BR112013013016B1 - Método para obter um peptídeo ou um polipeptídeo isolado com a capacidade reduzida de ativar células nkt e polipeptídeo isolado - Google Patents

Abstract

modulação de imunogenicidade de antígeno pela eliminação de epí-topos reconhecidos pelas células nkt. a presente invenção refere-se a um método e compostos para a prevenção de res-postas imunológicas direcionadas a alofatores, direcionadas a vetores virais usados para terapia genética e vacinação genética, direcionadas e proteínas às quais os pa-cientes são naturalmente expostos, direcionadas a organismos geneticamente modifi-cados e direcionadas a efeitos indesejáveis relacionados com a administração de vaci-nas para doenças alérgicas ou infecciosas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a peptídeos ou polipeptídeos para reduzir a imunogenicidade natural ou induzir a tolerância e o seu uso na prevenção de respostas imunológicas provocadas direcionadas a alofatores, direcionadas a vetores virais usados para terapia genética ou vacinação genética, direcionadas a antígenos ambientais usados em alimentos ou na alimentação ou aos quais os pacientes estão expostos por inalação ou por contato, ou para reduzir os efeitos colaterais associados com a vacinação por alérgenos ou agentes infecciosos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Em muitos exemplos, a administração de proteínas com objetivos terapêuticos resulta na resposta imunológica contra os agentes terapêuticos, o que impede qualquer administração adicional do dito agente terapêutico. Os exemplos disto são fornecidos pela administração de fator VIII da cascata de coagulação em pacientes afetados pela hemofilia A: aproximadamente um terço dos pacientes tratados produz anticorpos anti-fator VIII que inibem a função do fator VIII. A administração de enzimas tais como a alfa-galactosidase em pacientes que sofrem da deficiência do metabolismo de glicogênio é também seguida de uma resposta imunológica contra o agente terapêutico evitando qualquer administração adicional. Um terceiro exemplo é fornecido por anticorpos usados como agentes terapêuticos e direcionados através de molécula da superfície do linfócito, citocinas ou receptores de citocina. Acima de tudo, é altamente desejável encontrar novas aproximações terapêuticas que evitariam a imunização contra os agentes terapêuticos.

[003] O uso de vetores virais para a terapia genética ou a vacinação genética é severamente restringido pelo fato de que tais vetores virais provocam uma resposta imunológica que resulta na rápida eliminação das células transduzidas pelo vetor e na rápida perda da expressão do transgene. Os vetores virais provocam a ativação da resposta imunológica inata e adaptável com variável grau de intensidade que depende da natureza do vetor viral. Assim, os vetores de adenovírus fortemente estimulam respostas imunológicas inatas seguidas de uma resposta imunológica adaptável. Os vetores virais adenoassociados acionam uma resposta inata mais fraca, mas provocam a produção de anticorpo. O potencial tanto da terapia genética como de vacinação genética é enorme. Uma aproximação terapêutica pela qual a resposta inata e/ou adaptável fosse realizada através os vetores virais poderia representar um progresso altamente significativo no campo.

[004] Muitos pacientes sofrem da resposta provocada contra as proteínas às quais eles são naturalmente expostos. Os alérgenos, transportados pelo ar ou dos alimentos, provocam reações tal como rinite alérgica e asma, urticária, eczema e reação anafilática. A razão de como e porque os ditos pacientes apresentam tais reações só é parcialmente elucidada. Seria de muito benefício reduzir a imunogenicidade natural das diferentes proteínas tal como alérgenos alimentares, como o trigo causando a doença celíaca ou produtos tais como enzimas às quais os indivíduos são expostos por razões profissionais.

[005] Nas estratégias de vacinação contra doenças alérgicas ou contra agentes infecciosos, a eficácia terapêutica muitas vezes é limitada por efeitos colaterais sendo provocados pelas propriedades proinflamatórias dos alérgenos ou dos agentes infecciosos. Tais efeitos inflamatórios impedem o uso de doses mais altas de vacinas, e consequentemente a eficácia da vacina, e orientam a resposta imunológica na direção de uma resposta celular não desejada, tal como uma reação do tipo atrasada, e a produção de anticorpos de um isotipo que não é o ótimo para a condição considerada. Um melhor controle da inflamação na vacinação ofereceria uma modulação muito mais eficiente da resposta imunológica reduzindo efeitos colaterais relacionados à inflamação.

[006] As células exterminadoras naturais T (NKT) constituem uma linhagem distinta de linfócitos de T não convencionais que reconhecem os antígenos apresentados pela molécula complexa MHC não clássica CD1d. Dois subconjuntos das células NKT são atualmente descritos. As células NKT tipo 1, também chamadas células NKT invariáveis (iNKT), são as mais abundantes. Elas são caracterizadas pela presença de um receptor alfa beta da célula T (TCR) feito de uma cadeia alfa invariável, Valfal4 em ratos e Valfa24 em humanos. Esta cadeia alfa é associada a um número variável, embora limitado, de cadeias beta. As células NKT tipo 2 têm uma alfa beta TCR mas com uma cadeia alfa polimorfa. Entretanto, é evidente que existem outros subconjuntos das células NKT, o fenótipo dos quais ainda é incompletamente definido, mas que compartilham as características de serem ativados por glicolipídeos apresentados no contexto da molécula CD1d.

[007] Células NKT tipicamente expressam uma combinação de receptores das células exterminadoras naturais (NK), incluindo NKG2D e NK1.1. As células NKT são parte do sistema imunológico inato, que podem ser distinguidas do sistema imunológico adaptável pelo fato que elas não necessitam de expansão antes de adquirirem a capacidade efetora completa. A ativação das células NKT resulta em vários efeitos. Tais células liberam os mediadores pré formados, incluem uma ampla série de citocinas (incluindo interleucina (IL)-4, interferon (IFN)-gama, IL-21 e IFN-alfa) que fornecem a ajuda às células B para a produção de anticorpos e foi sugerido que a liberação de citocinas também possa influenciar as células T CD4+ (Burrows et al, Nature Immunology 2009, 10: 669-671). No contexto da presente invenção, a prevenção tanto da ativação da célula B como da ativação das células T CD4+ restrita ao fator de histocompatibilidade principal (MHC) classe II são consideradas como desempenhando um papel na redução ou na abolição da imunogenicidade de proteína.

[008] A unidade de reconhecimento das células NKT, a molécula de CD1d, tem uma estrutura que estreitamente se parece com aquela da molécula MHC classe I, incluindo a presença da microglobulina beta-2. Ela é caracterizada por uma fenda profunda limitada por duas cadeias alfas e contendo resíduos altamente hidrofóbicos, que aceita cadeias de lipídio. A fenda é aberta em ambas as extremidades, permitindo acomodar cadeias mais longas. O ligante canônico para CD1d é a alfa galactosilceramida sintética (alfa GalCer). Entretanto, foram descritos muitos ligantes alternativos naturais, incluindo glico e fosfolipídios, o sulfatídio de lipídio natural encontrado na mielina, manosídio fosfoinositol microbiano e alfa-glicuronosilceramida. O presente consenso (ver as revisões, tal como Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368 e Godfrey et al, Nature reviews Immunology 2010, 11: 197206) é que a CD1d se liga somente a ligantes contendo cadeias de lipídio, ou em geral uma estrutura comum feita de uma cauda de lipídios que é enterrada dentro da CD1d e um grupo frontal de resíduo de açúcar que sobressai para fora da CD1d.

[009] Não se considera que peptídeos sejam capazes de ativar células NKT por meio da apresentação pela CD1d. Foi sugerido, entretanto, que os longos peptídeos hidrofóbicos contendo grandes resíduos de aminoácido possam se ligar à CD1d (Castano et al, Science 1995, 269: 223-226). As observações realizadas usando bibliotecas de exposição de fago expressando sequência aleatórias de peptídeos sem relevância fisiológica definida permitiu estabelecer um motivo de consenso teórico (Castano et al, Science 1995, 269: 223-226 e veja abaixo).

[010] De fato, Castano et al., demonstrou que as células sendo ativadas são células CD8+, isto é, células restritas MHC classe I, e não células NKT. Esses achados ensinam a um versado na técnica que não há nenhuma evidência que os peptídeos hidrofóbicos sejam apresentados por moléculas CD1d. A relevância fisiológica das reivindicações feitas por Castano et al., foram também questionadas devido à incapacidade de provocar as células NKT sob os protocolos convencionais de imunização (Matsuda et al, Current Opinion in Immunology 2008, 20:358-368 e Brutkiewicz, Journal of Immunology 2006, 177: 769-775). Os sistemas artificiais tal como a imunização com células transfectadas para superexpressar a CD1d e carregada in vitro com um peptídeo derivado da ovalbumina foram capazes de provocar as células NKT. Do mesmo modo, a imunização intradérmica com o plasmídeo de DNA em conjunto com CD1d murino e as moléculas coestimuladoras induzem as células T citolíticas restritas ao CD1d (Lee et al, Journal of Experimental Medicine 1998, 187: 433-438). Os peptídeos hidrofóbicos contendo um motivo estrutural feito de um resíduo aromático nas posições P1 e P7, e uma cadeia alifática na posição P4 foram reivindicados por Castano, et al., (Science 269: 223, 1995) para conter um motivo principal para os epítopos de ligação CD1d. Tal como descrito acima, as conclusões alcançadas por Castano, et al., não são apoiadas por dados.

[011] Foi feita a inesperada constatação de que os peptídeos que abrangem uma sequência hidrofóbica de aminoácido são de fato capazes de provocar a ativação das células NKT.

[012] Se os epítopos da proteína administrados com objetivos terapêuticos, ou aos quais os pacientes são normalmente expostos, ou quando a vacinação genética ou terapia genética é executada, ou administrada no contexto da vacinação de doenças alérgicas ou infecciosas ligam a CD1d e desse modo ativam as células NKT, então a alteração nas ditas proteínas por mutações e/ou eliminações para eliminar os ditos epítopos seria altamente desejável para evitar a imunogenicidade.

[013] A identificação de tais epítopos seguidos pela mutação, adição ou eliminação de aminoácidos para impedir a ativação das células NKT, forma as bases da presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[014] A presente invenção se refere ao uso de peptídeos ou polipeptídeos para o tratamento de respostas imunológicas provocadas através de alofatores em um paciente impedindo tal resposta imunológica através dos ditos alofatores.

[015] A presente invenção também se refere ao uso de peptídeos ou polipeptídeos para o tratamento de respostas imunológicas provocadas através de vetores virais usados para a terapia genética ou a vacinação genética em um paciente impedindo tal resposta imunológica através dos ditos vetores virais.

[016] A presente invenção também se refere ao uso de peptídeos ou polipeptídeos feitos por organismos geneticamente modificados para a prevenção em um paciente de respostas imunológicas provocadas pela exposição às proteínas naturais.

