가 마우스 MOG 단백질에서 확인되었다. EAE이 유도된 C57BL/6 마우스의 비장으로부터 CD4+ NKT 세포를 제조하였다. 자기 비드를 사용하여 비장 세포 현탁액로부터 CD4(-) 세포를 먼저 제거하였다.
형광 표지, 예컨대 피코에리트린을 포함하여, CD1d 분자 (H-2b)의 사량체를 당업계에 공지된 바와 같이 제조하였다.
티오리덕타제 모티프 (CGPC)와 CD1d 결합 모티프를 연결하는 링커를 포함하는 CGPCGGFLRVPCWKI (서열 번호 4)를 밤새도록 인큐베이션시킴으로써 CD1d 제한 MOG NKT 세포 에피토프 및 티오리덕타제 모티프를 포함하는 합성 펩티드를 제조하였다.
실온에서 밤새도록 사량체에 서열 번호 4의 펩티드를 적재하였다. 이어서, 적재된 사량체를 세척하고, 37℃에서 2 h 동안 CD4+ T 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 형광 활성화 세포 분류 시스템으로 현탁액을 판독하고, MOG 펩티드에 특이적인 NKT 세포의 비율을 평가하였다.
실시예 5
역형성 림프종 키나제 (ALK)로부터 유래된 CD1d 제한 NKT 세포 에피토프로 유도된 NKT 세포에 의한 H-2b 종양 세포 (R113)의 직접적인 살해
역형성 림프종 키나제는 개체발생 동안 많은 세포에서 뿐만 아니라, 성년기에 외배엽 기언의 종양에서 발현되는 막횡단 수용체 티로신 키나제이다. 따라서, 동물 모델 및 인간 종양 둘 모두에서 나타난 바와 같이, 외배엽 기원의 모든 종양과 직접적으로 관련이 있는 종양유전자인 것으로 간주된다. 예를 들어, 인간 유방암 중 최대 60%까지 ALK를 발현한다. 마우스 기원의 ALK+ 종양 세포주가 이용가능하고, 이는 본 발명의 ALK 특이적 세포용해 CD4+ T 세포가 종양 세포를 살해하는 데 사용될 수 있는지 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다.
측면 잔기 내에서 CxxC 포맷의 티오리덕타제 모티프가 부가된, ALK의 CD1d 제한 NKT 세포 에피토프 (서열 번호 5의 펩티드: CHGC GGWLQIVTWWGPGS (여기서, 티오리덕타제 모티프는 밑줄체로 표시되어 있고, 2개의 글리신이 모티프와 CD1d 제한 에피토프 사이의 링커로서 사용된다))가 적재된 자가 가지 세포로 4회에 걸쳐 순수한(naive) 마우스의 비장으로부터 수득된 CD4 T 세포 (C57BL/6, H-2b 배경)를 자극하였다.
NKT 세포는 그 자체가 세포용해 활성을 가지고 있는 바, 본 발명자들은 평행 실험에서 티오레독스 모티프를 포함하지 않는, 천연 서열의 같은 CD1d 제한 NKT 에피토프 (WLQIVTWWGPGS)에 노출시킴으로써 자극을 받은 세포를 포함하였다.
최종 자극 후, 10일이 경과하였을 때, CD4 T 세포를 세척하고, 2:1의 비율 (CD4:종양 세포)로 104개의 R113 종양 세포를 함유하는 세포 배양 마이크로플레이트에 첨가하였다. R113은 ALK를 구성적으로 발현하는, C57BL/6 마우스로부터 수득된 종양 B 세포주이다.
20 h 동안의 공배양 후, 세포 아폽토시스의 마커로서 사용된 아넥신 V 결합에 대해 R113 종양 세포를 평가하였다.
