JPH06501260A

JPH06501260A - ヒト免疫不全ウィルスに対する中和抗体の誘発とワクチン接種に用いられるペプチド

Info

Publication number: JPH06501260A
Application number: JP3516126A
Authority: JP
Inventors: ヴァルネ，アンデルシュ; スヴェンネルフォルム，ヴォー; リューモ，ラーシュ; ヤンション，スチク; ホラール，ペーテル
Original assignee: シンテロ　ヴァクシーン　ディベロップメント　ケービー
Priority date: 1990-09-27
Filing date: 1991-09-25
Publication date: 1994-02-10
Also published as: CA2091263A1; DE69133242T2; CA2091263C; US5589175A; EP0550599A1; OA09802A; FI931393A0; WO1992005800A1; MC2308A1; EP0550599B1; ATE238065T1; FI931393A; HU9300877D0; AU650911B2; AU8643591A; ES2194836T3; DE69133242D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト免疫不全ウィルスに対する中和抗体の誘発とワクチン　に　いられるペプチド見匪■背景本発明は、ＡＩＤＳに対するワクチン接種に用いるのに適するペプチドに関する。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）として知られるようになった病気の原因となる。この死を避けられない病気は１９８１年に初めて認められたが、いまだにその治療法は見つかっていない。ＨＩＶは、性的接触、感染血液ないし血液製剤。

および出生時のような様々な経路で蔓延する。ＨＩＶ感染の複雑さと有効な治療法の不足のために、ＡＩＤＳの撲滅は、既に感染した人達の治療よりもむしろ新たな感染を予防することによって達成されると思われる。この目的に向かって、感染を検査し予防する手段の開発に多大な努力が費やされてきた。感染した人、血液、その他の生物学的生成物を識別するため、診断手法が開発されてきている。

一般的なウィルスと同様に、ＨＩＶはしばしば中和抗体の生産を誘発するが、他の多くのウィルスや他の病原菌に感染すると、防御免疫が生じるのに対し、ＨＩＶの特異抗体は病気の進行を止めるには不十分である。したがって、ＨＩＶの場合には、自然感染の免疫を誘発するワクチンは効果がないことが明らかであろう。事実、ＨＩＶタンパク質ｇｐ１６０から作られたワクチンは、中和抗体を誘発するにもかかわらず、ＨＩＶ感染に対する免疫はわずかしかもたらさないことが明らかにされている。有効な抗ＨＩＶワクチンが作れないために、１９９０年代の終りまで有効なワクチンは実用化されないであろうとの予測がなされている。

ＨＩＶゲノムの特性は、かなり明らかにされている。その約１０ｋｂの部分は、ＨＩＶ複製のための調節部分と、それぞれ核タンパク質。

逆転写酵素−タンパク質分解酵素−エンドヌクレアーゼ、内被および外被糖タンパク質の遺伝暗号を有する釘獲、止り、、　ｅｎｖ遺伝子を含む配列順序を暗号化する。

ＨＩＶの匣遺伝子は、細胞白糖タンパク質ｇｐ１６０を暗号化し、通常タンパク質分解により、ウィルス外部筒タンパク質ｇｐ１２０とウィルス膜内外糖タンパク質ｇｐ４１を形成する。　ｇｐ１２０はｇＰ’４１との非共有結合的相互作用の効果によって、ＨＩＶウィルス粒子との関係を持続する。この非共有結合的相互作用は弱く、その結果、ｇｐ１２０のほとんどは可溶体として細胞とウィルス粒子から解放される。

ＨＩ　Ｖ−１ゲノムのｍと特にｅｎｖの部分に暗号化されるタンパク質は、免疫原性を有することが既往の研究により明らかにされている。これは、ｇｌａ　とｅｎｖ遺伝子の生成物に対する抗体が、ＨＩＶに感染したＡＩＤＳおよびＡＲＣ（ＡＩＤＳに関連した症状）の患者の血清中に見出されるからである。

ＡＩＤＳとＡＲＣの患者およびウィルスに感染しているが症状の現れていない人達の血清から得られるいくつかの抗体は１ｇｐ１２０とｇｐｉ６０に特異的であることが既に明らかにされている。これらの抗体は。

中和作用を有する場合がある。外被糖タンパク質は、ＡＩＤＳおよびＡＲＣの患者の血清中の抗体と常に反応するＨＩＶ−１抗原である（アランら：“ＡＩＤｌｋ者に抗体を誘発する主要な糖タンパク質抗原は、ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｍ　ｋ：より暗号化される″、サイｘンス、　２２８．　］、０９１−１０９４．１９８５年、および、バリンら：“ＡＩＤＳ患者体内の抗体の主要な標的抗原の一例としてのＨＴＬＶ−ｍウィルス外被タンパク質”。

サイエンス、　２２８．１０９４−１０９６．１９８５年）、さらに患者の血清中の抗体は、釘５遺伝子によって暗号化されるウィルス核タンパク質のエピトープとも反応する。

診断と潜在的なワクチンの生成に使用される免疫学的に重要なＨＩＶ−１抗原は、細菌、酵母、ワクチニア等の種々の発現組織における１（ＩＶ−１ゲノムの部分のクローニングにより調製されてきた（カブラディラら：“細菌により合成したｅｎｖポリペプチドを用いたヒトＡＩＤＳレトロウィルス抗体の血清学的診断 ″、生物工学、　４．１２８−１３３、１９８６年、および、チャンら：“組み換え大腸菌−誘導ウィルス抗原ペプチドを使用する免疫学的検査を用いたヒトＴ細胞リンパ球ウィルス−ｍ　（ＨＴＬＶ−ｍ）の抗体検査″、生物工学、　３．９０５−９０９゜１９８５年）ａしかし、組み換えＤＮＡ法により生成されるＨ　Ｉ　Ｖ−１抗原は、ＨＩＶ−１抗原調製に混入するおそれのある発現組織を抗原とする抗体反応による、ワクチン接種の際の副作用とＥＬＩ　ＳＡ検定での偽陽性反応を避けるために、徹底的に精製しなければならない。また、精製中にＨＩＶ−１抗原が変性して、抗原の重要な効力が失われることもある。無傷のウィルスからのタンパク質の調製もまた、結果的に無傷のウィルスの混入を生じ得る。

