JPH05170797A - 環状ｈｉｖ主要中和決定基ペプチド - Google Patents

環状ｈｉｖ主要中和決定基ペプチド

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JPH05170797A
JPH05170797A JP4006576A JP657692A JPH05170797A JP H05170797 A JPH05170797 A JP H05170797A JP 4006576 A JP4006576 A JP 4006576A JP 657692 A JP657692 A JP 657692A JP H05170797 A JPH05170797 A JP H05170797A
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peptide
amino acid
seq
hiv
amino
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Maria A Bednarek
エー．ベドナレク マリア
Richard L Tolman
エル．トルマン リチャード
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Merck and Co Inc
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 安定なアミド結合による閉環によって生成さ
れる環状ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）主中和決定基
（ＰＮＤ）ペプチド又はその免疫学的に等価なペプチド
を合成し、提供する。 【効果】 これら環状ペプチドは分析用手段、ＥＬＩＳ
Ａ検定の試薬又は共有結合免疫原を製造するための試薬
として有用である。これらの安定な環状ペプチドを含む
結合体は哺乳類の抗ペプチド、抗−ＨＩＶ又はＨＩＶ−
中和免疫応答を高めるのに有用であり、このような結合
体を含む組成物は後天性免疫不全症候群（エイズ）又は
エイズ関連症（ＡＲＣ）を含むＨＩＶ疾患を予防するた
めのワクチンとして又はエイズ又はＡＲＣのようなＨＩ
Ｖ疾患に罹患しているヒトを治療するための免疫原とし
て使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）主要中和
決定基（ＰＮＤ）が哺乳類に於て抗−ＨＩＶ免疫応答を
高めることができることはすでに発表されている。アミ
ノ酸２９６と３４１の間のエイズウイルスエンベロープ
糖タンパク質gp１２０の高頻度可変領域［ラトナー(Rat
ner)等、ネイチャー第３１３巻、２７７頁（１９８５
年）の番号付けによる］は今までに同定されたＨＩＶ単
離株のほとんどにおいてアミノ酸四量体−ＧｌｙＰｒｏ
ＧｌｙＡｒｇ−（−ＧＰＧＲ−）を含んでいる。更に一
般に、システイン残基がこの四量体の両側約２０個のア
ミノ酸配列内に見出される。少なくとも、ありふれた単
離株の１つ、ＨＩＶ IIIＢではこれらのシステインがジ
スルフィド結合をしていることが知られている。従って
本明細書でループアミノ酸と呼ぶ中間部アミノ酸は環状
構造をとることになり、−ＧＰＧＲ−がル−プ先端で露
出される［ジャバヘリアン(Javaherian)等、ＰＮＡＳ
ＵＳＡ第８６巻、６７６８頁（１９８９年）］。
【０００２】哺乳類に於てＨＩＶ中和免疫応答の誘発を
目的とする、ペプチドを用いる試みは一般に線状又はジ
スルフィド結合環状ペプチドの使用に限られていた。線
状ペプチドは受容体免疫系が溶液中では三次元コンホメ
ーションを絶えず変えるエピトープにさらされることに
なるという限定があり、線状ＰＮＤがとると考えられる
コンホメーション数を限定するためにジスルフィド結合
にたよろうとすると、ジスルフィドの安定性は十分とい
うにはほど遠い。ジスルフィドが切断されると、上述の
付随した問題点を有する線状ペプチドを生じる。
【０００３】上述の線状又はジスルフィド結合と関係す
る問題点のほかに別の問題点としてはＰＮＤの配列が異
ることが見出された非常に多くの異なったＨＩＶ単離株
が同定されていることである。この多様性は、別々の特
異的免疫応答を引き起すＰＮＤが有効な抗−ＨＩＶ免疫
原であるためには異なった単離株からのＰＮＤペプチド
の混合物が広範囲の治療又は保護免疫原を得るための唯
一の解決法であることを意味している。有効なＰＮＤ二
次構造をより良く確認するためには不安定なジスルフィ
ド結合の使用を避ける安定な環状物を必要とする。本発
明に於て開示される環状ペプチドとこれらの生成物の製
造方法はこの要求を満たすものである。
【０００４】線状合成ペプチドは溶液中又は固形支持体
上で行なわれる多くの方法によって製造されている。関
係する原理や技術を包含している優れたテキストとして
は「ペプチド合成の原理」ボダンスツキー、Ｍ．，スプ
リンガー−バーラグ（１９８４年）、「固相ペプチド合
成」、スチュアート、Ｊ．Ｍ．ヤング、Ｊ．Ｄ．ピアス
ケミカルカンパニー（第２版、１９８４年）、「ペプ
チド」グロス、Ｅ．マイエンホファ、Ｊ．アカデミック
プレス社（１９７９年）(Principles of Peptide Synth
esis.Bodanszky.M.,Springer-Verlag （１９８４）；So
lid Phase Peptide Synthesis,Stewart J.M.,Young,J.