[017] A presente invenção adicionalmente se refere ao uso de peptídeos ou polipeptídeos com objetivos de vacinação quando a ativação da imunidade inata é prejudicial.

[018] A presente invenção também se refere a métodos para identificar a proteína que transporta epítopos de ligação CD1d e para eliminar tais epítopos por substituição ou eliminação de aminoácidos.

[019] Foi feita uma inesperada constatação de que uma proporção significante de peptídeos ou polipeptídeos transportou sequências de aminoácido que lhes permitiu ligar e serem apresentados por determinantes de CD1d para ativação de células T exterminadoras naturais (NK). A ativação de tais células resulta na liberação de citocinas e, em alguns casos, em aquisição ou aumento das propriedades citolíticas.

[020] A presente invenção se refere em um aspecto ao uso de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo isolado, usado como um alofator, que foi modificado para eliminar pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico envolvido na formação de um epítopo reconhecido pelas células NKT, como um medicamento para impedir em um paciente as respostas imunológicas ao dito alofator.

[021] A presente invenção também se refere em um aspecto ao uso de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo isolado, usado como um vetor viral para terapia genética ou vacinação genética, que foi modificada para eliminar pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico envolvido na formação de um epítopo reconhecido pelas células NKT, como um medicamento para impedir em um paciente as repostas imunológicas aos ditos vetores virais.

[022] A presente invenção também se refere em um aspecto ao uso de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo isolado produzido por um organismo geneticamente modificado, os ditos peptídeos ou polipeptídeos sendo modificados para eliminar pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico envolvido na formação de um epítopo reconhecido pelas células NKT, como um medicamento para impedir em um paciente as repostas imunológicas à exposição natural aos ditos peptídeos ou polipeptídeos.

[023] A presente invenção adicionalmente se refere em um aspecto ao uso de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo isolado usado como uma vacina, que foi modificada para eliminar pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico envolvido na formação de um epítopo reconhecido pelas células NKT, como um medicamento para impedir em um paciente uma resposta imunológica não desejada ou imprópria à dita vacina.

[024] Em um aspecto adicional, a invenção também cobre o uso de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo isolado, usado como um alofator, um vetor viral, um organismo geneticamente modificado ou uma vacina, que foi modificada para eliminar pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico envolvido na formação de um epítopo reconhecido pelas células NKT, como um medicamento para impedir em um paciente a ativação, produção de citocina, atividade citolítica e atividade supressora sobre respostas imunológicas adaptáveis transportadas por células NKT CD4+ no dito paciente.

[025] A presente invenção se refere a peptídeos hidrofóbicos ou polipeptídeos que abrangem pelo menos um epítopo de célula T restringido pela CD1d, em que os aminoácidos posicionados como resíduos de ancoragem de CD1d são substituídos por aminoácidos alternativos, ou eliminados, o que resulta na perda ou na redução significativa da ligação à CD1d e, consequentemente, na redução da ativação da célula NKT.

[026] A estrutura da molécula do CD1d indica que os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos devem ocupar duas bolsas hidrofóbicas localizadas nas extremidades da fenda da CD1d e que um resíduo alifático deve ocupar a posição no meio da fenda. Desse modo, como um exemplo geral da sequência de ligação CD1d, o motivo

pode ser usado em que [FW] indica que F ou W podem ocupar o primeiro resíduo de ancoragem (P1), que a posição P4 pode ser ocupada ou por I, L ou M e que P7 pode ser ocupado por F, W, T ou H, x neste motivo de modelo geral que suporta qualquer aminoácido. Deve ser claro para um versado na técnica que várias combinações destes resíduos de aminoácido são possíveis. Em uma determinada modalidade o motivo de modelo geral pode ser apresentado como uma sequência reversa tal como

. Em ainda outra determinada modalidade pelo menos um aminoácido é acrescentado dentro do motivo de ligação de CD1d, que interrompe o motivo, e evita a sua capacidade de ligar a CD1d e desse modo a sua capacidade de ativar as células NKT.

[027] A presente invenção adicionalmente se refere mais particularmente a peptídeos ou polipeptídeos em que F, W, T, H ou Y nas posições P1 e P7 são substituídos por um aminoácido não natural (por exemplo, um D-aminoácido) ou por um composto orgânico.

[028] Em qualquer um dos usos acima o dito alofator pode ser qualquer peptídeo ou polipeptídeo usado: (1) para terapia de substituição para defeitos de coagulação ou defeitos fibrinolíticos, incluindo o fator VIII, fator IX e estafiloquinase; (2) hormônios tal como hormônio do crescimento ou insulina; (3) citocinas e fatores de crescimento, tal como interferon alfa, interferon gama, GM-CSF e G- CSF; (4) anticorpos da modulação de respostas imunológicas, incluindo os anticorpos anti-IgE em doenças alérgicas, anticorpos anti-CD3 e anti- CD4 em rejeição de enxerto e uma variedade de doenças autoimunes, anticorpos anti-CD20 em linfomas não Hodgkin; (5) eritropoietina em insuficiência renal e; (6) antígenos geneticamente modificados.

[029] Em qualquer um dos usos acima o dito vetor viral pode ser qualquer peptídeo ou polipeptídeo de RNA de vírus (gama-retrovírus e lentivírus) ou DNA de vírus (adenovírus, vírus adenoassociado, vírus da herpes e poxvírus).

[030] Em qualquer um dos usos acima o dito organismo geneticamente modificado pode ser qualquer organismo de planta ou de origem animal, que é usado como alimento ou alimentação, para produzir colheitas ou material de produção, ou para produzir animais transgênicos para alimento ou alimentação, ou plantel.

[031] Em qualquer um dos acima, os ditos peptídeos ou polipeptídeos usados para vacinação podem ser de alérgenos ou de agentes infecciosos, incluindo vírus, bactérias e parasitas. Os alérgenos podem ser alérgenos transportados pelo ar tal como os derivados do ácaro de poeira domiciliar, de pólens ou de animais domésticos, alérgenos alimentares tal como amendoim, ovalbumina, cereais, frutos e legumes, e antígenos de contato tal como látex. As doenças que caracterizam sensibilização de alérgeno incluem a asma alérgica, a sinusite do rinoceronte alérgica, o choque anafilático, a urticária, a dermatite atópica e o dermatite de contato.

[032] A presente invenção também se refere a métodos para identificar peptídeos ou polipeptídeos que ativam células NKT e eliminam tal ativação alterando os epítopos de ligação CD1d por substituição, adição ou eliminação de aminoácidos. Os ditos métodos compreendem as etapas de incubação dos ditos peptídeos ou polipeptídeos com células que transportam CD1d, seguido pela adição de uma população das células NKT policlonais e determinação da ativação das ditas células NKT.

[033] A presente invenção adicionalmente abrange vetores virais isolados caracterizados pelo fato de que eles compreendem pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo de um alofator modificado por substituição ou eliminação de pelo menos um aminoácido hidrofóbico, ou pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo de um alérgeno ou de um agente infeccioso modificado por substituição ou eliminação de pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico. Deve-se entender que o próprio vetor viral também pode ser modificado por substituição ou eliminação de resíduos de aminoácido hidrofóbicos.

DEFINIÇÕES

[034] O termo "peptídeo" quando usado aqui se refere a uma molécula compreendendo uma sequência de aminoácidos entre 2 e 200 aminoácidos, conectados por ligações de peptídeo, mas que pode em uma determinada modalidade compreender estruturas de não aminoácido (como, por exemplo, um composto orgânico de ligação). Os peptídeos de acordo com a invenção podem conter alguns dos 20 aminoácidos convencionais ou versões modificadas dos mesmos, ou podem conter aminoácidos de ocorrência não natural incorporados pela síntese de peptídeo química ou pela modificação química ou enzimática. O termo "polipeptídeo"quando usado aqui se refere a geralmente peptídeos ou proteínas mais longas.

[035] O termo "epítopo"quando usado aqui se refere a uma ou várias partes (que podem definir um epítopo conformacional) de uma proteína que é especificamente reconhecida e ligada por um anticorpo ou uma porção do mesmo (Fab1, Fab2', etc.) ou um receptor apresentado na superfície celular de uma célula de linfócito B ou T, e que é capaz, pela dita ligação, de induzir uma resposta imunológica. O termo "antígeno"quando usado aqui refere a uma estrutura de uma macromolécula compreendendo um ou mais haptenos e/ou compreendendo um ou mais epítopos de célula T. Tipicamente, a dita macromolécula é uma proteína ou peptídeo (com ou sem polissacarídeo) ou feito da composição proteica e compreendendo um ou mais epítopos; a dita macromolécula pode aqui alternativamente ser mencionado como como "proteína antigênica"ou "peptídeo antigênico".

[036] O termo "alérgeno"se refere a um subconjunto específico do antígeno caracterizado pela sua capacidade de provocar anticorpos do isotipo IgE em indivíduos predispostos.

[037] O termo "epítopo de célula T" ou "epítopo de célula T" no contexto da presente invenção se refere a um epítopo de célula T dominante, subdominante ou menor, isto é, uma parte de uma proteína antigênica que é especificamente reconhecida e ligada por um receptor na superfície celular de um linfócito T. Se um epítopo é dominante, subdominante ou menor, depende da reação imune provocada contra o epítopo. A dominância depende da frequência na qual tais epítopos são reconhecidos por células T e capazes de ativá-los, entre todos os epítopos de célula T possíveis de uma proteína. Especialmente, um epítopo de célula T é um epítopo ligado pela classe I MHC ou moléculas de MHC classe II.

[038] O termo "epítopo de célula de NKT" se refere a uma parte de uma proteína antigênica que é especificamente reconhecida e ligada por um receptor na superfície celular de um linfócito T. Especialmente, um epítopo de célula NKT é um epítopo ligado por moléculas de CD1d.

[039] O termo "CD4 + as células efetoras" referem a células que pertencem ao subconjunto CD4-positivo das células T cuja função deve fornecer a ajuda a outras células, tal como, por exemplo, células B. Estas células efetoras são convencionalmente informadas como células Th (para células ajudantes T), com subconjuntos diferentes tal como células Th0, Th1, Th2 e Th17.

[040] O termo "células NKT" se refere a células do sistema imunológico inato caracterizado pelo fato que eles transportam receptores tal como NK1.1 e NKG2D, e reconhecem epítopos apresentados pela molécula CD1d. No contexto da presente invenção, as células NKT podem pertencer ao tipo 1 (invariante) ou ao subconjunto de tipo 2.

[041] A "molécula de CD1d" se refere a uma molécula de derivado de não MHC feita de 3 cadeias alfas e um conjunto antiparalelo de cadeias beta arranjadas em uma ranhura hidrofóbica profunda abriu-se de dois lados e capaz de apresentar lipídios, glicolipídeos ou peptídeos hidrofóbicos a células NKT.

