BR112013012555B1

BR112013012555B1 - Peptídeo imunogênico isolado derivado de uma proteína antigênica, seus usos, método para a preparação de um peptídeo com capacidade de provocar a ativação de células nkt e método in vitro para obtenção de uma população de células nkt cd4+ antígeno específicas

Info

Publication number: BR112013012555B1
Application number: BR112013012555-1A
Authority: BR
Inventors: Jean-Marie Saint-Remy
Original assignee: Imnate Sarl
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2011-11-24
Publication date: 2021-12-21
Also published as: CN103261218B; US11193114B2; DE11787873T1; ES2869155T3; BR112013012555B8; JP2018011592A; RU2013128866A; EP2643345B1; BR112013012555A2; KR101902029B1; DK2643345T3; AU2017200307A1; HUE055070T2; PT2643345T; EP3763729B1; KR20130119952A; JP6173915B2; AU2011333749A1; DK2643345T5; US20220119778A1

Abstract

PEPTÍDEOS IMUNOGÉNICOS PARA O USO NA PREVENÇÃO E/OU NO TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS, DOENÇAS AUTOIMUNES, RESPOSTAS IMUNES A ALOFATORES, DOENÇAS ALÉRGICAS, TUMORES, REJEIÇÃO A ENXERTOS E RESPOSTAS IMUNES CONTRA VETORES VIRAIS USADOS PARA A TERAPIA DE GENES OU NA VACINAÇÃO DE GENES.. A presente invenção refere-se a novos peptídeos que contêm epítopos reconhecidos por células T assassinas naturais CD4+ (NKT) para a atividade crescente para o uso em doenças infecciosas, doenças autoimunes, reação imune à administração de alofatores, doenças alérgicas, terapia de tumores, prevenção de rejeição a enxertos e prevenção de imunização contra proteínas virais usadas na terapia de genes ou na vacinação de genes.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção se refere a peptídeos imunogênicos eao seu uso no tratamento de doenças infecciosas, doenças autoimu- nes, respostas imunes a alofatores, doenças alérgicas, tumores, rejeição a enxertos e respostas imunes contra vetores virais usados para a terapia gênica ou a vacinação gênica.

Antecedentes da Invenção

[0002] A terapia de muitas doenças nos mamíferos é limitada pelaausência de medicamentos específicos.

[0003] Nas infecções causadas por patógenos intracelulares a infecção persiste por causa da insuficiência de resposta imune que deve reconhecer e eliminar as células infectadas. Muitos patógenos reduzem a expressão de superfície de moléculas, tais como o complexo de histocompatibilidade principal da classe I (MHC da classe I) nas células invadidas pelos ditos patógenos, reduzindo desse modo a capacidade do sistema imunológico de provocar uma resposta imune citolíti- ca que seja provocada quando os linfócitos T da linhagem CD8+ reconhecem e são ativados pela MHC da classe I que apresentam epíto- pos derivados de patógenos. Uma estratégia alternativa por meio da qual os linfócitos citolíticos pudessem eliminar as células invadidas por um patógeno seria muito desejável. Tal estratégia foi proposta (EP 2 059 256), na qual os epítopos restringidos da classe II derivados dos patógenos intracelulares e acoplado a um motivo de tiol-oxidoredutase são usados para provocar as células T CD4+ citolíticas que induzem a apoptose da célula apresentadora de antígeno (APC) que apresenta o epítopo cognato. No entanto, o recrutamento e a ativação de um subconjunto alternativo de células T citolíticas deve representar uma possibilidade distinta para aumentar a eliminação das células infectadas com um patógeno intracelular.

[0004] Em doenças autoimunes, tal como em respostas imunes àadministração de um alofator e em doenças alérgicas, é vantajosa a eliminação das células que apresentam peptídeos de um autoantíge- no, de um alofator ou de um alérgeno, de modo a impedir todas as respostas imunes e desse modo doenças não desejadas associadas com tais respostas imunes não desejadas. Sob tais circunstâncias, os epítopos de autoantígenos, alofatores ou alérgenos são apresentados principalmente pela MHC da classe II e o complexo formado entre o epítopo e os linfócitos T da linhagem CD4+ ativados por determinantes da classe II. Isto resulta na ativação de linfócitos B e na produção de anticorpos para os ditos autoantígenos, alofatores ou alérgenos. Um método que deve resultar na eliminação de APC pela citólise deve impedir a ativação das células T CD4+ e desse modo a produção de an-ticorpos. Tal estratégia foi proposta e descrita no pedido de patente WO 2008/017517 A1 em que os epítopos restringidos da classe II de autoantígenos ou alérgenos, ou alofatores, respectivamente, são usados ligados a um motivo de tiol-oxidoredutase. As células T CD4+ restringidas da classe II citolíticas provocadas pela exposição aos epíto- pos restringidos II da classe acoplados ao dito motivo induzem a apop- tose APC que apresenta o epítopo cognato. No entanto, o recrutamento e a ativação de células T citolíticas alternativas deve representar uma estratégia alternativa valiosa.

[0005] No caso de tumores, as células escapam da eliminação pela expressão de superfície de regulação para baixo de determinantes de MHC da classe I e daclasse II. Qualquer estratégia por meio da qual as células T citolíticas específicas para os antígenos de tumor devem ser provocadas deve representar, portanto, uma estratégia muito desejável para o tratamento de tumores. O pedido de patente WO 2009/101205 ensina que as células T citolíticas ativadas pela apresentação restringida da classe II de antígenos derivados de tumor podem ser usadas para a eliminação de tumores. No entanto, esta abordagem é limitada pela expressão pobre de determinantes de MHC da classe II por tumores.

[0006] Na rejeição a enxertos, o processo de rejeição crônica édirigido pela apresentação indireta dos antígenos excretados pelo enxerto e apresentados pelas células apresentadoras de antígenos do receptor aos seus próprios linfócitos T. A apresentação indireta ocorre pela apresentação de epítopos derivados de enxertos pelos epítopos da classe I e da classe II. Os linfócitos T da linhagem CD8 ativados pela apresentação de MHC da classe I de antígenos de enxerto migram para o enxerto em que eles mediam a rejeição pelo reconhecimento de seus epítopos cognatos diretamente nas células enxertadas. No entanto, a ativação das células CD8 requer a ajuda das células CD4 ativadas pela apresentação indireta de antígenos derivados de enxertos por determinantes de NHC da classe II. O pedido de patente WO 2009/100505 ensina que o uso dos epítopos de células T restringidas da classe II derivados do enxerto e acoplados a um motivo de tiol-oxidoredutase permite a eliminação pela apoptose APC que participa da apresentação indireta. No entanto, uma estratégia alternativa por meio da qual um outro subconjunto de células T citolíticas deve ser gerado seria muito desejável.

[0007] Do mesmo modo, novas abordagens terapêuticas tais comoa terapia gênica e a vacinação gênica são intensamente limitadas pela resposta imune do hospedeiro aos vetores virais usados para a trans- gênese ou a vacinação. Em ambas essas situações, os antígenos derivados dos vetores virais são excretados por células transduzidas com o vetor e apresentadas aos linfócitos do hospedeiro por APC do hospedeiro, isto é, pela apresentação indireta do antígeno. Deve ser observado o fato que muitos vetores virais ativam não somente o sistema imunológico adaptável, conduzindo à produção de anticorpos específicos e à ativação específica de células T, mas os ditos vetores virais também ativam o sistema imunológico inato. A ativação da imunidade inata serve como um adjuvante para a resposta adaptável. O pedido de patente WO 2009/101204 ensina que os epítopos restringidos da classe II derivados de vetores virais e acoplados a um motivo de tiol- oxidoredutase podem provocar a ativação de células CD4 T restringi-das da classe II citolíticas. No entanto, uma estratégia alternativa é altamente desejável, a qual deve suprimir a ativação do sistema imuno- lógico inato.

[0008] Em todos os exemplos aqui enumerados, fica óbvio para oelemento versado na técnica que as estratégias alternativas por meio das quais as células T citolíticas antígeno específicas podem ser provocadas, o que deve eliminar de uma maneira específica de antígeno a APC que apresenta o dito antígeno específico, devem ser de muita valia.

[0009] A presente invenção apresenta tal estratégia alternativa.

[00010] As células T Natural Killer (NKT) constituem um subconjunto distinto de linfócitos T não convencionais que reconhecem os antí- genos apresentados pela molécula complexa CD1d de MHC não clássica. Dois subconjuntos de células NKT são descritos atualmente. As células NKT do tipo 1, também chamadas células NKT invariantes (iNKT), são as mais abundantes. Elas são caracterizadas pela presença de um receptor alfa-beta de células T (TCR) feito de uma cadeia alfa invariante, Valpha14 no camundongo e Valpha24 nos seres hu- manos. Essa cadeia alfa é associada a um número variável, porém limitado de cadeias beta. As células NKT do tipo 2 têm um TCR alfabeta mas com uma cadeia alfa polimórfica. No entanto, é aparente que existem outros subconjuntos de células NKT, cujo fenótipo ainda se encontra definido de maneira incompleta, mas que compartilha das características de serem ativados pelos glicolipídeos apresentados no contexto da molécula de CD1d.

[00011] As células NKT expressam tipicamente uma combinação do receptor de células Natural Killer (NK), incluindo NKG2D e NK1.1. As células NKT fazem parte do sistema imunológico inato, que pode ser distinto do sistema imunológico adaptável pelo fato que não requerer a expansão antes da aquisição da capacidade de efetor plena. A maior parte dos seus mediadores é pré-formada e não requer a transcrição. Foi mostrado que as células NKT são os principais participantes da resposta imune contra os patógenos intracelulares e a rejeição a tumor. O seu papel no controle de doenças autoimunes e na rejeição de transplantes também é advogado.

[00012] A unidade de reconhecimento, a molécula de CD1d, tem uma estrutura bastante semelhante àquela da molécula de MHC da classe I, incluindo a presença de microglobulina beta-2. Ela é caracterizada por um sulco profunda limitada por duas cadeias alfa e contendo resíduos altamente hidrofóbicos, que aceita cadeias de lipídeos. O sulco é aberto em ambas as extremidades, permitindo acomodar cadeias mais longas. O ligante canônico para CD1d é a alfa galactosil ceramida sintética (alfa GalCer). No entanto, muitos ligantes alternativos naturais foram descritos, incluindo os glico- e os fosfolipídeos, o lipídeo natural sulfatídeo encontrado na mielina, fosfoinositol manosida microbial e alfa-glucuronosil ceramida. O presente consenso no estado da técnica (consultar as revisões, tais como Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368 e Godfrey et al, Nature revi ews Immunology 2010, 11: 197-206) é que CD1d se liga somente aos ligantes que contêm cadeias de lipídeos, ou em geral uma estrutura comum feita de uma cauda de lipídeo que é encerrada em CD1d e em um grupo principal de resíduo do açúcar que se projeta para fora de CD1d.

[00013] Os peptídeos não são considerados como capazes de ativar as células NKT através da apresentação CD1d. No entanto, foi sugerido que os peptídeos hidrofóbicos longos que contêm resíduos de aminoácidos volumosos podem se ligar a CD1d (Castano et al, Science 1995, 269: 223-226). As observações realizadas ao usar bibliotecas de apresentação de fagos que expressam peptídeos de sequência randômica sem nenhuma relevância fisiológica definida permitiram estabelecer um motivo de consenso teórico (Castano et al, Science 1995, 269: 223-226, e consultar a seguir).

[00014] De fato, Castano et al mostraram que as células que são ativadas são células T CD8+, isto é, células restringidas da classe I de MHC, e não células NKT. Estas constatações ensinam ao elemento versado na técnica que não há nenhuma evidência que os peptídeos hidrofóbicos são apresentados por moléculas de CD1d. A relevância fisiológica das reivindicações feitas por Castano et al foi ainda questionada devido à incapacidade de provocar células NKT sob protocolos de imunização convencionais (Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368 e Brutkiewicz Journal of Immunology 2006, 177: 769-775). Os sistemas artificiais tais como a imunização com células transfectadas para a superexpressão de CD1d e carregadas in vitro com um peptídeo derivado de ovalbumina podem provocar células NKT. Do mesmo modo, a imunização intradérmica com DNA de plasmídeo em conjunto com CD1d de murino e moléculas coesti- muladoras induzem células T citolíticas restringidas CD1d (Lee et al, Journal of Experimental Medicine 1998, 187: 433-438). Os peptídeos hidrofóbicos que contêm um motivo estrutural feito de um resíduo aromático nas posições P1 e P7, que representam resíduos de ancoragem para a ligação a bolsas hidrofóbicas de CD1d localizadas em cada extremidade da molécula de CD1d e uma cadeia alifática na posição P4 foram reivindicados por Castano et al (Science 269: 223,1995) como contendo um motivo de núcleo para epítopos de ligação de CD1d. Tal como descrito acima, as conclusões obtidas por Castano et al não são suportadas por dados.

[00015] Fez-se a constatação inesperada que os peptídeos que englobam uma sequência de aminoácido hidrofóbica são de fato capazes de provocar a ativação de células NKT. Um exemplo de tal sequência é representado pelo motivo [FW]-xx-[ILM]-xx-[FW], em que [FW] é um aminoácido selecionado de fenilalanina ou triptofano, e [ILM] é um aminoácido selecionado de isoleucina, leucina ou metionina. [FW] em P7 é indicado como sendo permissivo, o que significa que T ou H podem substituir F ou W.

[00016] Os inventores verificaram ainda que um motivo de ligação de CD1d era particularmente eficiente na modulação da atividade de NKT quando acoplado a um motivo de tiol-oxidoredutase. Este motivo apresenta uma estrutura geral de C-XX-C em que C é cisteína e X é qualquer aminoácido que não a tirosina, a fenilalanina e o triptofano. O pedido de patente WO 2008/017517 A1 ensina que os epítopos de células T restringidas da classe II acoplados a um motivo de tiol- oxidoredutase adquirem a propriedade de transformar o fenótipo e a função de células CD4 T restringidas da classe II em células citolíticas potentes, induzindo a apoptose de APC. Este efeito é devido à formação aumentada da sinapse entre a APC e as células T, uma consequência da redução e da isomerização da molécula de CD4 na superfície de células T.

[00017] Uma grande maioria de células NKT contém o correceptor de CD4, cujo papel continua mal definido. Uma publicação recente, no entanto, sugeriu que CD4 se liga à molécula de CD1d de uma maneira muito parecida que a sua ligação à MHC da classe II (Thedrez et al Blood 110: 251-258, 2007). Além disso, foi mostrado que a presença de CD4 é requerida para a ativação plena de células NKT.

[00018] A presente invenção se refere, portanto, ao uso de peptí- deos hidrofóbicos que têm a capacidade de se ligar a CD1d e desse modo recrutar e ativar células NKT, acoplados a um motivo de tiol- oxidoredutase. Tais peptídeos asseguram a especificidade de antíge- no e representam uma abordagem valiosa para o tratamento de:(1) doenças infecciosas com patógenos intracelulares, em que as células infectadas apresentam peptídeos hidrofóbicos derivados do patógeno e ligados a CD1d. O recrutamento de NKT e/ou a atividade aumentados de tais células NKT deve, portanto, conduzir à eliminação de células infectadas;(2) doenças autoimunes, respostas imunes à administração de um alofator e doenças alérgicas, em que os antígenos associados a cada um desses 3 tipos de doenças geram peptídeos hidrofóbicos apresentados por CD1d. O recrutamento e/ou a atividade aumentados de células NKT antígeno específicas podem, portanto, ajudar na eliminação de células apresentadoras de antígenos e desse modo na eliminação e uma resposta imune não desejada;(3) tumores, uma vez que as células de tumores expressam frequentemente antígenos específicos de tumores que contêm CD1d, que podem ser reconhecidos por células NKT. O aumento da atividade e do recrutamento de tais células NKT deve conduzir a uma maior eliminação de tumores;(4) rejeição a enxertos, uma vez que as células apresentadoras de antígenos hospedeiro apresentam peptídeos hidrofóbicos derivados do enxerto no contexto de CD1d. O reconhecimento desses peptídeos por células NKT hospedeiras deve conduzir à eliminação das células apresentadoras de antígenos e ao aborto do processo de rejeição a enxertos crônica;(5) terapia gênica e vacinação gênica, em que antígenos de vetores virais e excretados por células transduzidas são apresentados por determinantes de CD1d. O recrutamento e a ativação das células NKT que eliminam a APC do hospedeiro através do reconhecimento de antígenos de vetores virais devem ser benéficos tanto para a persistência da expressão de transgene quanto para a manutenção da imunogenicidade plena do transgene na vacinação gênica.

