ES2924027T3 - Péptidos inmunogénicos para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias a alofactores, enfermedades alérgicas, tumores, rechazo de injerto y respuestas inmunitarias contra vectores virales usados para terapia génica o vacunación génica - Google Patents

Péptidos inmunogénicos para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias a alofactores, enfermedades alérgicas, tumores, rechazo de injerto y respuestas inmunitarias contra vectores virales usados para terapia génica o vacunación génica Download PDF

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Abstract

La invención describe nuevos péptidos que contienen epítopos reconocidos por las células T asesinas naturales CD4+ (NKT) para aumentar la actividad para su uso en enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, reacción inmune a la administración de alofactores, enfermedades alérgicas, terapia de tumores, prevención del rechazo de injertos y prevención de inmunización contra proteínas virales utilizadas en terapia génica o vacunación génica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos inmunogénicos para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias a alofactores, enfermedades alérgicas, tumores, rechazo de injerto y respuestas inmunitarias contra vectores virales usados para terapia génica o vacunación génica
Campo de la invención
La presente invención se refiere a péptidos inmunogénicos y su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias hacia alofactores, enfermedades alérgicas, rechazo de injertos y respuestas inmunitarias contra vectores virales utilizados para terapia génica o vacunación génica. Las referencias a los procedimientos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción se deben interpretar como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas, vacunas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo animal por medio de terapia.
Antecedentes de la invención
La terapia de muchas enfermedades en mamíferos está limitada por la ausencia de medicamentos específicos.
En infecciones causadas por patógenos intracelulares, la infección persiste debido a la insuficiencia de la respuesta inmunitaria que reconocería y eliminaría las células infectadas. Muchos patógenos reducen la expresión de superficie de moléculas tales como el complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC de clase I) en las células invadidas por dichos patógenos, para de este modo reducir la capacidad del sistema inmunológico para provocar una respuesta inmunitaria citolítica que se produce cuando los linfocitos T del linaje CD8+ reconocen y son activados por epítopos derivados de patógenos que presentan MHC de clase I. Sería muy deseable una estrategia alternativa por la que los linfocitos citolíticos pudieran eliminar las células invadidas por un patógeno. Se ha propuesto una estrategia de este tipo (documento EP 2059256) en la que se utilizan epítopos restringidos de clase II derivados de patógenos intracelulares y acoplados a un motivo tiol-oxidorreductasa para provocar células T CD4+ citolíticas que inducen la apoptosis de la célula presentadora de antígeno (APC) presentando el epítopo análogo. Sin embargo, el reclutamiento y activación de un subconjunto alternativo de células T citolíticas representaría una clara posibilidad de aumentar la eliminación de células infectadas con un patógeno intracelular.
En enfermedades autoinmunitarias, como en respuestas inmunitarias a la administración de un alofactor y en enfermedades alérgicas, es ventajoso eliminar las células que presentan péptidos de un autoantígeno, un alofactor o un alérgeno, a fin de prevenir cualquier respuesta inmunitaria no deseada y, de este modo, enfermedades asociadas con tales respuestas inmunitarias no deseadas. Bajo tales circunstancias, los epítopos de autoantígenos, alofactores 0 alérgenos son presentados principalmente por el MHC de clase II y el complejo formado entre el epítopo y los determinantes de clase II activaron los linfocitos T del linaje CD4+. Esto da como resultado la activación de linfocitos B y la producción de anticuerpos contra dichos autoantígenos, alofactores o alérgenos. Un procedimiento que daría como resultado la eliminación de APC por citólisis evitaría la activación de las células T CD4+ y, por lo tanto, la producción de anticuerpos. Tal estrategia ha sido propuesta y descrita en la solicitud de patente WO 2008/017517 A1 en la que se utilizan epítopos restringidos de clase II de autoantígenos o alérgenos, o de alofactores, respectivamente, unidos a un motivo tiol-oxidorreductasa. Las células T CD4+ restringidas de clase II citolíticas provocadas por la exposición a epítopos restringidos de clase II acoplados a dicho motivo inducen la apoptosis de a Pc que presenta el epítopo análogo. Sin embargo, el reclutamiento y activación de células T citolíticas alternativas representaría una valiosa estrategia alternativa.
En el caso de tumores, las células escapan a la eliminación al subregular la expresión superficial de los determinantes del MHC de clase I y clase II. Por lo tanto, cualquier estrategia mediante la cual se obtengan células T citolíticas específicas para antígenos tumorales representaría una estrategia muy deseable para el tratamiento de tumores. El documento WO 2009/101205 enseña que las células T citolíticas activadas por la presentación restringida de clase II de antígenos derivados de tumores son útiles para la eliminación de tumores. Sin embargo, este enfoque está limitado por la escasa expresión de los determinantes del MHC de clase II por parte de los tumores.
En rechazo de injertos, el proceso de rechazo crónico es impulsado por la presentación indirecta de antígenos desprendidos por el injerto y presentados por las células receptoras presentadoras de antígenos a sus propios linfocitos T. La presentación indirecta se produce por la presentación de epítopos derivados del injerto tanto de clase 1 como de clase II. Los linfocitos T del linaje CD8 activados por la presentación del MHC de clase I de los antígenos del injerto migran al injerto en el que media el rechazo mediante el reconocimiento de sus epítopos afines directamente en las células injertadas. Sin embargo, la activación de las células CD8 requiere la ayuda de las células CD4 activadas por la presentación indirecta de antígenos derivados del injerto mediante determinantes del MHC de clase II. El documento WO 2009/100505 enseña que el uso de epítopos de células T restringidos de clase II derivados del injerto y acoplados a un motivo tiol-oxidorreductasa permite la eliminación por apoptosis de APC que participan en presentación indirecta. Sin embargo, sería muy deseable una estrategia alternativa mediante la cual se generaría otro subconjunto de células T citolíticas.
Asimismo, los enfoques terapéuticos novedosos, tales como terapia génica y vacunación génica, están gravemente limitados por la respuesta inmunitaria del huésped a vectores virales utilizados para transgénesis o vacunación. En ambas situaciones, los antígenos derivados de vectores virales son eliminados por células transducidas con el vector y presentados a los linfocitos del hospedador por las APC del hospedador, es decir, por presentación indirecta de antígenos. Es de destacar el hecho de que muchos vectores virales activan no solo el sistema inmunológico adaptativo, lo que lleva a la producción de anticuerpos específicos y la activación de células T específicas, sino que dichos vectores virales también activan el sistema inmunológico innato. La activación de la inmunidad innata sirve como un adyuvante para la respuesta adaptativa. El documento WO 2009/101204 enseña que los epítopos restringidos de clase II derivados de vectores virales y acoplados a un motivo tiol-oxidorreductasa pueden provocar la activación de células T CD4 restringidas de clase II citolítica. Sin embargo, es muy deseable una estrategia alternativa que suprima la activación del sistema inmunológico innato.
En todos los ejemplos enumerados en la presente memoria, es obvio para aquellos expertos en la técnica que estrategias alternativas por medio de las cuales se podrían obtener células T citolíticas específicas de antígeno, que eliminarían de una manera específica de antígeno las APC que presentan dicho antígeno específico, deberían ser de mucho valor.
La presente invención presenta una estrategia alternativa de este tipo.
Las células T asesinas naturales (NKT) constituyen un subconjunto distinto de linfocitos T no convencionales que reconocen antígenos presentados por el complejo no clásico MHC molécula CD1d. Actualmente se describen dos subconjuntos de células NKT. Las células NKT de tipo I, también llamadas células NKT invariantes (iNKT), son las más abundantes. Se caracterizan por la presencia de un receptor de células T alfa-beta (TCR) compuesto por una cadena alfa invariante, Valpha14 en el ratón y Valpha24 en humanos. Esta cadena alfa está asociada a un número variable, aunque limitado de cadenas beta. Las células NKT de tipo 2 tienen un TCR alfa-beta pero con una cadena alfa-polimórfica. Sin embargo, es evidente que existen otros subconjuntos de células NKT, cuyo fenotipo aún no está completamente definido, pero que comparten las características de ser activadas por glicolípidos presentados en el contexto de la molécula CD1d.
Las células NKT expresan típicamente una combinación de receptores de células asesinas naturales (NK), incluidos NKG2D y NK1.1. Las células NKT son parte del sistema inmunológico innato, que se puede distinguir del sistema inmunológico adaptativo por el hecho de que no requieren expansión antes de adquirir la capacidad efectora completa. La mayoría de sus mediadores están preformados y no requieren transcripción. Se ha demostrado que las células NKT son participantes principales en la respuesta inmunitaria contra patógenos intracelulares y rechazo de tumores. También se defiende su papel en el control de enfermedades autoinmunitarias y rechazo de trasplantes.
La unidad de reconocimiento, la molécula CD1d, tiene una estructura muy parecida a la de la molécula del MHC de clase I, que incluye la presencia de microglobulina beta-2. Se caracteriza por una hendidura profunda bordeada por dos cadenas alfa y que contiene residuos altamente hidrófobos, que acepta cadenas lipídicas. La hendidura está abierta en ambas extremidades, lo que permite acomodar cadenas más largas. El ligando canónico para CD1d es la alfa-galactosilceramida sintética (alfa GalCer). Sin embargo, se han descrito muchos ligandos alternativos naturales, incluidos los gluco y fosfolípidos, la sulfatida lipídica natural que se encuentra en la mielina, manosido de fosfoinositol microbiano y la alfa-glucuronosilceramida. El consenso actual en la técnica (véanse las revisiones, tales como Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368 y Godfrey et al, Nature reviews Immunology 2010, 11: 197­ 206) es que CD1d se une sólo a ligandos que contienen cadenas de lípidos, o en general una estructura común formada por una cola de lípidos que está enterrada en CD1d y un grupo de cabeza de residuos de azúcar que sobresale de CD1d.
No se considera que los péptidos puedan activar las células NKT a través de presentación por CD1d. Sin embargo, se sugirió que los péptidos hidrófobos largos que contienen residuos de aminoácidos voluminosos se podrían enlazar a CD1d (Castano et al, Science 1995, 269:223-226). 223-226). Las observaciones llevadas a cabo mediante el uso de bibliotecas de presentación de fagos que expresan péptidos de secuencia aleatoria sin relevancia fisiológica definida, permitieron establecer un motivo de consenso teórico (Castano et al, Science 1995, 269: 223-226 y véase más adelante).
De hecho, Castano et al demostró que las células que se activan son células T CD8+, es decir, células restringidas por MHC de clase I, y no células NKT. Estos hallazgos enseñan a la persona experimentada en la técnica que no hay evidencia de que las moléculas CD1d presenten péptidos hidrófobos. La relevancia fisiológica de las reivindicaciones hechas por Castano et al fue cuestionada aún más debido a la incapacidad de provocar células NKT bajo protocolos de inmunización convencionales (Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368 y Brutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775). Los sistemas artificiales tales como la inmunización con células transfectadas para sobreexpresar CD1d y cargadas in vitro con un péptido derivado de ovoalbúmina fueron capaces de provocar células NKT. Asimismo, la inmunización intradérmica con ADN plasmídico junto con CD1d murino y moléculas costimuladoras induce células T citolíticas restringidas a CD1d (Lee et al, Journal of Experimental Medicine 1998, 187: 433-438). Los péptidos hidrofóbicos que contienen un motivo estructural formado por un residuo aromático en posición P1 y P7, que representan residuos de anclaje para la unión a los bolsillos hidrofóbicos de CD1d situados en cada extremo de la molécula de CD1d y una cadena alifática en posición P4 fueron reivindicados por Castano et al (Science 269: 223,1995) de contener un motivo central para los epítopos de unión a CD1d. Como se describió anteriormente, las conclusiones a las que llegaron Castano et al no están respaldadas por datos.
Hicimos el hallazgo inesperado de que los péptidos que abarcan una secuencia de aminoácidos hidrófobos son de hecho capaces de provocar la activación de células n Kt . Un ejemplo de tal secuencia está representado por el motivo [FW]-xx-[ILM]-xx-[FW], en el que [FW] es un aminoácido seleccionado entre fenilalanina o triptófano, e [ILM] es un aminoácido seleccionado entre isoleucina, leucina o metionina. [FW] en P7 se dice que es permisivo, lo que significa que T o H pueden sustituir a F o W.
Además, descubrimos que un motivo de enlace a CD1d era particularmente eficaz para modular la actividad de NKT cuando se acoplaba a un motivo tiol-oxidorreductasa. Este motivo presenta una estructura general de C-XX-C en la que C es cisteína y X es cualquier aminoácido excepto tirosina, fenilalanina y triptófano. La solicitud de patente WO 2008/017517 A1 enseña que los epítopos de células T restringidas de clase II acoplados a un motivo tioloxidorreductasa adquieren la propiedad de transformar el fenotipo y la función de las células T CD4 restringidas de clase II en potentes células citolíticas, induciendo la apoptosis de APC. Este efecto se debe a una mayor formación de sinapsis entre APC y células T, una consecuencia de la reducción e isomerización de la molécula CD4 en la superficie de las células T.
El documento WO2010/037395 desvela monómeros y multímeros de MHC que comprenden uno o más péptidos derivados de tumores. El documento WO2007/135684 divulga péptidos que se caracterizan por la capacidad de provocar una respuesta autoinmunitaria mediada por células T contra células T CD4+. En el documento US2006/182763 se divulgan epítopos de células T CD8 inmunodominantes en la proteína E6 y E7 del virus del papiloma humano (HPV).
Una gran mayoría de las células NKT portan el correceptor CD4, cuya función sigue estando mal definida. Sin embargo, una publicación reciente sugirió que el CD4 se enlaza a la molécula CD1d de la misma manera que lo hace con el MHC de clase II (Thedrez et al Blood 110: 251-258, 2007). Además, se ha demostrado que la presencia de CD4 es necesaria para la activación completa de las células NKT. Una publicación anterior desvela que las células NKT CD4+ son específicas para un péptido de ovoalbúmina (Rigby et al. Blood 101:2024-2032, 2003).