도 3에 제시된 바와 같이, 단독 배양된 종양 세포 (3.8%; 좌측 히스토그램)와 비교하였을 때, 서열 1의 펩티드와 함께 배양된 NKT 세포의 존재하에서는 종양 세포 사멸이 4.5배 증가 (18%; 중간 히스토그램)한 것으로 나타났다. 예측한 바와 같이, CD1d 및 천연 서열의 펩티드와의 동족 상호작용에 의해 활성화된 NKT 세포는 중간 정도 비율(%)의 세포 사멸 (11%, 우측 히스토그램)을 보였다. 3중으로 실시하여 얻은 결과의 평균±SD.
따라서,
(1) 펩티드는 CD1d 결정기의 문맥 내에서 제시될 수 있고;
(2) 진정한 종양 세포는 CD1d 제한 에피토프의 동족 인식을 통한 활성화에 의해 수득된 NKT 세포에의 노출에 의해서 아폽토시스로 유도될 수 있고;
(3) 유의적으로 더 높은 비율의 종양 세포는 NKT 세포가 측면 잔기 내에 티오리덕타제 모티프를 포함하는 CD1d 제한 NKT 세포 에피토프에의 노출에 의해 활성화되었을 때, 아폽토시스로 유도된다는 결론에 이르게 되었다.
두번째 실험에서, 대체 유전적 배경 (BALB/c 마우스, H-2d 배경)으로부터의 순수한 CD4 T 세포를 순수한 마우스의 비장으로부터 수득하고, 서열 번호 5의 펩티드가 적재된 자가 가지 세포로 4회에 걸쳐 자극하였다.
상기 기술된 바와 같이, BALB/c 유래 ALK+ 종양 세포주 (VAC)와 함께 공배양하였다. faccs에 의해 아넥신-V 결합을 평가함으로써 종양 세포의 아폽토시스를 측정하였다.
도 4에 제시된 바와 같이, 단독으로 배양된 종양 세포 (5.6%; 좌측 히스토그램), 또는 천연 서열의 펩티드의 존재하에서 배양된 종양 세포 (15%; 우측 히스토그램)와 비교하였을 때, 서열 1의 펩티드와 함께 배양된 NKT 세포의 존재하에서는 종양 세포 사멸이 유의적으로 증가 (25%; 중간 히스토그램)한 것으로 나타났다. 3중으로 실시하여 얻은 결과의 평균±SD.
상기 데이터는 제2의 관련이 없는 종양 세포주가 NKT 세포에 노출되었을 때에 아폽토시스로 유도될 수 있고, 이러한 효과는 측면 잔기 내에 티오리덕타제 모티프를 포함하는 CD1d 제한 에피토프에의 노출에 의해 NKT 세포가 자극을 받았을 때에 유의적으로 증가한다는 것을 시사한다.
실시예 6
CD1d 결합 및 티오리덕타제 모티프를 포함하는 펩티드를 사용하는 사전 면역화에 의한 EAE 예방
EAE (실험적 자가면역 뇌척수염)는, 중추 신경계 탈수초가 발생한 것으로서, 다발성 경화증의 실험상 등가물로서 간주되는 모델 질환이다. 소수의 자가항원이 상기 질환의 유발 및 유지에 관여하는 것으로 간주되며, 그중 MOG (미엘린 희소돌기아교세포 당단백질)라는 것이 있다. 질환은 MOG 아미노산 35-55를 포함하는 CD4+ T 세포 에피토프를 사용하는 MOG 면역화에 의해 C57BL/6 마우스에서 유도될 수 있다.
MOG는 CD1d에 결합하고 NKT 세포를 활성화시키는 서열을 포함한다. 따라서, 합성에 의해 서열 PHFLRVPCWKI의 펩티드, 및 서열 CHGC GGFLRVPCWKI인 티오리덕타제 포함 펩티드 (서열 번호 6의 펩티드, 여기서 티오리덕타제 모티프는 밑줄체로 표시되어 있고, 모티프와 CD1d 결합 모티프 사이에는 2개의 글리신으로 된 링커가 존재한다)를 제조하였다.