[00019] Além do interesse terapêutico da presente invenção, os inventores fizeram a observação inesperada que a adição de um motivo de oxidoredutase dentro dos resíduos de flanqueio de epítopos de CD1d aumenta a ligação de TCR, o que resulta em uma detecção muito melhorada de células NKT CD4+. Os peptídeos que englobam epí- topos restringidos de CD1d naturais e pelo menos um motivo de tiore- dutase do formato CxxC, em que C indica a cisteína e x indica quaisquer aminoácidos que não a cisteína ou resíduos volumosos, tal como descrito na presente invenção, tem portanto, um interesse principal para:(1) finalidades analíticas: detecção da frequência do precursor de células NKT antes da vacinação, avaliação da afinidade de ligação de peptídeo para complexos de CD1d, acompanhamento de células NKT específicas durante o curso da vacinação ou sob imunos- supressão, identificação de células a despeito de sua atividade biológica, identificação das células implicadas no mecanismo da doença, depleção de células NKT específicas, e detecção de células NKT in situ, tal como em biópsias de órgãos;(2) finalidades de preparação: preparação de células NKT específicas para a avaliação da função e preparação de células NKT para a cultura e a purificação;(3) controle de qualidade para a população de células visada na terapia de células;(4) finalidades terapêuticas, incluindo a depleção de células NKT CD4+ específicas antes do enxerto do órgão.

Sumário da Invenção

[00020] A presente invenção se refere ao uso de peptídeos imuno- gênicos isolados para a prevenção e o tratamento de infecção com um patógeno intracelular em um indivíduo mediante o aumento da resposta imune para os antígenos específicos derivados do dito patógeno intracelular.

[00021] A presente invenção também de refere ao uso de peptídeos imunogênicos isolados para a prevenção e o tratamento de respostas autoimunes, respostas imunes à administração de alofatores e respostas imunes à exposição à alérgenos.

[00022] A presente invenção também se refere ao uso de peptídeos imunogênicos isolados para o tratamento de tumores.

[00023] A presente invenção também se refere ao uso de peptídeos imunogênicos isolados para a prevenção da rejeição a enxertos.

[00024] A presente invenção também se refere ao uso de peptídeos imunogênicos isolados para a prevenção da resposta imune contra proteínas virais usadas para a terapia gênica e/ou a vacinação gênica.

[00025] A presente invenção também se refere aos peptídeos para a detecção, a preparação e a depleção de células NKT.

[00026] A presente invenção se refere em um aspecto ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado a um pa- tógeno e (ii) um motivo de tiol-oxidoredutase (abreviado como motivo de tioredox) como um medicamento para a prevenção e/ou o tratamento, em um indivíduo, da infecção com o dito patógeno.

[00027] Em um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um autoantígeno, um alofa- tor ou um alérgeno e (ii) um motivo de tioredox como um medicamento para a prevenção e/ou o tratamento, em um indivíduo, de respostas imunes contra autoantígenos, alofatores e/ou alérgenos.

[00028] Em ainda um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado com tumor e (ii) um motivo de tioredox como um medicamento para o tratamento, em um indivíduo, de um tumor.

[00029] Em ainda um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um aloantíge- no e (ii) um motivo de tioredox como um medicamento para a prevenção, em um indivíduo, da rejeição a um enxerto.

[00030] Em ainda um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um vetor viral para a terapia gênica ou a vacinação gênica e (ii) um motivo de tiore- dox como um medicamento para a prevenção, em um indivíduo, de uma resposta imune contra um vetor viral.

[00031] Em um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado com patógeno, um autoantígeno, alofator, alérgeno, um antígeno associado com tumor, um aloantígeno ou um antígeno de vetor viral, e (ii) um motivo de tioredox, como um medicamento para aumentar a ativação, a produção de citocina e a atividade citolítico de células NKT CD4+ no dito indivíduo.

[00032] De modo geral, a invenção apresenta peptídeos imunogê- nicos que compreendem (i) um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado com patógeno, um autoantígeno, alofator, alérgeno, um antígeno associado com tumor, um aloantígeno, ou um antígeno de vetor viral, e (ii) um motivo de tioredox para o uso na prevenção ou no tratamento de uma infecção com um patógeno intracelular, na prevenção ou no tratamento de uma resposta imune contra au- toantígenos, alofatores, alérgenos, no tratamento de tumores, na prevenção da imunização contra aloantígenos ou contra um antígeno de vetor viral, em um receptor ao aumentar a resposta das células NKT CD4+ no dito receptor.

[00033] A presente invenção também se refere a células NKT do subconjunto do tipo 1 (iNKT) ou do tipo 2, assim como subconjuntos de NKT menos caracterizados, todos caracterizados como contendo o correceptor de CD4 e uma cadeia beta de TCR com capacidade de reconhecer o peptídeo ligado a CD1d.

[00034] A presente invenção também se refere aos peptídeos hidro- fóbicos com capacidade de se ligar a CD1d para a apresentação a células NKT.

[00035] A presente invenção se refere aos peptídeos hidrofóbicos que englobam pelo menos um epítopo de células T restringidas a CD1d. A estrutura da molécula de CD1d indica que resíduos de ami- noácidos hidrofóbicos são requeridos para ocupar as duas bolsas hi- drofóbicas localizadas nas extremidades do sulco de CD1d e que um resíduo alifático deve ocupar a posição no meio do sulco. Portanto, como um exemplo geral de sequência de ligação de CD1d, o motivo [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH] pode ser usado, em que [FW] indica que F ou W podem ocupar o primeiro resíduo de ancoragem (P1), que a posição P4 pode ser ocupada por I, L ou M, e que P7 pode ser ocupado por F,r W, T ou H. x em seu motivo de modelo geral indica qualquer aminoácido. Deve ficar claro para o elemento versado na técnica que várias combinações desses resíduos de aminoácidos são possíveis. Em uma modalidade particular, o motivo de modelo geral pode ser apresentado como uma sequência invertida tal como [FWTH]-xx-[ILM]- xx-[FW].

[00036] O dito motivo de tioredox é feito de uma sequência de consenso ([CST]-XX-[SCT]), em que [CST] é um aminoácido selecionado de cisteína, serina e treonina, e X pode ser qualquer aminoácido que não a tirosina (Y), a fenilalanina (F) e o triptofano (W). O dito motivo de tioredox é adicionado ao peptídeo na extremidade do terminal amino ou do terminal carbóxi, ou na extremidade de cada terminal, potencialmente separado do dito epítopo de células T restringidas de CD1d por um ligante contendo entre 1 e 7 aminoácidos.

[00037] Em uma modalidade particular, o dito ligante compreende os aminoácidos que fazem parte dos resíduos de flanqueio naturais.

[00038] A invenção também se refere aos métodos para a obtenção ou a indução de populações de células NKT tal como descrito acima, em que os ditos métodos compreendem as etapas de:(i) provisão de células T CD4+ naturais isoladas;(ii) colocação das ditas células em contato com um peptí- deo imunogênico que compreende um epítopo de células T apresentado pela molécula de CD1d e, adjacente ao dito epítopo de células T ou dali separado por um ligante contendo no máximo 7 aminoácidos, um motivo C-XX-[CST] ou [CST]-XX-C; e(iii) expansão das ditas células na presença de IL-2/IL-15 e/ou IL-7.

[00039] Em um aspecto adicional, a invenção engloba um método de identificação de uma população de células NKT CD4+, em que o dito método compreende as etapas de:(i) provisão de células T CD4+ naturais isoladas; (ii) provisão de células T CD4+ suspeitas de serem citotóxi- cas; e(iii) determinação que as células T providas em (ii) apresentam, em comparação às células T providas em (i), as características descritas acima.

[00040] Em qualquer um dos usos acima, o dito antígeno associado com patógeno intracelular pode ser qualquer antígeno derivado de vírus, bactérias, micobactérias ou parasitas com um ciclo de vida intracelular.

[00041] Em qualquer um dos itens acima, o dito autoantígeno pode ser qualquer antígeno associado com uma doença autoimune. Os exemplos de tais doenças são diabetes dependente de insulina, esclerose múltipla, miastenia grave e tireoidite.

[00042] Em qualquer um dos itens acima, os ditos alofatores são os polipeptídeos ou proteínas e fatores usados para a terapia de substituição para defeitos de coagulação ou defeitos fibrinolíticos, incluindo o fator VIII, o fator IX e a estafilocinase, hormônios tais como a insulina e o hormônio do crescimento, citocinas e fatores do crescimento tais como alfa-interferon, beta-interferon, gama-interferon, GM-CSF e G- CSF, anticorpos para a modulação de respostas imunes, incluindo anticorpos anti-IgE em doenças alérgicas, anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD20 na rejeição a enxertos e em uma variedade de doenças autoimunes, anticorpos anti-TNF-alfa na artrite reumatoide, e eritropoi- etina na insuficiência renal.

[00043] Em qualquer um dos itens acima, o dito alérgeno é um alérgeno transportado pelo ar, tais como aqueles derivados de ácaro da poeira de casa, de pólens ou de animais domésticos, os alérgenos de alimentos tais como o amendoim, a ovalbumina, os cereais, as frutas e os legumes, e antígenos de contato tais como o látex. As doenças que caracterizam a sensibilização do alérgeno incluem a asma alérgica, a rino-sinusite alérgica, o choque anafilático, a urticária, a dermatite atópica e a dermatite de contato.

[00044] Em qualquer um dos itens acima, os ditos antígenos associados com tumores são um oncogene, um proto-oncogene, uma proteína derivada de vírus, um fator de sobrevivência ou um determinante clonotípico tal como um determinante idiotípico derivado de um receptor de células B.

[00045] Em qualquer um dos itens acima, os ditos aloantígenos são antígenos de histocompatibilidade principais, antígenos de histocom- patibilidade secundários ou antígenos específicos de tecidos. Os ditos antígenos são envolvidos na rejeição de enxerto celular e de tecido.

[00046] Em qualquer um dos itens acima, os ditos vetores virais são derivados de adenovírus, vírus adenoassociados, retrovírus ou lentiví- rus.

[00047] Em qualquer um dos usos acima, o dito motivo de tioredox pode ser adjacente ao dito epítopo de células NKT ou ser separado do dito epítopo de células NKT por um ligante. Nas modalidades particulares, o ligante consiste em no máximo 7 aminoácidos.

[00048] Em uma modalidade adicional do peptídeo imunogênico nos usos acima, o dito motivo de tioredox não ocorre naturalmente dentro de uma região de 8 aminoácidos N- ou C-terminalmente adjacentes ao epítopo de células NKT no dito antígeno associado com pa- tógeno, auto-antígeno, alofator, alérgeno, antígeno associado com tumor, aloantígeno ou antígeno de vetor viral. Em particular, o dito motivo de tioredox é N-terminalmente posicionado em relação ao epítopo de células NKT.

[00049] Na modalidade particular do peptídeo imunogênico para os usos acima, o peptídeo imunogênico também compreende uma sequência alvo endossomal. Qualquer um dos peptídeos imunogênicos acima pode ser produzido pela síntese química ou pela expressão re- combinante.

[00050] Um método adicional da invenção visa a obtenção de uma população de células NKT, em que o dito método compreende as etapas de:(i) provisão de um peptídeo imunogênico que compreende um epítopo de células NKT derivado de um antígeno intracelular associado com patógeno, um autoantígeno, um alofator, um alérgeno, um antígeno associado com tumor, um aloantígeno ou um antígeno de vetor viral, e (ii) um motivo de tioredox;(ii) administração do peptídeo imunogênico a um indivíduo; e (na presença de um adjuvante)(iii) obtenção de uma população de células NKT CD4+.

[00051] As populações de células NKT CD4+ que podem ser obtidas pelos métodos acima também fazem parte da invenção, assim como o seu uso como um medicamento para a prevenção ou o tratamento, em um indivíduo, de uma infecção com o dito patógeno intracelular, a prevenção ou o tratamento de uma doença autoimune, uma resposta imune a um alofator, a prevenção ou o tratamento de doenças alérgicas, o tratamento de tumores, a prevenção da rejeição a enxertos, e a prevenção de uma resposta imune a um vetor viral usado para a terapia gênica ou a vacinação gênica.

[00052] Um aspecto adicional da invenção se refere aos peptídeos imunogênicos isolados que compreendem um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado com patógeno intracelular, ou de um autoantígeno, um alofator, um alérgeno, um antígeno associado com tumor, um aloantígeno ou um antígeno de vetor viral, e adjacente ao epítopo de células NKT ou separado do epítopo de células NKT por um ligante, um motivo de tioredox.

[00053] Ainda um aspecto adicional da invenção se refere ao peptí- deo isolado que compreende um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado com patógeno intracelular, ou de um autoantí- geno, um alofator, um alérgeno, um antígeno associado com tumor, um aloantígeno ou um antígeno de vetor viral, e, adjacente ao epítopo de células NKT ou separado do epítopo de células NKT por um ligante, um motivo de tioredox, para a detecção, a preparação ou a depleção de células NKT.

[00054] A invenção também engloba vetores virais isolados caracterizados pelo fato que compreendem pelo menos um antígeno associado com patógeno, ou pelo menos um autoantígeno, ou pelo menos um alofator, ou pelo menos um alérgeno, ou pelo menos um antígeno associado com tumor, ou pelo menos um aloantígeno, ou pelo menos um antígeno de vetor viral que compreende um epítopo de células NKT e, adjacente ao dito epítopo de células NKT ou separado do epítopo de células NKT por um ligante, um motivo de tioredox.

[00055] Mais particularmente, a invenção apresenta vetores virais isolados caracterizados pelo fato de que pelo menos um epítopo de células NKT presente em pelo menos um dos antígenos associados com patógenos, ou autoantígeno, ou alofator, ou alérgeno, ou de um antígeno associado com tumor, ou de um aloantígeno, ou de um antí- geno de vetor viral é modificado pela inserção no dito antígeno associado com patógeno, no dito autoantígeno, no dito alofator, no dito alér- geno, no dito antígeno associado com tumor, no dito aloantígeno, ou no dito antígeno de vetor viral, adjacente ao dito epítopo de células NKT ou separado do dito epítopo de células NKT por um ligante, de um motivo de tioredox.Definições

[00056] O termo "peptídeo" quando aqui usado se refere a uma molécula que compreende uma sequência de aminoácidos entre 2 e 200 aminoácidos, conectados por ligações de peptídeos, mas que podem em uma modalidade particular compreender estruturas que não de aminoácidos (tal como, por exemplo, um composto orgânico de ligação). Os peptídeos de acordo com a invenção podem conter qualquer um dos 20 aminoácidos convencionais ou versões modificadas dos mesmos, ou podem conter aminoácidos de ocorrência não natural incorporados pela síntese química de peptídeos ou pela modificação química ou enzimática.

[00057] Os termos "peptídeo" ou "peptídeo imunogênico" são usados de maneira indiferente, mas "peptídeo imunogênico" é o preferido geralmente para o peptídeo usado para finalidades terapêuticas, ao passo que "peptídeo" é o preferido para a detecção, a preparação e a depleção de células NKT.

[00058] O termo "epítopo" quando aqui usado se refere a uma ou várias porções (que podem definir um epítopo conformacional) de uma proteína que é especificamente reconhecida e ligada por um anticorpo ou por uma parte do mesmo (Fab', Fab2', etc.) ou um receptor apresentado na superfície da célula de um linfócito de célula de B ou T, e que pode, pela dita ligação, induzir uma resposta imune.