Por lo tanto, la presente divulgación se refiere al uso de péptidos hidrófobos que tienen la capacidad de enlazarse a CD1d y de este modo reclutar y activar células NKT, acopladas a un motivo tioloxidoreductasa. Dichos péptidos aseguran la especificidad del antígeno y representan un enfoque valioso para el tratamiento de
(1) enfermedades infecciosas con patógenos intracelulares, en las que las células infectadas presentan péptidos hidrófobos derivados del patógeno y enlazados a CD1d. Por tanto, un mayor reclutamiento y/o actividad de NKT de tales células NKT concurriría a la eliminación de las células infectadas;
(2) enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias a la administración de un alofactor y enfermedades alérgicas, en las que los antígenos asociados a cada uno de estos 3 tipos de enfermedades generan péptidos hidrófobos presentados por CD1d. Por lo tanto, un mayor reclutamiento y/o actividad de células NKT específicas de antígeno podría ayudar a eliminar las células presentadoras de antígeno y, por lo tanto, eliminar una respuesta inmunitaria no deseada;
(3) tumores, ya que las células tumorales a menudo expresan CD1d que porta antígenos específicos del tumor, que pueden ser reconocidos por células NKT. El aumento de actividad y reclutamiento de tales células NKT conduciría a una mayor eliminación del tumor;
(4) rechazo del injerto, ya que las células presentadoras de antígeno del huésped presentan péptidos hidrófobos derivados del injerto en el contexto de CD1d. El reconocimiento de estos péptidos por las células NKT del huésped conduciría a la eliminación de las células presentadoras de antígeno y abortaría el proceso de rechazo crónico del injerto;
(5) terapia génica y vacunación génica, en la que los determinantes CD1d presentan antígenos de vectores virales y desprendidos por células transducidas. El reclutamiento y activación de las células NKT que eliminan las APC del huésped mediante el reconocimiento de los antígenos del vector viral sería beneficioso tanto para la persistencia de la expresión del transgén como para el mantenimiento de inmunogenicidad completa del transgén en la vacunación génica.
Además del interés terapéutico de la presente divulgación, hicimos la observación inesperada de que la adición de un motivo oxidorreductasa dentro de los residuos flanqueantes de los epítopos CD1d aumenta el enlace de TCR, lo que da como resultado una detección mucho mejor de las células NKT c D4+. Por lo tanto, los péptidos que abarcan epítopos naturales restringidos a CD1d y al menos un motivo tiorreductasa del formato CxxC, en el que C representa cisteína y x cualquier aminoácido excepto cisteína o residuos voluminosos, como se describe en la presente divulgación, tienen un interés principal para:
(1) fines analíticos: detección de la frecuencia de precursores de células NKT antes de la vacunación, evaluación de la afinidad de enlace a péptidos para complejos CD1d, seguimiento de células NKT específicas durante el curso de la vacunación o bajo inmunosupresión, identificación de células independientemente de su actividad biológica, identificación de células implicadas en el mecanismo de la enfermedad, agotamiento de células NKT específicas y detección de células NKT in situ, como en biopsias de órganos;
(2) fines preparativos: preparación de células NKT específicas para evaluación de función y preparación de células NKT para cultivo y purificación;
(3) control de calidad de la población celular destinada a terapia celular;
(4) fines terapéuticos, incluido el agotamiento de células NKT CD4+ específicas antes del injerto de órganos.
Sumario de la invención
El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación se refiere al uso de péptidos inmunogénicos aislados para la prevención y tratamiento de infección con un patógeno intracelular en un individuo por medio del aumento de la respuesta inmunitaria hacia antígenos específicos derivados de dicho patógeno intracelular.
La presente divulgación también se refiere al uso de péptidos inmunogénicos aislados para la prevención y el tratamiento de respuestas autoinmunitarias, respuestas inmunitarias a la administración de alofactores y respuestas inmunitarias a exposición a alérgenos.
La presente divulgación se refiere además al uso de péptidos inmunogénicos aislados para el tratamiento de tumores.
La presente divulgación también se refiere al uso de péptidos inmunogénicos aislados para la prevención del rechazo de injertos.
La presente divulgación también se refiere al uso de péptidos inmunogénicos aislados para la prevención de la respuesta inmunitaria contra proteínas virales utilizadas para terapia génica y/o vacunación génica.
La presente divulgación también se refiere a péptidos para la detección, preparación y agotamiento de células NKT.
La presente divulgación se refiere en un aspecto al uso de al menos un péptido inmunogénico aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un antígeno asociado a patógenos y (ii) un motivo tiol-oxidorreductasa (motivo tiorredox en síntesis) como medicamento para prevenir y/o tratar, en un sujeto, la infección con dicho patógeno.
En un aspecto adicional, la divulgación también cubre el uso de al menos un péptido inmunogénico aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un autoantígeno, un alofactor o un alérgeno y (ii) un motivo tiorredox como un medicamento para prevenir y/o tratar, en un sujeto, respuestas inmunitarias frente a autoantígenos, alofactores y/o alérgenos.
En otro aspecto más, la divulgación también cubre el uso de al menos un péptido inmunogénico aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un antígeno asociado a tumores y (ii) un motivo tiorredox como un medicamento para tratar, en un individuo, un tumor.
En otro aspecto más, la divulgación también cubre el uso de al menos un péptido inmunogénico aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un aloantígeno y (ii) un motivo tiorredox como un medicamento para prevenir, en un individuo, rechazo de un injerto.
En otro aspecto más, la divulgación también cubre el uso de al menos un péptido inmunogénico hidrófobo aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un vector viral para terapia génica o vacunación génica y (ii) un motivo tiorredox como un medicamento para prevenir, en un individuo, una respuesta inmunitaria contra el vector viral.
También se divulga el uso de al menos un péptido inmunogénico aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un antígeno asociado a patógeno, un autoantígeno, alofactor, alérgeno, un antígeno asociado a tumor, un aloantígeno o un antígeno de vector viral, y (ii) un motivo tiorredox, como un medicamento para aumentar la activación, producción de citocinas y actividad citolítica de células NKT CD4+ en dicho sujeto.
Generalmente, se proporcionan péptidos inmunogénicos que comprenden (i) un epítopo de células NKT derivado de un antígeno asociado a patógenos, un autoantígeno, alofactor, alérgeno, un antígeno asociado a tumores, un aloantígeno o un antígeno de vector viral, y (ii) un motivo tiorredox para su uso en la prevención o tratamiento de una infección con un patógeno intracelular, la prevención o tratamiento de una respuesta inmunitaria contra autoantígenos, alofactores, alérgenos, tratamiento de tumores, la prevención de inmunización contra aloantígenos o contra un antígeno de vector viral, en un receptor por medio del aumento de respuesta celular NKT CD4+ en dicho receptor.
La divulgación también se refiere a células NKT de tipo 1 (iNKT) o subconjunto de tipo 2, así como subconjuntos de NKT menos caracterizados, todos caracterizados por portar el correceptor de CD4 y una cadena beta de t Cr capaz de reconocer el péptido enlazado a CD1d.
La presente divulgación también se refiere a péptidos hidrófobos capaces de enlazarse a CD1d para presentación a células NKT.
La divulgación se refiere a péptidos hidrófobos que abarcan al menos un epítopo de células T restringido a CD1d. La estructura de la molécula CD1d indica que se requieren residuos de aminoácidos hidrófobos para ocupar los dos bolsillos hidrófobos ubicados en las extremidades de la hendidura CD1d y que un residuo alifático debería ocupar la posición en el medio de la hendidura. Por lo tanto, como ejemplo general de secuencia de enlace a CD1d, se puede usar el motivo [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH] en el que [FW] indica que F o W pueden ocupar el primer residuo de anclaje (PI), que la posición P4 puede estar ocupada por I, L o M y que P7 puede estar ocupada por F, W, T o H. x en este modelo general de motivo, representa cualquier aminoácido. Debería estar claro para los expertos en la técnica que son posibles diversas combinaciones de estos residuos de aminoácidos. En un ejemplo particular, el motivo del modelo general se puede presentar como una secuencia revertida como [FWTH]-xx-[ILM]-xx-[FW].
De acuerdo con la invención, dicho motivo tiorredox está constituido por una secuencia consenso ([C]-XX-[CST] o [CST]-XX-[C]), en la que [CST] es un aminoácido seleccionado entre cisteína, serina y treonina, potencialmente separada de dicho epítopo de células T restringidas a CD1d por un enlazador de como máximo 7 aminoácidos. También se describe un motivo tiorredox formado por una secuencia consenso ([CST]-XX-[CST]), en la que [CST] es un aminoácido seleccionado entre cisteína, serina y treonina, y X puede ser cualquier aminoácido excepto tirosina (Y), fenilalanina (F) y triptófano (W). Dicho motivo tiorredox se añade al péptido en el extremo aminoterminal o carboxiterminal, o en cada extremo terminal, potencialmente separado de dicho epítopo de células T restringido a CD1d por un enlazador de entre 1 y 7 aminoácidos.
En una realización particular, dicho enlazador comprende aminoácidos que forman parte de los residuos flanqueantes naturales.
Se divulgan además procedimientos para obtener o inducir poblaciones de células NKT como se describió anteriormente, comprendiendo dichos procedimientos las etapas de:
(i) proporcionar células T CD4+ naturales aisladas;
(ii) poner en contacto esas células con un péptido inmunogénico que comprende un epítopo de célula T presentado por la molécula CD1d y, adyacente a dicho epítopo de célula T o separado de él por un enlazador de como máximo 7 aminoácidos, un motivo C-XX-[CST] o [CST]-XX-C; y
(iii) expandir dichas células en presencia de IL-2/IL-15 y/o IL-7
Además, se divulga un procedimiento para identificar una población de células NKT CD4+, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(i) proporcionar células T CD4+ naturales aisladas;
(ii) proporcionar células T CD4 sospechosas de ser citotóxicas; y
(iii) determinar que las células T proporcionadas en (ii) presentan, en comparación con las células T proporcionadas en (i), las características descritas anteriormente.
En cualquiera de los usos anteriores, dicho antígeno asociado a patógeno intracelular puede ser cualquier antígeno derivado de virus, bacterias, micobacterias o parásitos con un ciclo de vida intracelular.
En cualquiera de los anteriores, dicho autoantígeno puede ser cualquier antígeno asociado con una enfermedad autoinmunitaria. Ejemplos de tales enfermedades son diabetes insulinodependiente, esclerosis múltiple, miastenia gravis y tiroiditis.
En cualquiera de los anteriores, dichos alofactores son polipéptidos o proteínas y factores usados para terapia de reemplazo para defectos de coagulación o defectos fibrinolíticos, que incluyen factor VIII, factor IX y estafiloquinasa, hormonas tales como insulina y hormona del crecimiento, citocinas y factores de crecimiento tales como como interferón-alfa, interferón-beta, interferón-gamma, GM-CSF y G-CSF, anticuerpos para la modulación de respuestas inmunitarias, que incluyen anticuerpos anti-IgE en enfermedades alérgicas, anticuerpos anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD20 en rechazo de injertos y en una variedad de enfermedades autoinmunitarias, anticuerpos anti-TNF-alfa en la artritis reumatoide y eritropoyetina en insuficiencia renal.
En cualquiera de los anteriores, dicho alérgeno es alérgeno aerotransportado tal como los derivados de ácaros del polvo doméstico, de pólenes o de animales domésticos, alérgenos alimentarios tales como cacahuete, ovoalbúmina, cereales, frutas y legumbres, y antígenos de contacto tales como látex. Las enfermedades que caracterizan la sensibilización a alérgenos incluyen asma alérgica, rinosinusitis alérgica, choque anafiláctico, urticaria, dermatitis atópica y dermatitis de contacto.
En cualquiera de los anteriores, dichos antígenos asociados a tumores son un oncogén, un protooncogén, una proteína derivada de virus, un factor superviviente o un determinante clonotípico tal como un determinante idiotípico derivado de un receptor de células B.
En cualquiera de los anteriores, dichos aloantígenos son antígenos principales de histocompatibilidad, antígenos menores de histocompatibilidad o antígenos específicos de tejido. Dichos antígenos están implicados en el rechazo de injertos celulares y tisulares.
En cualquiera de los anteriores, dichos vectores virales se derivan de adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus o lentivirus.
En cualquiera de los usos anteriores, dicho motivo tiorredox puede ser adyacente a dicho epítopo de células NKT o estar separado de dicho epítopo de células NKT por medio de un enlazador. De acuerdo con la invención, el enlazador consta como máximo de 7 aminoácidos.
En un ejemplo del péptido inmunogénico en los usos anteriores, dicho motivo tiorredox no ocurre naturalmente dentro de una región de 8 aminoácidos de terminal N- o C- adyacentes al epítopo de células NKT en dicho antígeno asociado a patógeno, autoantígeno, alofactor, alérgeno, antígeno asociado a tumor, aloantígeno o antígeno de vector viral. En particular, dicho motivo tiorredox está posicionado en terminal N del epítopo de célula NKT.
En realizaciones particulares del péptido inmunogénico para los usos anteriores, el péptido inmunogénico comprende además una secuencia de direccionamiento endosómica. Cualquiera de los péptidos inmunogénicos anteriores puede producirse mediante síntesis química o mediante expresión recombinante.
Otro procedimiento divulgado tiene como objetivo obtener una población de células NKT, dicho procedimiento comprende las etapas de:
(i) proporcionar un péptido inmunogénico que comprende un epítopo de células NKT derivado de un antígeno intracelular asociado a patógenos, un autoantígeno, un alofactor, un alérgeno, un antígeno asociado a tumores, un aloantígeno o un antígeno de vector viral, y (ii) un motivo tiorredox;
(ii) administrar el péptido inmunogénico a un sujeto; y (en la presencia de un adyuvante)
(iii) obtener una población de células NKT CD4+.
También se describen las poblaciones de células NKT CD4+ que se pueden obtener por medio de los procedimientos anteriores, así como su uso como medicamento para prevenir o tratar, en un individuo, infección con dicho patógeno intracelular, prevenir o tratar una enfermedad autoinmunitaria, una respuesta inmunitaria a un alofactor, prevenir o tratar enfermedades alérgicas, tratar tumores, prevenir el rechazo de injertos y prevenir una respuesta inmunitaria a un vector viral utilizado para terapia génica o vacunación génica.
Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a péptidos inmunogénicos aislados que comprenden un epítopo de células NKT derivado de un antígeno asociado a patógeno intracelular, o de un autoantígeno, un alofactor, un alérgeno, un antígeno asociado a tumor, un aloantígeno o un antígeno de vector viral y, adyacente al epítopo de células NKT o separado del epítopo de células NKT por un enlazador, un motivo tiorredox.
Otro aspecto más de la divulgación se refiere a un péptido aislado que comprende un epítopo de células NKT derivado de un antígeno asociado a patógeno intracelular, o de un autoantígeno, un alofactor, un alérgeno, un antígeno asociado a tumor, un aloantígeno o un antígeno de vector viral y, adyacente al epítopo de células NKT o separado del epítopo de células NKT por un enlazador, un motivo tiorredox, para la detección, preparación o agotamiento de células NKT.
La divulgación abarca además vectores virales aislados caracterizados porque estos comprenden al menos un antígeno asociado a patógenos, o al menos un autoantígeno, o al menos un alofactor, o al menos un alérgeno, o al menos un antígeno asociado a tumores, o al menos un aloantígeno, o al menos un antígeno de vector viral que comprende un epítopo de células NKT y adyacente a dicho epítopo de células NKT o separado del epítopo de células NKT por un enlazador, un motivo tiorredox.