[042] O termo "distúrbios imunológicos"ou "doenças imunológicas" se refere a doenças em que uma reação do sistema imunológico é responsável por ou segura um mau funcionamento ou situação não fisiológica em um organismo. Os distúrbios imunológicos no contexto da presente invenção referem à patologia induzida por agentes infecciosos e vigilância de tumor.

[043] O termo "alofator" se refere a uma proteína, peptídeo ou fator (isto é, qualquer molécula) mostrando de polimorfismo quando comparado entre dois indivíduos das mesmas espécies, e, mais em geral, qualquer proteína, peptídeo ou fator que induz (alorreativo) a resposta imunológica no paciente que recebe o alofator. Pela extensão, os alofatores também incluem a proteína geneticamente modificada usada para a alimentação.

[044] O termo "aloantígeno"ou "antígeno de aloenxerto" quando usado aqui se refere a um derivado de antígeno de (abrigado de e/ou presente em) uma célula ou tecido que, quando transferido de um doador a um recebedor, pode ser reconhecido e ligado por um receptor do anticorpo da célula B ou T do recebedor. Os aloantígenos são tipicamente os produtos dos genes polimorfos. Um aloantígeno é uma proteína ou peptídeo que, quando comparado entre doador e recebedor (pertencendo às mesmas espécies), expõe diferenças estruturais leves. A presença de tal antígeno de doador no corpo de um recebedor pode provocar uma resposta imunológica no recebedor. Tal resposta imunológica de alorreativo é específica para o aloantígeno.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[045] A presente invenção fornece modos de impedir, em um paciente, uma resposta imunológica através alofatores, através de vetores virais usados para terapia genética ou vacinação genética, através proteína usada para alimento ou alimentação, através proteína à qual o dito paciente é exposto pela inalação ou por picadas, ou impedir, em um paciente, uma ativação indesejável da imunidade inata no uso de vacinas através alérgenos ou agentes infecciosos.

[046] Especialmente, a invenção fornece modos de impedir a expansão e a atividade funcional de células NKT CD4+. Tais células são normalmente classificadas em dois subconjuntos distintos, isto é, tipo 1 das células NKT que transportam uma cadeia alfa de TCR invariável (Valfal4 no rato, Valfa24 em seres humanos), ou tipo 2 células NKT que presentam um repertório de cadeia alfa diverso. Entretanto, evidência recente sugeriu que os subconjuntos alternativos das células NKT que não se ajustam na categoria de tipo 2 ou o tipo 1. É o objetivo da presente invenção de incluir estes não células NKT convencionais, contanto que eles transportem o correceptor CD4. Depois da apresentação de um antígeno ligado a CD1d, as células NKT são rapidamente ativadas e secretam um número de citocinas pensadas ser determinante para influenciar em outras células tanto dos sistemas imunes inatos como de adaptáveis. Em algumas circunstâncias, as células NKT ativadas de dita adquirem ou propriedades de citotóxico de aumento. Em circunstâncias ainda adicionais, a dita ativou células NKT suprimem ou reduzem o desencadeamento de uma resposta imunológica adaptável por interação com as células T CD4+ restrita à classe II.

[047] No contexto da presente invenção, foi feita a observação inesperada que os peptídeos podem ser apresentados pela molécula CD1d. Uma característica da molécula CD1d é que é feito de duas cadeias alfas antiparalelas que formam uma fenda de assentamento em cima de uma plataforma feita de duas cadeias beta antiparalelas. A fenda é estreita e profunda e aceite resíduos só hidrofóbicos, classicamente considerados ser só lipídios. A fenda pode acomodar uma sequência de 7 aminoácidos caracterizados como um resíduo hidrofóbico na posição (P) l e 7, e um resíduo alifático em P4. A P1 é obrigar resíduo hidrofóbico, tal como F, W, H ou Y. Entretanto, P7 é permissivo e pode conter resíduos alternativos contanto que eles não sejam polares. Os resíduos em P4 são preferivelmente alifáticos mas são opcionais. Uma sequência geral de um motivo de ligação CD1d é, desse modo

. Deve ser entretanto claro para os versados na técnica que o motivo é simétrico e que P7 pode considerar-se como a PI, e a P1 pode considerar-se como P7. A sequência geral de um motivo de ligação CD1d é fornecida aqui como uma indicação geral sem qualquer intenção restritiva. Os peptídeos e os polipeptídeos considerados para o pedido da presente invenção são definidos de acordo com a sua capacidade de ativar células NKT pela apresentação na molécula CD1d.

[048] Os peptídeos hidrofóbicos ou os polipeptídeos capazes de ativar células NKT e, consequentemente, transportando um ld-motivo- de-ligação de CD são encontrados em alofatores, vetores virais, proteína usada para alimento ou alimentação, proteína à qual o dito paciente é exposto pela inalação ou por picadas, geneticamente- proteína modificada e alérgenos, desse modo dotando alofator de dita, vetor viral, proteína geneticamente modificada ou alérgeno com a capacidade de ativar células NKT CD4+.

[049] A presente invenção se refere à produção de peptídeos ou polipeptídeos contendo motivos de ligação de CD1d, que os conferem com a capacidade de ativar células NKT e sendo modificados por substituição de resíduos hidrofóbicos na P1 e/ou P7, com, opcionalmente, substituição ou eliminação de resíduos alifáticos em P4, ou qualquer combinação destes, que resulta em uma perda ou a redução significativa da capacidade de peptídeos ou polipeptídeos para ligar a CD1d e desse modo resulta em uma perda ou a redução significativa de ditos peptídeos ou polipeptídeos para ativar células NKT.

[050] Em uma mais determinada modalidade, os F, W, T, H ou Y nas posições P1 e/ou P7são substituídos por um resíduo de aminoácido não hidrofóbico, ou, opcionalmente, I, L, M ou V na posição P4 é substituído por um resíduo não alifático, ou qualquer combinação destes.

[051] Em ainda outra determinada modalidade, os resíduos hidrofóbicos localizaram na posição P1 e/ou P7, ou, opcionalmente, resíduos alifáticos localizados em P4, ou qualquer combinação destes, são substituídos por pelo menos um aminoácido não natural diferente de F, W, T, H, Y, não natural ou por um composto orgânico não aromático.

[052] Em ainda outra determinada modalidade pelo menos um aminoácido é acrescentado dentro do motivo de ligação de CD1d, em qualquer posição dentro da sequência P1 à P7, que interrompe o motivo, previne a sua capacidade de ligar a CD1d e desse modo a sua capacidade de ativar células NKT.

[053] Em uma modalidade preferida, os aminoácidos não naturais são D-aminoácidos.

[054] A presente invenção também se refere à produção de peptídeos ou polipeptídeos contendo motivos de ligação de CD1d, que os conferem com a capacidade de ativar as células NKT, e sendo modificados pela eliminação de resíduos hidrofóbicos na P1 e/ou P7, ou, opcionalmente, pela eliminação de resíduos alifáticos em P4, ou qualquer combinação destes, que resulta em uma perda ou a redução significativa da capacidade de peptídeos ou polipeptídeos para ligar a CD1d e desse modo resulta em uma perda ou a redução significativa dos ditos peptídeos ou polipeptídeos para ativar células NKT.

[055] Depois da administração a um paciente, tais peptídeos ou os polipeptídeos não são carregados em CD1d e desse modo são impedidos de ativar as células NKT.

[056] Em um aspecto adicional, a invenção também cobre o uso de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo isolado compreendendo pelo menos uma substituição ou eliminação de F, W, T, H ou Y nas posições P1 ou P7 para impedir em um paciente uma resposta imunológica através administração de alofator, administração de vetor viral, proteína à qual o dito paciente é exposto por alimento, alimentação, rota sistêmica ou de inalação, ou alérgenos ou agentes infecciosos usados com objetivos de vacinação.

[057] Em ainda um aspecto adicional, a invenção cobre o uso de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo isolado compreendendo pelo menos uma substituição ou eliminação de F, W, T, H ou Y nas posições P1 ou P7 para impedir em um paciente a ativação das células NKT através administração de alofator, administração de vetor viral, proteína à qual o dito paciente é exposto por alimento, alimentação, rota sistêmica ou de inalação, ou alguns alérgenos ou agentes infecciosos usados com objetivos de vacinação.

[058] Em ainda um aspecto adicional, a invenção também cobre o uso de pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo isolado compreendendo pelo menos uma substituição ou eliminação de F, W, T, H ou Y nas posições P1 ou P7 como um medicamento para impedir em um paciente uma resposta imunológica através administração de alofator, administração de vetor viral, proteína à qual o dito paciente é exposto pelo alimento, alimentação, rota sistêmica ou de inalação, peptídeos ou polipeptídeos geneticamente modificados ou alguns alérgenos ou agentes infecciosos usados com objetivos de vacinação.

[059] O número de motivos de ligação CD1d quando presente em um peptídeo ou polipeptídeo, é muito limitado. Os exemplos de tais peptídeos ou polipeptídeos são fornecidos abaixo. Tipicamente um polipeptídeo apresenta de um a cinco destes motivos.

[060] Uma vantagem adicional da presente invenção consiste em que a molécula CD1d apresenta um grau muito limitado do polimorfismo. É, desse modo, óbvio para um versado na técnica que as mesmas substituições de aminoácido, a adição ou as eliminações de acordo com a presente invenção fornecem peptídeos ou polipeptídeos úteis para todos ou uma grande maioria de pacientes. Isto está no forte contraste com peptídeo ou ligação de motivos de polipeptídeo a moléculas de MHC classe II, em que um grande número de peptídeos pode ser delineado contendo a sequência apropriada. Isto é, devido às constrições mínimas impostas à peptídeos de ligação MHC classe II e ao grande polimorfismo de moléculas de classe II.

[061] Os peptídeos e os polipeptídeos que são o objetivo da presente invenção são identificados como se segue:

[062] (1) uma sequência de aminoácidos de peptídeo ou polipeptídeo é, opcionalmente, avaliada para a presença de pelo menos um motivo CD1d que contém um resíduo hidrofóbico em P1 e P7, e um resíduo alifático em P4. Uma sequência geral tal como

pode ser usada para usar o bem conhecido de algoritmos na técnica tal como: http://expasy.org/tools/scanprosite/

[063] Esta sequência geral deve ser considerada como um instrumento para ajudar a identificação de que sequências nos ditos peptídeos ou polipeptídeos contêm um motivo que pode permitir aos ditos peptídeos ou polipeptídeos ativar células NKT.