D.,Pierce Chemical Company （２nd.ed.１９８４）；T
he Peptides.Gross,E.Meienhofer,J.,Academic Press,I
nc.（１９７９））が挙げられる。一般に環状ペプチド
を必要とする場合、ジスルフィド結合環状物は少なくと
も２個のスルフヒドリルを含有する線状合成ペプチド例
えば２個のシステインを含有するペプチドの酸化によっ
て製造されている。本発明は安定なアミド結合環状構造
を有するペプチドを提供することによって不安定なジス
ルフィドの使用に伴う問題点を克服する。
【０００５】従って本発明は安定な環状構造を有する新
規なＨＩＶ ＰＮＤペプチド、そのような化合物の製造
方法及び使用方法を開示する。
【０００６】安定な環状ＨＩＶ ＰＮＤペプチド、ｃＰ
ＮＤはループアミノ酸のアミノ末端側の遊離アミノ酸と
ループアミノ酸のカルボキシ末端側の遊離カルボキシル
基、好ましくはペプチドの遊離カルボキシ末端間にアミ
ド結合を形成させることによって製造される。こうして
生成したｃＰＮＤは該ｃＰＮＤを含有する共有結合体免
疫原を製造するのに有用な試薬である。このような結合
体は哺乳類の抗−ペプチド、抗−ＨＩＶ又はＨＩＶ−中
和免疫応答を高めるのに有用である。このような結合体
を含有する組成物は後天性免疫不全症候群（エイズ）又
はエイズ関連症（ＡＲＣ）を含むＨＩＶ疾患を予防する
ためのワクチンとして又はエイズ又はＡＲＣに罹患して
いるヒトを治療するための免疫原として使用することが
できる。更にこのような結合体は哺乳類ＨＩＶ−中和免
疫応答のペプチド誘発に関係する構造−機能関係を分析
するのに有用な実験手段を提供する。
【０００７】本発明を要約すると、本発明は構造
【化９】 ｛式中 Ｒ1 はａ）水素又は ｂ）ノルロイシン、オルニチン、β−アラニン及びγア
ミノ酪酸から選択される標識アミノ酸を任意に含むアミ
ノ酸である。 Ｒ2 はａ）価標又はアミノ酸、又は ｂ）２〜１７個のアミノ酸を有するペプチドである。Ｒ
3 はアミノ酸又は２〜１７個のアミノ酸を有するペプチ
ドである。 Ｒ7 はａ）価標又は ｂ）式−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ−（ｎは１〜２０である）
を有する低級ヘテロアルキレンである。Ｒ8 は価標又は
−（ＣＨ2 ）4 −である。但しＲ2 を構成する少なくと
も１個のアミノ酸が一般式−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ
−型を有しない場合にはＲ7 は−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ−
でなければならない。｝を有する新規で安定な環状ＨＩ
Ｖ ＰＮＤペプチドに関する。
【０００８】この構造を有するペプチドは線状ＨＩＶ
ＰＮＤペプチドを環化することによって製造され、これ
は適当な側鎖保護を組込む既知の固相化学合成法によっ
て製造される。合成後、線状ＨＩＶ ＰＮＤペプチドを
樹脂から切断し、溶液中でアミド結合形成を仲介するこ
とができる試薬、好ましくはジフェニルホスホリルアジ
ド（ＤＰＰＡ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ
トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロ
ホスフェート（ＢＯＰ）又は類似の試薬で処理すること
によって環化する。ループアミノ酸の一方の側の遊離ア
ミノ基とループアミノ酸の他方の側の遊離カルボキシル
基が環状構造の形成に関与する。アミノ基はペプチドの
遊離アミノ末端、好ましくはペプチド定量が容易である
ノルロイシン、アミノ末端イソグルタミン（ｉＱ）の遊
離アミノ基又はループアミノ酸のアミノ末端側のリシン
のε−アミノ又はα−アミノ基であることができる。カ
ルボキシルは遊離ペプチドカルボキシ末端かグルタミン
酸又はアスパラギン酸のような酸性アミノ酸の側鎖であ
ることができる。
【０００９】安定なアミド結合環状ペプチドは、分析用
手段として、ＥＬＩＳＡ検定の試薬として又はポリサッ
カライド、タンパク質、ポリサッカライドとタンパク質
の両方又は環状ペプチドに増大した免疫原性を与える任
意の他の物質からなる免疫原担体に結合する試薬として
有用である。このような結合体は哺乳類の抗−ペプチ
ド、抗−ＨＩＶ又はＨＩＶ−中和免疫応答を誘発した
り、エイズ又はＡＲＣを含むＨＩＶ疾患を予防するワク