[00059] O termo "antígeno" quando aqui usado se refere a uma estrutura de uma macromolécula que compreende um ou mais hapte- no(s) e/ou que compreende um ou mais epítopos de células T. Tipicamente, a dita macromolécula é uma proteína ou um peptídeo (com ou sem polissacarídeos) ou feito de uma composição proteica e compreende um ou mais epítopos; a dita macromolécula pode ser aqui alternativamente indicada como "proteína antigênica" ou "peptídeo antigê- nico".

[00060] O termo "epítopo de células T" ou "epítopo de T-células" no contexto da presente invenção se refere a um epítopo de células T dominante, subdominante ou secundário, isto é, uma parte de uma proteína antigênica que é especificamente reconhecida e ligada por um receptor na superfície da célula de um linfócito T. Se um epítopo é dominante, subdominante ou secundário depende da reação imune provocada contra o epítopo. A dominância depende da frequência em que tais epítopos são reconhecidos por células T e com capacidade de ativar as mesmas, entre todos os epítopos de células T possíveis de uma proteína. Em particularmente, um epítopo de células T é um epí- topo ligado por moléculas de MHC da classe I ou de MHC da classe II.

[00061] O termo "epítopo de células NKT" se refere a uma parte de uma proteína antigênica que é especificamente reconhecida e ligada por um receptor na superfície da célula de um linfócito T. Em particular, um epítopo de células NKT é um epítopo ligado por moléculas de CD1d.

[00062] O termo "células efetoras CD4+" se refere às células que pertencem ao subconjunto de células T CD4-positivo cuja função é fornecer ajuda a outras células, tais como, por exemplo, células B. Essas células efetoras são relatadas convencionalmente como células Th (para células auxiliares T), com subconjuntos diferentes tais como células Th0, Th1, Th2 e Th17.

[00063] O termo "células NKT" se refere às células do sistema imu- nológico inato caracterizadas pelo fato que contêm receptores tais como NK1.1 e NKG2D, e reconhecem os epítopos apresentados pela molécula de CD1d. No contexto da presente invenção, as células NKT podem pertencer ao subconjunto do tipo 1 (invariante) ou do tipo 2, ou a qualquer uma das células NKT menos caracterizadas com os receptores de células T mais polimórficos do que as células NKT do tipo 1 ou do tipo 2.

[00064] A "molécula de CD1d" se refere a uma molécula derivada que não de MHC feita de 3 cadeias alfa e um conjunto antiparalelo de cadeias beta arranjadas em um sulco hidrofóbico profundo aberto em ambos lados e com capacidade de apresentar lipídeos, glicolipídeos ou peptídeos hidrofóbicos para as células NKT.

[00065] O termo "distúrbios imunes" ou "doenças imunes" se refere às doenças em que uma reação do sistema imunológico é responsável por ou sustenta um mau funcionamento ou uma situação não fisiológica em um organismo. Os distúrbios imunes no contexto da presente invenção referem-se à patologia induzido por agentes infecciosos e pela supervisão de tumor.

[00066] O termo "alofator" se refere a uma proteína, um peptídeo ou um fator (isto é, qualquer molécula) que apresenta polimorfismo quando comparado entre dois indivíduos da mesma espécie, e, de forma mais geral, qualquer proteína, peptídeo ou fator que induz uma resposta imune (aloreativa) no indivíduo que recebe o alofator.

[00067] O termo "aloantígeno" ou "antígeno de aloenxerto" quando aqui usado se refere a um antígeno derivado (excretado por e/ou presente em) de uma célula ou um tecido que, quando transferido de um doador a um receptor, pode ser reconhecido e ligado por um anticorpo do receptor de células B ou T do receptor. Os aloantígenos são tipicamente produtos de genes polimórficos. Um aloantígeno é uma proteína ou um peptídeo que, quando comparado entre o doador e o receptor (que pertencem à mesma espécie), apresenta ligeiras diferenças estruturais. A presença de tal antígeno doador no corpo de um receptor pode provocar uma resposta imune no receptor. Tal resposta imune alo- reativa é específica para o aloantígeno.

[00068] Os termos "motivo de tiol-oxidoredutase", "motivo de tiore- dutase", "motivo de tioredox" ou "motivo de redox" são aqui usados como termos sinônimos e referem-se a um motivo da sequência geral feita de [CST]-XX-[CST], em que C indica a cisteína, S indica a serina, T indica a treonina e X indica qualquer aminoácido que não a tirosina, a fenilalanina ou o triptofano.

Descrição Detalhada da Invenção

[00069] A presente invenção apresenta maneiras para prevenir ou tratar, em um indivíduo, da infecção com um patógeno intracelular. Ela também apresenta maneiras para prevenir e tratar de doenças autoi- munes, e respostas imunes depois da administração de um alofator ou alérgenos. Ela apresenta ainda maneiras de tratar tumores, prevenir a rejeição a enxertos e prevenir a resposta imune contra vetores virais.

[00070] Em particular, a invenção apresenta maneiras para aumentar a expansão e a atividade funcional de células NKT CD4+. Tais células são classificadas geralmente em dois subconjuntos distintos, isto é, células NKT do tipo 1 que contêm uma cadeia alfa TCR invariante (Valpha14 no camundongo, Valpha24 nos seres humanos), ou células NKT do tipo 2 que têm um repertório diverso da cadeia alfa. No entanto, a evidência recente sugeriu subconjuntos alternativos de células NKT que não se enquadram na categoria do tipo 1 ou do tipo 2. A finalidade da presente invenção consiste em incluir essas NKT não convencionais, uma vez que elas contêm o correceptor de CD4. Com a apresentação de um antígeno ligado a CD1d, as células NKT são rapidamente ativadas e secretam uma série de citocinas que se acredita serem determinantes para influenciar outras células do sistema imuno- lógico tanto inato quanto adaptável, e exercer uma atividade potente de mortandade de células apresentadoras de antígeno de CD1d+. Esse mecanismo é considerado como sendo crucial para a defesa contra a infecção com agentes intracelulares, mas também no monitoramento das células de tumor e na eliminação de tumor. O mesmo mecanismo está em jogo para o controle de respostas imunes não desejadas, uma vez que ocorre nas doenças autoimunes, e nas respostas imunes contra alofatores ou contra alérgenos.

[00071] Na rejeição a enxertos, os aloantígenos excretados pelo enxerto são apresentados ao sistema imunológico do indivíduo receptor pela via indireta. Isto significa que os antígenos de aloenxerto são absorvidos pelas células apresentadoras de antígenos do hospedeiro, que apresentam o dito aloantígeno às células T do hospedeiro de uma maneira restringida de CD1d. Um mecanismo por meio do qual as ditas células apresentadoras de antígenos do hospedeiro são destruídas ao serem mortas depois do reconhecimento cognato por células NKT CD4+, portanto, é benéfico para o receptor do enxerto.

[00072] Na resposta imune aos vetores virais usados para a terapia gênica e a vacinação gênica, os antígenos desprendidos de células transduzidas são absorvidos pelas células apresentadoras de antíge- nos do hospedeiro, com a apresentação indireta subsequente tal como no caso da rejeição a enxertos.

[00073] Quando as células NKT são ativadas por um peptídeo modificado de modo a conter uma atividade de tioredutase, este último aumenta de maneira significativa as propriedades de células NKT e aumenta desse modo a mortandade das células que contêm microrganismos intracelulares bem como células de tumor. A mortandade das células que apresentam autoantígenos, alofatores ou alérgenos por células NKT CD4+ antígeno específicas suprime a resposta imune contra os ditos autoantígenos, alofatores ou alérgenos. A mortandade das células hospedeiras que apresentam antígenos derivados de um enxerto ou de células transduzidas aborta a rejeição ou a resposta ao antígeno de vetor viral, respectivamente.

[00074] Desse modo, em um número crescente de doenças infecciosas, a importância das células NKT foi evidenciada. Estas incluem infecções com micobactérias (incluindo mycobacterium tuberculosis), parasitas tais como Leishmania, bactérias tais como Listeria monocytogenes, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae e Borrelia, e vírus tais como o vírus de herpes simplex (Chiba et al Journal of Immunology 181: 2292-2302, 2008; Mattner et al Nature 34: 525529. 2005; Tupin et al Nature Reviews. Microbiology 5: 405-417, 2007). Além de dirigir a mortandade de células infectadas, as células NKT, em virtude de sua capacidade de produzir concentrações elevadas de citocinas, e em particular de IFN-gama, podem ativar mecanismos de mortandade não específicos dentro das células infectadas. Esses mecanismos incluem a indução de oxidase de indoleami- na, sintase de óxido nítrico e produção de espécies reativas de oxigênio.

[00075] A participação de células NKT no controle de respostas imunes em doenças autoimune, ou contra alofatores ou alérgenos foi relatada em uma série de ocasiões (Jahng et al Journal of Experimental Medicine 199: 947-957, 2004; Van Belle e von Herrath, Molecular Immunology 47: 8-11, 2009) mas relativamente difícil de descrever. No contexto da presente invenção, os inventores fizeram a observação inesperada que os peptídeos podem ser apresentados pela molécula de CD1d. Uma característica da molécula de CD1d deve ser feita de 2 cadeias alfa antiparalelas que formam um sulco que assenta sobre uma plataforma feita de duas cadeias beta antiparalelas. O sulco é estreito e profundo, e aceita somente os resíduos hidrofóbicos, classicamente considerados como sendo somente lipídeos. De fato, os peptí- deos com resíduos hidrofóbicos têm a capacidade de se ligar ao sulco de CD1d. Além disso, devido ao fato que o sulco é aberto em ambos os lados, os peptídeos com mais de 7 aminoácidos de comprimento podem ser acomodados. Os peptídeos hidrofóbicos que contêm o motivo de CD1d são encontrados nos autoantígenos, alofatores e alérge- nos, dotando desse modo o dito autoantígeno, alofator ou alérgeno com a capacidade de ativar células NKT CD4+. A eliminação direta pela mortandade das células que apresentam o dito autoantígeno, alofator ou alérgeno elimina a capacidade de montar uma resposta imune contra esses antígenos/fatores.

[00076] Foi demonstrado que as células NKT participam indiretamente da defesa contra tumores, ao produzir citocinas com capacida- de de impulsionar a resposta inata e adaptável às células de tumor ou ao matar diretamente as células de tumor que apresentam os epítopos de lipídeos reconhecidos por células NKT (Crowe et al, Journal of Experimental Medicine 196:119-127, 2002; Tachibana et al, Clinical Cancer Research 11: 7322-7327, 2005; Dhodapkar et al, Journal of Experimental Medicine 197: 1667-1676, 2003; Song et al, Journal of Clinical Investigation 119:15241536, 2009). A mortandade direta envolve a produção de granzima e perforina. Foi mostrado que os tumores experimentais tais como os sarcomas induzidos por agentes carcinogenéti- cos ou pela deleção do gene supressor de tumor p53, assim como tumores espontâneos tais como mielomas, são suprimidos por células NKT. Os tumores suscetíveis a serem tratados pela presente invenção incluem aqueles que expressam oncogenes, tais como aqueles identificados por MAGE em alguns melanomas ou tirosina quinases, tais como ALK (quinase de linfoma anaplástico) identificada nos carcinomas de origem ectodérmica, proto-oncogenes, tais como a ciclina D1 expressa em carcinomas de tecidos moles, tais como aqueles do rim ou paratireoide, bem como em múltiplos mielomas, proteínas derivadas de vírus, tais como aquelas do vírus de Epstein-Barr em alguns carcinomas e em alguns linfomas do tipo de Hodgkin, fatores de sobrevivência, tais como determinantes de sobrevivência ou bcl2, e clo- notípicos, tais como as determinantes idiotípicos derivados de receptores de células B em linfomas foliculares ou múltiplos mielomas ou determinantes de receptores de células T em malignidades de células T.

[00077] As células que fazem parte de um enxerto, tanto um enxerto de tecido quanto um enxerto celular, não contêm, ou só contêm minimamente, a molécula de CD1d. O mesmo se aplica para células transduzidas na terapia gênica ou na vacinação gênica. Em ambas essas situações, as respostas imunes não desejadas que conduzem à rejeição a enxertos ou à imunização para o vetor viral, a resposta é provocada pela apresentação indireta do antígeno pelas células apre-sentadoras de antígenos do hospedeiro às células T do hospedeiro. A eliminação direta pela mortandade de células apresentadoras de antí- geno do hospedeiro depois da interação cognata com células NKT elimina a capacidade de montar uma resposta imune contra aloantíge- nos ou antígenos de vetor viral.

[00078] A presente invenção se refere à produção de peptídeos que contêm resíduos hidrofóbicos que conferem a capacidade de se ligar à molécula de CD1d. Com a administração, tais peptídeos são absorvidos pela APC, dirigidos ao endossoma tardio onde são carregados em CD1d e apresentados na superfície da APC. Os ditos peptídeos hidro- fóbicos são caracterizados por um motivo que corresponde à sequência geral [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH] ou [FWTH]-xx-[ILM]-xx-[FW], em que as posições P1 e P7 são ocupadas por resíduos hidrofóbico tais como fenilalanina (F) ou triptofano (W). P7 é, no entanto, permissivo no sentido que aceita resíduos hidrofóbicos alternativos à fenilalanina ou ao triptofano, tais como a treonina (T) ou a histidina (H). A posição P4 é ocupada por um resíduo alifático tal como a isoleucina (I), a leu- cina (L) ou a metionina (M).

[00079] O pedido de patente internacional WO 2009/101206 descreve peptídeos imunogênicos com capacidade de provocar a ativação de células CD4+ restringidas da classe II de histocompatibilidade principal, incluindo o peptídeo CGHCGGFTNMFATWSPSK. Não se sabe a partir do documento WO 2009/101206 que os peptídeos têm a capacidade de se ligar à molécula de CD1d. A presente invenção se refere, portanto, aos peptídeos que se ligam a CD1d e ativam as células NKT, contanto que o peptídeo não seja CGHCGGFTNMFATWSPSK.

[00080] A presente invenção se refere aos peptídeos feitos de resíduos hidrofóbicos que constituem naturalmente um motivo de ligação de CD1d. Em alguma modalidade, os resíduos de aminoácidos do dito motivo são modificados, geralmente pela substituição com resíduos que aumentam a capacidade de se ligar a CD1d. Em uma modalidade específica, os motivos são modificados para encaixar ainda mais com o motivo geral [FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]. Mais particularmente, os pep- tídeos são produzidos para conter uma F ou uma W na posição 7.

[00081] Os peptídeos da presente invenção também contêm um motivo de tioredutase adjacente aos resíduos hidrofóbicos ou separados de tais resíduos por um ligante. Uma vez apresentado pela molécula de CD1d, o motivo de tioredutase realça a capacidade de ativar células NKT, desse modo aumentando sua a atividade anti-infecciosa e/ou antitumor, a sua capacidade de suprimir respostas imunes para autoantígenos, alofatores, alérgenos, antígenos de aloenxerto e antí- genos de vetores virais usados na terapia gênica ou na vacinação gê- nica.

[00082] Uma descrição geral do motivo completo poderia ser, portanto, [CST]-XX-[CST]-ligante-[FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH] ou [FW]-xx- [ILM]-xx-[FWTH]-ligante-[CST]-XX-[CST], de acordo com o fato que o motivo de tioredutase pode ser adicionado à extremidade de terminal amino ou de terminal carbóxi. A adição de um ligante é opcional. Quando presente, tal ligante pode estar entre 1 e até 7 aminoácidos. Deve ficar claro ao elemento versado na técnica que esta descrição geral é fornecida somente para uma compreensão geral da invenção.

[00083] A presente invenção também de refere a células NKT obtidas e ativadas in vitro para a readministração passiva a um hospedeiro a fim de aumentar a sua capacidade de eliminar células infectadas com um patógeno, células que apresentam peptídeos derivados de autoantígenos, alofatores ou alérgenos, células de tumor, células que apresentam aloantígenos excretados de enxertos ou proteínas virais usadas na terapia gênica/vacinação gênica. Como uma alternativa à estimulação in vitro de células NKT por APC CD1d positiva, a invenção também se aplica aos métodos de transfecção ou de transdução de APC ao usar um construto genético com capacidade de dirigir a expressão do peptídeo imunogênico ao endossoma tardio para carregar na molécula de CD1d.