[064] (2) a capacidade do peptídeo ou polipeptídeo para ligar a CD1d e ativar células NKT é in vitro testado usando uma linhagem celular que exprime a molécula CD1d. Os exemplos de tais linhagens celulares são conhecidos na técnica (por exemplo, células de JAWS2). Em uma modalidade preferida, a linhagem celular não está apresentando moléculas de MHC classe II e é transformada para a hiperexpressão de CD1d utilização de um vetor viral que contém a sequência de DNA de CD1d ou qualquer outro meio conhecido na técnica introduzir um gene em uma célula. Os métodos da transdução de célula são conhecidos na técnica. A linhagem celular é carregada na cultura com o peptídeo ou polipeptídeo, ou com um peptídeo sintético que abrange a sequência correspondente. Tais peptídeos sintéticos são facilmente produzidos pela síntese, usando, por exemplo, o bem conhecido de síntese em fase sólida fmoc na técnica. A apresentação eficiente do peptídeo, polipeptídeo ou peptídeo sintético correspondente pela molécula CD1d é depois avaliada medindo a ativação das células NKT. Tais células podem ser obtidas do sangue periférico por, por exemplo, classificação magnética e mantidas na cultura com estimulantes tal como alfa-gal-ceramida, na presença de citocinas tal como IL-2, IL-15 ou IL-7. Estes métodos são descritos na técnica (ver, por exemplo, Godfrey et al, Nature Reviews. Immunology 2010, 11: 197206). A ativação das células NKT é avaliada usando métodos tal como a avaliação da produção de citocina.

[065] Alternativamente, os peptídeos de fato apresentados por APC em moléculas CD1d podem ser eluídos e separados por vários métodos de cromatografia. A descrição cheia de tal metodologia será encontrada em Scott et al, Immunity, 12: 71 1-720, 2000. Os ditos peptídeos são depois sequenciados para identificar que resíduos de aminoácido são localizados na P1 e P7.

[066] Alternativamente, a dita peptídeos sintéticos pode ser carregada em tetrâmeros da molécula de CD1d para detectar células NKT específicas para tal peptídeo. Uma possibilidade é usar tetrâmeros marcados com a fluorescência e detecção usando um sistema de classificação de célula ativado pela fluorescência (FACs).

[067] (3) as sequências de aminoácido identificadas como sendo capaz de ativar células NKT e, opcionalmente, identificado por algoritmos, são depois modificadas por substituição ou por eliminação. Em uma modalidade preferida, os F, W, T, H ou Y nas posições P1 e/ou P7são substituídos por pelo menos um aminoácido diferente de F, W, T, H, Y. Os aminoácidos naturais podem ser modificados por modificações de pós-transcricional ou substituídos com grupos químicos tal como grupos metila. Em outra modalidade preferida, os F, W, T, H ou Y nas posições P1 e/ou P7são substituídos por qualquer aminoácido não natural alternativo adequado. Os exemplos de resíduos de aminoácido não naturais são D-aminoácidos. Em ainda outra modalidade, os F, W, T, H ou Y nas posições P1 e/ou P7são substituídos por pelo menos um aminoácido diferente de F, W, T, H, Y. Em outra modalidade preferida, F, W, T, H ou Y na posição P1 é substituído por pelo menos um aminoácido diferente de F, W, T, H, Y, por qualquer aminoácido não natural alternativo adequado ou por um composto orgânico não aromático. Tal substituição de aminoácido é obtida usando métodos bem conhecidos na técnica. Em ainda uma nova modalidade preferida, F, W, T, H ou Y na posição P1 é eliminada. Em ainda outra modalidade, os F, W, T, H ou Y nas posições P1 e P7 são eliminados. Os métodos para executar eliminações de dita são bem conhecido na técnica. Em ainda outra determinada modalidade pelo menos um aminoácido é acrescentado dentro do motivo de ligação de CD1d, em qualquer posição dentro da P1 à sequência P7.

[068] De acordo com a presente invenção os medicamentos são previstos para o tratamento de doenças em que a administração de alofatores é necessitada, tal como em:

[069] (1) deficiência congênita ou adquirida em fatores associados com a coagulação (tal como fator VIII, fator IX ou fator X) ou fibrinólise, com o defeito em enzimas associadas com o metabolismo de polissacarídeo ou glicogênio (tal como na doença Pompe), ou com o defeito na produção hormonal (tal como insulina na diabete ou hormônio do crescimento no nanismo).

[070] (2) situações agudas ou crônicas em que é vantajoso administrar um agente curativo, tais agentes como trombolíticos incluem o estafiloquinase e a microplasmina,

[071] (3) distúrbios do sistema imunológico em que é necessário administrar citocinas (ou o seu receptor) ou fatores de crescimento (tal como interferon alfa, interferon beta, interferon gama, G-CSF, GM-GSF, KGF ou eritropoietina)

[072] (4) doenças caracterizadas por inflamação crônica ou respostas imunológicas impróprias, em que os anticorpos terapêuticos devem ser administrados, incluindo fator necrosante antitumor, anti- CD3 ou anticorpos anti-CD4 em doenças autoimunes e rejeição de enxerto, anticorpos a marcadores de superfície de linfócito (tal como anticorpos de anti-CD20 em linfomas não Hodgkin), ou anticorpos ao fator VIII na prevenção da trombose. A lista de anticorpos terapêuticos está crescendo rápido e a presente invenção pretende cobrir o uso de qualquer anticorpo usado com objetivos terapêuticos em geral.

[073] De acordo com a presente invenção os medicamentos também são previstos para uso em terapia genética e vacinação genética, em que os vetores virais são utilizados e em que a resposta imunológica contra os ditos vetores impede a expressão do transgene.

[074] De acordo com a presente invenção os medicamentos também são previstos para doenças provocadas pela exposição à proteína ambiental, tal como:

[075] (1) proteínas às quais o dito paciente é exposto por alimento ou alimentação. Os exemplos destes são cereais tal como trigo, milho, arroz, soja e colza, verduras tal como batata e beterraba, frutos tal como rosácea, nozes, e abacate, enzimas, fármacos antivirais ou antibacterianos.

[076] (2) proteínas através das quais o paciente é exposto por inalação, via sistêmica ou picada. Os exemplos destas são reações alérgicas a pólens, contato com a reação a picadas de himenóptera ou látex.

[077] De acordo com a presente invenção os medicamentos também são previstos para a imunização (vacinação) tal como:

[078] (1) vacinação contra alérgenos

[079] (2) vacinação contra agentes infecciosos, incluindo vírus, bactérias e parasitas

[080] Em ambas estas circunstâncias pode ser vantajoso impedir uma ativação do sistema imunológico inato para impedir o excesso da inflamação e as suas consequências prejudiciais no resultado da dita vacinação. Outra vantagem na colocação da vacinação a alérgenos ou agentes infecciosos consiste em que a eliminação da ativação de célula NKT previne o efeito supressivo das células NKT ativadas no desenvolvimento de uma resposta adaptável contra alérgenos de dita ou disse agentes infecciosos.

[081] Deve ser reconhecido que acima a lista não é exaustiva e que a invenção pretende cobrir produtos recentemente introduzidos tal como anticorpos, citocinas, fatores de crescimento ou peptídeos e polipeptídeos usados para substituição em deficiências congênitas ou adquiridas, e proteína geneticamente modificada.

[082] Deve entender-se que alguns dos peptídeos ou polipeptí- deos listados acima podem ser administrados na forma do gene do transgênese, que pode ser executado usando vetores virais ou outros meios conhecidos pelos versados na técnica. Em tal caso, o próprio vetor viral pode ser modificado de acordo com a presente invenção eliminando motivos de ligação de CD1d.

[083] O medicamento da invenção é normalmente, embora não necessariamente, uma formulação (farmacêutica) compreendida como o ingrediente ativo pelo menos um dos peptídeos ou os polipeptídeos da invenção ou um gene vetor terapêutico capaz de expressar ditos peptídeos ou polipeptídeos. À parte dos ingredientes ativos, tal formulação compreenderá pelo menos um diluente (farmaceuticamente aceitável).

[084] Uma exceção notável a esta regra é o uso da proteína de organismos geneticamente modificados de alimento ou alimentação, exposição pela inalação ou pela via sistêmica.

[085] Em geral, a administração de peptídeos ou os polipeptídeos da invenção previnem a ativação do sistema imunológico inato, mais particularmente a ativação das células NKT, mais particularmente a produção de citocinas associadas com a ativação de célula NKT.

[086] A via da administração de peptídeos ou polipeptídeos da presente invenção pode variar de acordo com a indicação e/ou a natureza dos peptídeos ou polipeptídeos. Os exemplos são a injeção intravenosa de fatores de coagulação, a injeção subcutânea da insulina e a administração oral de proteína geneticamente modificada. A presente invenção pretende cobrir todas outras vias possíveis da administração tal como intranasal, sublingual, percutâneo, intramuscular, intrarretal ou intravaginal.

[087] Como explicado detalhadamente adicionalmente os peptídeos ou os polipeptídeos da presente invenção podem ser feitos pela síntese química, que adicionalmente permite a incorporação de aminoácidos não naturais. Os peptídeos ou os polipeptídeos da presente invenção também podem ser produzidos usando métodos conhecidos na técnica para a produção da proteína recombinante usando sistemas de expressão tais como células bacterianas, células de levedura, células de inseto, células de planta ou células de mamífero.

[088] Outro aspecto da presente invenção se refere a métodos para gerar peptídeos e polipeptídeos da presente invenção aqui descritos. Tais métodos incluem a identificação de epítopos de células NKT de alofatores, vetores virais, proteína à qual o dito paciente é exposto por alimento, alimentação, rota sistêmica ou de inalação, alérgenos ou agentes infecciosos específicos. As vias de identificação in vitro e em epítopos de células NKT in silicosão amplamente conhecidos na técnica e alguns aspectos são elaborados sobre depois.