Más particularmente, también se divulgan vectores virales aislados caracterizados porque al menos un epítopo de células NKT presente en al menos uno de los antígenos asociados a patógenos, o del autoantígeno, o de alofactor, o de alérgeno, o de un antígeno asociado a tumor, o de un aloantígeno, o de un antígeno de vector viral se modifica por medio de la inserción en dicho antígeno asociado a patógeno, dicho autoantígeno, dicho alofactor, dicho alérgeno, dicho antígeno asociado a tumor, dicho aloantígeno o dicho antígeno de vector viral, adyacentes a dicho epítopo de células NKT o separados de dicho epítopo de células NKT por un enlazador, de un motivo tiorredox.
Definiciones
El término "péptido" cuando se usa en la presente memoria se refiere a una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 2 y 200 aminoácidos, conectados por enlaces peptídicos, pero que en una realización particular puede comprender estructuras que no son de aminoácidos (como por ejemplo un enlace orgánico compuesto). Los péptidos de acuerdo con la invención pueden contener cualquiera de los 20 aminoácidos convencionales o versiones modificadas de los mismos, o pueden contener aminoácidos de origen no natural incorporados por síntesis química de péptidos o por modificación química o enzimática.
Los términos "péptido" o "péptido inmunogénico" se usan indistintamente, pero normalmente se prefiere "péptido inmunogénico" para el péptido usado con fines terapéuticos, mientras que "péptido" se prefiere para la detección, preparación y agotamiento de células NKT. El término "epítopo" cuando se usa en la presente memoria se refiere a una o varias porciones (que pueden definir un epítopo conformacional) de una proteína que es/son específicamente reconocidas y enlazadas por un anticuerpo o una porción del mismo (Fab', Fab2', etc.) o un receptor presentado en la superficie celular de un linfocito de células B o T, y que es capaz, por medio de dicho enlace, de inducir una respuesta inmunitaria.
El término "antígeno" cuando se utiliza en la presente memoria se refiere a una estructura de una macromolécula que comprende uno o más haptenos y/o que comprende uno o más epítopos de células T. Típicamente, dicha macromolécula es una proteína o un péptido (con o sin polisacáridos) o de composición proteica y comprende uno o más epítopos; dicha macromolécula se puede denominar en la presente memoria alternativamente "proteína antigénica" o "péptido antigénico".
El término "epítopo de células T" o "epítopo de células-T" en el contexto de la presente invención se refiere a un epítopo de células T dominante, subdominante o menor, es decir, una parte de una proteína antigénica que se reconoce específicamente y enlazada por un receptor en la superficie celular de un linfocito T. El hecho de que un epítopo sea dominante, subdominante o menor depende de la reacción inmunitaria provocada contra el epítopo. La dominancia depende de la frecuencia con la que dichos epítopos son reconocidos por las células T y capaces de activarlos, entre todos los posibles epítopos de células T de una proteína. En particular, un epítopo de células T es un epítopo enlazado por moléculas de MHC de clase I o MHC de clase II.
El término "epítopo de células NKT" se refiere a una parte de una proteína antigénica que es específicamente reconocida y enlazada por un receptor en la superficie celular de un linfocito T. En particular, un epítopo de células NKT es un epítopo unido a las moléculas CD1d.
El término "células efectoras CD4+" se refiere a las células pertenecientes al subconjunto de células T CD4-positivas cuya función es proporcionar ayuda a otras células, tales como por ejemplo las células B. Estas células efectoras se denominan convencionalmente células Th (para las células T helper), con diferentes subconjuntos tales como las células Th0, Th1, Th2 y Th17.
El término "células NKT" se refiere a células del sistema inmunitaria innato caracterizadas por el hecho de que portan receptores tales como NK1.1 y NKG2D, y reconocen epítopos presentados por la molécula CD1d. En el contexto de la presente invención, las células NKT pueden pertenecer al subconjunto de tipo I (invariante) o de tipo 2, o a cualquiera de las células NKT menos caracterizadas con más receptores de células T polimórficas que las células NKT de tipo 1 o tipo 2.
La "molécula CD1d" se refiere a una molécula no derivada de MHC compuesta por 3 cadenas alfa y un conjunto antiparalelo de cadenas beta dispuestas en un surco hidrófobo profundo abierto en ambos lados y capaz de presentar lípidos, glicolípidos o péptidos hidrófobos a células NKT. El término "trastornos inmunitarios" o "enfermedades inmunitarias" se refiere a enfermedades en las que una reacción del sistema inmunitario es responsable por o mantiene un mal funcionamiento o una situación no fisiológica en un organismo. Los trastornos inmunitarios en el contexto utilizado en la presente memoria se refieren a patologías inducidas por agentes infecciosos y vigilancia tumoral.
El término "alofactor" se refiere a una proteína, péptido o factor (es decir, cualquier molécula) que muestra polimorfismo cuando se compara entre dos individuos de la misma especie y, más en general, cualquier proteína, péptido o factor que induzca una respuesta inmunitaria (alorreactiva) en el individuo que recibe el alofactor.
El término "aloantígeno" o "antígeno de aloinjerto" cuando se usa en la presente memoria se refiere a un antígeno derivado de (desprendido de y/o presente en) una célula o tejido que, cuando se transfiere de un donante a un receptor, puede ser reconocido y enlazado por un anticuerpo del receptor de células B o T del receptor. Los aloantígenos son típicamente productos de genes polimórficos. Un aloantígeno es una proteína o péptido que, cuando se compara entre donante y receptor (pertenecientes a la misma especie), presenta ligeras diferencias estructurales. La presencia de dicho antígeno del donante en el cuerpo de un receptor puede provocar una respuesta inmunitaria en el receptor. Tal respuesta inmunitaria alorreactiva es específica para el aloantígeno.
El término "motivo tiol-oxidorreductasa", "motivo tiorreductasa", "motivo tiorredox" o "motivo redox" se utilizan en la presente memoria como términos sinónimos y se refieren a un motivo de secuencia general hecho de [CST]-XX-[CST], en el que C representa cisteína, S para serina, T para treonina y X para cualquier aminoácido excepto tirosina, fenilalanina o triptófano.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona formas de prevenir o tratar, en un individuo, la infección con un patógeno intracelular. Además, proporciona formas de prevenir y tratar enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias después de la administración de un alofactor o de alérgenos. Además, proporciona formas de tratar tumores, prevenir el rechazo del injerto y prevenir la respuesta inmunitaria contra los vectores virales.
En particular, la divulgación proporciona formas de aumentar la expansión y actividad funcional de las células NKT CD4+. Estas células se clasifican generalmente en dos subconjuntos distintos, específicamente, tipo I para las células NKT que llevan una cadena alfa de TCR invariante (Valpha14 en el ratón, Valpha24 en humanos) o células NKT de tipo 2 que tienen un repertorio diverso de cadenas alfa. Sin embargo, la evidencia reciente ha sugerido subconjuntos alternativos de células NKT que no encajan en la categoría de tipo 1 o tipo 2. El propósito de la presente divulgación es incluir estas células NKT no convencionales, siempre que porten el correceptor CD4. Tras la presentación de un antígeno enlazado a CD1d, las células NKT se activan rápidamente y secretan una serie de citocinas que se cree que son determinantes para influir en otras células del sistema inmunitario innato y adaptativo y para ejercer una potente actividad destructora de las células presentadoras de antígenos CDld+. Este mecanismo se considera crucial para la defensa contra la infección con agentes intracelulares, pero también en la vigilancia de células tumorales y eliminación del tumor. El mismo mecanismo está en juego para el control de respuestas inmunitarias no deseadas como ocurre en enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias contra alofactores o contra alérgenos.
En rechazo de injerto, los aloantígenos desprendidos del injerto se presentan al sistema inmunitario del individuo receptor por la vía indirecta. Esto significa que los antígenos del aloinjerto desprendidos son captados por las células presentadoras de antígenos del huésped, que presentan dicho aloantígeno a las células T del huésped de una manera restringida a CD1d. Por tanto, un mecanismo por el cual dichas células presentadoras de antígenos del huésped se destruyen matando después del reconocimiento análogo por las células NKT CD4+ es beneficioso para el receptor del injerto.
En la respuesta inmunitaria hacia los vectores virales utilizados para terapia génica y vacunación génica, los antígenos desprendidos de las células transducidas son captados por las células presentadoras de antígenos del huésped, con una presentación indirecta posterior como en el caso del rechazo de injerto.
Cuando las células NKT son activadas por un péptido modificado para que contenga una actividad tiorreductasa, esta última aumenta significativamente las propiedades de las células NKT y, de este modo aumenta la muerte de células que portan microorganismos intracelulares, así como células tumorales. La muerte de células que presentan autoantígenos, alofactores o alérgenos por células NKT CD4+ específicas de antígeno suprime la respuesta inmunitaria frente a dichos autoantígenos, alofactores o alérgenos. La muerte de las células huésped que presentan antígenos derivados de un injerto o de células transducidas aborta el rechazo o la respuesta al antígeno del vector viral, respectivamente.
De este modo, en un número creciente de enfermedades infecciosas, se ha puesto de manifiesto la importancia de las células NKT. Estos incluyen infecciones por micobacterias (incluida Mycobacterium tuberculosis), parásitos como Leishmania, bacterias como Listeria monocytogenes, salmonela, pseudomonas aeruginosa, streptococcus pneumoniae y Borrelia, y virus como el virus del herpes simple (Chiba et al Journal of Immunology 181: 2292- 2302, 2008; Mattner et al Nature 434: 525529, 2005; Tupin et al Nature Reviews. Microbiology 5: 405-417, 2007). Además de la destrucción directa de las células infectadas, las células NKT, en virtud de su capacidad para producir altas concentraciones de citocinas, y en particular IFN-gama, pueden desencadenar mecanismos de muerte inespecíficos dentro de las células infectadas. Estos mecanismos incluyen la inducción de la indolamina oxidasa, óxido sintasa nítrica y la producción de especies reactivas de oxígeno.
La participación de células NKT en el control de respuestas inmunitarias en enfermedades autoinmunitarias, o contra alofactores o alérgenos se ha reportado en varias ocasiones (Jahng et al Journal of experimental Medicine 199: 947­ 957, 2004; Van Belle y von Herrath, Molecular Immunology 47: 8-11, 2009) pero relativamente difícil de describir. En el contexto de la presente invención, hicimos la observación inesperada de que la molécula CD1d puede presentar péptidos. Una característica de la molécula CD1d es estar compuesta por 2 cadenas alfa antiparalelas que forman una hendidura sentada sobre una plataforma formada por dos cadenas beta antiparalelas. La hendidura es estrecha y profunda y acepta solo residuos hidrófobos, clásicamente considerados solo lípidos. De hecho, los péptidos con residuos hidrófobos tienen la capacidad de enlazarse a la hendidura CD1d. Además, como la hendidura está abierta en ambos lados, se pueden acomodar péptidos de más de 7 aminoácidos. Los péptidos hidrófobos que portan el motivo CD1d se encuentran en autoantígenos, alofactores y alérgenos, dotando así a dicho autoantígeno, alofactor o alérgeno con la capacidad de activar células NKT CD4+. La eliminación directa mediante la muerte de las células que presentan dicho autoantígeno, alofactor o alérgeno elimina la capacidad de montar una respuesta inmunitaria contra estos antígenos/factores.
Se ha demostrado que las células NKT participan en la defensa contra tumores, ya sea indirectamente al producir citocinas capaces de estimular la respuesta tanto innata como adaptativa a las células tumorales o directamente al destruir las células tumorales que presentan epítopos lipídicos reconocidos por las células NKT (Crowe et al. Journal of experimental Medicine 196:119-127, 2002; Tachibana et al, Clinical Cancer Research 11: 7322-7327, 2005 Dhodapkar et al, Journal of experimental Medicine 197: 1667-1676, 2003 Song et al, Journal of clinical Investigation 119:15241536, 2009). La destrucción directa implica la producción de granzima y perforina. Se ha demostrado que los tumores experimentales como los sarcomas inducidos por agentes carcinogenéticos o por eliminación del gen supresor de tumores p53, así como los tumores espontáneos como los mielomas, son suprimidos por las células NKT. Los tumores susceptibles de ser tratados por la presente divulgación incluyen aquellos que expresan oncogenes, tales como el MAGE identificado en algunos melanomas o tirosina quinasas, tales como ALK (linfoma quinasa anaplásico) identificado en carcinomas de origen ectodérmico, protooncógenos, tales como ciclina DI expresada en carcinomas de tejidos blandos, tales como los de riñón o paratiroides, así como en mieloma múltiple, proteínas derivadas de virus, tales como las del virus de Epstein-Barr, en algunos carcinomas y en algunos linfomas de tipo Hodgkin, factores de supervivencia, tales como determinantes supervivientes o bcl2, y determinantes clonotípicos, tales como determinantes idiotípicos derivados del receptor de células B en linfomas foliculares o mielomas múltiples o determinantes de receptores de células T en neoplasias malignas de células T.
Las células que forman parte de un injerto, ya sea injerto de tejido o injerto celular, no portan, o sólo mínimamente, la molécula CD1d. Lo mismo se aplica a las células transducidas en terapia génica o vacunación génica. En ambas situaciones, respuestas inmunitarias no deseadas que conducen al rechazo del injerto o la inmunización hacia el vector viral, la respuesta es provocada por la presentación indirecta de antígenos de las células presentadoras de antígenos del huésped a las células T del huésped. La eliminación directa mediante la destrucción de las células presentadoras de antígenos del huesped después de la interacción afín con las células NKT elimina la capacidad de montar una respuesta inmunitaria contra aloantígenos o antígenos de vectores virales.
La presente divulgación se refiere a la producción de péptidos que contienen residuos hidrófobos que confieren la capacidad de enlazarse a la molécula CD1d. Tras la administración, dichos péptidos son absorbidos por APC, dirigidos al endosoma tardío donde se cargan en CD1d y se presentan en la superficie de APC. Dichos péptidos hidrófobos se caracterizan por un motivo correspondiente a la secuencia general [FW]-xx-[ILM]-xx[FWTH] o [FWTH]-xx-[ILM]-xx-[FW,] en las que las posiciones PI y P7 están ocupadas por residuos hidrófobos tales como la fenilalanina (F) o el triptófano (W). Sin embargo, P7 es permisivo en el sentido de que acepta residuos hidrófobos alternativos a la fenilalanina o triptófano, como treonina (T) o histidina (H). La posición P4 está ocupada por un residuo alifático como isoleucina (I), leucina (L) o metionina (M).