C57BL/6 마우스 군을 서열 번호 6의 펩티드로, 또는 대조군으로서는 천연 서열의 펩티드 (50 ㎍씩)로 4회에 걸쳐 피하로 면역화시켰다. 최종 면역화 후, 10일이 경과하였을 때, 순수한 면역화되지 않는 동물군을 비롯한, 모든 마우스를 CFA 중 100 ㎍ MOG 35-55 펩티드/400 ㎍ 미코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)의 피하 주사에 의해, 및 NaCl 중 300 ng 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)의 ip 주사에 의해 질환으로 유도하였다. +2일째, B. 페르투시스(B. pertussis)를 2차로 주사하였다.
시간 경과에 따라 EAE의 징후를 추적하였다. 서열 번호 6의 펩티드로 사전 면역화된 마우스에서는 EAE가 발병되지 않은 반면, 대조군인 순수한 마우스 및 천연 서열의 펩티드로 사전 면역화된 군에서는 유의적인 질환 징후가 발병된 것으로 관찰되었다.
실시예 7
GAD65 유래 펩티드를 사용한 자발성 인슐린 의존성 당뇨병의 예방 및 억제
비비만성 당뇨 (NOD) 마우스가 자발성 인슐린 의존성 당뇨병에 대해 적합한 동물 모델이 된다. 인간에서와 같이 상기 동물에서, 췌도염이 관찰될 수 있는 시점에서 자가항원 글루탐산 데카르복실라제 (GAD65)에 대한 조기 면역 반응이 관찰되는데, 상기 시점에서부터 반응은 분자내 및 분자간 확산에 의해 증대된다. 신생아에게 GAD65를 투여함으로써 상기 단백질에 대한 내성을 유도함으로써 당뇨병의 발병을 예방할 수 있다.
GAD65는 CD1d에 결합할 수 있는 능력을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 합성에 의해 GAD65의 아미노산 501 내지 507에 상응하는 서열 PQHTNVCFWFV 뿐만 아니라, 측면 잔기 내에 티오리덕타제 모티프를 포함하는 그의 대응물: 서열 번호 7의 펩티드: CHGC GGHTNVCFWFV (여기서, 티오리덕타제 모티프는 밑줄체로 표시되어 있고, 모티프와 CD1d 결합 모티프 사이에는 2개의 글리신으로 된 링커가 존재한다)를 제조하였다.
암컷 NOD 마우스를 4주령때부터 서열 번호 7 또는 천연 서열의 펩티드를 4회에 걸쳐 피하 주사하여 면역화시키고, 상기 군들 각각에서 면역화되지 않은 군과의 비교에 의해 혈당증을 추적하였다. 서열 번호 7의 펩티드로 사전 면역화된 NOD 마우스에서 고혈당증이 예방된 반면, 천연 서열의 펩티드로 처리된 마우스 및 면역화되지 않은 동물에서는 14주째 후를 시작으로 고혈당증이 발병된 것으로 관찰되었다.
실시예 8
알레르겐, Der p1에의 노출에 의해 유도되는 천식 예방
집 먼지 진드기, D. 테로니시누스(D. pteronyssinus)로부터 유래된 알레르겐이 빈번하게 알레르기성 천식에 관여한다. Der p1은 D. 테로니시누스의 주된 알레르겐이다. Der p1의 서열은 아미노산 서열 38 내지 44에 상응하는 CD1d 결합 모티프를 포함한다. 합성에 의해 서열 WAFSGVAATES의 펩티드 뿐만 아니라, 티오리덕타제 모티프를 포함하는 그의 대응물도 제조하였다. 따라서, 서열 번호 8의 펩티드 CGPC GGFSGVAATES는 티오리덕타제 모티프 (밑줄체로 표시) 및 모티프와 CD1d 결합 모티프 사이의 2개의 글리신으로 된 링커를 포함하였다.
연 3일 동안 100 ㎍의 Der p1을 비강내 점적하여 BALB/c 마우스에서 알레르기성 천식은 유도할 수 있었다. 천식은 기관지 과민성 및 호산구 침윤물의 폐로의 유인을 특징으로 한다.