[089] A identificação de um epítopo de células NKT no contexto da presente invenção é conhecida de uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, as sequências de peptídeos isoladas de alofatores, vetores virais, proteína à qual o dito paciente é exposto por alimento, alimentação, rota sistêmica ou de inalação, proteína geneticamente modificada, alérgenos ou agentes infecciosos específicos são testadas por, por exemplo, técnicas de citologia de NKT, para determinar se as sequências de peptídeo provocam uma resposta de célula NKT. Aquelas sequências de peptídeo encontradas provocar uma resposta de célula NKT são definidas como tendo célula de NKT atividade estimulante. A célula de NKT de mamífero a atividade estimulante pode ser adicionalmente testada pelo cultivo células NKT obtidas de um indivíduo sensibilizou a um alofator, vetor viral, proteína à qual o dito paciente é exposto por alimento, alimentação, rota sistêmica ou de inalação, proteína geneticamente modificada, alérgeno ou agente infeccioso específico, e determinação se a proliferação das células NKT ocorre em resposta ao peptídeo/epítopo como medido, por exemplo, pela absorção celular da timidina tritiada. Os índices de estimulação de respostas por células NKT a peptídeos/epítopos podem ser calculados como o CPM máximo em resposta a um peptídeo/epítopo dividido pelo CPM controle. Um índice de estimulação de célula NKT (S.I) igual a ou maior do que duas vezes o nível de base considera-se "positivo". Os resultados positivos são usados para calcular o índice de estimulação média de cada peptídeo/epítopo do grupo de peptídeos/epítopos testados. Os epítopos de células NKT não naturais podem ser adicionalmente opcionalmente testados para a sua afinidade de ligação a moléculas de CD1d. A ligação de epítopos de células NKT não naturais a moléculas de CD1d pode ser executada de maneiras diferentes. Por exemplo, as moléculas de CD1d solúveis são obtidas e feitas tetraméricas por síntese e/ou união química. A molécula de CD1d é purificada pela cromatografia de afinidade. As moléculas de CD1d solúveis são incubadas com um peptídeo de referência marcado com a biotina produzido de acordo com a sua afinidade de ligação forte para a dita molécula de CD1d. Os peptídeos a serem avaliados para a ligação de CD1d são depois incubados no momento de concentrações diferentes e a sua capacidade de deslocar o peptídeo de referência do seu sítio de ligação CD1d é calculada pela adição de neutravidina. Os métodos podem ser encontrados em, por exemplo, em Texier, et al., (2000) J. Immunology 164, 3177-3184) para peptídeos apresentados pelos determinantes de classe II MHC, mas o método pode ser facilmente aplicado epítopos de célula NKT restringidos por CDId. Os peptídeos imunogênicos ou os polipeptídeos da invenção têm um índice de estimulação de célula de NKT médio maior do que, ou igual a, 2. Um peptídeo imunogênico que tem um índice de estimulação de célula NKT dos maiores do que, ou igual a, 2 considera-se útil como um candidato para executar a substituição ou eliminação de resíduos de aminoácido hidrofóbicos, ou adição de aminoácidos dentro da sequência do motivo de ligação CD1d, tal como descrito na presente invenção.

[090] Se se encontrar que duas ou mais sequências de aminoácido que compartilham uma área da sobreposição no peptídeo nativo ou sequência de polipeptídeo têm a célula NKT humana a atividade estimulante, como determinada por técnicas de citologia T, mutação ou eliminação de resíduos de aminoácido hidrofóbicos pode ser executada para resíduos que pertencem a uma ou ambas das sequências.

[091] Os peptídeos ou os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos pela expressão recombinante em, por exemplo, células bacterianas (por exemplo, Escherichia coli), células de levedura (por exemplo, espécies Pichia, espécies Hansenula, espécies Saccharomyces ou Schizosaccharomyces), células de inseto (por exemplo de Spodoptera frugiperda ou Trichoplusia ni), células de planta ou células de mamífero (por exemplo, CHO, células de COS). A construção dos vetores de expressão adequados, desse modo, necessários (incluem a informação adicional tal como promotor e sequências de terminação) envolve, entretanto, técnicas padrão de DNA recombinantes. Os peptídeos recombinantemente produzidos ou os polipeptídeos da invenção podem ser derivados de uma proteína de precursor maior, por exemplo, via a fenda enzimática de sítios de fenda de enzima inseridos adjacente ao N e/ou C-terminal do peptídeo ou polipeptídeo, seguido da purificação adequada.

[092] Em vista do comprimento limitado de alguns peptídeos da invenção, eles podem estar preparados pela síntese de peptídeo química, em que os peptídeos estão preparados pela união os aminoácidos diferentes um a outro. A síntese química é particularmente adequada para a inclusão de, por exemplo, D-aminoácidos, aminoácidos com cadeias de lado de ocorrência não natural ou aminoácidos naturais com cadeias de lado modificadas tal cisteína como metilada. Os métodos de síntese de peptídeo químicos são poço descrito e os peptídeos podem ser encomendados de companhias tal como Applied Biosystems e outras companhias. A síntese de peptídeo pode ser executada como síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS) ou ao contrário da síntese de peptídeo de fase de solução. Os métodos SPPS mais conhecidos são t-Boc e química de fase sólida Fmoc que são amplamente conhecidas da pessoa experiente. Além disso, os peptídeos podem ser ligados um a outro para formar peptídeos mais longos usando uma estratégia de ligação (a união quimiosseletiva de dois fragmentos de peptídeos desprotegidos) como originalmente descrito por Kent (Schnolzer & Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) e revisto, por exemplo, em Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205. Isto fornece o potencial para atingir a síntese de proteína que está além do alcance de SPPS. Muitas proteínas com o tamanho de 100-300 resíduos foram sintetizadas com sucesso por este método.

[093] As propriedades físicas e químicas de um peptídeo ou polipep- tídeo da invenção (por exemplo, solubilidade, estabilidade) é examinado para determinar se o peptídeo é/seria adequado para uso em composições terapêuticas. Tipicamente isto é otimizado ajustando a sequência do peptídeo. Opcionalmente, o peptídeo pode ser modificado depois da síntese (as modificações químicas, por exemplo, acrescentam/eliminam grupos funcionais) a utilização de técnicas conhecidas na técnica.

[094] A produção de organismos geneticamente modificados se baseia em métodos bem conhecidos para os versados na técnica, inclusive clonagem, mutagênese dirigida para o sítio e crescimento.

[095] A presente invenção também se se refere a sequências de ácido nucleico que codificam os peptídeos ou os polipeptídeos da presente invenção e métodos do seu uso, por exemplo, da expressão recombinante ou na terapia genética. Especialmente, disse que as sequências de ácido nucleico são capazes de expressar peptídeos da invenção.

[096] Na terapia genética, as moléculas de ácido nucleico recombinantes que codificam os peptídeos ou os polipeptídeos da presente invenção podem ser usadas DNA como nu ou em lipossomas ou outros sistemas de lipídio da liberação para visar células. Outros métodos de transferência direta de DNA de plasmídeo em células é bem conhecido aos versados na técnica para uso na terapia genética humana e envolve o apontamento do DNA a receptores em células por complexante o plasmídeo DNA à proteína. Na sua forma mais simples, a transferência genética pode ser executada injetando simplesmente as quantidades mínimas do DNA no núcleo de uma célula, por meio de um processo da microinjeção. Uma vez que os genes recombinantes são introduzidos em uma célula, eles podem ser reconhecidos pelos mecanismos normais de transcrição e tradução celular, e um produto genético será expresso. Outros métodos também foram tentados para introduzir DNA em números maiores de células. Estes métodos incluem: a transfecção, em que DNA é precipitado com o fosfato de cálcio e tomado em células por pinocitose; eletroporação, em que as células são expostas a grandes pulsos de voltagem para introduzir orifícios na membrana); a fusão de lipofecção/lipossoma, em que o DNA é empacotado em vesículas lipofílicas que se fundem com uma célula alvo; e bombardeio de partícula usando DNA ligado a pequenos projéteis. Outro método para introduzir DNA em células deve ligar o DNA à proteína quimicamente modificada. A proteína de adenovírus é capaz de desestabilizar endossomas e realçar a absorção de DNA em células. Misturando adenovírus a soluções contendo complexos de DNA, ou a ligação de DNA ao covalentemente de polilisina anexado a adenovírus usando agentes de reticulação de proteína substancialmente melhora a absorção e a expressão do gene recombinante. Os vetores de vírus Adenoassociados também podem ser usados para a liberação genética em células vasculares. Como usado aqui, o "a transferência genética"significa o processo de introduzir uma molécula de ácido nucleico exógena em uma célula, que é comumente executada para permitir a expressão de um determinado produto codificado pelo gene. Acima citado produto pode incluir uma proteína, polipeptídeo, DNA ou RNA antissenso, ou RNA enzimaticamente ativo. A transferência genética pode ser executada em células cultivadas ou pela administração direta em mamíferos. Em outra modalidade, um vetor compreende uma sequência de molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo de acordo com a invenção é fornecida. Particularmente modalidades, o vetor é gerado de tal modo que a sequência de molécula de ácido nucleico é expressa só em um tecido específico. Os métodos de atingir a expressão gênica específica para o tecido são bem conhecidos na técnica, por exemplo, colocando a sequência que codifica um peptídeo imunogênico da invenção sob controle de um promotor, que dirige a expressão do peptídeo especificamente em um ou mais tecidos ou órgãos. O derivado de vetores de expressão de vírus tal como retrovírus, vírus de vacina, adenovírus, vírus adenoassociado, vírus da herpes, RNA de vírus ou vírus do papilloma bovino, podem ser usados para a liberação de sequências de nucleotídeo (por exemplo, cDNA) codificação de peptídeos, homólogos ou derivados do mesmo de acordo com a invenção nos tecidos visados ou população de célula. Os métodos sendo bem conhecido aos versados na técnica podem ser usados para construir vetores virais recombinantes contendo tais sequências de codificação. Alternativamente, as células projetadas contendo uma codificação de molécula de ácido nucleico de um peptídeo ou polipeptídeo de acordo com a invenção podem ser usadas na terapia genética.

[097] O medicamento da invenção é normalmente, mas não necessariamente (por exemplo, proteína produzida por organismos geneticamente modificados sendo usados para alimento, alimentação, ou ao qual o dito paciente é exposto à rota sistêmica ou de inalação), uma (farmacêutica) formulação compreendendo como ingrediente ativo pelo menos um dos peptídeos ou os polipeptídeos da invenção, um gene vetor terapêutico capaz de expressar os ditos peptídeos ou polipeptídeos. À parte dos ingredientes ativos, tal formulação compreenderá pelo menos um diluente (farmaceuticamente aceitável). Tipicamente, os compostos farmaceuticamente aceitáveis podem ser encontrados em, por exemplo, um manual de Farmacopéia (por exemplo, US, Europeu ou Farmacopéia Internacional). O medicamento ou a composição farmacêutica da invenção normalmente compreendem um (profilaticamente ou terapeuticamente) a quantidade eficaz dos ingredientes ativos em que a eficácia é em relação à condição ou o distúrbio a ser prevenido ou tratado.

[098] O medicamento ou a composição farmacêutica da invenção precisariam ser administrados a um paciente necessitado como uma parte de um regime profilático ou terapêutico compreende múltiplas administrações dos ditos medicamentos ou composição. A dita múltipla administração habitual ocorre em sequência e o intervalo de tempo entre duas administrações pode variar e será ajustada à natureza do ingrediente ativo e a natureza da condição a ser prevenida ou tratada. A quantidade do ingrediente ativo dado a um paciente na necessidade de uma administração única também pode variar e dependerá de fatores tal como a posição física do paciente (por exemplo, quanto a peso e idade), a posição da condição a ser prevenida ou tratada, e a experiência do profissional de tratamento, médico ou enfermeira.