La solicitud internacional WO 2009/101206 desvela péptidos inmunogénicos capaces de provocar la activación de células CD4+ restringidas de clase II de histocompatibilidad principal, incluido el péptido CGHCGGFTNMFATWSPSK. No se sabe por el documento WO 2009/101206 que los péptidos tengan la capacidad de enlazarse a la molécula CD1d. Por tanto, la presente divulgación se refiere a péptidos que se enlazan a CD1d y activan células NKT, con la afección de que el péptido no sea CGHCGGFTNMFATWSPSK.
La presente divulgación se refiere a péptidos hechos de residuos hidrófobos que naturalmente constituyen un motivo de enlace CD1d. En alguna realización, los residuos de aminoácidos de dicho motivo se pueden modificar, normalmente por medio de la sustitución con residuos que aumentan la capacidad de enlazarse a CD1d. De acuerdo con la especificación, los motivos pueden modificarse para ajustarse más estrechamente al motivo general [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]. Más particularmente, los péptidos se producen para contener una F o W en la posición 7.
Los péptidos de la presente invención también contienen un motivo de tiorreductasa adyacente a los residuos hidrófobos o separado de dichos residuos por un enlazador. Una vez presentado por la molécula CD1d, el motivo tiorreductasa potencia la capacidad de activar las células NKT, aumentando así su actividad antiinfecciosa y/o antitumoral, su capacidad para suprimir las respuestas inmunitarias hacia autoantígenos, alofactores, alérgenos, antígenos de aloinjerto y antígenos de vectores virales utilizados en terapia génica o vacunación génica.
Por lo tanto, una descripción general del motivo completo podría ser [CST]-XX-[CST]-enlazador-[FW]xx-[ILM]-xx-[FWTH] o [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]-enlazador-[CST]-XX-[CST], de acuerdo con el hecho de que el motivo tiorreductasa se puede añadir en el extremo terminal amino o en el extremo terminal carboxi. La adición de un enlazador es opcional. Cuando está presente, dicho enlazador puede estar entre 1 y hasta 7 aminoácidos. Debería estar claro para la persona experimentada en la técnica que esta descripción general se proporciona sólo para una comprensión general de la invención.
La presente divulgación también se refiere a células NKT obtenidas y activadas in vitro para la readministración pasiva a un huésped con el fin de aumentar su capacidad de eliminar células infectadas con un patógeno, células que presentan péptidos derivados de autoantígenos, alofactores o alérgenos, células tumorales, células que presentan aloantígenos desprendidos de injertos o de proteínas virales utilizadas en terapia génica/vacunación génica. Como alternativa a la estimulación in vitro de células NKT por APC CD1d positivo, la divulgación también se aplica a procedimientos de transfección o transducción de APC mediante el uso de un constructo genético capaz de conducir la expresión del péptido inmunogénico en el endosoma tardío para cargarlo en la molécula CD1d.
En particular, la divulgación proporciona formas de expandir células NKT específicas, con la consecuencia de una actividad aumentada que comprende, pero no se limita a:
(i) aumento de la producción de citocinas
(ii) aumento del contacto y eliminación del factor-dependiente soluble de las células presentadoras de antígeno. El resultado es, por tanto, una respuesta más eficaz frente a patógenos intracelulares, autoantígenos, alofactores, alérgenos, células tumorales y una supresión más eficaz de respuestas inmunitarias contra proteínas virales y de injerto utilizadas en la terapia génica/vacunación génica.
La presente divulgación también se refiere a la identificación de células NKT con propiedades requeridas en fluidos corporales u órganos. El procedimiento comprende la identificación de células NKT en virtud de su fenotipo de superficie, incluida la expresión de NK1.1, CD4, NKG2D y CD244. A continuación, las células se ponen en contacto con epítopos de células NKT definidos como péptidos que pueden ser presentados por la molécula CD1d. Luego, las células se expanden in vitro en presencia de IL-2 o IL-15 o IL-7.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona péptidos que contienen un motivo de enlace CD1d y un motivo tiorreductasa para la detección, preparación y agotamiento de células NKT. De acuerdo con la especificación, tales péptidos se pueden cargar en una molécula CD1d aislada, ya sea monomérica o, preferentemente, multimérica. La molécula de CD1d puede estar en forma soluble o enlazada a un soporte sólido.
La presente divulgación se debe considerar como una terapia curativa administrada cuando la infección está contraída o el tumor ya está presente. Esto se debe al hecho de que no se cree que las células NKT entren en un ciclo de memorización. Cuando se activan las células NKT, se expanden durante un período de unos pocos días, y luego la población entra en una fase de contracción y una posible falta de respuesta a corto plazo. Sin embargo, bajo algunas circunstancias, puede resultar aconsejable administrar la terapia mediante inmunización activa con péptidos de la invención en un marco preventivo. Ejemplos de estos son pacientes con alto riesgo de contraer una enfermedad infecciosa, como por ejemplo inmediatamente después del contacto con una persona infectada. También se contempla el uso preventivo de la terapia, ya sea por vacunación activa o por transferencia pasiva de células.
La presente divulgación se refiere en un aspecto al uso de al menos un péptido inmunogénico hidrófobo aislado que comprende (i) un epítopo de células n Kt derivado de un antígeno asociado a patógenos y (ii) un motivo tiooxidorreductasa (motivo tiorredox en síntesis) como un medicamento para prevenir y/o tratar, en un individuo, la infección por dicho patógeno.
En un aspecto adicional, la divulgación también cubre el uso de al menos un péptido inmunogénico hidrófobo aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un autoantígeno, un alofactor o un alérgeno y (ii) un motivo tiorredox como un medicamento para prevenir y/o tratar, en un individuo, respuestas inmunitarias frente a autoantígenos, alofactores y/o alérgenos.
En otro aspecto más, la divulgación también cubre el uso de al menos un péptido inmunogénico hidrófobo aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un antígeno asociado a tumores y (ii) un motivo tiorredox como un medicamento para tratar, en un individuo, un tumor.
En otro aspecto más, la divulgación también cubre el uso de al menos un péptido inmunogénico hidrófobo aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un aloantígeno y (ii) un motivo tiorredox como un medicamento para prevenir, en un individuo, el rechazo de un injerto.
En otro aspecto más, la divulgación también cubre el uso de al menos un péptido inmunogénico hidrófobo aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un vector viral para terapia génica o vacunación génica y (ii) un motivo tiorredox como un medicamento para prevenir, en un individuo, una respuesta inmunitaria contra el vector viral.
En un aspecto adicional, la divulgación también cubre el uso de al menos un péptido inmunogénico aislado que comprende (i) un epítopo de células NKT derivado de un antígeno asociado a patógeno, un autoantígeno, alofactor, alérgeno, un antígeno asociado a tumor, un aloantígeno o un antígeno de vector viral, y (ii) un motivo tiorredox, como un medicamento para aumentar la activación, producción de citocinas y actividad citolítica de células NKT CD4+ en dicho individuo.
Una ventaja adicional de la presente invención está relacionada con el grado muy limitado de polimorfismo de la molécula CD1d. Esto permite el uso de un solo péptido o de un número limitado de péptidos para la terapia de poblaciones consanguíneas, como seres humanos o animales. Además, las células NKT obtenidas de un donante podrían usarse para la transferencia pasiva en múltiples receptores. Esto contrasta mucho con la situación en la que los péptidos son presentados por moléculas de MHC de clase I o clase II, cuyo polimorfismo excluye el uso de péptidos únicos para receptores múltiples.
La estructura general de los epítopos de las células NKT contiene un residuo hidrófobo en las posiciones P1 y P7, con la posición P4 ocupada por una cadena alifática. Por tanto, la estructura general puede finalmente definirse como [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY] en la que x representa cualquier aminoácido. En la posición P1, P4 y P7, puede estar presente cualquiera de los aminoácidos enumerados. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos naturales o no naturales. Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen D-aminoácidos.
Generalmente, el compuesto orgánico con actividad reductora es una secuencia peptídica. Los fragmentos de péptidos con actividad reductora se encuentran en tiorreductasas, que son pequeñas enzimas reductoras de disulfuro que incluyen glutarredoxinas, nucleorredoxinas, tiorredoxinas y otras oxidorreductasas de tiol/disulfuro. Ejercen una actividad reductora para los enlaces disulfuro en proteínas (como enzimas) a través de cisteínas activas redox dentro de secuencias consenso de dominio activo conservadas: C-XX-C, C-XX-S, C-XX-T, S-XX-C, T-XX-C (Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225), en las que X representa cualquier aminoácido. Dichos dominios también se encuentran en proteínas más grandes tales como la proteína disulfuro isomerasa (PDI) y la fosfolipasa C específica de fosfoinosítido. En particular, los péptidos inmunogénicos comprenden como motivo redox el motivo de secuencia de tiorreductasa [CST]-XX-[CST], en otro ejemplo a ello, dicho motivo [CST]-XX-[CST] está posicionado en el terminal N del epítopo de la célula T. Más concretamente, en dicho motivo redox, al menos una de las posiciones [CST] está ocupada por una Cys; de este modo, el motivo es [C]-XX-[CST] o [CST]-XX-[C]. En la presente solicitud, dicho tetrapéptido se denominará "el motivo" o "motivo redox". Más en particular, los péptidos inmunogénicos pueden contener el motivo de secuencia [C]-XX-[CS] o [CS]-XX-[C]. Incluso más particularmente, los péptidos inmunogénicos contienen el motivo de secuencia C-XX-S, S-XX-C o C-XX-C.
El motivo en los péptidos inmunogénicos anteriores se coloca inmediatamente adyacente a la secuencia del epítopo dentro del péptido o se separa del epítopo de la célula T por medio de un enlazador. Más particularmente, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos de 7 aminoácidos o menos. Más particularmente, el enlazador comprende 1,2, 3 o 4 aminoácidos. Los aminoácidos típicos utilizados en enlazadores son serina y treonina. Ejemplos de péptidos con enlazadores de acuerdo con la presente invención son C-XX-C-G-epítopo, C-XX-C-GG-epítopo, C-XX-C-SSSepítopo, C-XX-C-SGSG-epítopo y similares. En otra realización particular más, la secuencia enlazadora abarca aminoácidos presentes de manera natural en la secuencia polipeptídica de la que se deriva el motivo de enlace a CD1d. Pueden incluirse números variables de tales aminoácidos naturales en los extremos amino o carboxiterminal del péptido o en ambos extremos.
Los péptidos inmunogénicos pueden comprender secuencias de aminoácidos cortas adicionales en el terminal N o C de la secuencia (artificial) que comprende el epítopo de células NKT y el compuesto reductor (motivo). Una secuencia de aminoácidos de este tipo se denomina generalmente en la presente memoria como una "secuencia flanqueante". Se puede colocar una secuencia flanqueante en el terminal N y/o C del motivo redox y/o del epítopo de células T en el péptido inmunogénico. Cuando el péptido inmunogénico comprende una secuencia de direccionamiento endosómica, puede estar presente una secuencia flanqueante entre el epítopo y una secuencia de direccionamiento endosómica y/o entre el compuesto reductor (por ejemplo, motivo) y una secuencia de direccionamiento endosómica. Más particularmente, una secuencia flanqueante es una secuencia de hasta 10 aminoácidos, o de entre 1 y 7 aminoácidos, tal como una secuencia de 2 aminoácidos. Más particularmente, la secuencia flanqueante contiene residuos de aminoácidos voluminosos que son útiles para estabilizar el péptido en la molécula CD1d.
En realizaciones particulares de la invención, el motivo redox en el péptido inmunogénico se localiza en el terminal N del epítopo.
Como se detalla anteriormente, los péptidos inmunogénicos comprenden un motivo reductor como se describe en la presente memoria unido a una secuencia de epítopo de células NKT. En casos particulares, los epítopos de células NKT se derivan de proteínas que no comprenden dentro de su secuencia natural nativa una secuencia de aminoácidos con propiedades redox dentro de una secuencia de 11 aminoácidos con terminales N o C adyacentes al epítopo de células NKT de interés.
En realizaciones particulares, el epítopo de células NKT se deriva de un patógeno intracelular. Dichos patógenos pueden ser virus, bacterias o parásitos. Los virus incluyen virus ADNss, ADNds y ARN, con como ejemplos Herpesviridae, Flaviviridae y Picornaviridae, virus de influenza, sarampión e inmunodeficiencia. Las bacterias y micobacterias incluyen Mycobacterium tuberculosis, otras micobacterias patógenas para humanos o animales, Yersiniosis, Brucella, Chlamydiae, Mycoplasma, Rickettsiae, Salmonellae y Shigellae. Los parásitos incluyen Plasmodiums, Leishmanias, Trypanosomas, Toxoplasma gondii, Listeria, Histoplasma.
En realizaciones particulares, el epítopo de células NKT se deriva de autoantígenos, que incluyen tiroglobulina, peroxidasa tiroidea, receptor de TSH en enfermedades tiroideas; insulina (proinsulina), descarboxilasa del ácido glutámico (GAD), tirosina fosfatasa IA-2, proteína de choque térmico HSP65, proteína relacionada con la subunidad catalítica de glucosa6-fosfatasa específica de islote (IGRP) en la diabetes tipo 1; 21-OH hidroxilasa en la adrenalitis autoinmunitaria; 17-alfa hidroxilasa, histidina descarboxilasa, triptófano hidroxilasa, tirosina hidroxilasa, síndromes poliendocrinos autoinmunitarias m; factor intrínseco de ATPasa H+/K+ en gastritis autoinmunitaria y anemia perniciosa; glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolípida (PLP) en la esclerosis múltiple; receptor de acetilcolina en miastenia gravis; proteína de enlace retinal (RBP) en síndromes oculares autoinmunitarias; colágeno tipo II y tipo IX en enfermedades autoinmunitarias del oído interno; transglutaminasa tisular en la enfermedad celíaca; proteína pANCA histona HI en enfermedades inflamatorias del intestino; proteína de choque térmico HSP60 y oxilipoproteínas de densidad ligera en aterosclerosis, y; sinucleína en enfermedad de Parkinson.
En realizaciones particulares, el epítopo de células NKT se deriva de alofactores, que incluyen cualquier péptido o polipéptido usado: (1) para terapia de reemplazo para defectos de coagulación o defectos fibrinolíticos, incluyendo factor VIII, factor IX y estafiloquinasa; (2) hormonas como hormona del crecimiento o insulina; (3) citocinas y factores de crecimiento, tales como interferón-alfa, interferón-gama, GM-CSF y G-CSF; (4) anticuerpos para la modulación de respuestas inmunitarias, incluyendo anticuerpos anti-IgE en enfermedades alérgicas, anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4 en rechazo de injertos y una variedad de enfermedades autoinmunitarias, anticuerpos anti-CD20 en linfomas no Hodgkin; (5) eritropoyetina en insuficiencia renal y; (6) antígenos modificados genéticamente.