ＨＩＶ−１の抗原タンパク質に相当する選択された合成ペプチドの免疫学的反応性を示すデータが、いくつか発表されている。ある研究では、ＨＩＶ−１のアミノ酸残基７３５−７５２に相当するアミノ酸連鎖Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｙ− Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａ@ｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓをもつペプチドが合成されている（ケネディら：　”ＨＴＬＶ−ｍ外被糖タンパク質と反応する合成ペプチド抗血清′″、サイエンス、　２３１．１５５６−１５５９．１９８６年）。ｇＰ４１の部分から得たこのペプチドをウサギの免疫処理に使用し、ＨＩＶ−１に対する中和抗体反応が誘発されるかどうかが試みられた。さらに、抗ｇｐ’ｌ　１抗体を有することがわかっているＡＩＤＳ患者からのいくつかの血清が、このペプチドと弱い反応性を示したことから、このペプチドは天然の＆ｐ１６０／ｇρ４１の抗体とある程度反応するエピトープを少なくとも一つ有することが示されている。しかし、このペプチドがウサギ以外の哺乳類で中和抗体を誘発することは示されておらず、ヒトのワクチンとしての使用も提案されていない。

倉囲み栗封本発明により、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０タンパク質とその類似体および同族体のエピトープに相当する新しいペプチドが与えられる。このペプチドは、単独で、もしくは組み合わせて、他の分子あるいは物質と組み合わせず、あるいは組み合わせて使用することができる。このペプチドは、ＨＩＶに対する強い免疫を誘発し、多クローンまたは単一クローン抗体を生産して、ＨＩＶ感染に対する免疫に有用である。

髪匪段詑狙至ユ更本発明は、霊長類の被験者によるＨＩＶ中和抗体の生産を誘発することが明らかにされたペプチドを与えるものである。ケネディら（”　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｍ外被糖タンパク質と反応する合成ペプチド抗血清″。

サイエンス、　２３１．１５５６−１５５９．１９８６年）により定義された座標では、このペプチドはｇｐｌ、２０タンパク質の範囲に相当する。本発明のペプチドを、ｇｐ１２０−１２　（７ミ／酸座標１５９−１８３）　、　ｇｐ１２０−１５　（７ミ／Ｗ座１１１２００−２２５）　、　ｇｐ１２０−１．６　（７ミ／酸座４１２１３−２３７）　、　ｇｐ１２０−１９（アミノ酸座標２５５ −２７６）と名付ける。ペプチドｇｐ１２０−１９は、既に報告されているペプチド（ホーら、サイエンス、　２３９．１０２１−１０２３．１９８８年）と類似しているが、霊長類においてｇｐ１２０−１９が中和抗体を誘発することを新たに明らかにした。本発明のペプチドは、ワクチンの組成における免疫原として、多クローンあるいは単一クローン抗体の生産、とりわけ重要なＨＩＶ中和抗体の生産に使用することができる。

タンパク質には、特定の抗体と反応し結合する部分である抗原決定因子あるいはエピトープが数多く含まれている。一般にタンパク質は５〜１０のエピトープを有し、それぞれのエピトープは６〜８のアミノ酸の連鎖を有する。エピトープには連続的なものと、不連続なものがあり、連続的なエピトープでは、６〜８のアミノ酸が直線連鎖として存在しており、不連続なエピトープでは、エピトープを形成するアミノ酸が、タンパク質の３次元的な折りたたみにより集合している。

エピトープは比較的わずかなアミノ酸から構成されているが、その抗体との反応性は、エピトープの周囲のタンパク質のアミノ酸によって影響を受ける。

抗原部位あるいはタンパク質のエピトープの地図作成を目的とした研究は、対象とするタンパク質の種々の範囲に相当する合成ペプチドを利用することによって促進されてきた（ラーナーら二″免疫疾患の生物学：病院実習書、ディクソン＆フィッシャー編、　ｐＰ、３３１−３３８．１９８３年、および、ラーナー：応用免疫学、　３６．１．１．９８４年）。エピトープ地図作成の研究に有用なのに加えて、合成ペプチドは、もしタンパク質の主要な抗原決定因子を含むならば、ワクチンおよび診断試薬としての可能性を有する（ファン・レーゲンモルテル：パスツール研究所年報、ウィルス学１３７Ｅ、　４９７−５２８．１９８６年、および、ファン・レーゲンモルテル：生物化学および分子生物学の実験法、ブローデン＆ファン・クニッペンベルグ編、第１９巻、抗原としての合成ペプチド、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　ｌ５ＢＮ　０−４４４−８０９７４−０．１９８８年）。