[00084] Em particular, a invenção apresenta maneiras de expandir células NKT específicas, com uma atividade aumentada como consequência que compreende, mas sem ficar a elas limitada:(i) produção aumentada de citocina(ii) eliminação aumentada dependente de contato e de fator solúvel de células apresentadoras de antígeno. O resultado é, portanto, uma resposta mais eficiente para patógenos intracelulares, autoan- tígenos, alofatores, alérgenos, células de Tumor e uma supressão mais eficiente de respostas imunes contra enxerto e proteínas virais usadas na terapia gênica/vacinação gênica.

[00085] A presente invenção também se refere à identificação de células NKT com propriedades requeridas em fluidos do corpo ou órgãos. O método compreende a identificação de células NKT em virtude de seu fenótipo de superfície, incluindo a expressão de NK1.1, CD4, NKG2D e CD244. As células são então colocadas em contato com os epítopos de células NKT definidos como peptídeos que podem ser apresentados pela molécula de CD1d. As células são expandidas então in vitro na presença de IL-2 ou IL-15 ou IL-7.

[00086] A presente invenção, portanto, apresenta peptídeos que contêm um motivo de ligação de CD1d e um motivo de tioredutase para a detecção, a preparação e a depleção de células NKT. Em uma modalidade preferida, tais peptídeos são carregados na molécula de CD1d isolada, tanto monomérica quanto, de preferência, multimérica. A molécula de CD1d pode estar em uma forma solúvel ou ligada a um suporte sólido.

[00087] A presente invenção deve ser considerada como uma tera- pia de cura administrada quando tanto a infecção é contraída quanto o tumor já se encontra presente. Isto é devido ao fato que não se considera que as células NKT participam de um ciclo de memorização. Quando as células NKT são ativadas, elas se expandem por um período de alguns dias, e então a população participa de uma fase de contração e possível não responsividade de curta duração. No entanto, sob algumas circunstâncias, pode ser aconselhável administrar a terapia pela imunização ativo com os peptídeos da invenção em uma configuração preventiva. Os exemplos disto são pacientes com alto risco de contrair uma doença infecciosa, tal como, por exemplo, imediatamente depois do contato com um indivíduo infectado. A presente invenção, portanto, também se refere ao uso preventivo da terapia, pela vacinação ativa ou pela transferência passiva de células.

[00088] A presente invenção se refere em um aspecto ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico hidrofóbico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado com associado com patógeno e (ii) um motivo de tio- oxidoredutase (abreviado como motivo de tioredox) como um medicamento para a prevenção e/ou o tratamento, em um indivíduo, da infecção com o dito patógeno.

[00089] Em um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico hidrofóbico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um autoantí- geno, um alofator ou um alérgeno e (ii) um motivo de tioredox como um medicamento para a prevenção e/ou o tratamento, em um indivíduo, de respostas imunes contra autoantígenos, alofatores e/ou alér- genos.

[00090] Em ainda um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico hidrofóbico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado com tumor e (ii) um motivo de tioredox como um medicamento para o tratamento, em um indivíduo, de um tumor.

[00091] Em ainda um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico hidrofóbico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um aloantígeno e (ii) um motivo de tioredox como um medicamento para a prevenção, em um indivíduo, da rejeição a um enxerto.

[00092] Em ainda um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico hidrofóbico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um vetor viral para a terapia gênica ou a vacinação gênica e (ii) um motivo de tioredox como um medicamento para a prevenção, em um indivíduo, de uma resposta imune contra o vetor viral.

[00093] Em um aspecto adicional, a invenção também se refere ao uso de pelo menos um peptídeo imunogênico isolado que compreende (i) um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado com patógeno, um autoantígeno, alofator, alérgeno, um antígeno associado com tumor, um aloantígeno ou um antígeno de vetor viral, e (ii) um motivo de tioredox, como um medicamento para aumentar a ativação, a produção de citocina e a atividade citolítica de células NKT CD4+ no dito indivíduo.

[00094] Uma vantagem adicional da presente invenção é relacionada ao grau muito limitado de polimorfismo da molécula de CD1d. Isto permite o uso de um único peptídeo ou um número limitado de peptí- deos para a terapia de populações cruzadas tais como seres humanos ou animais. Além disso, as células NKT oriundas de um doador podem ser usadas para a transferência passiva em receptores múltiplos. Isto contrasta bastante com a situação em que os peptídeos são apresentados pelas moléculas de MHC da classe I ou da classe II, cujo polimorfismo impossibilita o uso de peptídeos individuais para receptores múltiplos.

[00095] A estrutura geral de epítopos de células NKT contém um resíduo hidrofóbico nas posições P1 e P7, com a posição P4 ocupada por uma cadeia alifática. Desse modo, a estrutura geral pode ser eventualmente definida como [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY] em que x se refere a qualquer aminoácido. Nas posições P1, P4 e P7, qualquer um dos aminoácidos listados pode estar presente. Os aminoácidos podem ser aminoácidos naturais ou aminoácidos não naturais. Os exemplos de aminoácidos não naturais incluem os D-aminoácidos.

[00096] Geralmente, o composto orgânico com atividade redutora é uma sequência de peptídeo. Os fragmentos de peptídeo com atividade redutora são encontrados nas tioredutases que são pequenas enzimas redutoras de bissulfeto que incluem glutaredoxinas, nucleoredoxinas, tioredoxinas e outras oxidoredutases de tiol/dissulfeto. Elas exercem uma atividade redutora para as ligações de bissulfeto em proteínas (tais como enzimas) através de cisteínas ativas redox dentro de sequências de consenso de domínio ativas conservadas: C-XX-C, C-XX- S, C-XX-T, S-XX-C, T-XX-C (Fomenko et al (2003) Biochemistry 42, 11214-11225), em que X se refere a qualquer aminoácido. Tais domínios também são encontrados em proteínas maiores tais como a proteína isomerase de bissulfeto (PDI) e a fosfolipase C específica de fosfo- inositida. Em particular, os peptídeos imunogênicos compreendem como motivo de redox o motivo de sequência de tioredutase [CST]-XX- [CST], em uma outra modalidade, o dito motivo de [CST]-XX-[CST] é posicionado N-terminalmente em relação ao epítopo de células T. Mais especificamente, no dito motivo de redox pelo menos uma das posições [CST] é ocupada por uma Cys; desse modo o motivo é qualquer um de [C]-XX-[SCT] ou de [CST]-XX-[C]. No presente pedido de patente, tal tetrapeptídeo será indicado como "o motivo" ou "o motivo de redox". Mais particularmente, os peptídeos imunogênicos podem conter o motivo de sequência [C]-XX-[CS] ou [CS]-XX-[C]. Ainda mais particu-larmente, os peptídeos imunogênicos contêm o motivo de sequência C-XX-S, S-XX-C ou C-XX-C.

[00097] O motivo nos peptídeos imunogênicos acima é colocado tanto imediatamente adjacente à sequência de epítopo dentro do pep- tídeo, ou então é separado do epítopo de células T por um ligante. Mais particularmente, o ligante compreende uma sequência de amino- ácidos de 7 aminoácidos ou menos. Mais particularmente, o ligante compreende 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos. Os aminoácidos típicos usados nos ligantes são a serina e a treonina. Os exemplos de peptídeos com ligantes de acordo com a presente invenção são C-XX-C-G-epítopo, C-XX-C-GG-epítopo C-XX-C-SSS-epítopo, C-XX-C-SGSG-epítopo e outros ainda. Em ainda uma outra modalidade particular, a sequência de ligante engloba os aminoácidos naturalmente presentes na sequência de polipeptídeo da qual o motivo de ligação de CD1d é derivado. Os números variáveis de tais aminoácidos naturais podem ser incluídos nas extremidades de terminal amino ou carbóxi do peptídeo ou em ambas as extremidades.

[00098] Os peptídeos imunogênicos podem compreender sequências de aminoácidos curtas adicionais N ou C-terminalmente da sequência (artificial) que compreende o epítopo de células NKT e o composto redutor (motivo). Tal sequência de aminoácido é aqui indicada de modo geral como uma ‘sequência de flanqueio’. Uma sequência de flanqueio pode ser posicionada N- e/ou C-terminalmente em relação ao motivo de redox e/ou ao epítopo de células T no peptídeo imuno- gênico. Quando o peptídeo imunogênico compreende uma sequência alvo endossomal, uma sequência de flanqueio pode estar presente entre o epítopo e uma sequência alvo endossomal e/ou entre o composto redutor (por exemplo, o motivo) e uma sequência alvo endosso- mal. Mais particularmente, uma sequência de flanqueio é uma se- quência de até 10 aminoácidos, ou contendo entre 1 e 7 aminoácidos, tal como uma sequência de 2 aminoácidos. Mais particularmente, a sequência de flanqueio contém resíduos de aminoácidos volumosos que são úteis para estabilizar o peptídeo na molécula de CD1d.

[00099] Nas modalidades particulares da invenção, o motivo de redox no peptídeo imunogênico fica localizado N-terminalmente em relação ao epítopo.

[000100] Tal como detalhado acima, os peptídeos imunogênicos compreendem um motivo redutor tal como aqui descrito ligado a uma sequência de epítopo de células NKT. Em casos particulares, os epí- topos de células NKT são derivados de proteínas que não compreendem dentro de sua sequência natural nativa uma sequência de amino- ácido com propriedades de redox dentro de uma sequência de 11 aminoácidos N- ou C-terminalmente adjacente ao epítopo de células NKT de interesse.

[000101] Nas modalidades particulares, o epítopo de células NKT é derivado de um patógeno intracelular. Tais patógenos podem ser vírus, bactérias ou parasitas. Os vírus incluem vírus de ssDNA, dsDNA e RNA, tais como por exemplo, Herpesviridae, Flaviviridae e Picornaviri- dae, influenza, sarampo e vírus de imunodeficiência. As bactérias e as micobactérias incluem Mycobacterium tuberculosis, outras micobacté- rias patogênicas aos seres humanos ou animais, Yersiniosis, Brucella, Chlamydiae, Mycoplasma, Rickettsiae, Salmonellae e Shigellae. Os parasitas incluem Plasmodiums, Leishmanias, Trypanosomas, Toxoplasma gondii, Listeria, Histoplasma.

[000102] Nas modalidades particulares, o epítopo de células NKT são derivados de autoantígenos, incluindo a tiroglobulina, peroxidase da tiroide, receptor de TSH em doenças da tiroide; a insulina (proinsu- lina), a decarboxilase de ácido glutâmico (GAD), a fosfatase de tirosina IA-2, a proteína HSP65 de choque térmico, a proteína relacionada à subunidade catalítica de glicose 6-fosfatase específica de islet (IGRP) em diabetes do tipo 1; a 21-OH hidroxilase em adrenalite autoimune; a 17-alfa hidroxilase, a histidina decarbóxilase, a triptofano hidroxilase, a tirosina hidroxilase, em síndromes de poliendocrina autoimunes; o fator intrínseco de H+/K+ ATPase em gastrite autoimune e anemia perniciosa; a glicoproteina de oligodendrócito de mielina (MOG), proteína básica de mielina (MBP), a proteína de proteolipídeo (PLP) na esclerose múltipla; o receptor de acetil colina em miastenia grave; a proteína de ligação de retinol (RBP) em síndrome ocular autoimune; colágenos do tipo II e do tipo IX em doenças autoimunes da orelha interna; a transglutaminase de tecido na doença celíaca; a proteína pANCA his- tona H1 em doenças inflamatórias do intestino; a proteína HSP60 de choque térmico e as lipoproteínas de densidade oxi-leve na ateroscle- rose e a sinucleina no mal de Parkinson.

[000103] Nas modalidades particulares, o epítopo de células NKT é derivado de alofatores, incluindo qualquer peptídeo ou polipeptídeo usado: (1) para a terapia de substituição para defeitos de coagulação ou defeitos fibrinolíticos, incluindo o fator VIII, o fator IX e a estafiloqui- nase; (2) hormônios tais como o hormônio do crescimento ou a insulina; (3) citocinas e fatores do crescimento, tais como interferon-alfa, interferon-gama, GM-CSF e G-CSF; (4) anticorpos para a modulação de respostas imunes, incluindo anticorpos anti-IgE em doenças alérgicas, anticorpos anti-CD3 e anti-CD4 na rejeição a enxertos e uma variedade de doenças autoimunes, anticorpos anti-CD20 em linfomas que não de Hodgkin; (5) eritropoietina na insuficiência renal e; (6) antíge- nos geneticamente modificados.

[000104] Nas modalidades particulares, o epítopo de células NKT são derivados de alérgenos, incluindo alérgenos transportados pelo ar, tais como aqueles derivados dos ácaros de poeira de casa, pólens ou animais domésticos, dos alérgenos de alimentos tais como o amen- doim, a ovalbumina, os cereais, as frutas e os legumes, e dos alérge- nos de contato tais como o látex. As doenças que caracterizam a sensibilização do alérgeno incluem a asma alérgica, a rino-sinusite alérgica, o choque anafilático, a urticária, a dermatite atópica e a dermatite de contato.

[000105] Nas modalidades particulares, o epítopo de células NKT é derivado de tumor, incluindo qualquer peptídeo ou derivado de poli- peptídeo de: (1) oncogenes, tais como MAGE identificado em alguns melanomas; (2) proto-oncogenes, tais como a ciclina D1 expressa em carcinomas de tecidos moles tais como aqueles do rim ou paratireoide, bem como mieloma múltiplo; (3) proteínas derivadas de vírus, tais como aquelas do vírus de Epstein-Barr em alguns carcinomas e em alguns linfomas do tipo de Hodgkin; (4) fatores de sobrevivência, que são fatores antiapoptóticos tais como a survivina ou o bcl2; (5) determinantes clonotípicos, tais como os determinantes idiotípicos deriva-dos de determinantes de receptor do receptor de células B em linfo- mas foliculares ou em mielomas múltiplos ou células T em malignidades de células T.

[000106] Nas modalidades particulares, o epítopo de células NKT é derivado de aloantígeno, incluindo qualquer peptídeo ou polipeptídeo derivado determinantes de histocompatibilidade principal da classe I ou da classe II, complexos de histocompatibilidade secundária ou antí- genos relacionados a tecidos. Os ditos peptídeos ou polipeptídeos podem ser envolvidos na rejeição de órgãos celulares ou sólidos. Os enxertos celulares incluem o enxerto de células do sangue do cordão, o enxerto de células tronco, ou o enxerto de células islet do pâncreas. Os enxertos de órgãos sólidos incluem os rins, os pulmões, o coração, o fígado, o pâncreas, os ossos, a pele, ou os tecidos moles.

[000107] Nas modalidades particulares, o epítopo de células NKT é derivado de um vetor viral usado para a terapia gênica ou a vacinação gênica, incluindo qualquer peptídeo ou polipeptídeo de vírus do RNA (gama-retrovírus e lentivírus) ou de vírus do DNA (adenovírus, vírus adenoassociados, vírus da herpes e vírus da sífilis).

[000108] As células NKT provocadas e ativadas por peptídeos imuno- gênicos da presente invenção podem suprimir a patogênese devido a antígenos complexos emparelhados. Um requisito mínimo para que tais células sejam ativadas consiste em reconhecer um peptídeo cognato apresentado pela molécula de CD1d, conduzindo à mortandade da célula carregada com patógeno, ou a mortandade da APC que apresenta o au- toantígeno, o alofator ou o alérgeno, ou a mortandade de células de tumor, ou a mortandade da APC que apresenta o aloantígeno, ou da APC que apresenta o antígeno derivado de um vetor viral.

[000109] Em todas as situações acima, os ditos peptídeos imunogê- nicos ativam a produção de citocina, tal como IFN-gama, que irá ativar outras células efetoras incluindo as células T CD4+ e as células T CD8+. As células T CD4+ e T CD8+ podem participar da eliminação da célula que apresenta o patógeno intracelular, o autoantígeno, o alofa- tor, o alérgeno, o antígeno de tumor, o aloantígeno ou o antígeno derivado do vetor viral.