チンを処方するか又はエイズ又はＡＲＣのようなＨＩＶ
疾患に罹患しているヒトを治療するのに有用である。
【００１０】従って本発明の目的は哺乳類の抗−ペプチ
ド、抗−ＨＩＶ又はＨＩＶ−中和免疫応答を誘発させる
ために又は抗−ＨＩＶワクチンとして又はエイズやＡＲ
Ｃを含むＨＩＶ疾患に罹患しているヒトの治療用免疫原
として使用するための組成物を製造するために使用する
ことができる結合体を製造するのに試薬として有用であ
る新規で安定な環状ＨＩＶ ＰＮＤペプチドを提供する
ことである。別の目的はアミド結合構造によるＨＩＶ
ＰＮＤペプチドの安定な環化方法を提供することであ
る。
【００１１】〔定義及び略語〕 ＡＡ検定 ペプチド又はタンパク質を遊離アミノ酸
に酸加水分解した後、定量するアミノ酸分析 Ａｂｕ γ−アミノ酪酸 Ａｃｐ ６−アミノカプロン酸 Ａｃｍ アセタミドメチル、チオール保護基 Ａｕｎｄ １１−アミノウンデカン酸 活性化 続く望ましい反応を起こすことができる
ように、ペプチド、タンパク質又はポリサッカライド部
分とその部分を誘導化することができる試薬と反応させ
る エイズ 後天性免疫不全症候群 アミノ酸 酸とアミノ官能基の両方を有する分子。
一般構造Ｈ2 Ｎ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨ（Ｒ基はアミノ酸本
体を定義する）を有する２０種の一般のα−アミノ酸が
ある。また一般構造Ｈ2 Ｎ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯＯＨ
（Ｒ基は水素となりｎは１〜２０である）を有するアミ
ノ酸もこの定義に包含される。これらのアミノ酸はＤ又
はＬ立体化学形を有することができ、小文字の１文字略
語又はアミノ酸名の前の接頭辞”Ｄ−”によって特にこ
とわらない限りアミノ酸は天然又はＬ配置を有する。２
０種の一般のアミノ酸名及びＲ基の構造は本明細書では
次の表に従って単一の文字コードで確認される。
【００１２】 アミノ酸名 ３文字コード １文字コード 側鎖（Ｒ） アラニン Ａｌａ Ａ −CH3 アルギニン Ａｒｇ Ｒ −(CH2)3NHCHNH2NH2 + アスパラギン Ａｓｎ Ｎ −CH2 CONH2 アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ −CH2COOH システイン Ｃｙｓ Ｃ −CH2SH グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ −(CH2)2COOH グルタミン Ｇｌｎ Ｑ −(CH2)2CONH2 グリシン Ｇｌｙ Ｇ −H ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ −CH2-イミダゾール イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ −CH(CH3)CH2CH3 ロイシン Ｌｅｕ Ｌ −CH2CH(CH3)2 リシン Ｌｙｓ Ｋ −(CH2)4NH3 + メチオニン Ｍｅｔ Ｍ −(CH2)2SCH3 フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ −CH2-フェニル プロリン Ｐｒｏ Ｐ −α,N- トリメチレン セリン Ｓｅｒ Ｓ −CH2OH トレオニン Ｔｈｒ Ｔ −CH(OH)CH3 トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ −CH2-インドール チロシン Ｔｙｒ Ｙ −CH2-フェニル-OH バリン Ｖａｌ Ｖ −ＣＨ（ＣＨ３）２
【００１３】 抗体 特定の抗原を結合することができる、哺乳類Ｂ細胞によっ て産生されるタンパク質 ＡＲＣ エイズ関連症 ＡＺＴ アジドチミジン、抗エイズ化合物 ビジェネリック 別々に誘導されたパートナーの反応から生じる分子鎖又は スペーサー 結合体。このスペーサーにより生成した結合体の分析用分 解はスペーサーを放出及び定量し、共有結合の程度の尺度 となる。 ＢＯＰ ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルア ミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート キャップ形成 低分子との反応による結合体上の反応部位の除去。 