特定の抗体の生産と反応性に関して、合成ペプチドはいくつかの長所を有する。

タンパク質のアミノ酸の配列により決定されるタンパク質のアミノ酸連鎖、あるいはタンパク質を暗号化するＤＮＡ塩基配列から決定される予測アミノ酸連鎖から、合成ペプチドの正確な連鎖が選択される。特定の合成ペプチドを使用することにより、ワクチン接種および抗体の生成や検査においてタンパク質を全長にわたって用いる必要性が排除される。さらに、メリフィールドらによる固相ペプチド合成技術により、必要なペプチドを半無限量化学的に生産することが可能である（エリクソン＆メリフィールド：タンパク質、第３版。

第２巻、アカデミツクプレス、ニューヨーク、第３章、　１９７６年）。自動ペプチド合成器の実用化によりこの技術はさらに進歩した。

タンパク質の抗原の範囲を予測するために、種々の基準を用いることが可能であるが、こうした範囲に相当するペプチドがワクチンとして必ずしも有用であるとは限らない、たとえば、ペプチドの空間的な配向が適当でないために、タンパク質と反応する抗体によって認識されないことによって、免疫原性が失われることもある。Ｃ型レトロウィルスから得られるある種のペプチドとＨＩＶは、ＨＩＶ単独よりも強い免疫抑制剤として機能してしまうこともわかっている（ＣｉａｎｃｉｏｌＯら：免疫学会誌、　１２４．２９００−２９０５．１９８０年、および、　Ｃ１ａｎｃｉｏｌｏら：米国科学協会報、　２３０．４５３−４５５．１９８５年）患者に副作用をもたらすようなペプチドは、ワクチンとしての使用に不適切であろう。

さらに、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２について、特に明らかなこととして、これらの二つのウィルス集団にはそれぞれの中で重大な遺伝的変異性があり、その結果、ウィルスの数多くの血清型あるいは分離株か生じる。このことは、免疫原の製剤に用いるペプチドを得るためにタンパク質の範囲を選ぶ際に、大きな拘束となる。しかしながら、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のタンパク質のある免疫優性部分は、比較的変動しにくいことが明らかにされている。合成ペプチドは、天然の分子中では普通免疫原性を示さない一般的な連鎖に対して、免疫反応を誘発することができるウィルスワクチンの鍵ともなり得る。普通は、不活動的なこれらのエピトープは、広範囲の防御特性をもち得る（Ｓｔｅｖａｒｄら：免疫学Ｔｏｄａｙ、　８．５１−５８．１９８７年）。ウィルスに触れる機会の多い人々を感染から守ることを目的として、いくつかの実験的なワクチンが作られた（ベルマンら：　ｇＰ１６０ではなく組み換え糖タンパク質ｇｐ１．２０を用いてワクチン接種した後のＨＩＶ−１による感染からのチンパンジーの防御”、ネイチャー、　３４５．６２２−６２５．１９９０年）。

免疫学的に重要なＨＩＶタンパク質の範囲に相当する合成ペプチドは、ＨＩＶの検査のための診断法としてすぐ使えるほか、多クローンまたは単一クローン抗体を生成してＨＩＶ用のワクチンとなる可能性があることが、今回明らかになった。

ｇｐ１２０の中和エピトープは、何名かの研究者によって数多く発見され定義されている。その概要については、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ　：　Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　、　３（補遺１）　、　５ｉｌｌ−５１１８，１９８９年を参照されたい、　Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉは、概括の中で、以下のアミノ酸座標、　２５４−２７４．３０３−３３７．４５８−４８４．４９１−５２３の４つの異なるウィルス中和エピトープについて述べている。

前述したように、アミノ酸座標２５４−２７４のペプチドを用いてウサギに免疫処置した結果、生じた抗血清はＨＩＶ−１を中和することが確かめられている。

発明に含まれるペプチドが有するアミノ酸連鎖はそれぞれ、免疫処置される宿主内でＨＩＶ特異抗体の生成を誘発する連続（直線）エピトープを少なくとも一つ含む。

したがって１本発明は、Ｍｕｅｓｉｎｇらが″ヒトのＡＩＤＳ／リンパ節疾患レトロウィルスの核酸構造と発現″（ネイチャー、　３１３．４５０−４５８、１９８５年）で述へでイるＨＩＶ−１，ＨＴＬＶｍ−Ｈの外被遺伝子によって暗号化されるＨ　Ｉ　Ｖ　ｇＰ１２０タンパク質の範囲に相当する免疫原性ペプチドを対象とする。ヌクレオチド連鎖は、ＨＩＶＰＶ２２の名でＧｅｎｂａｎｋ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　６３に与えられている。本発明はさらに、ペプチドの免疫原性に大きな影響を及ぼさない、機能的に等価なペプチドの変異体を含む。たとえば、アミノ酸残基の保守的な置換、一つないし数個のアミノ酸の削除あるいは付加、アミノ酸残基のアミノ酸類似体への置換は、発明の範囲に含まれる。

同族体は保守的に置換されたアミノ酸残基をもつペプチドである。

別のアミノ酸に保守的に置換することが可能なアミノ酸には、グリシン／アラニン、バリン／イソロイシン／ロイシン、アスパラギン／グルタミン、アスパラギンｉｍ＆／グルタミン酸、セリン／トレオニン、リジン／アルギニン、フェニルアラニン／チロシンその他がある。配列順序を後述するｇＰ１２０−１２．　ｇｐ１２０−１５．　ｇｐ１２０−１６．およびｇＰ１２０−１９と呼ぶペプチドと反応する抗体と反応する同族体ペプチドは、本発明の範囲内にあると考えている。さらに、本発明のペプチドに相当する同族体ペプチドで、ＨＩＶの異なる分離株から得られるものもすへて本発明の範囲に含まれる。