En realizaciones particulares, el epítopo de células NKT se deriva de alérgenos, incluidos alérgenos transportados por el aire tales como los derivados de ácaros del polvo doméstico, de pólen o de animales domésticos, alérgenos alimentarios tales como cacahuete, ovoalbúmina, cereales, frutas y legumbres y alérgenos de contacto tales como el látex. Las enfermedades que caracterizan la sensibilización a alérgenos incluyen asma alérgica, rinosinusitis alérgica, choque anafiláctico, urticaria, dermatitis atópica y dermatitis de contacto.
De acuerdo con la especificación, el epítopo de células NKT puede derivar de un tumor, que incluye cualquier péptido o polipéptido derivado de: (1) oncogenes, tales como el MAGE identificado en algunos melanomas; (2) protooncogenes, tales como ciclina DI expresada en carcinomas de tejidos blandos tales como los de riñón o paratiroides, así como en mieloma múltiple; (3) proteínas derivadas de virus, tales como las del virus de Epstein-Barr en algunos carcinomas y en algunos linfomas de tipo Hodgkin; (4) factores de supervivencia, que son factores antiapoptóticos tales como survivina o bcl2; (5) determinantes clonotípicos, tales como determinantes idiotípicos derivados del receptor de células B en linfomas foliculares o mielomas múltiples o determinantes de receptores de células T en neoplasias malignas de células T.
En realizaciones particulares, el epítopo de células NKT se deriva de aloantígeno, que incluye cualquier péptido o polipéptido derivado de determinantes principales de histocompatibilidad clase I o clase II, complejos menores de histocompatibilidad o antígenos relacionados con tejidos. Dichos péptidos o polipéptidos pueden estar implicados en el rechazo de órganos sólidos o celulares. Los injertos celulares incluyen injerto de células de sangre de cordón, injerto de células madre o injerto de células de islotes pancreáticos. Los injertos de órganos sólidos incluyen riñones, pulmones, corazones, hígados, páncreas, huesos, piel o tejidos blandos.
En realizaciones particulares, el epítopo de células NKT se deriva de un vector viral usado para terapia génica o vacunación génica, que incluye cualquier péptido o polipéptido de virus de ARN (gama-retrovirus y lentivirus) o virus de ADN (adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y poxvirus).
Las células NKT provocadas y activadas por péptidos inmunogénicos de la presente invención pueden suprimir la patogénesis debido incluso a antígenos complejos. Un requisito mínimo para que tales células se activen es reconocer un péptido análogo presentado por la molécula CD1d, lo que conduce a la muerte de la célula cargada de patógeno, o la muerte de las APC que presentan el autoantígeno, el alofactor o el alérgeno, o la muerte de células tumorales, o muerte de APC que presenta el aloantígeno, o APC que presenta el antígeno derivado de un vector viral.
En todas las situaciones anteriores, dichos péptidos inmunogénicos activan la producción de citocinas, tales como IFN-gama, que activará otras células efectoras, incluidas las células T CD4+ y las células T CD8+. Tanto las células T CD4+ como las CD8+ pueden participar en la eliminación de la célula que presenta el patógeno intracelular, autoantígeno, alofactor, alérgeno, antígeno tumoral, aloantígeno o antígeno derivado de vector viral.
En situaciones en las que está presente más de un antígeno en un individuo, la misma APC puede no presentar todos los antígenos relevantes, dado que tales antígenos pueden ser absorbidos por APC potencialmente diferentes. Por lo tanto, se anticipa que la combinación de dos o más péptidos inmunogénicos puede usarse para la prevención o el tratamiento de enfermedades. Debería estar claro para las personas experimentadas en la técnica que se prevé cualquier combinación de dichos péptidos inmunogénicos. Los ejemplos de tal combinación incluyen péptidos para suprimir la producción de anticuerpos contra un alofactor como el factor VIII de la vía de coagulación y péptidos para la supresión de respuestas inmunitarias a vectores virales usados para terapia génica de hemofilia A (ausencia de factor VIII funcional). Otros ejemplos incluyen la combinación de infecciones con patógenos como el VIH y las infecciones por micobacterias.
Los péptidos inmunogénicos para su uso en el contexto de la presente invención se identifican por medio de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una realización preferida, se pueden identificar péptidos que comprenden la secuencia general [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY]. Dichos péptidos se identifican mediante procedimientos conocidos por las personas experimentadas en la técnica utilizando algoritmos accesibles en internet. Por ejemplo, los péptidos se pueden identificar al ingresar una secuencia en la siguiente página de internet: http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/
Los péptidos se pueden producir luego por medio de síntesis mediante el uso de, por ejemplo, la síntesis en fase sólida de fmoc bien conocida en la técnica.
Sin embargo, la secuencia general proporcionada en la presente memoria se debe considerar como una indicación de que un péptido contiene un motivo de unión a CD1d. A continuación, dichos péptidos deben ser probados in vitro para comprobar su reactividad con las células NKT. Con este fin, se preparan APC CD1d+ a partir de una fuente animal o humana. Luego, las células se incuban con el péptido de interés y una fuente de células NKT. La activación de este último se puede identificar por proliferación, producción de citocinas como IFN-gama e IL-4 y marcadores de superficie. Estos procedimientos están bien descritos en la técnica. Además, se pueden usar tetrámeros de la molécula CD1d después de cargar con el péptido de la invención para detectar células NKT específicas para dicho péptido. Una posibilidad es utilizar tetrámeros marcados con fluorescencia y detección mediante un sistema de clasificación por fluorescencia (facs).
Los péptidos inmunogénicos de la invención se pueden producir por medio de la tecnología recombinante mediante el uso de sistemas de expresión tales como células bacterianas, células de levadura, células de insectos, células vegetales o células de mamíferos.
En consecuencia, se prevén medicamentos para el tratamiento de infecciones por patógenos intracelulares, para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, de respuestas inmunitarias a alofactores o alérgenos, para el tratamiento de tumores, el tratamiento del rechazo de injertos o el tratamiento de respuestas inmunitarias a vectores virales utilizados para terapia génica o vacunación génica. En muchas de estas situaciones, el tratamiento puede concebirse como una terapia preventiva. El medicamento es normalmente, aunque no necesariamente, una formulación (farmacéutica) que comprende como ingrediente activo al menos uno de los péptidos inmunogénicos descritos en la presente memoria, una población de células NKT para dichos péptidos inmunogénicos o un vector terapéutico génico capaz de expresar dicho péptido inmunogénico. Aparte del ingrediente o ingredientes activos, dicha formulación comprenderá al menos uno de un diluyente, portador o adyuvante (farmacéuticamente aceptable). En particular, la composición farmacéutica son vacunas para aplicación profiláctica o terapéutica.
Además, se prevén medicamentos para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, el tratamiento de respuestas inmunitarias a alofactores, el tratamiento de enfermedades alérgicas, el tratamiento de tumores, el tratamiento de rechazo del injerto y el tratamiento de respuestas inmunitarias provocadas contra vectores virales utilizados para terapia génica y para vacunación génica.
Por consiguiente, la divulgación se refiere a péptidos inmunogénicos, que comprenden al menos un epítopo de células NKT de un antígeno asociado a patógeno, un autoantígeno, un alérgeno, un alofactor, un antígeno tumoral, un antígeno desprendido de un injerto o derivado de un vector viral utilizado en terapia génica o vacunación génica, acoplado a un motivo tiorreductasa de secuencia [CST]-XX-[CST].
La cisteína aminoterminal en el motivo ejerce un ataque nucleofílico sobre un puente disulfuro sobre una proteína diana. El puente disulfuro se reduce y un intercambio de electrones con la segunda cisteína del motivo libera la proteína diana en una forma reducida, a lo que sigue la isomerización y/u homodimerización de la proteína diana. En algunos casos, la heterodimerización puede ocurrir por intercambio de electrones con una proteína diferente. El resultado final es un cambio en la configuración de la proteína diana (isomerización) o la formación de dímeros o polímeros de orden superior. Este mecanismo se proporciona aquí como un ejemplo sin ninguna intención limitante.
El epítopo de células NKT y el motivo tiorreductasa están opcionalmente separados por una secuencia enlazadora. En otras realizaciones opcionales, el péptido inmunogénico comprende adicionalmente una secuencia de direccionamiento endosómica (por ejemplo, secuencia de direccionamiento endosómica tardía) y/o secuencias "flanqueantes" adicionales.
Como se explica en detalle más adelante, los péptidos inmunogénicos de la presente invención se pueden preparar mediante síntesis química, lo que permite la incorporación de aminoácidos no naturales. Por consiguiente, los residuos de cisteína del motivo tiorreductasa pueden reemplazarse por otro aminoácido con un grupo tiol tal como mercaptovalina, homocisteína u otros aminoácidos naturales o no naturales con función tiol. Para tener actividad reductora, los residuos de cisteína no deberían aparecer como parte de un puente disulfuro de cisteína. No obstante, los residuos de cisteína se pueden modificar, por ejemplo, por medio de metilación, dado que la cisteína metilada se convierte en cisteína con grupos tiol libres in vivo.
En los péptidos inmunogénicos de la presente invención que comprenden el motivo tiorreductasa descrito anteriormente, dicho motivo se localiza de manera que, cuando el epítopo encaja en el surco CD1d, dicho motivo permanece fuera del surco de enlace CD1d. Dicho motivo se coloca inmediatamente adyacente a la secuencia del epítopo dentro del péptido o se separa del epítopo de la célula T mediante un enlazador. Más particularmente, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos de 7 aminoácidos o menos. Más particularmente, el enlazador comprende 1, 2, 3 o 4 aminoácidos. En aquellas realizaciones particulares de los péptidos de la invención donde el dicho motivo es adyacente a la secuencia del epítopo, esto se indica como posición P-4 a P-1 o P+1 a P+4 en comparación con la secuencia del epítopo. Aparte de un enlazador peptídico, se pueden usar otros compuestos orgánicos como enlazador para enlazar las partes del péptido inmunogénico entre sí.
En realizaciones particulares de la invención, el motivo tiorreductasa en el péptido inmunogénico se localiza en el terminal N del epítopo.
Como se describió anteriormente, los péptidos inmunogénicos de acuerdo con la invención comprenden, además de un motivo tiorreductasa, un epítopo de células NKT derivado de un antígeno asociado a patógenos, un auto o alofactor, un alérgeno, un antígeno desprendido por un injerto o un antígeno derivado de vectores virales utilizado en terapia génica o vacunación génica. Se puede identificar un epítopo de células NKT en una secuencia de proteína por medio de ensayos funcionales y/o uno o más ensayos de predicción de sílica. Los aminoácidos en una secuencia de epítopo de células NKT se numeran según su posición en el surco de enlace de las proteínas CD1d. En realizaciones particulares, el epítopo de células NKT presente dentro de los péptidos de la invención consiste en entre 7 y 25 aminoácidos, aún más particularmente entre 7 y 16 aminoácidos, pero más particularmente consiste en 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos. En una realización más particular, el epítopo de la célula NKT consiste en una secuencia de 7 aminoácidos. En una realización particular adicional, el epítopo de células NKT es un epítopo, que se presenta a las células NKT mediante moléculas CD1d. En realizaciones particulares de la presente invención, la secuencia del epítopo de las células NKT es una secuencia del epítopo que encaja en la hendidura de una proteína CD1d, más particularmente un péptido de 7 aminoácidos que encaja en la hendidura CD1d. El epítopo de células NKT de los péptidos inmunogénicos de la invención puede corresponder a una secuencia de epítopo natural de una proteína o puede ser una versión modificada de la misma, siempre que el epítopo de células NKT modificado conserve su capacidad para enlazarse dentro de la hendidura CD1d, similar a la secuencia natural del epítopo de células NKT. El epítopo de células NKT modificado puede tener la misma afinidad de enlace por la proteína CD1d que el epítopo natural, pero también puede tener una afinidad reducida. En realizaciones particulares, la afinidad de enlace del péptido modificado es no menos de 10 veces menor que la del péptido original, más particularmente no menos de 5 veces menor. Es un hallazgo de la presente invención que los péptidos de la presente invención tienen un efecto estabilizador sobre los complejos de proteínas. Por consiguiente, el efecto estabilizador del complejo péptido-CD1d compensa la afinidad reducida del epítopo modificado por la molécula CD1d.
En realizaciones particulares, los péptidos inmunogénicos de la invención comprenden además una secuencia de aminoácidos (u otro compuesto orgánico) que facilita la captación del péptido en endosomas (tardíos) para su procesamiento y presentación dentro de los determinantes de CD1d. El direccionamiento tardío del endosoma está mediado por señales presentes en la cola citoplásmica de proteínas y corresponden a motivos peptídicos bien identificados como el motivo [DE]XXXL[LI] o DXXLL con base de dileucina (por ejemplo, DXXXLL), el motivo YXX0 con base de tirosina o el llamado motivo de racimo ácido. El símbolo 0 representa residuos de aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas voluminosas como Phe, Tyr y Trp. Las secuencias de direccionamiento tardío del endosoma permiten el procesamiento y la presentación eficiente del epítopo de células T derivado de antígenos por moléculas CD1d. Dichas secuencias de direccionamiento endosómico están contenidas, por ejemplo, dentro de la proteína gp75 (Vijayasaradhi et al. (1995) J Cell Biol 130, 807-820), la proteína gama c D3 humana, el HLA-BM p (Copier et al. (1996) J Immunol. 157, 1017-1027), la cola citoplasmática del receptor DEC205 (Mahnke et al. (2000) J Cell Biol 151, 673-683). Otros ejemplos de péptidos que funcionan como señales de clasificación para el endosoma se divulgan en la revisión de Bonifacio y Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447. Alternativamente, la secuencia puede ser la de un epítopo de células T subdominante o menor de una proteína, lo que facilita la captación en el endosoma tardío sin superar la respuesta de las células NKT hacia el epítopo de células NKT derivado de asociación a patógenos, el epítopo de células NKT derivado de auto o alofactor, epítopo de células NKT derivado de alérgenos, epítopo de células NKT derivado de antígenos tumorales o epítopos de células NKT derivados de aloantígenos desprendidos por injertos o antígenos de vectores virales usados en terapia génica o vacunación génica.
En realizaciones particulares adicionales, los péptidos inmunogénicos de la invención son péptidos que comprenden epítopos de células NKT que no comprenden un motivo tiorreductasa dentro de su secuencia natural. Sin embargo, en realizaciones alternativas, un epítopo de células NKT que se enlaza a la hendidura CD1d puede comprender un motivo tiooxidorreductasa tal como se describe en la presente memoria dentro de su secuencia de epítopo; los péptidos inmunogénicos de acuerdo con la invención que comprenden tal epítopo de células NKT deben comprender además otro motivo tiooxidorreductasa libre acoplado (adyacente o separado por un enlazador) al terminal N o C al epítopo de manera que el residuo unido pueda asegurar la actividad reductora (contrario al motivo tiooxidorreductasa presente en el epítopo, que está enterrado dentro de la hendidura).