Ｃｂｚ ベンジルオキシカルボニル 結合体 少なくとも１つの因子が望ましい抗原（例えばＨＩＶ Ｐ （コンジュゲート） ＮＤ）であり、別の因子が担体タンパク質又は担体代用物 である互いに共有結合した不連続の化学因子の複合体 コアアミノ酸 哺乳類に於てＨＩＶ−中和免疫応答を誘発させるのに不可 欠なＨＩＶ ＰＮＤのアミノ酸 ＤＰＰＡ ジフェニルホスホリルアジド ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着剤検定 Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル ＨＩＶ ヒト免疫不全ウイルス、レンチウイルス群に属し、エイズ 及び関連症の病因物質とされる。ＨＩＶはまたＨＴＬＶ（ ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス）、ＬＡＶ（リンパ腺症 関連ウイルス）及びＡＲＶ（エイズ関連ウイルス）として 知られている。
【００１４】 免疫原 哺乳類免疫応答の刺激物質として有用な分子 免疫学的に等価な 哺乳類に於てＨＩＶ中和免疫応答例えば等価なペプチドエ ペプチド ピトープを認識することができる抗体を誘発させる機能を 共通して有する環状又は線状ペプチド 標識アミノ酸 ＡＡ検定に於いて他のペプチド又はタンパク質アミノ酸に よって生じるシグナルによる妨害がないシグナルを有する アミノ酸、例えばノルロイシン、オルニチン、β−アラニ ン、γアミノ酪酸 Ｍｔｒ ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニルスルホニ ル ＮＥＭ Ｎ−エチルマレイミド ＯＭＰＣ ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎ
ｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 髄膜 炎菌）の外膜タンパク質複合体(Outer Membrane Protein Complex)。免疫エンハンサー及びペプチド担体として用い られる。 ペプチド アミド（ペプチド）結合により結合したアミノ酸の重合体 ＰＥＰ ペプチド ＰＮＤ 主要中和決定基。ＰＮＤを含有する免疫原を接種したとき に受容体である哺乳類に於てＨＩＶ中和抗体に結合するこ とができ、ＨＩＶ中和抗体を高めることができるペプチジ ル配列による名称。例えばＨＩＶ gp １２０の残基２９６ 〜３４１又はそのサブ断片 PnPs6B ストレプトコッカス ニューモニエ(Streptococcus pneum oniae 肺炎レンサ球菌）６Ｂ萃膜ポリサッカライド ＰＲＯ 免疫原タンパク質 タンパク質 高分子ペプチド ＰＲＰ ポリリボシル−リビトールホスフェート ＰＳＡ 通常重合体の単量体単位に繰り返しリン酸単位を有するア ニオンポリサッカライド
【００１５】樹脂 固相ペプチド合成の固
形支持体マトリックスワング（ＷＡＮＧ） コポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂への４−
（ヒドロキシメチル）フェノキシメチル結合はバッチＦ
ｍｏｃ固相ペプチド合成に用いられ、最後に樹脂から９
５％ＴＦＡ切断し、同時に酸感受性側鎖保護基を脱保護
するサスリン（ＳＡＳＲＩＮ） コポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂への４−
（ヒドロキシメチル）−３−メトキシフェノキシメチル
結合はバッチＦｍｏｃ固相ペプチド合成に用いられ最後
に樹脂から１％ＴＦＡ／ＣＨ2 Ｃｌ2 で切り出すが酸不
安定側鎖保護基は、そのままで残る。ペプシンＫＡ（ＰＥＰＳＹＮ ＫＡ） ＫＩＥＳＥＬＧＵＨＲに吸着したポリアミド樹脂への４
−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチル結合は連続流
動カラムＦｍｏｃ固相ペプチド合成に使用される。ペプ
チドは上のワング樹脂で記載した通り樹脂から切断す
る。ペプシンＫＨ（ＰＥＰＳＹＮ ＫＨ） ＫＩＥＳＥＬＧＵＨＲに吸着したポリアミド樹脂への４
−（ヒドロキシメチル）−３−メトキシメチル結合はＦ
ｍｏｃ固相ペプチド合成に使用される。側鎖保護ペプチ
ドは上のサスリン樹脂で記載した通り樹脂から切断す
る。
【００１６】”スキャホルド” スペーサー骨格上に組
込まれた複数ペプチドエピトープを有する免疫原で担体
分子に結合している。 ＳＣＭＨＣ Ｓ−カルボキシメチルホモシステア
ミン。共有結合体免疫原の分解によって放出され、ＡＡ
検定によって定量化可能な酸安定ビジェネリックスペー
サー Ｚ ベンジルオキシカルボニル