類似体は、本発明のペプチドと機能的に等価であるが、ある種の非自然発生的ないしは変更されたアミノ酸残基をもつペプチドと定義される。さらに、１つ以上のペプチドおよびペプチド類似体もしくは同族体の重合体が１本発明に含まれる。またｇｐ１２０−１２．　ｇｐ１２０−ｉ５．　ｇρ１２０−１６．　ｇＰ１２０−１９よりもそれぞれアミノ酸残基が少ないペプチドも本発明に含まれるが、これらはペプチドのどれか１つに免疫原性エピトープが１つ以上存在することによって１元のペプチドの免疫原特性を有するものとする。

これらのペプチドは、既知の固相ペプチド合成法（メリフィールド＆バラ二−二 ″′ペプチド−分析・合成・生物学″、第１巻、グロス＆マイネンホッファー編、アカデミツクプレス、ニューヨーク、第１章。

１９８０年）により合成した。この合成により１元のタンパク質の配列順序とは一致しない１つ以上のアミノ酸に、ペプチドのアミノないしカルボキシル末端基を付加することもできる。こうした特別なアミノ酸は、ペプチドを他のペプチドや大きな担体タンパク質や固体支持に結合するために有用である。これらの目的のために有用なアミノ酸には、チロシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システィン、およびこれらの派生物その他がある。付加タンパク質変更法は、たとえば、ペプチドを別のタンパク質や、ペプチド分子や支持に結合する付加法としてのＮＨ２−アセチル化や、Ｃ００Ｈ−末端アミド化のように用いられる。ペプチドを互いに、あるいは担体タンパク質や固体支持に結合する方法は、技術的によく知られている。したがって、上述したようなカルボキシルないしアミノ末端基をもつ特別なアミノ酸残基は、担体や固体支持に結合している。していないにかかわらず、本発明の範囲に含まれる。本発明のペプチドに関連するものには、ここで述べるすべての具体化したものが含まれる。ワクチンを生成する別の方法は、１つ以上の本発明のペプチドと、高い免疫原性をもつタンパク質から成る。融合タンパク質を生成する分子生物学的な技術を用いるものである。たとえば、対象とする抗原と、コレラ毒素のＢサブユニットから成る融合タンパク質は、対象とする抗原に対する免疫反応を誘発することが示されている（サンチェスら：゛′′ワクチン開発礎としての亜ｆｆｌのコレラ毒素Ｂサブユニットの過剰表出のための組み換えシステム″、米国科学協会報、　８６．４８１−４８５．１９８９年）。

新しいペプチド連鎖を以下に示す。アミノ酸残基は１Ｍｕｅｓｉｎｇらが″ヒトのＡＩＤＳ／リンパ節疾患レトロウィルスの核酸構造と発現″（ネイチャー、　３１３．４５０−４５８．１９８５年）で既に述べているヌクレオチドから得ている。ペプチドは、そのカルボキシル末端に、カルボキシル基よりもアミド基を有するほうが望ましい、カルボキシル末端は、カルボキシル基であっても、また以下に示す成分であってもよい。

ｇＰ、１２０−１２Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｉ　ｌｅ−Ｌｙ　ｓ−Ａ　５ｎ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａ　ｓｎ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−５ｅｔ−１１ｅ−Ａ　ｒｇ−Ｇｌｙ −Ｌｙ　ｓ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｌｙ　ｓ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｔｙｒ−Ａ　ｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｙ−ＺＰｇ１２０−１．５Ｘ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−５ａｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−丁ｈｒ−５ｅｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙ　５−Ｖａ　１−５ｅｒ− Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｈｉ　ｓ−Ｔ　ｙｒ− Ｃｙｓ−Ｙ−ＺＡ　ｌａ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｙ−Ｐｈｅ−Ａ　ｌａ−Ｉ　ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙ　５−Ｃｙｓ−Ａ　ｓｎ−Ａｓｎ−Ｙ−Ｚｇｐ１２０−１９Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−シミｌ−５ｅｒ−丁ｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ　５ｎ−Ｇ　ｌｙ−５ｅｒ− Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｙ−ＺここでＸは、ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子もしくはペプチドの担体との結合を容易にするために選ばれた付加アミノ酸であり、Ｙは何もないかＣｙｓであり、Ｚはカルボキシル末端アミノ酸のカルボキシル基もしくはアミド基である。使用したアミノ酸の略号を表２に定義する。

これらのペプチドは、将来のＨＩＶ感染を予防するワクチンとして、あるいはすてにＨＩＶに感染した被験者のＨＩＶに対する免疫反応を強化するために使用できる。これらのペプチドは、ワクチンとして誰に対しても用いることができるが、最も適切な対象者はＨＩＶ感染の危険がある人々である。そうした対象者には、同性愛者、売春婦、静脈注射薬物使用者、医療に従事し患者や生物学的標本と接触を持つ人達が含まれるが、彼らに限定されるわけではない。本発明はまた。

これらのペプチドと特異的に反応する単一クローンおよび多クローン抗体を与える。本発明はさらに、ＨＩＶを中和する抗体を与える。

本発明の望ましい具体化として、免疫原用の組成にこのペプチドを含めて調剤することができる。これらの免疫原は、ヒトを含む哺乳類におけるワクチンとして、もしくは動物体内に多クローンないし単一クローン抗体の生成を誘発するために使用できる。こうした組成を調剤するために、免疫原として有効な量の少なくとも１つのペプチドを、ヒトを含む哺乳類への投与に適する生理的に受容可能な担体と混合する。これらのペプチドは、相互に、他のペプチドと、タンパク質担体と、あるいは他の担体と共有結合し、リボゾームなどの小胞に取り込まれるか、またはワクチン技術的に知られている補助剤や吸着剤と混合される。たとえば、高橋らが″精製したＨＩＶ−１外被タンパク質とｌＳｃ０Ｍ５を用いた免疫によるＣＤｇ＋細胞障害性Ｔ細胞の誘発”（ネイチャー、　３４４．８７３−８７５．１９９０年）で述べているような免疫刺激性複合体と、１個ないし数個のペプチドを混合することができる。