[000110] Nas situações em que mais de um antígeno está presente em um indivíduo, a mesma APC não pode apresentar todos os antíge- nos relevantes, uma vez que tais antígenos podem ser absorvidos por uma APC potencialmente diferente. Antecipa-se, portanto, que a combinação de dois ou mais peptídeos imunogênicos pode ser usada para a prevenção ou o tratamento da doença. Deve estar claro para o elemento versado na técnica que qualquer combinação dos ditos peptí- deos imunogênicos é provida. Os exemplos de tal combinação incluem peptídeos para suprimir a produção dos anticorpos para um alofator tal como o fator VIII da via de coagulação e os peptídeos para a supressão de respostas imunes aos vetores virais usados para a terapia gê- nica de hemofilia A (ausência do fator funcional VIII). Outros exemplos incluem a combinação de infecções com os patógenos tais como o HIV e infecções micobacterianas.

[000111] Os peptídeos imunogênicos para o uso no contexto da presente invenção são identificados pelos métodos conhecidos de uma pessoa versada na técnica. Em uma modalidade preferida, os peptí- deos que compreendem a sequência geral [FWHY]-xx-[ILMV]-xx- [FWHY] podem ser identificados. Os ditos peptídeos são identificados pelos métodos conhecidos dos elementos versados na técnica ao usar pelos algoritmos acessíveis on line. Por exemplo, os peptídeos podem ser identificados ao inserir uma sequência no seguinte site da Web: http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/

[000112] Os peptídeos podem então ser produzidos pela síntese ao usar, por exemplo, a síntese de fase sólida de fmoc bem conhecida na técnica.

[000113] No entanto, a sequência geral aqui fornecida deve ser considerada como uma indicação que um peptídeo contém um motivo de ligação de CD1d. Os ditos peptídeos devem então ser testados in vitro quanto à reatividade com células NKT. Para essa finalidade, CD1d+ APC são preparados a partir de uma fonte animal ou humana. As células são incubadas então com o peptídeo de interesse e uma fonte de células NKT. A ativação destas últimas pode ser identificada pela proliferação, produção de citocinas tais como IFN-gama e IL-4 e marcadores de superfície. Esses métodos estão bem descritos no estado da técnica. Além disso, os tetrâmeros de moléculas de CD1d podem ser usados após a carga com o peptídeo da invenção para detectar as células NKT específicas para tal peptídeo. Uma possibilidade consiste em usar tetrâmeros etiquetados com fluorescência e a detecção ao usar um sistema de classificação de fluorescência (facs).

[000114] Os peptídeos imunogênicos da invenção podem ser produ- zidos por meio de tecnologia recombinante ao usar sistemas de expressão tais como células bacterianas, células de levedura, células de insetos, células de plantas ou células de mamíferos.

[000115] De acordo com a presente invenção, os medicamentos providos para o tratamento da infecção com patógenos intracelulares, para o tratamento de doenças autoimunes, respostas imunes a alofatores ou alérgenos, para o tratamento de tumores, o tratamento de rejeição a enxertos, ou o tratamento de respostas imunes aos vetores virais usados para a terapia gênica ou a vacinação gênica. Em muitas destas situações, o tratamento pode ser provido como uma terapia preventiva. O medicamento da invenção é geralmente, embora não necessariamente, uma formulação (farmacêutica) que compreende como ingrediente ativo pelo menos um dos peptídeos imunogênicos da invenção, uma população de células NKT para os ditos peptídeos imu- nogênicos ou um vetor terapêutico de gene com capacidade de expressar o dito peptídeo imunogênico. Além do(s) ingrediente(s) ati- vo(s), tal formulação deve compreender pelo menos um dentre um di- luente, um veículo ou um adjuvante (farmaceuticamente aceitável). Em particular, a composição farmacêutica da invenção consiste em vacinas para a aplicação profilática ou terapêutica.

[000116] De acordo com a presente invenção os medicamentos providos para o tratamento de doenças autoimunes, o tratamento de respostas imunes a alofatores, o tratamento de doenças alérgicas, o tratamento de tumores, o tratamento da rejeição a enxertos e o tratamento de respostas imunes provocadas contra os vetores virais usados para a terapia gênica e para a vacinação gênica.

[000117] Por conseguinte, a invenção se refere a peptídeos imuno- gênicos, os quais compreendem pelo menos um epítopo de células NKT de um antígeno associado com patógeno, um autoantígeno, um alérgeno, um alofator, um antígeno de tumor, um antígeno excretado de um enxerto ou derivado de um vetor viral usado na terapia gênica ou na vacinação gênica, acoplados a um motivo de tioredutase da sequência [CST]-XX-[CST].

[000118] A cisteína do amino terminal no motivo empreende um ataque nucleofílico contra uma ligação de bissulfeto em uma proteína alvo. A ligação de bissulfeto é reduzida e uma troca de elétrons com a segunda cisteína do motivo libera a proteína alvo em uma forma reduzida, o que é seguido pela isomerização e/ou homodimerização da proteína alvo. Em alguns casos, a heterodimerização pode ocorrer pela troca de elétrons com uma proteína diferente. O resultado final é uma mudança na configuração da proteína alvo (isomerização) ou a formação de dímeros ou polímeros de uma ordem mais elevada. Esse mecanismo é aqui fornecido como um exemplo sem nenhuma intenção de limitação.

[000119] O epítopo de células NKT e o motivo de tioredutase são separados opcionalmente por uma sequência de ligante. Em outras modalidades opcionais, o peptídeo imunogênico compreende adicionalmente uma sequência alvo de endossoma (por exemplo, a última sequência alvo endossomal) e/ou sequências de "flanqueio" adicionais.

[000120] Tal como explicado em mais detalhes, os peptídeos imuno- gênicos da presente invenção podem ser obtidos pela síntese química, a qual permite a incorporação de aminoácidos não naturais. Por conseguinte, os resíduos de cisteína do motivo de tioredutase podem ser substituídos por um outro aminoácido com um grupo tiol tal como mercaptovalina, homocisteína ou um outro aminoácido natural ou não natural com uma função de tiol. A fim de ter uma atividade redutora, os resíduos de cisteína não devem ocorrer como parte de uma ligação de bissulfeto de cisteína. No entanto, os resíduos de cisteína podem ser modificados, tal como através de metilação, uma vez que a cisteína metilada é convertida em cisteína com grupos de tiol livres in vivo.

[000121] Nos peptídeos imunogênicos da presente invenção que compreendem o motivo de tioredutase descrito acima, o dito motivo é posicionado de maneira tal que, quando o epítopo encaixa no sulco de CD1d, o dito motivo permanece fora do sulco de ligação de CD1d. O dito motivo é colocado imediatamente adjacente à sequência do epíto- po dentro do peptídeo, ou então é separado do epítopo de células T por um ligante. Mais particularmente, o ligante compreende uma sequência de aminoácidos de 7 aminoácidos ou menos. Mais particularmente, o ligante compreende 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos nessas modalidades particulares dos peptídeos da invenção onde o dito motivo é adjacente à sequência do epítopo isso é indicado como a posição P-4 a P-1 ou P+1 a P+4 em comparação à sequência de epítopo. Além de um ligante de peptídeo, outros compostos orgânicos podem ser usados como ligante para ligar as partes do peptídeo imunogênico umas às outras.

[000122] Nas modalidades particulares da invenção, o motivo de tio- redutase no peptídeo imunogênico é localizado N-terminalmente em relação ao epítopo.

[000123] Tal como descrito acima, os peptídeos imunogênicos de acordo com a invenção compreendem, além de um motivo de tioredu- tase, um epítopo de células NKT derivado de um antígeno associado com patógeno, um auto- ou alofator, um alérgeno, um antígeno derivado de tumor, um antígeno excretado por um enxerto ou um antígeno derivado dos vetores virais usados na terapia gênica ou na vacinação gênica. Um epítopo de células NKT em uma sequência de proteína pode ser identificado por ensaios funcionais e/ou por um ou por mais ensaios de predição in silico. Os aminoácidos em uma sequência de epítopo de células NKT é numerado de acordo com a sua posição no sulco de ligação das proteínas de CD1d. Nas modalidades particula- res, o epítopo de células NKT presente dentro dos peptídeos da invenção compreendem entre 7 e 25 aminoácidos, ainda mais particularmente entre 7 e 16 aminoácidos, e mais particularmente ainda consistem em 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 aminoácidos. Em uma outra modalidade particular, o epítopo de células NKT o epítopo consiste em uma sequência de 7 aminoácidos. Em uma outra modalidade particular, o epítopo de células NKT é um epítopo, o qual é apresentado às células de NKT por moléculas de CD1d. Nas modalidades particulares da presente invenção, a sequência de epítopo de células NKT é uma sequência que encaixa no sulco de uma proteína de CD1d, mais particularmente um peptídeo de 7 aminoácidos que encaixa no sulco CD1d. O epítopo de células NKT dos peptídeos imunogênicos da in-venção pode corresponder a uma sequência de epítopo natural de uma proteína ou pode ser uma versão modificada do mesmo, uma vez que o epítopo de células NKT modificado retém a sua capacidade de se ligar dentro do sulco de CD1d, de modo similar à sequência de epí- topo natural de células NKT. O epítopo de células NKT modificado pode ter a mesma afinidade de ligação com para a proteína de CD1d que o epítopo natural, mas também pode ter uma afinidade menor. Nas modalidades particulares, a afinidade de ligação do peptídeo modificado é não menos do que 10 vezes menor do que o peptídeo original, e mais particularmente não menos do que 5 vezes menor. Uma constatação da presente invenção é que os peptídeos da presente invenção têm um efeito de estabilização em complexos de proteínas. Por conseguinte, o efeito de estabilização do complexo de peptídeos-CD1d compensa a menor afinidade do epítopo modificado para a molécula de CD1d.

[000124] Nas modalidades particulares, os peptídeos imunogênicos da invenção também compreendem uma sequência de aminoácido (ou um outro composto orgânico) que facilita a absorção do peptídeo nos endossomas (tardios) (atrasados) para o processamento e a apresentação dentro das determinantes de CD1d. O alvo dos endossomas tardios é mediado pelos sinais presentes na cauda citoplásmica das proteínas e corresponde aos motivos de peptídeos bem identificados tais como [DE]XXXL[LI] baseado em dileucina ou o motivo de DXXLL (por exemplo, DXXXLL), o motivo de YXX0 baseado em tirosina ou o chamado motivo de aglomerado de ácidos. O símbolo 0 representa resíduos de aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas volumosas tais como Phe, Tyr e Trp. As sequências alvo do endossoma tardio permitem o processamento e a apresentação eficiente do epítopo de células T derivado de antígeno por moléculas de CD1d. Tais sequências alvo endossomais são contidas, por exemplo, dentro da proteína gp75 (Vi- jayasaradhi et al (1995) J Cell Biol 130, 807-820), a proteína CD3 ga-ma humana, HLA-BM β (Copier et al. (1996) J. Immunol. 157, 10171027), a cauda citoplásmica do receptor de DEC205 (Mahnke et al (2000) J Cell Biol 151, 673-683). Outros exemplos dos peptídeos que funcionam como sinais de classificção para o endossoma são apresentados na revisão de Bonifacio e Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447. Alternativamente, a sequência pode ser aquela de um epítopo de células T subdominante ou secundário de uma proteína, o qual facilita a absorção no endossoma tardio sem superar a resposta das células NKT para o epítopo de células NKT derivado associado com patógeno, o epítopo de células NKT derivado de auto- ou alofator, o epítopo de células NKT derivado de alérgeno, o epítopo de células NKT derivado de antígeno de tumor, ou os epítopos de células NKT derivados de aloantígenos excretados por enxertos ou por antígenos dos vetores virais usados na terapia gênica ou na vacinação gênica.

[000125] Em outras modalidades particulares, os peptídeos imuno- gênicos da invenção são peptídeos que compreendem os epítopos de células NKT que não compreendem um motivo de tioredutase dentro de sua sequência natural. No entanto, em modalidade alternativas, um epítopo de células NKT que se liga ao sulco de CD1d pode compreender um motivo de tio-oxidoredutase tal como aqui descrito dentro de sua sequência de epítopo; os peptídeos imunogênicos de acordo com a invenção que compreendem tal epítopo de células NKT devem compreender ainda um outro motivo de tio-oxidoredutase livre (adjacente ou separado por um ligante) N- ou C-terminalmente acoplado ao epí- topo de maneira tal que o resíduo ligado pode assegurar a atividade redutora (ao contrário do motivo de tio-oxidoredutase presente no epí- topo, que fica enterrado dentro do sulco).

[000126] Um outro aspecto da presente invenção se refere aos métodos para a geração dos peptídeos imunogênicos da presente invenção aqui descritos. Tais métodos incluem a identificação de epítopos de células NKT de antígenos associados com patógeno, de autoantí- genos ou de alofatores de interesse, de alérgenos, de antígenos relacionados com tumores, de aloantígenos excretados dos enxertos ou dos antígenos derivados dos vetores virais usados na terapia gênica ou na vacinação gênica. As maneiras para a identificação in vitro e in silico de epítopos de células NKT são amplamente conhecidas no estado da técnica e alguns aspectos são elaborados mais adiante. Tais métodos adicionais incluem a geração de peptídeos imunogênicos da invenção incluindo o epítopo de células NKT identificado e um motivo de tioredutase (com ou sem ligante(s), sequência(s) de flanqueio ou sequência alvo endossomal. Os peptídeos imunogênicos gerados são avaliados em seguida quanto à capacidade de induzis células de NKT CD4+ ao antígeno associado com patógeno, autoantígenos, alofato- res, alérgenos, antígenos derivados de tumor, aloantígenos excretado dos enxertos ou dos antígenos derivados dos vetores virais usados para a terapia gênica ou a vacinação gênica.

[000127] Os peptídeos imunogênicos de acordo com a invenção são gerados a partir do(s) epítopo(s) de células NKT de antígenos associados com patógeno, ou de autoantígenos, ou de alofatores, ou de alérgenos, ou de tumores, ou de aloantígenos, ou de vetores virais usados para a terapia gênica ou a vacinação gênica.