【００１７】以下本発明を詳細に説明する 本発明は構造ｃＰＮＤ：
【化１０】 ｛式中 Ｒ1 はａ）水素又は ｂ）ノルロイシン、オルニチン、β−アラニン及びγア
ミノ酪酸から選択される標識アミノ酸を含んでも良いア
ミノ酸である。 Ｒ2 はａ）価標又はアミノ酸又は ｂ）２〜１７個のアミノ酸を有するペプチドである。Ｒ
3 はアミノ酸又は２〜１７個のアミノ酸を有するペプチ
ドである。 Ｒ7 はａ）価標又は ｂ）式−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ−（ｎは１〜２０である）
を有する低級ヘテロアルキレンである。Ｒ8 は価標又は
−（ＣＨ2 ）4 −である。但しＲ2 を構成する少なくと
も１個のアミノ酸が一般式−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ
−型を有しない場合にはＲ7 は−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ−
でなければならない。｝を有する新規な環状ＨＩＶＰＮ
Ｄペプチドに関する。“アミノ酸”としては次の一般構
造ＮＨ2 （ＣＨ2 ）n ＣＯＯＨ（ｎは１〜２０である）
を有する化合物を包含する。ペプチドに組込まれる場合
この種類のアミノ酸は一般構造−ＮＨ（ＣＨ2 ）n ＣＯ
−を有する二価のラジカルである。
【００１８】環状ペプチドのループを形成するアミノ酸
−Ｒ2 −ＧＰＧＲ−Ｒ3 −は以後ループアミノ酸と呼ば
れる。Ｒ2 及びＲ3 配列に関する手引きはラロサ(LaRos
a)等［サイエンス第２４９巻、９３２〜９３５頁（１９
９０年）］にあり２４５株のＨＩＶ単離株のＨＩＶｇｐ
１２０に於けるＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ四量体を取り
囲む配列が調べられている。従ってＲ2 は四量体のアミ
ノ末端側、システインまでに見られる配列のどれを選ん
でもよく、Ｒ3 は四量体のカルボキシ末端側、システイ
ンまでに見られる配列のどれを選んでもよい。
【００１９】“不安定でない結合”とはアミド及びチオ
エーテル結合のような、不安定なジスルフィド結合以外
の共有結合を意味する。適当な架橋構造を用いることに
よって環のループ構造のコンホメーションを、免疫系に
提示されるＰＮＤエピトープを微妙に同調させて最適に
することができる。例えば２炭素を含む架橋構造の使用
はＣ5 含有架橋を使用する場合より“きつい”ループを
生成する。
【００２０】本発明の好ましい環状ＨＩＶ ＰＮＤは構
造
【化１１】 ｛式中Ｒ1 は水素又はノルロイシンである。Ｒ8 は価標
又は−（ＣＨ2 ）4 −である。Ｒ7 は価標又は−（ＣＨ
2 ）n −ＮＨ−（ｎは１〜２０である）である。Ｒ2 は
Ｘn Ｘ1 Ｘ2 からなりＸ2 がＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ
配列に最も近い。 Ｘ1 はａ）セリン ｂ）プロリン ｃ）アルギニン ｄ）ヒスチジン ｅ）グルタミン及び ｆ）スレオニン から選択されるＲ2 の一成分である。 Ｘ2 はａ）イソロイシン ｂ）アルギニン ｃ）バリン ｄ）メチオニン、及び ｅ）−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ−（ｎは１〜２０であ
る） から選択されるＲ2 の一成分である。 Ｘn はＲ2 の一成分であり価標、アミノ酸又は２〜１５
個のアミノ酸を有するペプチドであり該アミノ酸の０又
は１個は構造 −ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ−（ｎは１〜２０である） を有する。
【００２１】同様にＲ3 はＸ3 Ｘ4 Ｘm からなりＸ3 が
ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ配列に最も近い。 Ｘ3 はａ）アラニン ｂ）アルギニン ｃ）バリン及び ｄ）ロイシン から選択されるＲ3 の一成分である。Ｘ4 はＲ3 の一成
分であり ａ）フェニルアラニン ｂ）イソロイシン ｃ）バリン及び ｄ）ロイシン から選択される。
【００２２】Ｘm はＲ3 の一成分であり価標、アミノ酸
又は１５個までのアミノ酸を有するペプチドであり該ア
ミノ酸の０又は１個は構造 −ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ（ｎは１〜２０である） を有する。但しＲ2 を構成する少なくとも１個のアミノ