あるいは、ペプチドを結合せず単体でヒトを含む哺乳類への投与に適する通常生理食塩溶液や緩衝化合物のような生理的に受容可能な担体と混合することもできる。

抗体を誘発するす入での免疫原性組成と同様に、本発明のペプチドの免疫原として有効な量は、経験的に決めなければならない。考慮すべき要因としては、元のペプチドの免疫原性、ペプチドが補助剤、担体タンパク質、他の担体と複合しているかもしくは共有結合しているかどうか１組成の投与経路、すなわち静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等、および投与されるべき免疫量の数値がある。こうした要因は、ワクチン技術的に知られており、不必要な実験を行わなくとも、免疫学者には十分こうした決定ができるものである。

発明の範囲を制限する意図はまったくないが、以下に特定の実施例を示すことによって、本発明をさらにわかりやすく説明する。

夾族忽−よペズ天五介戊応用生物系ペプチド合成剤４３０Ａ型が、本発明のペプチドの合成に使用された。それぞれの合成では、Ｐ−メチルベンジルヒドリルアミン固相支持樹脂（ペプチドインターナショナル、ルイスビル、ＫＹ）を使用した。ペプチド合成剤４３０Ａ型の利用者用便覧（応用生物系。

１９８６年）に従って、ペプチドを合成した。

合成に用いたアミノ酸はすへてα−ＮＨ，群を防護するｔ−ブチルカルボニル群（ｔ−Ｂｏｃ）を含み、スイスのツバ生物化学ＡＧから得たものである。反応性側鎖群をもつアミノ酸は、望ましくない側鎖反応を防止するための付加防護群を含む、すへてのペプチドの合成に用いた個々の防護アミノ酸を吹の表１に示す。

退」− ペプチドの４　に　いたアミノＢｏｃ−Ａｌａ−ＯＨＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＲ’Ｈ，ＯＢｏｃ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）−Ｏｆ（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（２−ＣＩ−Ｚ）−０Ｈ（ｃｒｙｓｔ　、　）ＢｏＣ−Ａｓｎ−ＯＨＢｏＣ−阿ｅｔ−ＯＨＢｏｃ−Ａｓｐ　（Ｏｂｚｌ）−０ＨＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｐｍｅｏｂｚｌ）−０ｈ　Ｂｏｃ−Ｐｒｏ −ＯＨＢｏｃ−Ｇｌｕ　（Ｏｂｚｌ）−ＯＨＢｏｃ−５ｅｒ　（Ｂｚｌ）−０８ ″ＤＣＨＡＢｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−０８Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨＢｏｃ−Ｔｒｐ　（Ｆｏｒｍｙｌ）−０ＨＢｏｃ−Ｈｉｓ−（Ｔｏｓ） −ＯＨＢｏｃ−Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ）−０１１Ｂｏｃ−１１ｅ−ＯＨＡｌ／２Ｈ２０Ｂｏｃ−シミｌ−０４４ＴＯ５＝トシルあるいはｐ−トルエンサルホン酸０ｂｚｌ　＝ベンジルオキシＰｍｅｏｂｚｌ＝　Ｐ−メチルベンジルオキシ２−ＣＬ−２＝カルボベンゾキシクロライド２−Ｂｒ−Ｚ＝カルボベンゾキシブロマイド特定の合成終了後、防護群は合成されたペプチドから除去され、ペプチドは三フッ素メタンサルフォンａ　（Ｔ　Ｆ　Ｍ　Ｓ　Ａ　）を用いた処理によって固体支持樹脂から分離される。この処理は、ベルゴツトら二″固相ペプチド合成での分離試薬としてのトリフルオロメタンサルフオン酸の利用″″、応用応用生物系利用者報告ジペプチド合成２発行、１６＋１９８６年９月２日に述べられている方法に従った。用いた実験記録の詳細を以下に示す。

１、ペプチド樹脂１グラム当たり、排除剤として３社のチオアニソール１，２− エタンジチオール（２：ｌ）を加え、室温で１０分間連続撹拌して混合した。

２、三フッ素酢酸（ＴＦＡ、）ＩＣ）ｍｌを加えて、室温で１０分間連続的に撹拌した。

３、ＴＦＭＳＡ　１ｍｌを強力に撹拌しながら滴下して加え、室温で２５分間反応させた。

４、分離後ペプチドを無水エーテルで沈殿させ、洗浄した。

５、沈殿し洗浄されたペプチドを、少量のＴＦＡに溶解させた（約５ｍ１）　。

６、溶解したペプチドは、上記ステップ４と同様に再度沈殿、洗浄され、沈殿物をＮ２の蒸気で乾燥させた。

特定の検査への使用に先立ち、必要なら逆相の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってペプチドの純度をさらに上げることも可能である。こうした純化に特に適したカラムは、ペプチドを溶出させる水（Ｔ　Ｆ　Ａ）−アセトニトリル（ＴＦＡ）勾配を用いた逆相ヴイダック＠ｃ−ｉｓカラムである。表２に示すアミノ酸配列順序をもつ４０種のペプチドを合成した。