[000128] Em particular, o epítopo de células NKT usado pode ser um epítopo de células NKT dominante. A identificação e a seleção de um epítopo de células NKT de um antígeno associado com patógeno, de um autoantígeno, alofator, um alérgeno, um antígeno derivado de tumor, um aloantígeno excretado pelo enxerto ou antígenos derivados dos vetores virais usados na terapia gênica ou na vacinação gênica para o uso no contexto da presente invenção são conhecidas de um elemento versado na técnica. Por exemplo, as sequências de peptí- deos isoladas de um antígeno associado com patógeno, um autoantí- geno ou um alofator, um alérgeno, um antígeno derivado de tumor, um aloantígeno excretado por um enxerto ou antígenos derivados dos vetores virais usados na terapia gênica ou na vacinação gênica é testado, por exemplo, por técnicas de biologia de células T, para determinar se as sequências de peptídeos provocam uma resposta das células NKT. Essas sequências de peptídeos que devem provocar uma resposta das células NKT são definidas como tendo uma atividade estimuladora de células NKT. A atividade estimuladora de células NKT humanas também pode ser testada ao cultivar as células de NKT obtidas de um indivíduo sensibilizado para um antígeno associado com patógeno, um autoantígeno ou um alofator para um alérgeno, um antí- geno derivado de tumor, um aloantígeno excretado pelo enxerto ou antígenos derivados dos vetores virais usados na terapia gênica ou na vacinação gênica com um peptídeo derivado dos ditos antígenos, e ao determinar se a proliferação de células NKT ocorre em resposta ao peptídeo tal como medido, por exemplo, pela absorção celular de timi- dina tritiada. Os índices de estimulação para as respostas por células NKT aos peptídeos podem ser calculados como CPM máximo em resposta a um peptídeo dividido pelo CPM de controle. Um índice de estimulação de células NKT (S.I.) igual a ou maior do qu duas vezes o nível de fundo é considerado como "positivo". Os resultados positivos são usados para calcular o índice médio de estimulação para cada peptídeo para o grupo dos peptídeos testados. Os epítopos de células NKT não naturais (ou modificados) também podem ser opcionalmente testados quanto à sua afinidade de ligação com as moléculas de CD1d. A ligação de epítopos de células NKT não naturais (ou modificados) às moléculas de CD1d pode ser executada de maneiras dife-rentes. Por exemplo, as moléculas de CD1d solúveis são obtidas e tornadas tetraméricas pela síntese ou pelo acoplamento químico. A molécula de CD1d é purificada por meio de cromatografia de afinidade. As moléculas de CD1d solúveis são incubadas com um peptídeo etiquetado com biotina de referência produzido de acordo com a sua forte afinidade de ligação para essa molécula de CD1d. Os peptídeos a serem avaliados quanto à ligação de CD1d são então incubados a concentrações diferentes e a sua capacidade de deslocar o peptídeo de referência de sua ligação de CD1d é calculada pela adição de neu- travidina. Os métodos podem ser encontrados, por exemplo, em Texier et al., (2000) J. Immunology 164, 3177-3184). Os peptídeos imunogê- nicos da invenção têm um índice médio de estimulação de células NKT maior do que ou igual a 2,0. Um peptídeo imunogênico que tem um índice de estimulação ds células NKT maior do que ou igual a 2,0 é considerado como sendo útil como um agente profilático ou terapêutico. Mais particularmente, os peptídeos imunogênicos de acordo com a invenção têm um índice médio de estimulação de células NKT de pelo menos 2,5, pelo menos 3,5, pelo menos 4,0, ou até mesmo de pelo menos 5,0. Além disso, tais peptídeos têm tipicamente um índice de positividade (P.I.) de pelo menos cerca de 100, de pelo menos 150, de pelo menos cerca de 200 ou de pelo menos cerca de 250. O índice de positividade para um peptídeo é determinado ao multiplicar o índice médio de estimulação das células NKT pela porcentagem de indivíduos, em uma população de indivíduos sensíveis a um antígeno de vetor viral (por exemplo, pelo menos 9 indivíduos, pelo menos 16 indivíduos ou pelo menos 29 ou 30, ou até mesmo mais), que têm células NKT que respondem ao peptídeo (que corresponde desse modo ao SI multiplicado pela natureza promíscua do peptídeo/epítopo). Desse modo, o índice de positividade representa ambos a intensidade de uma resposta de células NKT a um peptídeo (S.I.) e a frequência de uma resposta das células NKT a um peptídeo em uma população de indivíduos sensíveis a um antígeno de vetor viral. A fim de determinar os epítopos de células NKT ideais, por exemplo, por meio de técnicas de mapeamento fino, um peptídeo que tem uma atividade estimulado-ra de células T e que compreende desse modo pelo menos um epíto- po de células T tal como determinado por técnicas de biologia de células T é modificado pela adição ou pela deleção de resíduos de amino- ácido no N- ou C-terminal do peptídeo e testado para determinar uma mudança na reatividade das células NKT ao peptídeo modificado. Se for verificado que dois ou mais peptídeos que compartilham uma área de sobreposição na sequência nativa da proteína têm uma atividade estimuladora de células NKT humanas, tal como determinado por técnicas de biologia de células T, peptídeos adicionais podem ser produzidos, os quais compreendem todos ou uma parcela de tais peptídeos, e esses peptídeos adicionais podem ser testados por um procedimento similar. Ao seguir essa técnica, os peptídeos são selecionados e produzidos de maneira recombinante ou sinteticamente. Os epítopos ou peptídeos de células NKT são selecionados com base em vários fatores, incluindo a intensidade da resposta das células NKT ao peptí- deo (por exemplo, índice de estimulação) e a frequência da resposta das células NKT ao peptídeo em uma população de indivíduos.

[000129] Os métodos usados para a identificação de um antígeno associado com patógeno, um autoantígeno ou um alofator, um alérge- no, um antígeno derivado de tumor, um aloantígeno excretado pelo enxerto ou antígenos derivados dos vetores virais usados na terapia gênica ou na vacinação gênica são conhecidos no estado da técnica. Desse modo, as estratégias de clonagem posicional ou de clonagem de expressão podem ser usadas para identificar os antígenos candidatos. Para uma descrição completa da metodologia, consultar, por exemplo, Mendoza et al, Immunity, 7: 461-472, 1997. Alternativamente, os peptídeos apresentados realmente por APC em moléculas de CD1d podem ser eluídos e separados por vários métodos de cromato- grafia. A descrição completa de tal metodologia pode ser encontrada em Scott et al, Immunity, 12: 711-720, 2000. Os antígenos candidatos podem ser selecionados por um ou mais em algoritmos in vitro para identificar uma sequência de epítopo de células NKT dentro de uma proteína antigênica. Os algoritmos apropriados incluem, mas sem ficar a eles limitados, aqueles encontrados no seguinte site da Web:http://www.expasy.ch/tools/scanprosite/

[000130] Mais particularmente, tais algoritmos permitem a predição dentro de uma proteína antigênica de uma ou mais sequências de peptídeos que irão encaixar no sulco de uma molécula de CD1d.

[000131] Os peptídeos imunogênicos da invenção podem ser produzidos pela expressão recombinante em, por exemplo, células bacteria- nas (por exemplo Escherichia coli), células de levedura (por exemplo, espécies Pichia, espécies Hansenula, espécies Saccharomyces ou Schizosaccharomyces), células de insetos (por exemplo de Spodopte- ra frugiperda ou de Trichoplusia ni), células de plantas ou células de mamíferos (por exemplo, células CHO, COS). A construção dos vetores de expressão apropriados, portanto, requeridos (incluindo informa- ções adicionais tais como o promotor e as sequências de terminação) envolve entrementes técnicas de DNA recombinante padrão. Os pep- tídeos imunogênicos produzidos de maneira recombinante da invenção podem ser derivados de uma proteína de precursor maior, por exemplo, através da clivagem enzimática de sítios de clivagem de enzima inseridos adjacentes ao N- e/ou C-terminal do peptídeo imunogê- nico, seguidos pela purificação apropriada.

[000132] Em vista do comprimento limitado dos peptídeos imunogê- nicos da invenção, eles podem ser preparados pela síntese química de peptídeos, na qual os peptídeos são preparados ao acoplar aminoáci- dos diferentes uns aos outros. A síntese química é em particular apropriada para a inclusão, por exemplo, de D-aminoácidos, aminoácidos com cadeias laterais não ocorrendo naturalmente ou aminoácidos naturais com cadeias laterais modificadas tais como a cisteína metilada. Os métodos de síntese química de peptídeos são bem descritos e os peptídeos podem ser pedidos junto a empresas tais como Applied Biosystems e outras empresas. A síntese do peptídeo pode ser execu-tada como a síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS) ou, ao contrário da síntese de peptídeo de fase de solução. Os métodos mais bem conhecidos de SPPS são as químicas de fase sólida t-Boc e Fmoc que são amplamente conhecidas de um elemento versado na técnica. Além disso, os peptídeos podem ser ligados uns aos outros para formar peptídeos mais longos ao usar uma estratégia de ligação (acoplamento quimioseletivo de dois fragmentos de peptídeo desprotegidos) tal como descrito originalmente por Kent (Schnolzer & Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) e revisto, por exemplo, em Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205. Isto fornece um potencial tremendo na obtenção da síntese de proteína que fica além do âmbito de SPPS. Muitas proteínas com o tamanho de 100 a 300 resíduos foram sintetizadas com sucesso por este método. Os peptídeos sintéticos continuam a desempenhar um papel crucial crescente nos campos de pesquisa de bioquímica, de farmacologia, de neurobiologia, de enzimologia e de biologia molecular por causa dos avanços enormes no SPPS.

[000133] As propriedades físicas e químicas de um peptídeo imuno- gênico de interesse (por exemplo, a solubilidade, a estabilidade) são examinadas para determinar se o peptídeo é/deve ser apropriado para o uso em composições terapêuticas. Tipicamente, isto é otimizado ao configurar a sequência de peptídeo. Opcionalmente, o peptídeo pode ser modificado depois da síntese (modificações químicas, por exemplo, a adição/deleção de grupos funcionais) ao usar técnicas conhecidas na técnica.

[000134] Por conseguinte, em ainda um aspecto adicional, a presente invenção apresenta métodos de geração de células NKT CD4+ an- tígeno específicas associado com patógeno, ou células NKT CD4+ específicas de autoantígeno ou alofator, ou células NKT CD4+ específicas de alérgeno, ou células NKT CD4+ antígeno específicas de tumor, ou células NKT CD4+ específicas para aloantígenos excretados de enxertos, ou células NKT CD4+ específicas para antígenos das proteínas virais usadas na terapia gênica ou na vacinação gênica, in vivo ou in vitro (ex vivo). Em particular, as ditas células NKT respondem com propriedades proliferativas fortes a qualquer célula que apresenta os ditos antígenos e podem ser obtidas como uma população de células. Além disso, em particular as ditas células NKT respondem com propriedades supressoras fortes a toda qualquer que apresenta um auto- ou aloantígeno, um alérgeno, antígenos excretados de enxertos ou derivados das proteínas virais usadas na terapia gênica ou na vacinação gênica, e podem ser obtidas como uma população de células.

[000135] A invenção estende-se a tais (populações de) células NKT CD4+ antígeno específicas que podem ser obtidas pelos métodos aqui descritos.

[000136] Em uma modalidade, são apresentados métodos que compreendem o isolamento de células de sangue periféricas, a estimulação da população de célula in vitro mediante a colocação de um peptí- deo imunogênico de acordo com a invenção em contato com as células de sangue periféricas isoladas, e a expansão da população de células estimulada, mais particularmente na presença de IL-2 ou IL-15 e IL-7. Os métodos de acordo com a invenção têm a vantagem que números maiores de células NKT CD4+ são produzidos e que as ditas células podem ser geradas, as quais são específicas para o antígeno associado com patógeno, ou para o auto- ou o aloantígeno, o alérge- no, o antígeno relacionado com tumor, os antígenos excretados dos enxertos ou os antígenos das proteínas virais usadas na terapia gêni- ca ou na vacinação gênica (ao usar um peptídeo que compreende um epítopo específico de antígeno).

[000137] Em uma modalidade alternativa, as células NKT CD4+ podem ser geradas in vivo, isto é, pela administração de um peptídeo imunogênico aqui fornecido a um indivíduo, e a coleta das células NKT CD4+ geradas in vivo.

[000138] As células NKT CD4+ antígeno específicas associado com patógeno que podem ser obteníveis pelos métodos acima são do interesse particular para o uso como um medicamento para impedir em uma morbidez e/ou em uma mortalidade sujeitos associados com a infecção com vírus, bactérias ou parasitas. O autoantígeno ou as células alofator-específicas de NKT CD4+ obteníveis pelos métodos acima são do interesse particular para o uso como um medicamento para suprimir a morbidez e/ou a mortalidade associados com as doenças au- toimune ou a reação contra os alofatores. As células NKT CD4+ específicas de alérgenos que podem ser obtidas pelos métodos acima são de interesse particular para o uso como um medicamento para suprimir a morbidez e/ou a mortalidade associadas com as doenças alérgicas. As células NKT CD4+ antígeno específicas de tumor que podem ser obtidas pelos métodos acima são de interesse particular para o uso como um medicamento para suprimir a morbidez e/ou a mortalidade associadas com os tumores. As células NKT CD4+ específicas de alo- antígeno de enxerto que podem ser obtidas pelos métodos acima são de interesse particular para impedir a rejeição a enxertos. As células NKT CD4+ específicas de proteínas virais que podem ser obtidas pelos métodos acima são de interesse particular para o uso como um medicamento para suprimir a morbidez e/ou a mortalidade associadas com a terapia gênica ou a vacinação gênica.

[000139] Para qualquer um dos usos descritos acima dos peptídeos imunogênicos da invenção, os ditos peptídeos podem ser substituídos pelas ditas células NKT CD4+. O uso de células tanto alogênicas quanto autogênicas é provido. Qualquer método que compreende a administração das ditas células NKT CD4+ antígeno específicas a um indivíduo com necessidade (isto é, para prevenir a morbidez associada à infecção com um patógeno intracelular, prevenir ou tratar a morbidez associada com as doenças autoimunes, a reação a alofator, a exposição à alérgeno, tumores, a rejeição a enxertos e a reação contra antí- genos de vetores virais) faz parte da presente invenção.

[000140] A presente invenção também de refere às sequências de ácidos nucleicos que codificam os peptídeos imunogênicos da presente invenção e aos métodos para o seu uso, por exemplo, para a expressão recombinante ou na terapia gênica. Em particular, as ditas sequências de ácidos nucleicos podem expressar os peptídeos imuno- gênicos da invenção.

[000141] Os peptídeos imunogênicos da invenção podem ser administrados a um indivíduo com necessidade ao usar qualquer método apropriado de terapia gênica. Em qualquer uso ou método da invenção para a prevenção de morbidez/mortalidade associada com um patóge- no ou para a supressão da resposta imune a um autoantígeno ou a um alofator, a imunização com um peptídeo imunogênico da invenção pode ser combinada com a transferência de célula adotiva. Quando combinadas, as ditas imunização, transferência de célula e terapia gê- nica podem ser usadas simultaneamente, ou sequencialmente em qualquer combinação possível.

[000142] Na terapia gênica, as moléculas de ácido nucleico recombi- nantes que codificam os peptídeos imunogênicos podem ser usadas como DNA nú ou em lipossomas ou outros sistemas de lipídeos para a aplicação a células alvo. Outros métodos para a transferência direta do DNA de plasmídeo em células são bem conhecidos dos elementos versados na técnica para o uso na terapia gênica humanos e envolvem o foco do DNA nos receptores nas células por meio da complexa- ção do DNA de plasmídeo às proteínas. Em sua forma mais simples, transferência de gene pode ser executada simplesmente ao injetar quantidades diminutas de DNA no núcleo de uma célula, através de um processo de microinjeção. Uma vez que os genes recombinantes são introduzidos em uma célula, eles podem ser reconhecidos pelos mecanismos normais da célula para a transcrição e a tradução, e um produto do gene será expresso. Outros métodos também foram experimentados para introduzir o DNA em números maiores de células. Esses métodos incluem: a transfecção, em que o DNA é precipitado com fosfato de cálcio e levado para as células por meio de pinocitose; a eletroporação, em que as células são expostas a grandes pulsos de voltagem para introduzir furos na membrana); a fusão de lipofec- ção/lipossoma, em que o DNA é acondicionado em vesículas lipofílicas que se fundem com uma célula alvo; e o bombardeamento de partículas ao usar o DNA ligado a projéteis pequenos. Um outro método para introduzir o DNA nas células consiste em acoplar o DNA às proteínas quimicamente modificadas. As proteínas de adenovírus podem deses- tabilizar endossomas e realçar a absorção do DNA nas células. A mistura do adenovírus às soluções que contêm complexos de DNA, ou a ligação do DNA à polilisina covalentemente ligada à proteína de ade- novírus ao usar agentes de reticulação melhora substancialmente a absorção e a expressão do gene recombinante. Os vetores de vírus adenoassociados também podem ser usados para a aplicação de gene em células vasculares. Tal como aqui usado, "transferência de genes" significa o processo de introdução de uma molécula de ácido nu- cleico estranha em uma célula, o que é normalmente executado para permitir a expressão de um produto particular codificado pelo gene. O dito produto pode incluir uma proteína, um polipeptídeo, DNA antis- senso ou RNA, ou RNA enzimaticamente ativo. A transgerência de gene pode ser executada em células cultivadas ou pela administração direta em mamíferos. Em uma outra modalidade, é provido um vetor que compreende uma sequência de moléculas de ácido nucleico que codifica um peptídeo imunogênico de acordo com a invenção. Nas modalidades particulares, o vetor é gerado de maneira tal que a sequência de moléculas de ácido nucleico é expressa somente em um tecido específico. Os métodos de obtenção da expressão de gene específico de tecido são bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, ao colocar a sequência que codifica um peptídeo imunogêni- co da invenção sob o controle de um promotor, o qual dirige a expressão do peptídeo especificamente em um ou mais tecidos ou órgãos. Os vetores de expressão derivados de vírus tais como retrovírus, vírus de vaccínia, adenovírus, vírus adenoassociado, vírus do herpes, vírus do RNA ou vírus de papiloma bovino, podem ser usados para a aplicação de sequências de nucleotídeos (por exemplo, cDNA) que codificam peptídeos, homólogos ou seus derivados de acordo com a invenção nos tecidos ou na população de células alvo. Os métodos que são bem conhecidos dos elementos versados na técnica podem ser usados para construir os vetores virais recombinantes que contêm tais sequências de codificação. Alternativamente, as células projetadas que contêm uma molécula de ácido nucleico que codifica para um peptídeo imunogênico de acordo com a invenção podem ser usadas na terapia gênica.