Otro aspecto de la presente invención se refiere a procedimientos para generar péptidos inmunogénicos de la presente invención descritos en la presente memoria. Dichos procedimientos incluyen la identificación de epítopos de células NKT a partir de antígenos asociados a patógenos, de autoantígenos o alofactores de interés, alérgenos, antígenos relacionados con tumores, aloantígenos desprendidos de injertos o antígenos derivados de vectores virales usados en terapia génica o vacunación génica. Los procedimientos para la identificación in vitro y en sílica de epítopos de células NKT son ampliamente conocidos en la técnica y algunos aspectos se detallan a continuación. Dichos procedimientos incluyen además la generación de péptidos inmunogénicos de la invención que incluyen el epítopo de células NKT identificado y un motivo de tiorreductasa (con o sin enlazador o enlazadores, secuencia o secuencias flanqueantes o secuencia de direccionamiento endosómica. A continuación, los péptidos inmunogénicos generados se evalúan para la capacidad de inducir células NKT CD4+ a antígenos asociados a patógenos, autoantígenos, alofactores, alérgenos, antígenos derivados de tumores, aloantígenos desprendidos de injertos o antígenos derivados de vectores virales utilizados para terapia génica o vacunación génica.
Los péptidos inmunogénicos como se divulgan en la presente memoria se generan a partir de epítopo o epítopos de células NKT de antígenos asociados a patógenos, o de autoantígenos, o de alofactores, o de alérgenos, o de tumores, o de aloantígenos, o de vectores virales usados para terapia génica o vacunación génica.
En particular, el epítopo de células NKT usado puede ser un epítopo de células NKT dominante. Es conocido por una persona experimentada en la técnica la identificación y selección de un epítopo de células NKT a partir de un antígeno asociado a un patógeno, de un autoantígeno, alofactor, un alérgeno, un antígeno derivado de tumor, un aloantígeno desprendido por injerto o antígenos derivados de vectores virales utilizados en terapia génica o vacunación génica. Por ejemplo, las secuencias de péptidos aisladas de un antígeno asociado a patógenos, de un autoantígeno o alofactor, un alérgeno, un antígeno derivado de tumores, un aloantígeno desprendido por un injerto o antígenos derivados de vectores virales usados en terapia génica o vacunación génica son probados por, por ejemplo, técnicas de biología de células T, para determinar si las secuencias de péptidos provocan una respuesta de células NKT. Las secuencias de péptidos que se ha encontrado que provocan una respuesta de células NKT se definen como que tienen actividad estimulante de células NKT. La actividad estimulante de las células NKT humanas se puede probar además cultivando células NKT obtenidas de un individuo sensibilizado a un antígeno asociado a un patógeno, un autoantígeno o alofactor, un alérgeno, un antígeno derivado de tumor, un aloantígeno desprendido por injerto o antígenos derivados de vectores virales utilizado en terapia génica o vacunación génica con un péptido/epítopo derivado de dichos antígenos, y determinar si la proliferación de células NKT se produce en respuesta al péptido/epítopo medido, por ejemplo, por captación celular de timidina tritiada. Los índices de estimulación para las respuestas de las células NKT a los péptidos/epítopos se pueden calcular como el CPM máximo en respuesta a un péptido/epítopo dividido por el CPM de control. Un índice de estimulación de células NKT (S.I.) igual a o mayor que dos veces el nivel de fondo se considera "positivo". Los resultados positivos se utilizan para calcular el índice de estimulación medio para cada péptido/epítopo para el grupo de péptidos/epítopos probados. Los epítopos de células NKT no naturales (o modificadas) se pueden probar más opcionalmente para determinar su afinidad de enlace a moléculas CD1d. El enlace de epítopos de células NKT no naturales (o modificadas) a moléculas CD1d se puede realizar de diferentes formas. Por ejemplo, las moléculas de CD1d solubles se obtienen y se hacen tetraméricas por síntesis o acoplamiento químico. La molécula de CD1d se purifica mediante cromatografía de afinidad. Las moléculas de CD1d solubles se incuban con un péptido de referencia marcado con biotina producido de acuerdo con su fuerte afinidad de enlace por esa molécula de CD1d. Los péptidos por evaluar para enlazarse a CD1d se incuban luego a diferentes concentraciones y su capacidad para desplazar el péptido de referencia de su enlace a CD1d se calcula mediante la adición de neutravidina. Se pueden encontrar procedimientos en, por ejemplo, Texier et al., (2000) J Immunology 164, 3177-3184). Los péptidos inmunogénicos de la invención tienen un índice de estimulación de células NKT medio mayor o igual a 2,0. Un péptido inmunogénico que tiene un índice de estimulación de células NKT mayor o igual a 2,0 se considera útil como un agente profiláctico o terapéutico. Más particularmente, los péptidos inmunogénicos de acuerdo con la invención tienen un índice de estimulación de células NKT medio de al menos 2,5, al menos 3,5, al menos 4,0 o incluso al menos 5,0. Además, tales péptidos tienen típicamente un índice de positividad (P.I.) de al menos aproximadamente 100, al menos 150, al menos aproximadamente 200 o al menos aproximadamente 250. El índice de positividad para un péptido se determina por medio de la multiplicación del índice medio de estimulación de células NKT por el porcentaje de individuos, en una población de individuos sensibles a un antígeno de vector viral (por ejemplo, al menos 9 individuos, al menos 16 individuos o al menos 29 o 30, o incluso más), que tienen células NKT que responden al péptido (lo que corresponde al SI multiplicado por la naturaleza promiscua del péptido/epítopo). Por tanto, el índice de positividad representa tanto la fuerza de la respuesta de las células NKT a un péptido (S.I.) como la frecuencia de la respuesta de las células NKT a un péptido en una población de individuos sensibles a un antígeno de vector viral. Para determinar los epítopos óptimos de células NKT mediante, por ejemplo, técnicas de mapeo fino, se modifica un péptido que tiene actividad estimulante de células T y, por lo tanto, comprende al menos un epítopo de células T determinado por técnicas de biología de células T mediante la adición o eliminación de residuos de aminoácidos en el terminal N- o C- del péptido y se probó para determinar un cambio en la reactividad de las células NKT al péptido modificado. Si se encuentra que dos o más péptidos que comparten un área de superposición en la secuencia de la proteína nativa tienen actividad estimulante de células NKT humanas, según se determina mediante técnicas de biología de células T, se pueden producir péptidos adicionales que comprendan todos o una porción de dichos péptidos y estos péptidos adicionales pueden probarse mediante un procedimiento similar. Siguiendo esta técnica, los péptidos se seleccionan y producen de manera recombinante o sintética. Los epítopos o péptidos de las células n Kt se seleccionan en función de diversos factores, incluida la fuerza de la respuesta de las células NKT al péptido/epítopo (por ejemplo, índice de estimulación) y la frecuencia de la respuesta de las células NKT al péptido en una población de individuos.
Se conocen en la técnica procedimientos usados para la identificación de un antígeno asociado a patógeno, de un autoantígeno o alofactor, un alérgeno, un antígeno derivado de tumor, un aloantígeno desprendido por injerto o antígenos derivados de vectores virales usados en terapia génica o vacunación génica. Por tanto, se pueden utilizar estrategias de clonación posicional o clonación de expresión para identificar antígenos candidatos. Para una descripción completa de la metodología, véase, por ejemplo, Mendoza et al, Immunity, 7: 461-472, 1997. Alternativamente, los péptidos realmente presentados por a Pc en moléculas CD1d pueden eluirse y separarse mediante diversos procedimientos cromatográficos. La descripción completa de dicha metodología se encontrará en Scott et al, Immunity, 12: 711-720, 2000. Los antígenos candidatos se pueden cribar por medio de uno o más algoritmos in vitro para identificar una secuencia de epítopo de células NKT dentro de una proteína antigénica. Los algoritmos adecuados incluyen, pero no son limitados a los que se encuentran en la siguiente página de internet: http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/
Más particularmente, tales algoritmos permiten la predicción dentro de una proteína antigénica de una o más secuencias de péptidos que encajarán en el surco de una molécula CD1d.
Los péptidos inmunogénicos de la invención se pueden producir por medio de expresión recombinante en, por ejemplo, células bacterianas (por ejemplo, Escherichia coli), células de levadura (por ejemplo, especies de Pichia, especies de Hansenula, especies de Saccharomyces o Schizosaccharomyces), células de insectos (por ejemplo, de Spodoptera frugiperda o Trichoplusia ni), células vegetales o células de mamífero (por ejemplo, células CHO, COS). La construcción de los vectores de expresión adecuados requeridos por lo tanto (que incluyen información adicional como secuencias promotoras y de terminación) implica mientras tanto técnicas estándar de ADN recombinante. Los péptidos inmunogénicos de la invención producidos de manera recombinante pueden derivarse de una proteína precursora más grande, por ejemplo, mediante escisión enzimática de sitios de escisión enzimática insertados adyacentes al terminal N- y/o C- del péptido inmunogénico, seguido de una purificación adecuada.
En vista de la longitud limitada de los péptidos inmunogénicos de la invención, pueden prepararse mediante síntesis química de péptidos, en la que los péptidos se preparan acoplando los diferentes aminoácidos entre sí. La síntesis química es particularmente adecuada para la inclusión de por ejemplo, D-aminoácidos, aminoácidos con cadenas laterales de origen no natural o aminoácidos naturales con cadenas laterales modificadas como la cisteína metilada. Los procedimientos de síntesis de péptidos químicos están bien descritos y los péptidos se pueden solicitar a empresas como Applied Biosystems y otras empresas. La síntesis de péptidos se puede realizar como síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) o al contrario de la síntesis de péptidos en fase de solución. Los procedimientos SPPS más conocidos son la química en fase sólida de t-Boc y Fmoc, que es ampliamente conocida por las personas experimentadas. Además, los péptidos se pueden unir entre sí para formar péptidos más largos mediante el uso de una estrategia de ligación (acoplamiento quimioselectivo de dos fragmentos de péptidos no protegidos) como describió originalmente Kent (Schnolzer & Kent (1992) Int. J Pept. Protein Res. 40, 180-193) y revisado, por ejemplo, en Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205. Esto proporciona el tremendo potencial para lograr la síntesis de proteínas que está más allá del alcance de SPPS. Muchas proteínas con un tamaño de 100-300 residuos se han sintetizado con éxito mediante este procedimiento. Los péptidos sintéticos han seguido desempeñando un papel crucial cada vez mayor en los campos de investigación de bioquímica, farmacología, neurobiología, enzimología y biología molecular debido a los enormes avances en el SPPS.
Se examinan las propiedades físicas y químicas de un péptido inmunogénico de interés (por ejemplo, solubilidad, estabilidad) para determinar si el péptido es/sería adecuado para su uso en composiciones terapéuticas. Normalmente, esto se optimiza ajustando la secuencia del péptido. Opcionalmente, el péptido se puede modificar después de la síntesis (modificaciones químicas, por ejemplo, agregar/eliminar grupos funcionales) usando técnicas conocidas en la técnica.
Por consiguiente, en otro aspecto más, la presente divulgación proporciona procedimientos para generar células NKT CD4+ específicas de antígeno asociadas a patógenos, o células NKT CD4+ específicas de autoantígeno o alofactor, o células NKT CD4+ específicas de alérgeno, o células NKT CD4+ específicas de antígeno tumoral, o células NKT CD4+ específicas de aloantígenos desprendidos de injertos, o células NKT CD4+ específicas de antígenos de proteínas virales utilizadas en terapia génica o vacunación génica, ya sea in vivo o in vitro (ex vivo). En particular, dichas células NKT responden con fuertes propiedades proliferativas hacia cualquier célula que presente dichos antígenos y se pueden obtener como una población celular. Además, en particular, dichas células NKT responden con fuertes propiedades supresoras hacia cualquier célula que presente un auto o aloantígeno, un alérgeno, antígenos desprendidos de injerto o derivados de proteínas virales utilizadas en terapia génica o vacunación génica, y se pueden obtener como población celular.
La divulgación se extiende a dichas (poblaciones de) células NKT CD4+ específicas de antígeno que se pueden obtener mediante los procedimientos descritos en la presente memoria.
De acuerdo con la especificación, se proporcionan procedimientos que pueden comprender el aislamiento de células sanguíneas periféricas, la estimulación de la población celular in vitro al poner en contacto un péptido inmunogénico de acuerdo con la invención con las células sanguíneas periféricas aisladas y la expansión de la población de células estimuladas, más particularmente en presencia de IL-2 o IL-15 e IL-7. Los procedimientos usados en la presente memoria tienen la ventaja de que se producen un mayor número de células NKT CD4+ y que se pueden generar dichas células que son específicas para el antígeno asociado a patógeno, o para el auto o aloantígeno, el alérgeno, el antígeno relacionado con tumor, los antígenos desprendidos de injertos o los antígenos de proteínas virales utilizados en terapia génica o vacunación génica (mediante el uso de un péptido que comprende un epítopo específico de antígeno).
De acuerdo con la presente memoria descriptiva, las células NKT CD4+ se pueden generar in vivo, es decir, por medio de la administración de un péptido inmunogénico proporcionado en la presente memoria a un individuo, y la recolección de células NKT CD4+ generadas in vivo.
Las células NKT CD4+ específicas de antígeno asociadas a patógenos que se pueden obtener mediante los procedimientos anteriores son de particular interés para su uso como un medicamento para prevenir la morbilidad y/o mortalidad en un sujeto asociadas con la infección con virus, bacterias o parásitos. Las células NKT CD4+ específicas de autoantígeno o alofactor que pueden obtenerse mediante los procedimientos anteriores son de particular interés para su uso como un medicamento para suprimir la morbilidad y/o mortalidad asociadas con enfermedades autoinmunitarias o la reacción contra alofactores. Las células NKT CD4+ específicas de alérgeno que se pueden obtener mediante los procedimientos anteriores son de particular interés para su uso como un medicamento para suprimir morbilidad y/o mortalidad asociadas con enfermedades alérgicas. Las células NKT CD4+ específicas de antígeno tumoral que se pueden obtener mediante los procedimientos anteriores son de particular interés para su uso como un medicamento para suprimir morbilidad y/o mortalidad asociadas con tumores. Las células NKT CD4+ específicas de aloantígeno de injerto que se pueden obtener mediante los procedimientos anteriores son de particular interés para prevenir el rechazo del injerto. Las células NKT CD4+ específicas de proteínas víricas que se pueden obtener mediante los procedimientos anteriores son de particular interés para su uso como un medicamento para suprimir morbilidad y/o mortalidad asociadas con terapia génica o vacunación génica.