失施何ス報燕（／し戯に４種中和試駿はすべてＨ−９細胞とＨＴＬＶ−Ｉ［ＩＢウィルス（Ｒ，Ｃ，ガロによって発明され、ニューヨーク、マンハセット、ノースショア病院、ウィリアム・ホール博士によって供給されたもの）を用いて行った。Ｈ−９細胞（Ｎ９　ＮＹと呼ぶ）を、２０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＥＮ／５ＴＲＥＰ　各５０μｇ　／　ｍ　Ｑ、殺菌剤不使用）を補ったＲＰＭＩ溶液（ギブコ）内で維持した。細胞は４日ごとに１：３に希釈して２次培養した。

細胞をシャーレから剥離し、３２５ｘｇで遠心分離して沈殿させた。

沈殿した細胞を、あらかじめ１／１０に希釈した１ｍｌのウィルス種内で再懸濁し、頻繁に撹拌しながら３７℃で６０分間吸収させた。ウィルス吸収後、細胞を再び遠心分離し、２０％ＦＣ３とポリブレン（２μｇ／ｍＱ）を含むＲＰＭＩ中に再懸濁しく最終濃度５　Ｘ　１０’細胞／ｍＡ）、５％Ｃ○２中で３７℃で培養した。

融合細胞形成の監視、免疫電光法による陽性細胞、およびｐ−２４生成（アボットＰ−２４抗原試験によって検査した）によって、感染後４〜５日で感染細胞が検出可能であることがわかった。ＨＩＶ生産のピークは感染後１０〜１５日で見られ、この時点でウィルスを収集した。不要物を除去するための低速遠心分離の後、感染細胞から収集したウィルスを含む上澄みを一９０℃で凍結保存した。滴定終末点４０．０００　５０％組織培養感染供与量（ＴＣＩＤ、。）の１つのウィルス種（ＮＴ３−ＮＴ１９と呼ぶ）を研究全般に使用した。

夾施但すペプチドの複機能結合剤としてＮ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（スウェーデン、ウプサラ、ファーマシア）を取扱説明書（ファーマシア）に従って用い、本発明によるペプチドと、５級卵白アルブミン（米国ミズーリ州セントルイス、ジグマンとを、約１０：１（ペプチド二卵白アルブミン）のモル比で併有結合させた。

その概略は以下の通りである。

卵白アルブミンを結合緩衝液（０−２Ｍ　Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４−Ｐ　Ｈ８、５）に溶解した。溶解した卵白アルブミンは、その後同じ緩衝液を用いて、セファデックスＧ−２５Ｍカラム（ファーマシア、スウェーデン）に通した。２８０ｎｍでタンパク質濃度を測定し、回収率を決定した。

５ＰＤＰを最終濃度が４０ｍＭとなるように９９．５％エタノール中に溶解した。次に、卵白アルブミン溶液を撹拌しながら、５ＰＤＰを滴下して加えた。そのあと５ＰＤＰ−卵白アルブミン混合液を約３０分間室温に放置した。溶出剤として水を用い、この混合液をセファデックスＧ−２５Ｍカラムに通すことによって、結合していない５ＰＤＰから、卵白アルブミン−５ＰＤＰ結合体を分離した。

５０μＱの結合体を水２　ｍ　Ｑで希釈したあと、ペプチド溶液に加える量を決定するために、２８０ｎｍで希釈結合体を測定し、希釈結合体に１００μＱのジチオスレイトール（ＤＴＴ）（シグマ）を加えて３４３ｎｍで測定することによって、卵白アルブミン−８ＰＤＰ結合体の置換率を決定した。

最後に、卵白アルブミン−５ＰＤＰ結合体と結合させる合成ペプチドを、最終濃度が１ｍｇ／ｍＱとなるように１０％酢酸中に溶解し、卵白アルブミン−５ＰＤＰ結合体を適当な量（上述の置換率により決定される）加えて、室温に一晩おいた。

寒施桝土免疫五層ス２１記録抗体形成にアカゲザルを使用した。最初のペプチド接種に先立ち、このサルから血液試料を採取した。この最初の血液試料を″免疫前″（表３〜６）と呼び、対照試料として用い、それぞれの免疫血清と同時に分析した。

０．５ｍ１２食塩加リジ酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した１００μｇのペプチド− ３ＰＤＰ−卵白アルブミンを、これらのサルに接種した。

サルは３週問おきに３回、筋肉内注射により免疫処置された。補助剤として０　、５　ｍ　Ｑのフロイント完全免疫助成剤をすべての免疫処置に用いた。最後の免疫処置から２週間後に、こ九らのサルから採血し、免疫前血清と高度免疫血清について、実施例５に述べる中和検査を行った。

実差舅ｊ一旦ユＸ二」己旧炉艮変ＨＴＬＶＩＩＩ−Ｂ感染力を中和する抗体を含む血清を、ＨＩＶ−１融合細胞形成およびＰ−２４抗原生成の阻止能力と、ペプチド特異抗血清を欠く対照感染と比較して免疫蛍光検査標識により決定される感染細胞の減少数によって検出した。実施例２で述べたウィルス種を１００ＴＣＩＤ、、に希釈し、実施例４で述べたように免疫処置されたサルから得られた補体非動化免疫血清の階段４倍希釈溶液（１１５，１／２０、ｌ／８０）と混合した。陽性の対照試料として、ＨＩＶ中和滴定量が１／４０〜１／１６０であることがわかっているモルモットの高度免疫血清（ＭｓＶと呼ぶ）を、すべて実験に使用した（スウェーデン、ウプサラ、、ＢＭＣ，獣医ウィルス学科、Ｂ、モレリン教授の厚意により与えられた）。