[000143] Deve estar claro para o versado na técnica que o peptídeo ou o polipeptídeo usado na terapia gênica podem fazer parte do antí- geno completo a partir do qual o peptídeo ou o polipeptídeo são derivados.

[000144] Em que a administração de um ou mais peptídeos de acordo com a invenção é assegurada através da transferência de genes (isto é, a administração de um ácido nucleico que assegura a expressão dos peptídeos de acordo com a invenção in vivo com a administração), a dosagem apropriada do ácido nucleico pode ser determinada com base na quantidade de peptídeo expressa como resultado do ácido nucleico introduzido.

[000145] O medicamento da invenção é normalmente, mas não ne-cessariamente, uma formulação (farmacêutica) que compreende como ingrediente ativo pelo menos um dos peptídeos imunogênicos da invenção, uma (população de) peptídeos imunogênicos de células NKT CD4+ ou um vetor terapêutico de gene com capacidade de expressar o dito peptídeo imunogênico. Além do(s) ingrediente(s) ativo(s), tal formulação deve compreende pelo menos um dentre um diluente, um veículo ou um adjuvante (farmaceuticamente aceitáveis). Tipicamente, os compostos farmaceuticamente aceitáveis (tais como diluentes, veículos e adjuvantes) podem ser encontrados, por exemplo, em um manual de Farmacopeia (por exemplo, Farmacopeia norte-americana, europeia ou internacional). O medicamento ou a composição farmacêutica da invenção compreendem normalmente uma quantidade efi- caz (profilática ou terapeuticamente) do(s) ingrediente(s) ativo(s) em que a eficácia é relativo à condição ou ao distúrbio a serem prevenidos ou tratados. Em particular, as composições farmacêuticas da invenção são vacinas para a aplicação profilática ou terapêutica.

[000146] O medicamento ou a composição farmacêutica da invenção podem ter que ser administrados a um indivíduo com necessidade como parte de um regime profilático ou terapêutico que compreende administrações múltiplas do dito medicamento ou composição. As ditas administrações múltiplas usuais ocorrem sequencialmente e o intervalo de tempo entre duas administrações pode variar e será ajustado à natureza do ingrediente ativo e à natureza da condição a ser prevenida ou tratada. A quantidade de ingrediente ativo aplicada a um indivíduo com necessidade em uma única administração também pode variar e vai depender de fatores tais como o estado físico do indivíduo (por exemplo, peso, idade), o estado da condição a ser prevenida ou tratada, e a experiência do profissional do tratamento, do médico ou da en-fermeira.

[000147] O termo "diluentes" se refere, por exemplo, a soluções de soro fisiológico. O termo "adjuvante" se refere de maneira geral a um agente farmacológico ou imunológico que modifica (de preferência aumenta) o efeito de outros agentes (por exemplo, drogas, vacinas) enquanto tem poucos, quando tem algum, efeitos diretos quando aplicado sozinho. Como um exemplo, é citado um hidróxido de alumínio adjuvante (alum), ao qual um peptídeo imunogênico da invenção pode ser adsorvido. Além disso, muitos outros adjuvantes são conhecidos no estado da técnica e podem ser usados contanto que facilitem a apresentação do peptídeo na ativação das células CD1d e NKT. O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa qualquer material ou substância com o qual o ingrediente ativo é formulado a fim de facilitar sua a aplicação ou disseminação ao lócus a ser tratado, por exemplo, ao dissolver, dispersar ou difundir a dita composição, e/ou facilitar a sua armazenagem, transporte ou manipulação sem prejudicar a sua eficácia. Eles incluem todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agente bactericida e fungicida (por exemplo, fe- nol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotônicos (tais como açúcares ou cloreto de sódio), e similares. Os ingredientes adicionais podem ser incluídos a fim de controlar a duração da ação do ingrediente ativo na composição. O veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um sólido ou um líquido ou um gás que é comprimido para formar um líquido, isto é, as composições da presente invenção podem ser apropriadamente usadas como concentrados, emulsões, soluções, granulados, pós, sprays, aerossóis, suspensões, pomadas, cremes, comprimidos, péletes ou polvilhos. Os veículos farmacêuticos apropriados para o uso nas ditas composições farmacêuticas e a sua formulação são bem conhecidos dos versados na técnica, e não há nenhuma limitação particular quanto à sua seleção dentro da presente invenção. Eles também podem incluir aditivos tais como agentes umectantes, agentes dispersantes, aglutinadores, adesivos, agentes emulsionan- tes, solventes, revestimentos, agentes bactericidas e fungicidas (por exemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotônicos (tais como açúcares ou cloreto de sódio), e outros ainda, contanto que os mesmos sejam consistentes com a prática farmacêutica, isto é, veículos e aditivos que não geram danos permanentes aos mamíferos. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas de qualquer maneira conhecida, por exemplo, por mistura homogênea, revestimento e/ou trituração dos ingredientes ativos, em um procedimento de uma etapa ou de múltiplas etapas, com o material de veículo selecionado e, onde apropriado, os outros aditivos tais como agentes tensoativos. Eles também podem ser preparados por meio de micronização, por exemplo, de modo que sejam obtidos na forma de microesferas, eles geralmente que têm um diâmetro de cerca de 1 a 10 μm, isto é, para a fabricação de microcápsulas para liberação controlada ou sustentada dos ingredientes ativos.

[000148] Os peptídeos imunogênicos, os homólogos ou os derivados dos mesmos de acordo com a invenção (e seus sais ou composições farmacêuticas fisiologicamente aceitáveis todos incluídos no termo "in-gredientes ativos") podem ser administrados por qualquer via apropriada à condição a ser prevenida ou tratada e apropriada para os compostos, neste caso as proteínas imunogênicas a serem administradas. As vias possíveis incluem regional, sistêmica, oral (forma sólida ou inalação), retal, nasal, tópica (incluindo ocular, oral e sublingual), vaginal e parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra- dérmica, intrarterial, intratecal e epidural). A via de administração preferida pode variar, por exemplo, com a condição do receptor ou com a condição a ser prevenida ou tratada.

[000149] As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. As formulações da presente invenção apropriadas para a administração oral podem ser apresentadas como unidades distintas tais como cápsulas, cachês ou comprimidos, cada um dos quais contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou em um líquido não aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou uma emulsão líquida de água em óleo. O ingrediente ativo também pode ser apresentado como um bolus, um eletuário ou uma pasta. Um comprimido pode ser feita por meio de compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os tabletes comprimidos podem ser preparados por meio da compressão em uma máquina apropriada do ingrediente ativo em uma forma de fluência livre tal como um pó ou grânulos, misturado opcionalmente com um aglutinante, um lubrificante, um diluente inerte, um conservante, um agente tensoativo ou dispersante. Os comprimidos moldados podem ser feitos por meio da moldagem em uma máquina apropriada de uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser opcionalmente revestidos ou classificados e podem ser formulados de modo a prover a liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo nos mesmos.

[000150] Um aspecto adicional da invenção se refere a peptídeos imunogênicos isolados que compreendem um epítopo de células NKT de um antígeno associado com patógeno, de um autoantígeno ou alofator, de um alérgeno, de um antígeno associado com tumor, de um aloantígeno excretado de um enxerto, ou de antígenos de vírus usados para a terapia gênica ou a vacinação gênica e, adjacente ao dito epítopo células NKT ou separado do dito epítopo de células NKT por um ligante, um motivo de tioredutase.

[000151] Os vetores virais para a finalidade da terapia gênica ou vacinação gênica são altamente acessíveis às modificações por meio da tecnologia de ácido nucleico recombinante. Em vista do acima exposto, um elemento versado na técnica irá facilmente imaginar que a modificação no epítopo de células NKT de vetor viral tal como aplicado nos peptídeos imunogênicos e em seus usos de acordo com a invenção pode ser introduzida imediatamente no próprio vetor viral. Dessa maneira, a vacinação com os peptídeos imunogênicos que compreendem um epítopo de células NKT de um antígeno associado com pató- geno, um autoantígeno ou alofator, um alérgeno, um antígeno associado com tumor, um aloantígeno de um enxerto, ou antígenos dos vetores virais usados para a terapia gênica ou a vacinação gênica e um motivo de tioredutase (e/ou a vacinação gênica correspondente e/ou a transferência de célula adotiva correspondente) pode se tornar redun- dante, uma vez que os mesmos efeitos benéficos podem ser obtidos com um vetor viral modificado. Desse modo, a invenção também engloba os vetores virais modificados definidos como vetores virais isolados caracterizados pelo fato de que pelo menos um epítopo de células NKT presente em pelo menos uma das proteínas de vetores virais é modificada pela inserção na dita proteína de vetor viral, adjacente ao dito epítopo de células NKT ou separada do dito epítopo de células NKT por um ligante, de um motivo de tioredutase. Em uma outra modalidade, o dito vetor viral também é caracterizado pelo fato que o dito epítopo modificado de células NKT pode ser apresentado por uma molécula de CD1d. Em uma outra modalidade, os ditos vetores virais isolados são ainda caracterizados pelo fato que as suas propriedades de transdução da célula não são alteradas de maneira significativa em comparação ao mesmo vetor viral que não apresenta a modificação do epítopo de células NKT.

[000152] A presente invenção será ilustrada agora por meio dos exemplos a seguir, os quais são fornecidos sem nenhuma intenção de limitação. Além disso, todas as referências aqui descritas são aqui explicitamente incluídas a título de referência.

ExemplosExemplo 1

[000153] Controle da ativação de células T CD4+ restringidas da classe II específicas para o fator VIII pela imunização com um peptí- deo que contém um epítopo de células T restringidas por CD1d e um motivo de tioredutase em resíduos de flanqueio

[000154] Camundongos de fator VIII KO BALB/c (grupo A) foram imunizados 4 vezes a um intervalo de 1 semana com 50 μg de peptí- deo 2196, que contém um epítopo de células NKT restringidas por CD1d e um motivo de tioredutase de C-XX-C dentro dos resíduos de flanqueamento (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 1: CGH CGG FTN MFA TWS PSK

[000155] O fator humano VIII foi injetado então pela via subcutânea ao usar 10 IU por injeção em 5 ocasiões separadas por uma semana. Dez dias depois da última imunização os camundongos foram sacrificados e as células T CD4+ do baço foram preparadas pela classificação magnética das células. Tais células foram estimuladas duas vezes com o peptídeo de imunização e FVII in vitro antes de ser avaliado o seu estado de ativação tal como medido pela produção de IL-4 e IFN- gama. Um grupo de controle (B) foi tratado de acordo com o mesmo protocolo, mas não recebeu a vacinação de peptídeo.

[000156] Os resultados (Figura 1) mostram uma redução de 10 vezes da produção de IL-4 pelas células T CD4+ específicas do Fator VIII obtidas a partir dos camundongos imunizados com o peptídeo em comparação ao grupo de controle, e uma redução de 7 vezes na produção de IFN-gama.

[000157] Os resultados são mostrados como média + SEM.

Exemplo 2

[000158] Supressão da resposta do anticorpo de IgG anti-Ad5 pela imunização com um peptídeo que contém um epítopo de células NKT restringidas por CD1d e um motivo de tioredutase

[000159] Camundongos C57BL/6 (n = 6) foram imunizados por quatro injeções subcutâneas de 50 μg do peptídeo da SEQ ID NO: 2 em alum aplicadas em um intervalo de uma semana.SEQ ID NO: 2: CHG CGG FIGLMYY

[000160] Tal peptídeo contém um epítopo de células NKT restringidas por CD1d da proteína de hexon de adenovírus 5 (Ad5) e um motivo de tioredutase em resíduos de flanqueio. Um grupo de controle (n = 6) dos camundongos recebeu o soro fisiológico em alum em vez do peptídeo. Todos os camundongos receberam então 2 injeções de 109 partículas virais de Ad5 pela via IV, separadas por 1 semana. Dez dias após a última injeção de Ad5, os camundongos foram sangrados e a concentração de anticorpos de IgG total para as partículas de Ad5 foi medida em um ensaio ELISA de ligação direta. Em resumo, as partículas virais de Ad5 foram insolubilizadas em placas de poliestireno, seguidas pela lavagem e pela incubação com uma diluição do soro do camundongo. Após uma segunda lavagem, a ligação de anticorpos anti-Ad5 de camundongo foi detectada pela adição de um antissoro de cabra ao IgG do camundongo. Os camundongos pré-tratados com peptídeo (histograma preto; Figura 2) não produziram quantidades significativas de anticorpos, ao passo que os camundongos não imunizados (histograma aberto) produzem uma resposta viva após a segunda injeção de Ad5.

[000161] Os resultados são fornecidos em unidades arbitrárias como média + SEM.** indica uma significância a p<0,001.

Exemplo 3

[000162] Indução da apoptose de células de tumor pelas células NKT CD4+ provocadas pela imunização de camundongo com um peptídeo que engloba um epítopo NKT restringido por CD1d que contém um motivo de tioredutase

[000163] Camundongos C57BL/6 (n = 6) foram imunizados por quatro injeções subcutâneas de 50 μg do peptídeo da SEQ ID NO: 3 em alum executadas em um intervalo de uma semana.SEQ ID NO: 3: CGH CGG FDKLPGF

[000164] Tal peptídeo contém um epítopo de células NKT restringidas por CD1d derivadas da ovalbumina e um motivo de tioredutase em resíduos de flanqueio. Um grupo de controle (n = 6) de camundongos recebeu o soro fisiológico em alum em vez do peptídeo. Dez dias depois da última imunização os camundongos foram sacrificados e as células T CD4+ do baço foram preparadas pela classificação magnéti- ca das células. Tais células foram estimuladas duas vezes com o pep- tídeo de imunização in vitro antes de ser avaliado o seu estado de ativação tal como medido pela produção de IL-4 e de IFN-gama.

[000165] As linhagens de células NKT CD4+ foram então ensaiadas in vitro quanto à sua capacidade de matar células de tumor EG7. As células de tumor EG7 (H-2b) são derivadas de um timoma transduzido com um construto de ova. Um epítopo de ova restringido por CD1d é apresentado por tais células, que se sabe é insuficiente para liberar a ativação de NKT e a mortandade das células de tumor.

[000166] As células EG7 foram etiquetadas ao nível da membrana com 1 μM de DiOC18 (perclorato de 3,3'-dioctadecicloxacarbocianina, da Invitrogen). As células EG7 (1 x 105 por cavidade) foram cultivadas então por 18 horas a 37°C na presença de linhagens de células NKT a razões de 1/1 a 1/5 (células EG7 versus células NKT). As linhagens de células NKT tinham sido estimuladas primeiramente por 4 h in vitro com as células apresentadoras de antígeno carregadas com o peptí- deo da SEQ ID NO: 3. Depois de 18 horas, as células foram colhidas e manchadas para Annexin V e 7-AAD ao seguir as instruções do fabricante (kit de Detecção de Apoptose; BD Biosciences) e analisado as em um citômetro de fluxo FACSCantoII (BD Biosciences).