Para cualquiera de los usos descritos anteriormente de los péptidos inmunogénicos de la invención, dichos péptidos pueden ser reemplazados por dichas células NKT CD4+. Se prevé tanto el uso de células alogénicas como autógenas. Cualquier procedimiento que comprenda la administración de dichas células NKT CD4+ específicas de antígeno a un sujeto que lo necesite (es decir, para prevenir la morbilidad asociada a la infección con un patógeno intracelular, prevenir o tratar la morbilidad asociada con enfermedades autoinmunitarias, reacción al alofactor, exposición al alérgeno, tumor, rechazo de injerto y reacción contra antígenos de vectores virales) es parte de la presente divulgación.
La presente divulgación también se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos inmunogénicos de la presente invención y procedimientos para su uso, por ejemplo, para expresión recombinante o en terapia génica. En particular, dichas secuencias de ácido nucleico son capaces de expresar péptidos inmunogénicos de la invención.
Los péptidos inmunogénicos de la invención se pueden administrar a un sujeto que lo necesite usando cualquier procedimiento de terapia génica adecuado. En cualquier uso o procedimiento descrito para la prevención de la morbilidad/mortalidad asociada con un patógeno o para la supresión de la respuesta inmunitaria a un autoantígeno o alofactor, la inmunización con un péptido inmunogénico de la invención puede combinarse con transferencia celular adoptiva. Cuando se combinan, dicha inmunización, se pueden usar simultánea o secuencialmente en cualquier combinación posible la transferencia de células adoptivas y terapia génica.
En la terapia génica, las moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican los péptidos inmunogénicos se pueden usar como ADN desnudo o en liposomas u otros sistemas lipídicos para la administración a células diana. Las personas experimentadas en la técnica conocen bien otros procedimientos para la transferencia directa de ADN plasmídico a las células para su uso en terapia génica humana e implican direccionar el ADN a receptores de las células formando complejos del ADN plasmídico con las proteínas. En su forma más simple, la transferencia de genes se puede realizar simplemente inyectando mínimas cantidades de ADN en el núcleo de una célula, mediante un proceso de microinyección. Una vez que los genes recombinantes se introducen en una célula, pueden ser reconocidos por los mecanismos normales de la célula para la transcripción y traducción, y se expresará un producto génico. También se han intentado otros procedimientos para introducir ADN en un mayor número de células. Estos procedimientos incluyen: transfección, en la que el ADN se precipita con fosfato de calcio y se introduce en las células mediante pinocitosis; electroporación, en la que las células se exponen a grandes pulsos de voltaje para introducir agujeros en la membrana); fusión de lipofección/liposomas, en la que el ADN se empaqueta en vesículas lipofílicas que se fusionan con una célula diana; y bombardeo de partículas utilizando ADN enlazado a pequeños proyectiles. Otro procedimiento para introducir ADN en células es acoplar el ADN a proteínas modificadas químicamente. Las proteínas de adenovirus son capaces de desestabilizar endosomas y potenciar la captación de ADN en las células. La mezcla de adenovirus con soluciones que contienen complejos de ADN, o el enlace de ADN a polilisina unida covalentemente a adenovirus usando agentes de entrecruzamiento de proteínas mejora sustancialmente la captación y expresión del gen recombinante. Los vectores de virus adenoasociados también se pueden usar para la administración de genes en células vasculares. Como se usa en la presente memoria, "transferencia génica" significa el proceso de introducir una molécula de ácido nucleico extraña en una célula, lo que se realiza comúnmente para permitir la expresión de un producto particular codificado por el gen. El dicho producto puede incluir una proteína, polipéptido, ADN o ARN antisentido o ARN enzimáticamente activo. La transferencia génica se puede realizar en células cultivadas o mediante administración directa a mamíferos. En otro ejemplo, se proporciona un vector que comprende una secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de acuerdo con la invención. En ejemplos particulares, el vector se genera de manera que la secuencia de la molécula de ácido nucleico se exprese solo en un tejido específico. Los procedimientos para lograr la expresión génica específica de tejido son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, colocando la secuencia que codifica un péptido inmunogénico de la invención bajo control de un promotor, que dirige la expresión del péptido específicamente en uno o más tejido o tejidos u órgano u órganos. Los vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, adenovirus, virus adenoasociado, virus del herpes, virus de ARN o virus del papiloma bovino, pueden usarse para la administración de secuencias de nucleótidos (por ejemplo, ADNc) que codifican péptidos, homólogos o derivados de los mismos de acuerdo con la invención en los tejidos o la población celular diana. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos por las personas experimentadas en la técnica para construir vectores virales recombinantes que contienen tales secuencias codificantes. Alternativamente, las células manipuladas que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido inmunogénico de acuerdo con la invención pueden usarse en terapia génica.
Debería estar claro para la persona experimentada en la técnica que el péptido o polipéptido usado en la terapia génica puede ser parte del antígeno completo del que se deriva el péptido o polipéptido.
Donde se asegura la administración de uno o más péptidos de acuerdo con la invención por medio de transferencia génica (es decir, la administración de un ácido nucleico que asegura la expresión de péptidos de acuerdo con la invención in vivo tras administración), la dosificación apropiada del ácido nucleico se puede determinar en base a la cantidad de péptido expresada como resultado del ácido nucleico introducido.
El medicamento como se desveló en la presente memoria es usualmente, pero no necesariamente, una formulación (farmacéutica) que comprende como ingrediente activo al menos uno de los péptidos inmunogénicos de la invención, un (población de) péptido inmunogénico de células NKT CD4+ o un vector terapéutico génico capaz de expresar dicho péptido inmunogénico. Aparte del ingrediente o ingredientes activos, dicha formulación comprenderá al menos uno de un diluyente, portador o adyuvante (farmacéuticamente aceptable). Normalmente, los compuestos farmacéuticamente aceptables (tales como diluyentes, portadores y adyuvantes) se pueden encontrar en, por ejemplo, un manual de Farmacopea (por ejemplo, Farmacopea estadounidense, europea o internacional). El medicamento o composición farmacéutica como se desvelan en la presente memoria normalmente comprende una cantidad (profiláctica o terapéuticamente) eficaz del ingrediente o ingredientes activos en la que la eficacia está relacionada con la afección o trastorno que se va a prevenir o tratar. En particular, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria son vacunas para aplicación profiláctica o terapéutica.
El medicamento o composición farmacéutica como se desvela en la presente memoria puede necesitar ser administrado a un individuo que lo necesite como parte de un régimen profiláctico o terapéutico que comprende múltiples administraciones de dicho medicamento o composición. Dichas administraciones múltiples usualmente ocurren secuencialmente y el intervalo de tiempo entre dos administraciones puede variar y se ajustará a la naturaleza del ingrediente activo y la naturaleza de la afección que se va a prevenir o tratar. La cantidad de ingrediente activo administrada a un sujeto que lo necesita en una sola administración también puede variar y dependerá de factores tales como el estado físico del sujeto (por ejemplo, peso, edad), el estado de la afección a prevenir o tratar, y la experiencia del doctor tratante, médico o enfermero.
El término "diluyentes" se refiere, por ejemplo, a soluciones salinas fisiológicas. El término "adyuvante" normalmente se refiere a un agente farmacológico o inmunológico que modifica (preferiblemente aumenta) el efecto de otros agentes (por ejemplo, fármacos, vacunas) mientras que tiene pocos o ningún efecto directo cuando se administra por sí mismo. Se da como un ejemplo de un adyuvante de hidróxido de aluminio (alumbre), al que se puede adsorber un péptido inmunogénico de la invención. Además, se conocen muchos otros adyuvantes en la técnica y se pueden usar siempre que faciliten la presentación de péptidos en CD1d y la activación de células NKT. El término "portador farmacéuticamente aceptable" significa cualquier material o sustancia con la que se formula el ingrediente activo para facilitar su aplicación o diseminación al lugar a tratar, por ejemplo, disolviendo, dispersando o difundiendo dicha composición, y/o para facilitar su almacenamiento, transporte o manipulación sin alterar su eficacia. Incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos (por ejemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotónicos (como azúcares o cloruro de sodio) y similares. Pueden incluirse ingredientes adicionales para controlar la duración de acción del ingrediente activo en la composición. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser un sólido o un líquido o un gas que se ha comprimido para formar un líquido, es decir, las composiciones se pueden usar adecuadamente como concentrados, emulsiones, soluciones, granulados, polvillos, aspersores, aerosoles, suspensiones, ungüentos, cremas, comprimidos, pellas o polvos. También son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica las formulaciones de portadores farmacéuticos adecuados para su uso en dichas composiciones farmacéuticas, y no existe una restricción particular para su selección en la presente divulgación. También pueden incluir aditivos tales como agentes humectantes, agentes dispersantes, etiquetas adhesivas, adhesivos, agentes emulsionantes, disolventes, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos (por ejemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotónicos (tales como azúcares o cloruro de sodio) y similares, siempre que los mismos sean compatibles con la práctica farmacéutica, es decir, portadores y aditivos que no creen un daño permanente a los mamíferos. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar de cualquier manera conocida, por ejemplo mezclando, recubriendo y/o triturando homogéneamente los ingredientes activos, en un procedimiento de una o varias etapas, con el material portador seleccionado y, donde sea apropiado, los otros aditivos tales como agentes con actividad de superficie. También pueden prepararse mediante micronización, por ejemplo, con el fin de obtenerlas en forma de microesferas que normalmente tienen un diámetro de aproximadamente 1 a 10 pm, específicamente para la fabricación de microcápsulas para la liberación controlada o sostenida de los ingredientes activos.
Los péptidos inmunogénicos, homólogos o derivados de los mismos de acuerdo con la invención (y sus sales fisiológicamente aceptables o composiciones farmacéuticas, todas incluidas en el término "ingredientes activos") pueden administrarse por cualquier vía apropiada a la afección a prevenir o tratar y apropiada para los compuestos, aquí las proteínas inmunogénicas a administrar. Las posibles vías incluyen regional, sistémica, oral (forma sólida o inhalación), rectal, nasal, tópica (incluyendo ocular, bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intraarterial, intratecal y epidural). La vía de administración preferida puede variar, por ejemplo, con la afección del receptor o con la afección a prevenir o tratar.
Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Las formulaciones para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, bolsitas o comprimidos que contienen cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como polvo o gránulos; como solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El ingrediente activo también puede presentarse en forma de bolo, electuario o pasta. Se puede preparar una tableta por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma de flujo libre tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglomerante, lubricante, diluyente inerte, conservante, agente con actividad de superficie o agente dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir o ranurar opcionalmente y se pueden formular para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo que contienen.
También se divulgan péptidos inmunogénicos aislados que comprenden un epítopo de células NKT de un antígeno asociado a patógenos, de un autoantígeno o alofactor, de un alérgeno, un antígeno asociado a tumores, un aloantígeno desprendido de un injerto o antígenos de virus utilizados para terapia génica o vacunación génica y, adyacente a dicho epítopo de células NKT o separado de dicho epítopo de células NKT por un enlazador, un motivo tiorreductasa.
Los vectores virales con fines de terapia génica o vacunación génica son muy susceptibles de modificaciones mediante tecnología de ácidos nucleicos recombinantes. En vista de lo anterior, una persona capacitada preverá fácilmente que la modificación del epítopo de células NKT del vector viral, tal como se aplica en los péptidos inmunogénicos y sus usos, se puede introducir inmediatamente en el propio vector viral. Como tal, la vacunación con los péptidos inmunogénicos que comprende un epítopo de células NKT de un antígeno asociado a patógeno, un autoantígeno o alofactor, un alérgeno, un antígeno asociado con un tumor, un aloantígeno de un injerto o antígenos de vectores virales usados para terapia génica o vacunación génica y un motivo de tiorreductasa (y/o la correspondiente vacunación génica y/o la correspondiente transferencia celular adoptiva) se puede volver redundante dado que se pueden obtener los mismos efectos beneficiosos con un vector viral modificado. Por tanto, la presente divulgación abarca además vectores virales modificados definidos como vectores virales aislados caracterizados porque al menos un epítopo de células NKT presente en al menos una de las proteínas del vector viral se modifica por medio de la inserción en dicha proteína del vector viral, adyacente a dicho epítopo de células NKT o separado de dicho epítopo de células NKT por un enlazador, de un motivo tiorreductasa. En un ejemplo, dicho vector viral se caracteriza además porque dicho epítopo de células NKT modificado es capaz de ser presentado por una molécula CD1d. En otro ejemplo, dichos vectores virales aislados se caracterizan además porque sus propiedades de transducción celular no se alteran significativamente en comparación con el mismo vector viral que no porta la modificación del epítopo de células NKT.
La presente invención se ilustrará ahora por medio de los siguientes ejemplos, que se proporcionan sin ninguna intención limitante.
Ejemplos
Ejemplo 1
Control de la activación de células T CD4+ restringidas de clase II específicas del factor VIII por medio de inmunización con un péptido que contiene un epítopo de células T restringidas a CD1d y un motivo tiorreductasa en los residuos flanqueantes.
Se inmunizaron ratones KO con factor VIII BALB/c (grupo A) 4 veces en un intervalo de 1 semana con 50 |jg de péptido 2196, que contiene un epítopo de células NKT restringido a CD1d y un motivo de tiorreductasa C-XX-C dentro de los residuos flanqueantes (SEQ ID1).
SEQ ID1: CGH CGG FTN MFA TWS PSK
A continuación, se inyectó factor VIII humano por vía subcutánea mediante el uso de 10 IU por inyección en 5 ocasiones separadas por una semana. Diez días después de la última inmunización, se sacrificaron los ratones y se prepararon células T CD4+ de bazo mediante clasificación magnética de células. Estas células se estimularon dos veces con el péptido inmunizante y FVIII in vitro antes de evaluar su estado de activación medido por la producción de IL-4 e IFN-gamma. Un grupo de control (B) se trató de acuerdo con el mismo protocolo pero no recibió vacunación con péptidos.
Los resultados (Figura 1) muestran una reducción de 10 veces en la producción de IL-4 por células T CD4+ específicas del Factor VIII obtenidas de ratones inmunizados con el péptido en comparación con el grupo de control, y una reducción de 7 veces en la producción de IFN-gama.
Los resultados se muestran como medias SEM.
Ejemplo 2
Supresión de la respuesta de anticuerpos IgG anti-Ad5 por medio de inmunización con un péptido que contiene un epítopo de células NKT restringido a CD1d y un motivo tiorreductasa
Se inmunizaron ratones C57BL/6 (n = 6) por medio de cuatro inyecciones subcutáneas de 50 jg de péptido de SEQ ID2 en alumbre llevadas a cabo en un intervalo de una semana.