３７℃で６０分間または４°Ｃで１６時間の培養後、血清−ウィルス混合液にＩ　Ｘ　１０６のＨ−９細胞を加え、さらに６０分間３７℃で培養した。培養に続いて細胞を１回洗浄し、１滴定弁当り２ｍＲの成長培養液（ＲＰＭｌ、１０％ＦＣＳ、２μｇポリブレン／ｍＱ）とともに、２４滴定井の多血プレートに配置した。

感染後５〜１２日の細胞について、融合細胞の存在を顕微鏡（倍率Ｘ２ＱＯ）で調へた。感染した細胞からの上澄みについて、取扱説明■ 書（アボットａｇ試験ＨＩＶＡＧ−１、ヒトの血清ないし血しょう中のヒト免疫不全ウィルス■型（ＨＩＶ−１）抗原の検出のための酵素免疫学的検定）に従って、感染１０日後に１０倍階段希釈（１／１０〜ｌ／１０００）して、Ｐ−２４抗原の存在を検査した。結果は４５４ｎｒｎでの吸光度で示され、吸光度が高いほどタンパク質濃度が高く、したがってＨＩ　Ｖに感染していることを示す。上澄みを階段希釈するのは、ｐ−２４ａ度を最も正確な範囲（２，ｏ吸収単位未満）で検出するためである。

免疫蛍光検査（ＩＦ）用スライド上に細胞をアクセント固定することにより、実験終了時（通常は感染１５日後）の感染細胞数を決定した。Ｊｅａｎｓｓｏｎらが″高度免疫血清を用いた細胞培養からのマイコプラスマの除去”　（Ｅｘ、Ｃｅ１１Ｒｅｓ、、１６１，１８１−１８８，１９８５年）で述へている標準的な手順に従って、ＨＩＶ感染個体からの１／４００希釈高度免疫血清と、１／１００希釈フルオレセインインチオシアネー）−（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトガンマＧ抗体（フランス、Ｂｉｏ−Ｍｅｒｉｅｕｘ）を用いて。

間接ＩＦ検査を行った。ペプチド１〜４０で免疫処置したサルの高度免疫血清の判別検査によって得られた結果を表３〜６に示す。

表３　（Ａ−Ｄ）〜６で、上澄みのｐ−２４抗ｉｔは、前述したようにＥＬＬＩＳＡで分析した。

抗原陽性細胞の相対的な量を、ＡＧ陽性細胞として示し、以下のように割合を表した。

一＝０％、＋＝＞Ｏ−２％、＋＋＝３−１０％。

＋＋＋＝１１−２０％ここで割合の範囲は抗原陽性細胞の数を示す。

表３　Ａ　（ＨＩＶＮＴ３Ｐ１．ＸＬＳ）は、ペプチドｇｐ１２０−１−ｇｐ１２０−１０で免疫処置したサルから採取した血清について得られた結果を示す。

使用した細胞はＨ９ＮＹであり、使用したウィルスは、実施例２で述べたＨＴＬＶ−ｍＢ・１８バツチである。培養方法は、３７℃、１時間の（ウィルス＋血清）培養とした。

表３　Ｂ　（）ＩＩＶＮＴ４Ｐ１．ＸＬＳ）　４！、　ペプチドｇｐ１２０−１１〜ｇｐ１２０−２０で免疫処置したサルから採取した血清について得られた結果を示す。使用した細胞はＨ９ＮＹであり、使用したウィルスは、実施例２で述べたＨＴＬＶ−ｍＢ・１８バツチである。培養方法は、３７℃、１時間の（ウィルス＋血清）培養とした。

表３　Ｃ（ＨＩＶＮＴ５Ｐ１．ＸＬＳ）は、ペプチドｇｐ１２０−２１〜ｇｐ１２０−３０で免疫処置したサルから採取した血清について得られた結果を示す。

使用した細胞はＨ９Ｎ　Ｙであり、使用したウィルスは、実施例２で述べたＨＴＬＶ−ｍＢ・１８バツチである。培養方法は、３７℃、１時間の（ウィルス＋血清）培養とした。

表３　Ｄ　（ＨＩＶＮＴ６Ｐ１．ＸＬＳ）は、ペプチドｇｐ１２０−３１〜ｇｐ１２０−４０で免疫処置したサルから採取した血清について得られた結果を示す、使用した細胞はＨ９ＮＹであり、使用したウィルスは、実施例２で述べたＨＴＬＶ−ｍＢ・１８バツチである。培養方法は、３７°Ｃ１１時間の（ウィルス＋血清）培養とした。

表４　（）ＩＩＶＴＡＢ４．ＸＬＳ）は、最初の検査（表３Ａ−Ｄ）により決められる推定中和抗体の第１回再検査の結果を示す。各検査で使用したウィルスはＨＩＶＴＬＶ−ｍＢ・１８バツチであり、使用した細胞はＨ９ＮＹである。１− １９列の第１回再検査結果は、中和試験番号５の結果である。培養方法は、３７ ℃、１時間の培養とした。２−３２列の第１回再検査結果は、中和試験番号７の結果である。培養方法は、３７℃、１時間の培養とした。

表５　（）ｌＩＶＴＡＢ５．ＸＬｓ）は、陽性プペチドの第２回、第３回、第４回の再検査の結果を示す。各検査で使用したウィルスはＨＴＬＶ−ｍＢ・１８バツチであり、使用した細胞はＨ９Ｎ　Ｙである。１−４列の第２回再検査結果は、中和試験番号７の結果である。培養方法は、３７°Ｃ５１時間の培養とした。