BALB/c 마우스를 50 ㎍의 서열 번호 8의 펩티드 또는 대조군으로서 천연 서열의 펩티드를 4회에 걸쳐 면역화시켰다. 최종 면역화 후 10일째, Der p1을 비강내 점적에 의해 투여하였다. 서열 번호 8의 펩티드로 사전 면역화된 마우스에서는 메타콜린 흡입에 대한 기도 반응성은 발생하지 않았고, 호산구를 포함하는 폐 침윤도 나타나지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> Imnate SARL <120> IMMUNOGENIC PEPTIDES FOR USE IN THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF ... <130> IMN0543KR <150> EP10192559 <151> 2010-11-25 <160> 12 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T cell epitope of Factor VIII <400> 1 Cys Gly His Cys Gly Gly Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro 1 5 10 15 Ser Lys <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thioreductase motif + NKT cell epitope of hexon protein of adenovirus 5 (Ad5) <400> 2 Cys His Gly Cys Gly Gly Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thioreductase motif + NKT cell epitope of ovalbumin <400> 3 Cys Gly His Cys Gly Gly Phe Asp Lys Leu Pro Gly Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thioreductase motif + NKT cell epitope of MOG <400> 4 Cys Gly Pro Cys Gly Gly Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile 1 5 10 15 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thioreductase motif + NKT cell epitope of ALK <400> 5 Cys His Gly Cys Gly Gly Trp Leu Gln Ile Val Thr Trp Trp Gly Pro 1 5 10 15 Gly Ser <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thioreductase motif + NKT cell epitope of MOG <400> 6 Cys His Gly Cys Gly Gly Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thioreductase motif + NKT cell epitope of GAD65 <400> 7 Cys His Gly Cys Gly Gly His Thr Asn Val Cys Phe Trp Phe Val 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> thioreductase motif + NKT cell epitope of Der P 1 <400> 8 Cys Gly Pro Cys Gly Gly Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NKT cell epitope of ALK <400> 9 Trp Leu Gln Ile Val Thr Trp Trp Gly Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NKT cell epitope of MOG <400> 10 Pro His Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NKT cell epitope of GAD65 <400> 11 Pro Gln His Thr Asn Val Cys Phe Trp Phe Val 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NKT cell epitope of Der p 1 <400> 12 Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser 1 5 10

Claims (16)

  1. (1) [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY] 모티프를 갖는 항원성 단백질의 자연 킬러 T (NKT) 세포 에피토프;
    (2) 상기 항원성 단백질의 NKT 세포 에피토프 바로 옆에 인접해 있거나 또는 7개 이하의 아미노산의 링커에 의해 상기 NKT 세포 에피토프로부터 분리되어 있는 티오리덕타제 [CST]-xx-C 또는 C-xx-[CST] 모티프; 및
    (3) 펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단에서의 10개 이하의 아미노산인 측면 아미노산 서열,
    로 이루어지며, 여기서 상기 x는 임의의 아미노산을 나타내고, [FWHY]는 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로부터 선택된 아미노산이고, [ILMV]는 이소류신, 류신, 메티오닌 및 발린으로부터 선택되는 아미노산이고, [CST]는 시스테인, 세린 및 트레오닌으로부터 선택되는 아미노산이고, 상기 항원성 단백질은 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 이식편으로부터 방출된 동종항원, 세포내 병원체의 항원성 단백질 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터로부터의 항원성 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 NKT 세포 에피토프가 유래된 상기 항원성 단백질은 재조합 전 그의 본래의 천연 서열 내에서 상기 NKT 세포 에피토프의 N- 또는 C- 말단에 인접한 11개의 아미노산 내에 [CST]-xx-C 또는 C-xx-[CST] 모티프를 포함하지 않는 것인,
    단리된 재조합 면역원성 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 NKT 세포 에피토프가 [FW]-xx-[ILMV]-xx-[FW] 모티프를 가지고, 여기서 [FW]는 페닐알라닌 및 트립토판으로부터 선택되는 아미노산인 펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 티오리덕타제 모티프가 C-xx-C의 서열을 가지는 것인 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, x가 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판을 제외한 임의의 아미노산을 나타내는 것인 펩티드.