SEQ ID2: CHG CGG FIGLMYY
Dicho péptido contiene un epítopo de células NKT restringido a CD1d de hex sobre proteína de adenovirus (Ad5) y un motivo tiorreductasa en residuos flanqueantes. Un grupo de control (n = 6) de ratones recibió suero fisiológico en alumbre en lugar de péptido. A continuación, todos los ratones recibieron 2 inyecciones de 9 partículas virales Ad5 por vía IV, separadas por 1 semana. Diez días después de la última inyección de Ad5, se desangraron los ratones y se midió la concentración de anticuerpos IgG totales contra las partículas de Ad5 en un ELISA de unión directa. Brevemente, las partículas virales Ad5 se insolubilizaron en placas de poliestireno, seguidas de un lavado y una incubación con una dilución de suero de ratón. Después de un segundo lavado, se detectó el enlace de anticuerpos anti-Ad5 de ratón mediante la adición de un antisuero de cabra a IgG de ratón. Los ratones pretratados con péptido (histograma negro; Figura 2) no produjeron cantidades significativas de anticuerpos, mientras que los ratones no inmunizados (histograma abierto) produjeron una respuesta enérgica después de la segunda inyección de Ad5. Los resultados se dan en unidades arbitrarias como medias SEM.** indica significancia a p< 0,001.
Ejemplo 3
Inducción de apoptosis de células tumorales por células NKT CD4+ provocada por inmunización de ratón con un péptido que abarca un epítopo NKT restringido a CD1d que contiene un motivo tiorreductasa
Se inmunizaron ratones C57BL/6 (n = 6) mediante cuatro inyecciones subcutáneas de 50 jg de péptido de SEQ ID3 en alumbre llevadas a cabo en un intervalo de una semana.
SEQ ID3: CGH CGG FDKLPGF
Dicho péptido contiene un epítopo de células NKT restringido a CD1d derivado de ovoalbúmina y un motivo tiorreductasa en residuos flanqueantes. Un grupo de control (n = 6) de ratones recibió suero fisiológico en alumbre en lugar de péptido. Diez días después de la última inmunización, se sacrificaron los ratones y se prepararon células T CD4+ de bazo mediante clasificación magnética de células. Estas células se estimularon dos veces con el péptido inmunizante in vitro antes de evaluar su estado de activación medido por la producción de IL-4 e IFN-gama.
A continuación, se ensayaron in vitro líneas de células NKT CD4+ para determinar su capacidad para matar células tumorales EG7. Las células tumorales EG7 (H-2b) se derivan de un timoma transducido con un constructo de óvulo. Tales células presentan un epítopo de óvulo restringido a CD1d, que se sabe que es insuficiente para desencadenar la activación de NKT y la muerte de células tumorales.
Se marcaron células EG7 a nivel de membrana con D iOCi81 pM (perclorato de 3,3' dioctadecicloxacarbocianina de Invitrogen). A continuación, se cultivaron células EG7 (1x105 por pocillo) durante 18 horas a 37 ° C en presencia de líneas de células NKT en proporciones de 1/1 (células EG7 frente a células NKT). Las líneas de células NKT se habían estimulado en primer lugar durante 4 horas in vitro con células presentadoras de antígeno cargadas con péptido de SEQ ID3. Después de 18 horas, las células se cosecharon y se tiñeron para anexina V y 7-AAD siguiendo las instrucciones del fabricante (kit de detección de apoptosis; BD Biosciences) y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCantoII (BD Biosciences).
Los resultados muestran que las células EG7 incubadas con líneas celulares NKT obtenidas de ratones inmunizados con péptido de SEQ ID3 son inducidas a apoptosis, mientras que las células NKT obtenidas de ratones de control que han recibido suero fisiológico en lugar de péptido no indujeron un grado significativo de tum o apoptosis celular.
Ejemplo 4
Uso de tetrámeros de moléculas CD1d para la detección de linfocitos NKT CD4+ específicos de MOG
La esclerosis múltiple es una enfermedad de desmielinización crónica en la que es probable que las células NKT CD4+ hacia autoantígenos tales como la glicoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG) jueguen un papel clave. Su equivalente experimental, EAE (encefalomielitis autoinmunitaria experimental) imita la mayoría de las características distintivas de las enfermedades humanas y se utiliza para comprender los mecanismos patogénicos y delinear nuevos tratamientos.
Por lo tanto, la enumeración de células NKT CD4+ específicas de MOG podría predecir el resultado de la enfermedad.
Se identifica un epítopo de enlace a CD1d en la proteína MOG de ratón por medio de una combinación de algoritmos y ensayo funcional como se describe anteriormente, correspondiente a la secuencia 200 a 206.
Se preparan células NKT CD4+ a partir del bazo de ratones C57BL/6 en los que se ha inducido EAE. Las células CD4(-) se extraen primero de la suspensión de células del bazo utilizando perlas magnéticas.
Los tetrameros de moléculas de CDd (H-2b) se fabrican como se conoce en la técnica, que incluyen un marcador fluorescente tal como ficoeritrina.
Se produce un péptido sintético, que abarca un epítopo de células MOG NKT restringido a CD1d y un motivo tiorreductasa por medio de incubación durante la noche:
CGPCGGFLRVPCWKI (SEQ ID 4), que contiene un enlazador que une el motivo tiorreductasa (CGPC) y el motivo de enlace CD1d.
Los tetrameros se cargan con el péptido de SEQ ID 4 durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, los tetrámeros cargados se lavan y se incuban con células T CD4+ durante 2 horas a 37 ° C. A continuación, se lee la suspensión con un sistema de clasificación de células activado por fluorescencia y se evalúa la proporción de células NKT específicas del péptido MOG.
Ejemplo 5
Muerte directa de una célula tumoral H-2b (R113) por células NKT provocada con un epítopo de células NKT restringido a CD1d derivado de quinasa de linfoma anaplásico (ALK).
La quinasa de linfoma anaplásico es un receptor de tirosina quinasa transmembrana que se expresa en muchas células durante la ontogenia, pero solo en tumores de origen ectodérmico en la vida adulta. Por tanto, se considera como un oncógeno directamente relacionado con todos los tumores de origen ectodérmico como se muestra tanto en modelos animales como en tumores humanos. Por ejemplo, hasta el 60 % de los cánceres de mama humanos expresan ALK. Las líneas de células tumorales ALK+ de origen de ratón están disponibles y se pueden usar para evaluar si las células T CD4+ citolíticas específicas de ALK son capaces de matar células tumorales.
Las células T CD4 (C57BL/6, fondo H-2b) obtenidas del bazo de ratones bloqueados genéticamente se estimularon cuatro veces con células dendríticas autólogas cargadas con un epítopo de células NKT restringido a CD1d de ALK, al que se agregó un motivo de tiorreductasa del formato CxxC dentro de los residuos flanqueantes. (Péptido de SEQ ID5: CHGCGGWLQIVTWGPGS -con el motivo de la tiorreductasa subrayado y 2 glicinas utilizadas como enlace entre el motivo y el epítopo restringido a CD1d-)
Como las células NKT tienen por sí mismas una actividad citolítica, incluimos células que fueron estimuladas en experimentos paralelos por medio de la exposición al mismo epítopo NKT restringido a c D1 d en secuencia natural, sin motivo tiorredox (WLQIVTWGPGS).
Diez días después de la última estimulación, las células T CD4 se lavaron y se añadieron a microplacas de cultivo celular que contenían 104 células tumorales R113 en una proporción de 2 a 1 (CD4 para girar o células). R113 es una línea de células B tumorales obtenida de ratones C57BL/6, que expresa constitutivamente ALK. Después de 20 horas de cocultivo, se evaluó el enlace de las células tumorales R113 con anexina V usada como marcador de apoptosis celular.
La Figura 3 muestra que en presencia de células NKT cultivadas con el péptido de secuencia 1, hay un aumento de 4,5 veces en la muerte de células tumorales (18 %; histograma medio) en comparación con las células tumorales cultivadas solas (3,8 %; histograma izquierdo). Como era de esperar, las células NKT activadas por interacción análoga con CD1d y el péptido en secuencia natural muestran un % intermedio de muerte celular (11 %, histograma derecho). media ± Sd de triplicados.
Por lo tanto, se concluye que:
(1) los péptidos se pueden presentar dentro del contexto de determinantes de CD1d;
(2) las células tumorales auténticas se pueden inducir a la apoptosis por medio de la exposición a células NKT obtenidas por activación a través del reconocimiento análogo de un epítopo restringido a CD1d;
(3) una proporción significativamente mayor de células tumorales se induce a la apoptosis cuando las células NKT se activan mediante exposición a un epítopo de células NKT restringido a CD1d que contiene un motivo tiorreductasa dentro de los residuos flanqueantes.
En un segundo experimento, se obtuvieron células T CD4 bloqueadas genéticamente de un fondo genético alternativo (ratones BALB/c, fondo H-2d) del bazo de ratones bloqueados genéticamente y se estimularon cuatro veces con células dendríticas autólogas cargadas con péptido de s Eq ID5. Se llevó a cabo el cocultivo con una línea de células tumorales (VAC) ALK+ derivada de BALB/c como se describió anteriormente. La apoptosis de las células tumorales se midió evaluando la unión de Anexina-V mediante facs.
La Figura 4 muestra que en presencia de células NKT cultivadas con el péptido de secuencia 1, hay un aumento significativo en la muerte de células tumorales (25 %; histograma medio) en comparación con las células tumorales cultivadas solas (5,6 %; histograma izquierdo) o en la presencia de péptido en secuencia natural (15 %; histograma derecho). media ± SD de triplicados.
Estos datos indican que una segunda línea celular tumoral no relacionada se puede inducir a la apoptosis cuando se expone a células NKT, y que este efecto aumenta significativamente cuando las células NKT han sido estimuladas por la exposición a epítopos restringidos a CD1d que contienen un motivo tiorreductasa adentro de residuos flanqueantes.
Ejemplo 6
Prevención de EAE por medio de preinmunización con un péptido que contiene un motivo de enlace CD1d y un motivo tiorreductasa
La EAE (encefalomielitis autoinmunitaria experimental) es una enfermedad modelo en la que se produce la desmielinización del sistema nervioso central y que se considera como el equivalente experimental de la esclerosis múltiple. Se considera que un pequeño número de autoantígenos están implicados en la provocación y mantenimiento de la enfermedad, entre los que se encuentran la MOG (glucoproteína oligodendrocítica de mielina). La enfermedad se puede provocar en los ratones C57BL/6 mediante inmunización con MOG, utilizando un epítopo de células T CD4+ que abarca los aminoácidos 35-55 de MOG.
La MOG contiene una secuencia que se enlaza a CD1d y activa las células NKT. De este modo, el péptido de secuencia PHFLRVPCWKI se produce por síntesis y un péptido que contiene tiorreductasa de secuencia CHGCGGFLRVPCWKI (péptido de SEQ iD6, en el que el motivo tiorreductasa está subrayado y un enlazador de 2 glicinas entre el motivo y el motivo de enlace a CD1d).
Se inmunizan grupos de ratones C57BL/6 cuatro veces por vía subcutánea (50 |jg) con péptido de SEQ ID6 o, como control, con péptido en secuencia natural. Diez días después de la última inmunización, se induce la enfermedad a todos los ratones, incluido un grupo de animales bloqueados genéticamente, no inmunizados, por medio de una inyección subcutánea de 100 jg de péptido MOG 35-55/400 jg de Mycobacterium butyricum en c Fa y una inyección ip de 300 ng de Bortetella pertussis en NaCl. El día 2, se administra una segunda inyección de B. pertussis.
Se siguen los signos de EAE a lo largo del tiempo. Se observa que los ratones preinmunizados con péptido de SEQ

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido inmunogénico aislado que comprende:
(1) un epítopo de células T asesinas naturales (NKT) de una proteína antigénica que comprende un motivo [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY]; y
(2) un motivo tiorreductasa [CST]-xx-C o C-xx-[CST], que es inmediatamente adyacente a dicho epítopo de células NKT o separado por un enlazador de como máximo 7 aminoácidos,
(3) una secuencia opcional de aminoácidos de flanqueo de hasta 10 aminoácidos en el extremo N y/o C del péptido,
en la que dicha proteína antigénica no comprende en su secuencia natural un motivo [CST]-xx-C o C-xx-[CST] dentro de los 11 aminoácidos N- o C adyacentes terminalmente a dicho epítopo de células n Kt .
2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como medicamento, preferentemente para su uso en el tratamiento de tumores.
3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en la detección, preparación y agotamiento de las células NKT CD4+.
4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o el péptido para uso de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3, en el que dicho epítopo de células NKT comprende una secuencia representada por el motivo [FW]-xx-[ILMV]-xx-[FW],
5. El péptido o el péptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho motivo tiorreductasa tiene la secuencia C-XX-C.
6. El péptido o el péptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que X representa cualquier aminoácido excepto tirosina, fenilalanina y triptófano.
7. El péptido o el péptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha proteína antigénica es un antígeno asociado a un tumor.
8. El péptido o el péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho antígeno asociado a tumores se selecciona del grupo de antígenos asociados a tumores que consiste en: oncógenos, protooncógenos, proteínas derivadas de virus, bcl2 y reactivos clonotípicos.
9. El péptido o el péptido para uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que dicho antígeno asociado al tumor se selecciona del grupo de antígenos asociados al tumor que consiste en: MAGE, ciclina D1, proteínas del virus de Epstein-Barr, bcl2, determinantes idiotípicos derivados de receptores de células B o determinantes de receptores de células T.
10. Un procedimiento in vitro para obtener una población de células NKT CD4+ específicas de antígeno, el procedimiento comprende las etapas de:
- proporcionar células sanguíneas periféricas aisladas;
- poner en contacto dichas células in vitro con un péptido inmunogénico que comprende
(1) un epítopo de células NKT de una proteína antigénica que comprende un motivo [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY]; y
(2) un motivo C-XX-[CST] o [CST]-XX-C de tiorreductasa; y
- expandir dichas células en presencia de IL-2, IL-15 o IL-7.
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha proteína antigénica es un antígeno asociado a un tumor.
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho antígeno asociado al tumor se selecciona del grupo de antígenos asociados al tumor que consiste en: oncógenos, protooncógenos, proteínas derivadas de virus, bcl2 y reactivos clonotípicos.
13. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 11 o 12, en el que dicho antígeno asociado al tumor se selecciona del grupo de antígenos asociados al tumor que consiste en: MAGE, ciclina D1, proteínas del virus de Epstein-Barr, bcl2, determinantes idiotípicos derivados de receptores de células B o determinantes de receptores de células T.
14. Una población de células NKT CD4+ específicas de antígeno obtenida por el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.
15. Una población de células NKT CD4+ específicas de antígeno de acuerdo con la reivindicación 14 para su uso como un medicamento, preferentemente para su uso en el tratamiento de tumores.
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