[099] O termo "diluentes" se refere, por exemplo, a soluções salinas fisiológicas. O termo "transportador farmaceuticamente aceitável"significa qualquer material ou substância com a qual o ingrediente ativo é formulado para facilitar o seu transporte ou disseminação ao lugar a ser tratado, por exemplo, dissolvendo-se, dispersando-se ou difundindo a acima citada composição, e/ou facilitar o seu armazenamento, transporte ou tratamento sem prejudicar a sua eficácia. Eles incluem alguns e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos (por exemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotônicos (tal como açúcar ou cloreto de sódio) e assim por diante. Os ingredientes adicionais podem ser incluídos para controlar a duração da ação do ingrediente ativo na composição. O transportador farmaceuticamente aceitável pode ser um sólido ou um líquido ou um gás que foi comprimido para formar um líquido, isto é, as composições desta invenção podem ser adequadamente usadas como concentrados, emulsões, soluções, grânulos, borrifos, aerossóis, suspensões, unguentos, cremes, pastilhas, granulados ou pó. Os transportadores farmacêuticos adequados para uso nas ditas composições farmacêuticas e a sua formulação são bem conhecido aos versados na técnica, e não há nenhuma determinada restrição à sua seleção dentro da presente invenção. Eles também podem incluir aditivos, tal como agentes de umectante, agentes dispersantes, rótulos gomados, adesivos, agentes emulsificantes, solventes, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos (por exemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol), agentes isotônicos (tal como açúcar ou cloreto de sódio) e assim por diante, contanto que o mesmo seja compatível com prática farmacêutica, isto é, transportadores e aditivos que não criam o dano permanente a mamíferos. As composições farmacêuticas da presente invenção podem estar preparadas em qualquer maneira conhecida, por exemplo, misturando- se homogeneamente, revestindo e/ou moendo os ingredientes ativos, em procedimento de uma etapa ou de multietapas, com o material de transportador selecionado e, onde apropriado, outros aditivos tais como agentes superficiais e ativos. Eles também podem ser preparados pela micronização, por exemplo, à vista para obtê-los na forma de microesferas que normalmente têm um diâmetro de aproximadamente de 1 a 10 μm, isto é, para a produção de microcápsulas de liberação controlada ou retardada dos ingredientes ativos.

[0100] Os peptídeos ou os polipeptídeos, os homólogos ou os derivados do mesmo de acordo com a invenção (e os seus sais fisiologicamente aceitáveis ou composições farmacêuticas todos incluídos no termo "ingredientes ativos") podem ser administrados por qualquer via apropriada para a condição a ser prevenida ou tratada e apropriada para os compostos, ao qual o peptídeo ou polipeptídeo deva ser administrado. As vias possíveis incluem regional, sistêmico, oral (forma sólida ou inalação), retal, nasal, tópico (inclusive ocular, oral e sublingual), vaginal e parenteral (inclusive subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intradérmica, intraarterial, intratecal e epidural). A via preferida da administração pode variar com, por exemplo, a condição do receptor ou com a condição a ser prevenida ou tratada.

[0101] As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de unidade de dosagem e podem estar preparadas por algum dos métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. As formulações da presente invenção adequada para a administração oral podem ser apresentadas unidades separadas tal como cápsulas, saches ou pastilhas cada uma contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo na água ou uma emulsão líquida de água no óleo. O ingrediente ativo também pode ser apresentado como um bolus, eleituário ou pasta. Uma pastilha pode ser feita por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes e acessórios. As pastilhas de comprimido podem ser preparadas comprimindo em uma máquina adequada o ingrediente ativo em uma forma fluente de maneira livre tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um ligante, lubrificante, diluente inerte, preservativo, superfície ativa ou agente dispersante. As pastilhas moldadas podem ser feitas criando um molde adequado que trabalhe na máquina como uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. As pastilhas podem ser opcionalmente revestidas ou marcadas e podem ser formuladas para fornecer uma liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo na mesma.

[0102] Os vetores virais com o objetivo de terapia genética ou vacinação genética são altamente acessíveis a modificações por meio da tecnologia de ácido nucleico recombinante. Em vista do descrito acima, uma pessoa experiente preverá adicionalmente facilmente que a eliminação do epítopo de célula NKT de vetor viral como aplicado nos peptídeos ou polipeptídeos e os seus usos de acordo com a invenção podem ser introduzidos imediatamente no próprio vetor viral. Desse modo, a invenção adicionalmente abrange vetores virais modificados definidos vetores virais como isolados os motivos de ligação de CD1d caracterizados pelo fato de que foram eliminados por substituição ou eliminação de aminoácidos.

[0103] A presente invenção será ilustrada agora por meio dos seguintes exemplos, sendo fornecidos sem qualquer intenção restritiva. Além disso, todas as referências descritas aqui estão explicitamente incluídas aqui pela referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: fator VIII de coagulação.

[0104] Os pacientes que sofrem da hemofilia A necessitam de quantidades suficientes do fator VIII (FVIII), que é a razão da tendência ao sangramento descontrolado. Tais pacientes são tratados por infusões de FVIII purificadas de fonte plasmática ou produzidas pela tecnologia recombinante. A administração de FVIII resulta na formação de anticorpos específicos, que em mais ou menos 30 % dos casos inibem a função de FVIII como um cofator de coagulação.

[0105] Usando um algoritmo, identificamos dentro da sequência da molécula FVIII 3 sequências que carregam uma sequência de ligação CD1d, que combinou com o motivo de sequência

. Estes motivos são localizados nos domínios A1 e A3, respectivamente:

Estas sequências (sublinhadas) possuem em comum um resíduo aromático (fenilalanina, F) na posição 1, um resíduo alifático (isoleucina, I, ou valina, V) na posição 4, e um resíduo aromático (histidina, H, ou tirosina, Y) na posição 7.

[0106] Para determinar se estas sequências podem ativar células NKT in vivo, FVIII (2 IU) foi injetado intravenosamente em ratos com hemofilia A em 4 ocasiões separadas por um intervalo de 1 semana. Os ratos com hemofilia A não produzem nenhum FVIII devido a um códon de parada introduzido no gene FVIII no éxon 16.

[0107] Os ratos foram sacrificados 10 dias depois da última injeção, o baço foi retirado e células T CD4+ foram separadas pela separação por grânulo magnético. As células NKT são caracterizadas por expressão de CD4 e reconhecimento do antígeno apresentado pela molécula de CD1d. Um tetrâmero de CD1d foi obtido de um fornecedor comercial e carregado com peptídeos FVIIIs do tamanho de 15 aminoácidos, que incluíram peptídeos contendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3. A ligação significativa de tetrâmeros de CD1d carregados com estes peptídeos foi observada, indicando que estes 3 peptídeos foram capazes de ligar a CD1d e que a injeção de FVIII provocou a ativação das células NKT. Os resultados representativos são dados na Figura 1.

[0108] Adicionalmente, a imunização direta com peptídeos contendo um motivo CD1d (os peptídeos da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3) foi suficiente como para provocar a ativação das células NKT e a produção de anticorpos a FVIII. A ativação proeminente foi observada com o peptídeo de SEQ ID NO: 1. Os resultados representativos são dados na Figura 2.

[0109] As quimeras de medula óssea foram construídas na qual os ratos com hemofilia A foram primeiro radiados e reconstituídos com a medula óssea de ratos que carecem das células NKT, isto é, ratos CD1d nocauteados. Na ausência das células NKT, os ratos foram incapazes de produzir quantidades significativas de anticorpos para o FVIII, e praticamente nenhum anticorpo inibindo a função do FVIII (Figura 3).

[0110] O domínio de A1 de FVIII foi produzido pela tecnologia recombinante na sua sequência natural ou com uma substituição de F309 e H315 pela serina (polipeptídeo de SEQ ID NO: 4). Os domínios de FVIII A1 na sequência natural ou SEQ ID NO: 4 foram usados para imunizar grupos separados de ratos. Os resultados mostraram que a substituição de F309 e H315 por S (SEQ ID NO: 4) foi suficiente para impedir a ativação das células NKT como células T CD4+ avaliadas do baço tal como descrito acima.

[0111] O domínio de FVIII A3 foi produzido pela tecnologia recombinante na sua sequência natural ou com uma substituição de F1816 e H1822 pela serina (polipeptídeo da SEQ ID NO: 5). Os domínios FVIII A3 na sequência natural ou SEQ ID NO: 5 foram usados para imunizar grupos separados de ratos. Os resultados mostraram que a substituição de F1816 e H1822 por S (SEQ ID NO: 5) foi suficiente para impedir a ativação das células NKT como avaliadas DAS células T CD4+ do baço tal como descrito acima.

[0112] Uma molécula FVIII eliminada do domínio B na sua sequência natural provocou a ativação das células NKT (ver acima). Uma molécula FVIII com 4 substituições de aminoácido foi preparada contendo F309S, H315S, F1816S e F1918S (SEQ ID NO: 6). As injeções intravenosas de tal FVIII mutado em ratos com hemofilia A não resultaram na formação de anticorpos contra o FVIII e, consequentemente, nenhum anticorpo inibiu a função de FVIII.

[0113] Concluiu-se, desse modo, que:

[0114] (1) FVIII naturalmente contém vários motivos de ligação CD1d;

[0115] (2) estes motivos CD1d são funcionais e provocam a ativação das células NKT;

[0116] (3) a ativação das células NKT é um requisito para a produção de anticorpos contra FVIII;

[0117] (4) a eliminação dos motivos CD1d pela substituição de aminoácido é suficiente para eliminar a produção de anticorpos anti- FVIII

[0118] Deve ser claro para os versados na técnica que a invenção também se refere a animais transgênicos feitos para a produção de fatores de coagulação tal como o fator IX.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS Figura 1.

[0119] As células NKT reconhecem epítopos de fator VIII apresentados por CD1d

[0120] Os ratos com hemofilia A foram imunizados com 2 Fator VIII IU em 4 ocasiões separadas por uma semana. O baço foi depois retirado e células T CD4+ foram separadas pela separação por grânulo magnético. Um tetrâmero marcado com fluorocromo de CD1d foi obtido de um fornecedor comercial e carregado com peptídeos FVIIIs do tamanho de 15 aminoácidos, que incluíram peptídeos contendo SEQ ID NO: 1, 2 e 3. O carregamento foi executado na temperatura ambiente durante a noite no escuro.

[0121] Os tetrâmeros foram depois incubados durante 30 minutos em 4°C com a população de células T CD4+ e a suspensão da célula foi analisada por FACs.