  5. 삭제
  6. 포유동물에서의 세포내 병원체에 의한 감염, 자가면역 질환, 동종인자 또는 알레르겐 노출에 대한 면역 반응, 동종이식편 거부 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터에 대한 면역 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 병증의 예방 또는 치료에 있어서의 제1항에 따른 펩티드 또는 제1항에 따른 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물.
  7. CD4+ T 림프구의 검출, 제조 및 고갈을 위해 시험관내 사용되는 제1항에 따른 펩티드를 포함하는 조성물.
  8. 1) 항원성 단백질 내에서 [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY] 모티프를 포함하는 NKT 세포 에피토프 서열을 확인하는 단계로서, 여기서 x가 임의의 아미노산이고, [FWHY]는 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로부터 선택된 아미노산이고, [ILMV]는 이소류신, 류신, 메티오닌 및 발린으로부터 선택되는 아미노산인 단계,
    2) - 단계 1)에서 확인된 NKT 세포 에피토프, 및
    - x가 임의의 아미노산이고, [CST]는 시스테인, 세린 및 트레오닌으로부터 선택되는 아미노산인 티오리덕타제 [CST]-xx-C 또는 C-xx-[CST] 모티프를 포함하는 서열
    을 포함하는 펩티드 서열을 제공하여 상기 티오리덕타제 모티프 및 상기 NKT 세포 에피토프가 서로 바로 옆에 인접해 있거나 또는 7개 이하의 아미노산의 링커에 의해 분리되어 있도록 하는 단계, 및
    3) 펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단에 10개 이하의 아미노산인 측면 아미노산 서열을 연결하는 단계
    를 포함하는,
    NKT 세포 활성화를 유도할 수 있는 펩티드를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 티오리덕타제 모티프가 C-xx-C인 방법.
  10. 제8항에 있어서, NKT 세포 에피토프 서열이 [FW]-xx-[ILMV]-xx-[FW] 모티프를 포함하고, 여기서 [FW]는 페닐알라닌 및 트립토판으로부터 선택되는 아미노산인 방법.
  11. - 말초 혈액 세포를 제공하는 단계,
    - 시험관내에서 상기 세포를, (1) [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY] 모티프를 포함하는 항원성 단백질의 NKT 세포 에피토프, (2) 상기 에피토프 바로 옆에 인접해 있거나 또는 7개 이하의 아미노산의 링커에 의해 상기 NKT 세포 에피토프로부터 분리되어 있는 티오리덕타제 C-xx-[CST] 또는 [CST]-xx-C 모티프, 및 (3) 펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단에서의 10개 이하의 아미노산인 측면 아미노산 서열로 이루어지는 면역원성 펩티드와 접촉시키는 단계, 및
    - IL-2 또는 IL-15 또는 IL-7의 존재하에서 상기 세포를 증대시키는 단계
    를 포함하며, 여기서 x는 임의의 아미노산을 나타내고, [FWHY]는 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신으로부터 선택된 아미노산이고, [ILMV]는 이소류신, 류신, 메티오닌 및 발린으로부터 선택되는 아미노산이고, [CST]는 시스테인, 세린 및 트레오닌으로부터 선택되는 아미노산이고, 항원성 단백질은 자가항원, 동종인자, 알레르겐, 이식편으로부터 방출된 동종항원, 세포내 병원체의 항원성 단백질 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종을 위해 사용되는 바이러스 벡터로부터의 항원성 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    항원 특이적 NKT 세포 집단을 수득하는 시험관내 방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 항원 특이적 NKT 세포 집단.
  14. 세포내 병원체에 의한 감염, 자가면역 반응, 동종인자에 대한 면역 반응, 알레르겐에 대한 면역 반응, 동종이식편 거부 및 유전자 요법 또는 유전자 백신접종에서 사용되는 바이러스 단백질에 대한 면역 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 병증의 치료 또는 예방을 위한, 제13항에 따른 항원 특이적 NKT 세포 집단을 포함하는 제약 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
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