５−１３列の第２回再検査結果は、中和試験番号１２の結果である。１４〜１６列の第３回再検査結果は、中和試験番号１２の結果である。培養方法は、３７℃ 、１時間の培養とした。

１７−３９列の第４回再検査結果は、中和試験番号１６の結果である。

培養方法は、４°Ｃ１１６時間の培養とした。４０−５３列の第２回再検査結果は、中和試験番号１９の結果である。培養方法は、４°Ｃ１１６時間の細胞＋ウィルス培養とした。

表６　（ＨＩＶＫＯＭＢＰ、ＸＬＳ）は、組み合わせた高度免疫血清の中和検査結果を示す。ウィルスと細胞の培養方法は、４℃、１６時間としたことに注意されたい。

表３　（Ａ−Ｄ）〜６に示した結果は、本発明のペプチドが霊長類被験者のＨＩＶ中和抗体生産を誘発することを示している。したがって、ＨＩＶによる感染の阻止、あるいはすでにＨＩＶに感染した被験者におけるより高度な免疫反応の誘発のために、これらのペプチドをヒト被験者へのワクチン接種として使用することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内的存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有するペプチド。
【請求項２】Ｘを前記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子と、前記ペプチドと担体の結合を容易にするために選択した１個の付加アミノ酸とより成る基から選択し、Ｙは存在しないかシステインであり、Ｚを前記カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド基より成る基より選択することを特徴とした請求項第１項に記載のペプチド。
【請求項３】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内に存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有するペプチド。
【請求項４】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内に存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体的よって認識される少なくとも１個のエピトープを有するペプチド。
【請求項５】Ｘを前記ペプチドのアミノ末端ＮＨｚ基の水素原子と、前記ペプチドと担体の結合を容易にするため的選択した１個の付加アミノ酸とより成る基から選択し、Ｙは存在しないかシステインであり、Ｚを前記カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド基より成る基より選択することを特徴とした請求項第４項に記載のペプチド。
【請求項６】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内に存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有するペプチド。
【請求項７】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内的存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体的よって認識される少なくとも１個のエピトープを有するペプチド。
【請求項８】Ｘを前記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子と、前記ペプチドと担体の結合を容易にするために選択した１個の付加アミノ酸とより成る基から選択し、Ｙは存在しないかシステインであり、Ｚを前記カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド基より成る基より選択することを特徴とした請求項第７項的記載のペプチド。
【請求項９】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内に存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルス的特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有するペプチド。
【請求項１０】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内に存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有するペプチド。
【請求項１１】Ｘを前記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子と、前記ペプチドと担体の結合を容易にするために選択した１個の付加アミノ酸とより成る基から選択し、Ｙは存在しないかシステインであり、Ｚを前記カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド基より成る基より選択することを特徴とした請求項第１０項的記載のペプチド。
【請求項１２】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内に存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有するペプチド。
【請求項１３】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内に存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有する免疫的に有効な量のペプチドと生理的に摂取可能なペプチド担体よりなるワクチン組成。
【請求項１４】Ｘを前記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子と、前記ペプチドと担体の結合を容易にするために選択した１個の付加アミノ酸とより成る基から選択し、Ｙは存在しないかシステインであり、Ｚを前記カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド基より成る基より選択することを特徴とした請求項第１３項的記載の組成。
【請求項１５】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内的存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルス的特異的な抗体的よって認識される少なくとも１個のエピトープを有する免疫的に有効な量のペプチドと生理的的摂取可能なペプチド担体よりなるワクチン組成。
【請求項１６】Ｘを前記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子と、前記ペプチドと担体の結合を容易にするために選択した１個の付加アミノ酸とより成る基から選択し、Ｙは存在しないかシステインであり、Ｚを前記カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド基より成る基より選択することを特徴とした請求項第１５項に記載の組成。
【請求項１７】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内的存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有する免疫的的有効な量のペプチドと生理的に摂取可能なペプチド担体よりなるワクチン組成。
【請求項１８】Ｘを前記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子と、前記ペプチドと担体の結合を容易にするために選択した１個の付加アミノ酸とより成る基から選択し、Ｙは存在しないかシステインであり、Ｚを前記カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド基より成る基より選択することを特徴とした請求項第１７項に記載の組成。
【請求項１９】【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内に存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを有する免疫的に有効な量のペプチドと生理的に摂取可能なペプチド担体よりなるワクチン組成。
【請求項２０】Ｘを前記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子と、前記ペプチドと担体の結合を容易にするために選択した１個の付加アミノ酸とより成る基から選択し、Ｙは存在しないかシステインであり、Ｚを前記カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド基より成る基より選択することを特徴とした請求項第１９項に記載の組成。
【請求項２１】【配列があります】および【配列があります】のアミノ酸配列順序および該アミノ酸配列順序と類似体および同族体のアミノ酸配列順序内に存在するエピトープでヒト免疫不全ウイルスに特異的な抗体によって認識される少なくとも１個のエピトープを各々有する少なくとも２個の免疫的に有効な量のペプチドと生理的に摂取可能なペプチド担体より成るワクチン組成。
【請求項２２】Ｘを前記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子と、前記ペプチドと担体の結合を容易にするために選択した１個の追加アミノ酸とより成る基から選択し、Ｙは存在しないかシステインであり、Ｚを前記カルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基とアミド基より成る基より選択することを特徴とした請求項第２１項に記載の組成。