[0122] A figura mostra que os tetrâmeros de CD1d carregados com o peptídeo de SEQ ID NO: 1 (44pept na figura) são reconhecidos pelas células NKT. O CD1d ctl (-) mostra o % das células NKT que reconhecem tetrâmeros descarregados. O CD1d ctl (+) mostra o % das células NKT que reconhecem tetrâmeros carregados com a menina da alfa ceramida, que recruta todas as células NKT. Até 45 % das células NKT reconhecem 44pept, que é compatível com a ausência de polimorfismo ao nível CD1d e polimorfismo muito limitado ao nível do NKT T o receptor de célula. Figura 2.

[0123] A imunização de ratos com hemofilia A com um CD1d- restricted peptídeos provoca anticorpos de antifator VIII

[0124] Os ratos com hemofilia A foram imunizados 3 vezes subcuta- neamente com 50 μg de uma mistura equimolar de peptídeos de SEQ ID NO: 1 (44pept) e peptídeo de SEQ ID NO: 2 (256pept) adsorvidos em hidróxido de alumínio. Um grupo de controle recebeu o soro fisiológico em vez de peptídeos. O plasma foi tomado 10 dias depois da última imunização e avaliado para a presença de anticorpos de antifator VIII, usando um ensaio de ligação direta. Resumidamente, o Fator VIII (10 IU/ml) foi insolubilizado sobre placas de poliestireno, que foram lavadas e incubadas com uma diluição 1/10 de plasma. Depois de uma nova lavagem, um soro anti-HRP de cabra anti-rato marcado foi acrescentado, seguido de um substrato de enzima. O desenvolvimento de cor foi lido como OD.

[0125] A figura mostra que os ratos com hemofilia A imunizados com peptídeos da SEQ ID NO: 1 e da SEQ ID NO: 2 desenvolvem anticorpos ao Fator VIII. Figura 3.

[0126] Os ratos com hemofilia A reconstituídos com a medula óssea de ratos CD1d KO não produzem anticorpos para o Fator VIII.

[0127] Os ratos com hemofilia A foram letalmente irradiados e reconstituídos com a medula óssea de ratos CD1d KO (5x106/rato), que necessitam das células NKT. Seis semanas depois da reconstituição de medula óssea os ratos receberam 4 injeções IV de 2 IU/mL separadas por uma semana. Os ratos foram sangrados 10 dias depois da imunização última e o plasma foi analisado para a presença de anticorpos de antifator VIII usando um ensaio de ligação direto tal como descrito na legenda da Figura 2. Um grupo de controle de ratos com hemofilia A irradiados foi reconstituído com uma medula óssea normal.

[0128] A figura indica que, embora os ratos de controle produzam altas concentrações de anticorpos anti-FVIII depois da quarta injeção do Fator VIII (painel à esquerda), os ratos reconstituídos com a medula óssea dos ratos deficientes da célula NKT não o fizeram (painel à direita).

Exemplo 2: vetores virais de adenovirus 5.

[0129] Os vetores virais são comumente usados para vacinação genética e terapia genética. Um dos mais comuns destes vetores virais é derivado de adenovírus, sorotipo 5. Os adenovírus (Ad) são vírus não envoltos que possuem um genoma de DNA linear, duplamente encalhada de aproximadamente 35 KBs. O ser humano Ad5 tem um capsídeo consistindo de 3 proteína estrutural principal: hexon, penton e fibra. Os anticorpos neutralizam são levantados através hexon proteína. Tais anticorpos são muito comum em seres humanos como consequência da infecção viral. A presença de tais anticorpos bloqueia a entrada do vetor viral e, consequentemente, previne a expressão da proteína de transgene transportada pelo vetor. Os anticorpos de Anti- Ad5 são gerados no decorrer de uma resposta adaptável, que depende da ativação das células T CD4+ específicas para epítopos apresentados no contexto de moléculas de MHC classe II.

[0130] Conhece-se que Ad5 ativa o sistema imunológico inato, embora o mecanismo exato pelo qual ocorre e a posição onde ele se realiza permaneça pouco nítido. Ainda, a ativação do sistema imunológico inato pode ser uma etapa necessária para neutralizar anticorpos a ser formados.

[0131] Usando algoritmos, identificamos 7 sequências de aminoácido que combinam com o motivo geral

de um CD1d sequência de ligação (SEQ ID NO: 7, com motivos sublinhados) em hexon 6.

[0132] Os ratos foram injetados intravenosamente com 109PFU do vetor Ad5 em 3 ocasiões em intervalos de 10 dias. Células T CD4+ estiveram depois preparados do baço pela separação por grânulo magnético. Células T CD4+ foram incubados com tetrâmeros de CD1d carregados com peptídeos que correspondem a cada uma das 7 sequências identificadas. Ele mostrou que uma proporção significante (± 10 %) de CD4 + as células NKT foram marcadas por tetrâmeros, indicando que as injeções do vetor Ad5 ativaram células NKT específicas para o peptídeo de SEQ ID NO: 7. Além disso, tais ratos produziram anticorpos específicos do isotipo IgG2a, característica de neutralizar anticorpos no rato.

[0133] Um vetor viral esteve preparado que conteve uma substituição de [FW] pela serina S para cada uma das 7 sequências de aminoácido identificadas. Este vetor viral mutado (SEQ ID NO: 8, com motivos sublinhados) foi usado para imunizar animais de acordo com o mesmo protocolo tal como descrito acima para a sequência natural. A proporção das células NKT os tetrâmeros de utilização como avaliados carregados com o peptídeo na sequência natural (SEQ ID NO: 7) foram <1 % e a concentração do vírus Ad5 anticorpos específicos foi significativamente reduzida (até dez vezes).

[0134] Concluiu-se, desse modo, que a substituição de F a S em cada posição de P1 de motivos de ligação de CD1d foi suficiente como reduzir a ativação de célula NKT e desse modo reduzir a produção de anticorpos anti-Ad5.

Exemplo 3: proteína geneticamente modificada.

[0135] A proteína à qual os pacientes são expostos por meio de inalação ou ingestão está provocando frequentemente reações não desejadas em pacientes predispostos. A asma alérgica afeta milhões de pessoas através do mundo. A alergia de alimento por outro lado tem uma prevalência total de ± 2.5 % na população geral. Os alérgenos transportados pelo ar, ingerido ou penetração da pele podem compartilhar propriedades pelas quais eles ativam células NKT.

[0136] Um alérgeno de alimento mais comum é maçã (Malus domesticus), e com alergenicidade carrega quase exclusivamente Mal d 1 proteína, uma proteína com 159 aminoácido em comprimento, que protege a planta contra agentes infecciosos. Um motivo de sequência foi identificado usando algoritmos de computador, que corresponde ao motivo geral

de um CD1d sequência de ligação.

[0137] Correspondência de FKLIESY com aminoácidos 144-150 de Mal d 1 (SEQ ID NO: 9)

[0138] Uma forma recombinante de Mal d 1, no qual F144 e Y150 foram transformados em S foi produzida pela engenharia genética. A forma recombinante de Mal d 1, desse modo, abrange o peptídeo da sequência:

[0139] SKLIESS (SEQ ID NO: 10)

[0140] Os peptídeos sintéticos que correspondem SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10 foram produzidos. A sua capacidade de ativar células NKT foi in vitro determinado usando derivado das células dendríticas humano do sangue periférico monócitos de um indivíduo sensibilizado a Mal d 1. As células dendríticas carregadas com cada um dos dois peptídeos foram incubadas na presença das células NKT obtidas do mesmo indivíduo classificando linfócitos periféricos usando marcadores específicos tal como CD4 e NKG2D. Observou-se que as células NKT incubadas com o peptídeo de SEQ ID NO: 9 ativaram uma proporção significante das células NKT, enquanto o peptídeo mutado de SEQ ID NO: 10 não fez. Adicionalmente, os tetrâmeros de CD1d humanos carregados com peptídeos de SEQ ID NO: 9 foram reconhecidos por uma proporção significante das células NKT, mas os tetrâmeros carregaram com o peptídeo mutado de SEQ ID NO: 10 foram reconhecidos por menos de 1 % das células NKT.

[0141] Os dois F144S e as mutações Y150S são introduzidos diretamente em células clonais pela mutagênese sítio-dirigida. O organismo inteiro é depois produzido por estratégias de crescimento convencionais. As maçãs produzidas por este OGM não provocam reações alérgicas.

[0142] Um pedido específico dos peptídeos ou os polipeptídeos da presente invenção são doença celíaca (intolerância à glúten). Esta doença está entre a maior parte de povo em seres humanos e é relacionada à ativação de célula T a epítopos Gliadina sendo apresentados no contexto de determinantes de classe II MHC. Uma suscetibilidade genética foi descrita, com seres humanos que transportam o HLA-DQ2 ou determinante de classe II DQ8 que é predisposto à doença. Estes determinantes de classe II apresentam peptídeos que foram submetidos à diamidação por transglutaminase. Entretanto, estes eventos são os resultados da reação inflamatória intestinal, provavelmente relacionada ao sistema imunológico inato.

[0143] Gliadinas são os monômeros dos 250-300 resíduos de aminoácido. Uma procura do motivo geral

de um CD1d a sequência de ligação usando algoritmos de computador identificou tal sequência (SEQ ID NO: 11, ver a listagem de sequências) na alfa-gliadina. Uma forma mutada da alfa-Gliadina foi depois produzida no qual o resíduo F do motivo foi substituído por um resíduo S (SEQ ID NO: 12, vide a listagem de sequência).

[0144] O mesmo procedimento quanto a Mal d 1 foi seguido para mostrar que, embora o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11 ativasse uma proporção significante das células NKT quando apresentado pela apresentação do antígeno células dendríticas, a forma mutada do polipeptídeo (SEQ ID NO: 12) não conseguiu fazer assim. Quanto a Mal d 1, os tetrâmeros de CD1d humanos carregados com um peptídeo sintético que representa o motivo identificados no polipeptídeo de SEQ ID NO: 11 foram reconhecidos pelas células NKT, enquanto os tetrâmeros carregados com a forma mutada do motivo como mostrado em SEQ ID NO: 12 não foram.

[0145] A mutação foi introduzida diretamente em células clonais pelo mutagênese sítio-dirigida. O organismo cheio foi depois produzido por estratégias de crescimento convencionais. Os cereais contendo a forma mutada de Gliadina não provocam reações da intolerância.

[0146] Deve ser óbvio para os versados na técnica que a presente invenção também pode ser aplicada a proteína que é acrescentada a, por exemplo, organismos geneticamente modificados para aumentar a sua resistência a inseticida, pesticidas ou qualquer outra modificação julgada ser benéfica. Tais modificações transportam o risco de criar novos motivos de ligação de CD1d.