[000167] Os resultados mostram que as células EG7 incubadas com linhagens de células NKT obtidas dos camundongos imunizados com peptídeo da SEQ ID NO: 3 são induzidas à apoptose, ao passo que as células NKT obtidas a partir dos camundongos de controle que receberam o soro fisiológico em vez do peptídeo não induziram um grau significativo de apoptose das células de tumor.

Exemplo 4

[000168] Uso de tetrâmeros de moléculas de CD1d para a detecção de linfócitos de NKT CD4+ específicos de MOG

[000169] A esclerose múltipla é uma doença de desmielinação crôni- ca em que as células NKT CD4+ para autoantígenos tais como a gli- coproteína oligodendrocítica de mielina (MOG) desempenham provavelmente um papel chave. O seu equivalente experimental, EAE (en- cefalomielite autoimune experimental) imita a maior parte das indicações humanas da doença e é usado de modo a compreender mecanismos patogenéticos e delinear tratamentos novos.

[000170] A enumeração de células NKT CD4+ específicas de MOG pode, portanto, ser preditiva do resultado da doença.

[000171] Um epítopo de ligação de CD1d é identificado na proteína MOG de camundongo pela combinação de algoritmos e o ensaio funcional tal como descrito acima, que corresponde às sequências 200 a 206.

[000172] As células NKT CD4+ são preparadas a partir do baço de camundongos C57BL/6 em que EAE foi induzido. As células CD4(-) são removidas primeiramente da suspensão de células do baço ao usar contas magnéticas.

[000173] Os tetrâmeros das moléculas de CD1d (H-2b) são feitos tal como é conhecido na técnica, incluindo uma etiqueta fluorescente tal como ficoeritrina.

[000174] Um peptídeo sintético é produzido, o qual engloba um epí- topo de células MOG NKT restringidas por CD1d e um motivo de tiore- dutase pela incubação durante toda a noite:

[000175] CGPCGGFLRVPCWKI (SEQ ID NO: 4), que contém um ligante que une o motivo de tioredutase (CGPC) e o motivo de ligação de CD1d.

[000176] Os tetrâmeros são carregados com o peptídeo da SEQ ID NO: 4 durante toda a noite à temperatura ambiente. Os tetrâmeros carregados são então lavados e incubados com as células T CD4+ por 2 horas a 37°C. A suspensão é lida então com um sistema de classificação de células ativadas por fluorescência e a proporção das células NKT específicas ao peptídeo de MOG é avaliada.

Exemplo 5

[000177] Mortandade direta de uma célula de tumor de H-2b (R113) por células NKT provocadas com um epítopo de células NKT restringidas por CD1d derivado da quinase de linfoma anaplástico (ALK)

[000178] A quinase de linfoma anaplástico é uma quinase de tirosina do receptor de transmembrana que é expressa em muitas células durante a ontogenia, mas somente em tumores de origem ectodérmica na vida do adulto. Portanto, é considerada como um oncógeno relacionado diretamente a todos os tumores de origem ectodérmica tal como mostrado nos modelos animais e em tumores humanos. Por exemplo, até 60% dos cânceres de mama humanos expressam ALK. As linhagens de células de tumor ALK+ de origem de camundongo são disponíveis e podem ser usadas para avaliar se as células T CD4+ ci- tolíticas específicas de ALK da invenção podem matar células de tumor.

[000179] Células CD4 T (base de C57BL/6, H-2b) obtidas do baço de camundongos intocados foram estimuladas quatro vezes com células dendríticas autólogas carregadas com um epítopo de células NKT restringidas por CD1d de ALK, às quais um motivo de tioredutase do formato CxxC foi adicionado dentro dos resíduos de flanqueio. (Peptídeo da SEQ ID NO: 5: CHGCGGWLQIVTWWGPGS (com o motivo de tio- redutase sublinhado e 2 glicinas usadas como ligante entre o motivo e o epítopo restringido por CD1d)).

[000180] Uma vez que as células NKT têm por si mesmas uma atividade citolítica, os inventores incluíram células que foram estimuladas em experiências paralelas pela exposição ao mesmo epítopo de NKT restringido por CD1d na sequência natural, sem o motivo de tioredox (WLQIVTWWGPGS).

[000181] Dez dias após a última estimulação, as células CD4 T fo- ram lavadas e adicionadas a microplacas de cultura de células contendo 104 células de tumor R113 a uma razão de 2 para 1 (CD4 em relação às células de tumor). R113 é uma linhagem de células de tumor B obtida a partir de camundongos C57BL/6, que expressa ALK constitutivamente.

[000182] Depois de 20 horas de cocultura, as células de tumor R113 foram avaliadas quanto à ligação de Anexina V usada como marcador da apoptose das células.

[000183] A Figura 3 mostra que, na presença das células NKT cultivadas com o peptídeo da sequência 1, há um aumento de 4,5 vezes na morte das células de tumor (18%; histograma do meio) em comparação às células de tumor cultivadas sozinhas (3,8%; histograma da esquerda). Tal como esperado, as células NKT ativadas pela interação cognata com CD1d e o peptídeo na sequência natural mostram uma % intermediário da morte das células (11%, histograma da direita). média ± Desvio Padrão de triplicatas.

[000184] Portanto, a conclusão é que:(1) os peptídeos podem ser apresentados dentro do contexto de determinantes de CD1d;(2) as células de tumor bona fide podem ser induzidas à apoptose pela exposição às células NKT obtidas pelo reconhecimento através da ativação cognata de um epítopo restringido por CD1d;(3) uma proporção significativamente maior de células de tumor é induzida à apoptose quando as células NKT são ativadas pela exposição a um epítopo das células NKT restringidas por CD1d que contêm um motivo de tioredutase dentro dos resíduos de flanqueio.

[000185] Em uma segunda experiência, células CD4 T intocadas de uma base genética alternativa (camundongos BALB/c, base de H-2d) foram obtidas a partir do baço de camundongos intocados e estimuladas quatro vezes com as células dendríticas autólogas carregadas com o peptídeo da SEQ ID NO: 5.

[000186] A cocultura com uma linhagem de células de tumor ALK+ derivadas de BALB/c (VAC) foi executada tal como descrito acima. A apoptose das células de tumor foi medida pela avaliação da ligação de Anexina V por faccs.

[000187] A Figura 4 mostra que, na presença das células NKT cultivadas com peptídeos da sequência 1, há um aumento significativo na morte das células de tumor (25%; histograma do meio) em comparação às células de tumor cultivadas sozinhas (5,6%; histograma da esquerda) ou na presença do peptídeo na sequência natural (15%; histograma da direita). média ± Desvio Padrão de triplicatas

[000188] Esses dados indicam que uma segunda linhagem de células de tumor não relacionada pode ser induzida à apoptose quando exposta às células NKT, e que esse efeito é aumentado de maneira significativa quando as células NKT são estimuladas pela exposição aos epítopos restringidos por CD1d que contêm um motivo de tioredu- tase dentro dos resíduos de flanqueio.

Exemplo 6

[000189] Prevenção de EAE pela pré-imunização com um peptídeo que contém uma ligação de CD1d e um motivo de tioredutase

[000190] A EAE (encefalomielite autoimune experimental) é uma doença modelo em que a desmielinização do sistema nervoso central ocorre e que é considerada como o equivalente experimental da esclerose múltipla. Um número pequeno de autoantígenos é considerado como estando implicado na provocação e na manutenção da doença, entre os quais a MOG (glicoproteína oligodendrocítica de mielina). A doença pode ser provocada nos camundongos C57BL/6 pela imunização de MOG, ao usar um epítopo de células T CD4+ que engloba 3555 aminoácidos de MOG.

[000191] A MOG contém uma sequência que se liga a CD1d e ativa as células NKT. Desse modo, o peptídeo da sequência PHFLRVPCW- KI é produzido pela síntese um peptídeo contendo tioredutase da sequência CHGCGGFLRVPCWKI (peptídeo da SEQ ID NO: 6, em que o motivo de tioredutase é sublinhado e um ligante de 2 glicinas entre o motivo e o motivo de ligação de CD1d).

[000192] Grupos de camundongos C57BL/6 foram imunizados quatro vezes subcutaneamente (50 μg) com um peptídeo da SEQ ID NO: 6 ou, como um controle, com um peptídeo na sequência natural. Dez dias após a última imunização, todos os camundongos, incluindo um grupo de animais não imunizados intocados, são induzidos à doença pela injeção subcutânea de 100 μg de peptídeo de MOG 35-55/400 μg de Mycobacterium butyricum em CFA e pela injeção IP de 300 ng de Bortetella pertussis em NaCl. No dia +2, uma segunda injeção de B. pertussis é aplicada.

[000193] Os sinais de EAE são seguidos com o passar do tempo. Observa-se que os camundongos pré-imunizados com peptídeo da SEQ ID NO: 6 não desenvolvem EAE, ao passo que os camundongos intocados de controle e o grupo pré-imunizado com peptídeo na sequência natural desenvolvem sinais significativos da doença.

Exemplo 7

[000194] Prevenção e supressão de diabetes dependente de insulina espontâneo com peptídeos derivados de GAD65

[000195] Camundongos com diabetes não obesos (NOD) constituem um modelo animal apropriado para o diabetes dependente de insulina espontâneo. Em tais animais, tal como em seres humanos, uma resposta imune inicial à descarboxilase de ácido glutâmico de autoantíge- no (GAD65) é observada em um momento em que a insulite pode ser observada, da qual a resposta se estende por difusão intramolecular e intermolecular. A indução de tolerância a GAD65 pela administração da proteína aos neonascidos impede o surgimento do diabetes.

[000196] A GAD65 contém sequências de aminoácidos com a capacidade de se ligar a CD1d. Desse modo, a sequência PQHTN- VCFWFV, que corresponde aos aminoácidos 501 a 507 de GAD65, é produzida pela síntese, bem como as suas contrapartes que englobam um motivo de tioredutase dentro dos resíduos de flanqueio: peptídeo da SEQ ID NO: 7: CHGCGGHTNVCFWFV (com o motivo de tioredu- tase sublinhado e um ligante de 2 glicinas entre o motivo e o motivo de ligação de CD1d).

[000197] Camundongos NOD fêmeas foram imunizados a partir da idade de 4 semanas por 4 injeções subcutâneas dos peptídeos da SEQ ID NO: 7 ou de sequência natural, e a glicemia é seguida em cada um desses grupos, pela comparação com um grupo não imunizado. Observa-se que os camundongos NOD pré-imunizados com os peptí- deos da SEQ ID NO: 7 são prevenidos contra a hiperglicemia, ao passo que os camundongos tratados com o peptídeo de sequência natural e os animais não imunizados desenvolvem a hiperglicemia que começa após a 14a semana.

Exemplo 8

[000198] Prevenção da asma induzida pela exposição a um alérge- no, Der p 1

[000199] Os alérgenos de ácaros da poeira de casa, D. pteronyssi- nus, são envolvidos normalmente na asma alérgica. Der p 1 é o alér- geno principal de D. pteronyssinus. A sequência de Der p 1 contém um motivo de ligação de CD1d que corresponde à sequência de aminoá- cidos 38 a 44. Um peptídeo da sequência WAFSGVAATES é produzido pela síntese, bem como as suas contrapartes que contêm um motivo de tioredutase. Desse modo, o peptídeo da SEQ ID NO: 8 CGPCGGFSGVAATES contém um motivo de tioredutase (sublinhado) e um ligante de 2 glicinas entre o motivo e o motivo de ligação de CD1d.

[000200] A asma alérgica pode ser induzida em camundongos BALB/c por instilações nasais de 100 μg de Der p 1 administradas em 3 dias consecutivos. A asma é caracterizada pela hiperreatividade bronquial e a atração de infiltrados de eosinófilos no pulmão.

[000201] Os camundongos BALB/c são imunizados por 4 injeções de 50 μg dos peptídeos da SEQ ID NO: 8 ou do peptídeo na sequência natural como um controle. Der p 1 é administrado pela instilação nasal 10 dias após a última imunização. Pode ser observado que os camundongos pré-imunizados com o peptídeo da SEQ ID NO: 8 não desenvolvem reatividade nas vias aéreas à inalação de metacolina e não exibem uma infiltração do pulmão com eosinófilos.

Claims

1. Peptídeo imunogênico isolado derivado de uma proteína antigênica, caracterizado pelo fato de que compreende:(1) um epítopo de células T Natural Killer (NKT) de uma proteína antigênica compreendendo o motivo [FWHY]-xx-[ILMV]-xx- [FWHY], e(2) um motivo de tioredutase [CST]-xx-C ou C-xx[CST], que está imediatamente adjacente ao referido epítopo de células NKT ou separado por um ligante de no máximo 7 aminoácidos,em que a proteína antigênica é selecionada a partir do grupo que consiste em um autoantígeno, um alofator, um alérgeno, um aloantígeno eliminado por um enxerto, um antígeno de um patógeno intracelular e um antígeno de um vetor viral usado para terapia genética ou vacinação gênica, eem que a referida proteína antigênica não compreende um motivo [CST] -xx-C ou C-xx- [CST] dentre os 11 aminoácidos N- ou C terminalmente adjacentes ao referido epítopo de células NKT.

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido epítopo de células NKT compreende o motivo [FW]-xx-[ILMV]-xx-[FW].

3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido motivo de tioredutase apresenta a sequência C-XX-C.

4. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que X se se refere a qualquer aminoácido exceto tirosina, fenilalanina e triptofano.

5. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido epítopo de células NKT é derivado dos au- toantígenos: glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG), proteína básica de mielina (MBP) e proteína proteolipídica (PLP).

6. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido epítopo de células NKT é derivado dos au- toantígenos: insulina (pró-insulina), ácido glutâmico descarboxilase (GAD), tirosina fosfatase IA-2, proteína de choque térmico HSP65 e proteína relacionada à subunidade catalítica de glicose6-fosfatase específica de ilhotas (IGRP).

7. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o tratamento de esclerose múltipla.

8. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o tratamento de diabetes tipo 1.

9. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para a prevenção ou o tratamento de uma condição em um mamífero selecionada a partir do grupo que consiste em uma infecção com um patógeno intracelular, uma doença autoimune, uma resposta imune a alofatores ou à exposição à alérgenos, um tumor, uma rejeição a aloenxertos, e a geração de uma resposta imune contra um vetor viral usado para a terapia gênica ou a vacinação gênica.

10. Método para a preparação de um peptídeo com capacidade de provocar a ativação de células NKT, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(1) fornecer uma sequência de peptídeo de uma proteína antigênica compreendendo um epítopo de células NKT compreendendo um motivo [FWHY]-xx-[ILMV]-xx-[FWHY], e(2) ligar à referida sequência de peptídeo uma sequência que compreende um motivo de tioredutase de [CST]-xx-C ou C-xx[CST], de maneira tal que o referido motivo de tioredutase e o referido epítopo de células NKT estejam imediatamente adjacentes um ao outro ou estejam separados por um ligante de no máximo 7 aminoácidos.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de ligação da referida sequência peptídica a uma sequência compreendendo um motivo tiorre- dutase C-xx-C.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de fornecer uma sequência de peptídeo de uma proteína antigênica compreendendo um epítopo de célula NKT compreendendo um motivo [FW] -xx- [ILMV] -xx- [FW].

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido antígeno não compreende um motivo [CST] -xx-C ou C-xx- [CST] dentre os 11 ami- noácidos N- ou C terminalmente adjacentes ao referido epítopo de células NKT.

14. Método in vitro para a obtenção de uma população de células NKT CD4+ antígeno específicas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:- fornecer células isoladas de sangue periférico,- contatar as referidas células in vitro com um peptídeo imunogênico que compreende (1) um epítopo de células NKT de uma proteína antigênica que compreende um motivo [FWHY]-xx-[ILMV]-xx- [FWHY] e (2) um motivo tioredutase C-XX-[CST] ou [CST]-XX-Cem que o antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em um autoantígeno, um alofator, um alérgeno, um aloantí- geno eliminado por um enxerto, um antígeno de um patógeno intracelular e um antígeno de um vetor viral usado para terapia gênica ou vacinação gênica; e- expandir as referidas células na presença de IL-2, IL-15 ou IL-7.