[0147] Os exemplos adicionais da proteína geneticamente modifi cada com toda ergonicidade/imunogenicidade reduzida são: • alérgenos alimentares tal como soja, amendoim e frutos da família Rosaceous • proteína de leite • alérgenos transportados pelo ar tal como látex (Hevea brasiliensis), pólens de gramas tal como grama de Centeio (Lolium perenne), Timothy (Phleum pratense) ou o Kentucky grama azul (Poa pratensis) • parvalbumina de peixe • fosfolipase A2 de mel de abelha

[0148] Também deve ser claro para um versado na técnica que a invenção estende a métodos pelos quais os peptídeos ou os polipeptídeos da invenção são produzidos, incluem a produção de plantas e animais transgênicas.

Exemplo 4: alérgeno Der p 1.

[0149] O Der p 1 é uma protease de cisteína que é o alérgeno principal do assim chamado ácaro de poeira domiciliar (HDM), D. pteronyssinus. A sensibilização a HDM é de muito o gatilho mais comum da asma alérgica e rinite no mundo inteiro. O Der p 1 contém 3 motivos que combinam com o motivo de ligação de CD1d geral

, algoritmos de computador de utilização como identificados e sendo: SEQ ID NO: 13: aminoácidos de FSGVAAT 38-44 de Der p 1 SEQ ID NO: 14: aminoácidos de HSAIAAVI 135-141 de Der p 1 SEQ ID NO: 15: aminoácidos de YPYVVIL 216-222 de Der p 1

[0150] Os peptídeos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 foram sintetizados e usados para carregar tetrâmeros de CD1d.

[0151] Os ratos de BALB/c foram submetidos à administração intranasal de Der p 1, usando 50 μg da salina que contém 100 μg de Der p 1. Este procedimento de desafio foi repetido duas vezes em três dias consecutivos no intervalo de uma semana. Os ratos foram sacrificados 5 dias depois da instilação nasal última e o baço foi retirado. Células T CD4+ foram purificados pela separação por grânulo magnético e incubaram na presença dos tetrâmeros de CD1d carregados com peptídeos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15. Pelo determinação do separador de célula ativado pela fluorescência (FACs), observou-se que uma percentagem significante das células (± 10 %) foi corada com os tetrâmeros, identificando-os como células NKT CD4+. Concluiu-se, desse modo, que os peptídeos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 foram funcionais na ligação a CD1d e em ser reconhecidos pelas células NKT.

[0152] Célula T CD4+ obtidas dos experimentos acima foram incubados no meio de cultura na presença de uma célula que apresenta o antígeno que exprime a molécula de CD1d. Tais células estão comercial-mentedisponíveis, quanto ao exemplo as células JAWS2, que não exprimem determinantes de classe II MHC. As células de JAWS2 foram carregadas com Der p 1 e apresentação de Der p 1-os epítopos de derivado por CD1d foram avaliados medindo a produção de citocinas tal como IFN-gama e IL-4 como marcadores da ativação NKT. Pode observar- se que uma produção significante de citocinas esteve presente, confirmando que Der p 1 conteve epítopos apresentados por moléculas de CD1d.

[0153] Depois, uma forma mutada de Der p 1 foi preparada pela engenharia genética, na qual os 3 resíduos de aminoácido preditos para estar na posição P1 da ligação de CD1d de peptídeos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 foram substituídos pela serina. O Der mutado p 1 (SEQ ID NO: 16) foi usado para a instilação nasal tal como descrito acima com Der p 1 na sequência natural (SEQ ID NO: 17). Em tal caso, nenhuma ligação significante de célula T CD4+ esplenócitos foi observada quando incubado com os tetrâmeros carregados com peptídeo de SEQ ID NO: 13, peptídeo de SEQ ID NO: 14 ou peptídeo de SEQ ID NO: 15, indicando que o Der mutado p 1 tinha perdido a sua capacidade de ativar células NKT específicas para estes peptídeos.

[0154] Adicionalmente, Der p 1 transformado (SEQ ID NO: 16) foi usado para carregar células JAWS2 e testado para a sua capacidade de ativar células NKT. Para este experimento, as células NKT foram usadas como obtidas de ratos imunizados com Der p 1 na configuração natural ou em mutada. A produção da IFN-gama e IL-4 foi tomada como uma indicação da ativação NKT. Observou-se que as células NKT obtidas de ratos imunizados com a sequência natural Der p 1 não conseguiram ser ativadas quando incubado na presença das células JAWS2 carregadas com Der mutado p 1.

[0155] Concluiu-se, desse modo, que Der p 1 na sequência natural conteve epítopos de célula T restringidos de CD1d funcional que ativam células NKT. Adicionalmente, a eliminação de tais epítopos funcional restritos a CD1d pela mutação foi suficiente para eliminar a ativação de célula NKT.

Exemplo 5: anticorpos.

[0156] Os anticorpos são usados agentes como terapêuticos em um grande número de indicações, de doenças inflamatórias crônicas tal como artrite reumatoide (por exemplo, anti-TNF-alfa anticorpos) ou asma alérgica (por exemplo, anticorpos de anti-IgE), a tumores (por exemplo, anticorpos de anti-CD20). Mais de 120 anticorpos terapêuticos são atualmente usados para pedidos clínicos em vários estágios de pré- clínico a provas de fase III e aceitaram para a prática clínica regular.

[0157] Os anticorpos terapêuticos são quiméricos ou totalmente humanizados, que contém a sequência da origem exógena só nas regiões de determinação de complementaridade das partes variáveis. Uma minoria de tais anticorpos é derivada do repertório humano e, como tal, considera-se como pobremente imunogênica. Entretanto, os anticorpos através o anticorpo terapêutico, mesmo quando diretamente derivado do repertório humano, são produzidos por uma maioria dos pacientes sob tratamento, com, em uma proporção significante dos casos, a produção de anticorpos que neutralizam a atividade do agente terapêutico.

[0158] Uma procura de epítopos que combinam com o motivo de ligação de CD1d na sequência de anticorpo de ser humano IgG foi executada usando algoritmos de computador. Um de tal motivo foi identificado na região CH2 (o segundo domínio da cadeia pesada parte constante) de cada uma da subclasse 4 de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e um segundo motivo foi identificado na alça CH3 de IgG1, IgG2 e IgG4: SEQ ID NO: 18: YRVVSVL (CH2 de IgG1 e IgG4) SEQ ID NO: 19: FRVVSVL (CH2 de IgG2 e IgG3) SEQ ID NO: 20: HEALHNH (alça de CH3 de IgG1, IgG2 e IgG4)

[0159] Os peptídeos sintéticos que correspondem SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 foram produzidos e usados para carregar tetrâmeros de CD1d humanos quanto aos exemplos acima (ver, por exemplo, o exemplo 4 para o alérgeno Der p 1). As células de sangue periférico foram obtidas pela punctura venosa de pacientes que tinham recebido uma injeção de um anticorpo terapêutico durante os 5 prévios dias. Células T CD4+ foram purificadas pela separação por grânulo magnético. As células foram depois incubadas com tetrâmeros carregados com peptídeos de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20. A análise por FACs identifica uma proporção significante das células NKT (± 10 %) marcado por tetrâmeros.

[0160] Os anticorpos humanos monoclonais do isotipo IgG4 foram derivados do sangue periférico B linfócitos pela transformação com o vírus Epstein-Barr. A sequência genômica de tais anticorpos foi obtida das células B transformadas. Um vetor viral que contém a sequência de cDNA correspondente foi construído e usado para a transfecção das células de CHO. Todos estes métodos são conhecidos na técnica (ver por exemplo, Jacquemin et al., Blood, 92: 496-506, 1998).

[0161] Os resíduos de aminoácido hidrofóbicos localizados na posição 1 nos peptídeos de SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20 foram transformados a uma serina e o anticorpo mutado produzido por células de CHO transfectadas.

[0162] Sangue periférico células T CD4+ obtidas como acima foram expostos no meio de cultura a células dendríticas humanas (derivado do sangue periférico miócitos humanos por métodos conhecidos na técnica) e carregaram com qualquer o anticorpo na configuração natural (SEQ ID NO: 21) ou o seu companheiro mutado (SEQ ID NO: 22). Depois do cultivo as células com células T CD4+ durante 5 a 7 dias, a população das células T CD4+ ativadas pelo anticorpo natural ou por mutado foi avaliada. Células NKT CD4+ foram separados das células T CD4+ usando um anticorpo a NKG2D, um marcador superficial associado com NK ou células NKT só.

[0163] Observou-se que células T CD4+ e células NKT foram ativadas quando o anticorpo na sequência natural foi usado (SEQ ID NO: 21), enquanto a forma mutada do anticorpo (SEQ ID NO: 22) só ativa CD4 restringido a células T classe II+ e não células NKT.

[0164] Concluiu-se que os anticorpos de ser humano IgG contiveram epítopos que correspondem ao motivo

, tendo a capacidade a ser reconhecida por e ativar células NKT. Adicionalmente, a mutação de resíduos de aminoácido hidrofóbicos-chave dentro de tal motivo foi suficiente para impedir a ativação das células NKT.

[0165] Deve entender-se que os exemplos fornecidos aqui não são exaustivos e que as combinações de proteína ou peptídeos contendo vários números de substituições de aminoácido ou eliminações podem ser visionadas. Por exemplo, no exemplo 1, várias combinações de substituição de aminoácidos hidrofóbicos podem ser delineadas.

Claims (6)

1. Método para obter um peptídeo ou um polipeptídeo isolado com a capacidade reduzida de ativar células NKT, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. identificação de pelo menos um epítopo de célula NKT restrito a CD1d dentro da sequência de aminoácidos natural do dito peptídeo, em que o dito epítopo compreende o motivo

com resíduos de aminoácidos hidrofóbicos na posição P1 e/ou P7 b. eliminação de pelo menos um epítopo NKT restrito a CD1d por substituição ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico na posição P1 e/ou P7 por um resíduo não hidrofóbico ou por adição de pelo menos um aminoácido em qualquer posição dentro do referido epítopo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a eliminação do(s) referido(s) epítopo(s) de células NKT restrito(s) a CD1d ocorre pela substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido hidrofóbico na posição P1 e / ou P7 por um resíduo não hidrofóbico.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um F, W, T, H, Y na posição P1 e/ou P7 é substituído por pelo menos um dentre qualquer aminoácido natural, aminoácido não natural ou compostos de aminoácido não aromáticos em que o dito aminoácido é diferente de F, W, T, H, Y.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a eliminação do(s) referido(s) epítopo(s) restrito(s) a CD1d inclui ainda a substituição ou deleção de um resíduo alifático em P4.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito resíduo alifático em P4 é I, L, M.

6. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que é obtenível pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o dito polipeptídeo consiste em SEQ ID NO: 4.

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