酸が一般式−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ−型を有しない
場合にはＲ7 は−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ−でなければなら
ない。｝を有する。
【００２３】本発明の新規な環状ペプチドは実質的に二
相で製造される。まずは線状ペプチドを例えばＡＢＩ−
４３１Ａペプチドシンセサイザーにより既知の固相ペプ
チド合成化学によって例えばＦｍｏｃ化学と試薬として
適当に側鎖保護されたＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて製造
する。次に線状ペプチドを樹脂から切断し、溶液中でペ
プチドの遊離アミノ末端をペプチド結合生成を仲介する
ＤＰＰＡ、ＢＯＰ又は類似試薬によりループアミノ酸の
カルボキシ末端側の遊離カルボキシル基に結合させるこ
とによって環化する。得られた生成物は高速原子衝撃質
量分析［ＦＡＢ−ＭＳ］、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析
又は核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）によって確認する
ことができる。
【００２４】本発明の環状ペプチドはＥＬＩＳＡ検定の
試薬として使用することができ、ＨＩＶ中和抗体を検定
で用いる場合ペプチド構造機能関係を分析する手段とな
る。また本発明の環状ペプチドは担体例えばポリサッカ
ライド、免疫原性タンパク質又はペプチドの免疫原性を
高めることができる物質の組合わせに結合させることが
できる。具体的には本発明のペプチドをナイセリアメニ
ンギチジスｂの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）から
なる担体に結合させた。このような結合体を製造する具
体例を以下に示す。
【００２５】ワクチンとして使用する場合、本発明のペ
プチドは免疫学的に有効な濃度で、結合した状態で投与
すべきである。好適には結合化ペプチド１μg 〜１mg最
適には約１００〜３００μg を哺乳類に筋肉内、静脈内
又は皮下投与する。結合体を適当なアジュバント例えば
水酸化アルミニウムゲルに吸着させた後に投与すること
が好ましい（実施例６〜８参照）。これらのペプチドの
結合体免疫原は哺乳類に於て抗ペプチド免疫応答を誘発
させることができる。例えばＯＭＰＣに結合させたｃＰ
ＮＤ９５５はウサギに於て免疫１２週間後に抗体を高め
た。これらのウサギ４匹のうち２匹で増大した抗体はＨ
ＩＶ中和抗体であった。同様にＯＭＰＣに結合させたｃ
ＰＮＤ９７８はウサギに於て抗ペプチド抗体を高め試験
した４匹のウサギのうち３匹で増大した抗体はＨＩＶ中
和抗体であった。
【００２６】各々の場合結合体は環化ペプチドをマレイ
ミド化し、このマレイミドペプチドをチオール化ＯＭＰ
Ｃと反応させて製造した。こうして生成した結合体をミ
ョウバンに吸着させ結合体の投与量１００〜３００μg
を０、４及び８週目に筋肉内投与した。以下の実施例は
本発明の環状ペプチドの製造方法及び使用方法を更に個
々に示すものである。しかしながらこれらの実施例は本
発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではな
い。
【００２７】実施例１ ｃＰＮＤ７２４、［Ｓｅｑ．Ｉｄ．：１：］の製造
【化１２】 線状ペプチド［Ｓｅｑ．Ｉｄ．：５：］
【化１３】 を０．２５ミリモルスケールでＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（εＮ
ｌｅ−ｚ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ化学を用いＡＢＩ−４３１
固相シンセサイザーでシングルカップリングで合成し
た。ペプチドをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びアニソ
ール、２０℃、４．５時間により樹脂から切断した。粗
成物質約０．４ｇをウォーターズデルタプレプシステム
で精製し、ピーク画分を乾燥した。質量分析により分子
量１４７３を得これは計算分子量と一致した。
【００２８】線状ペプチド（０．３４ｇ、０．２２ミリ
モル）をジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）
（０．１２ml、０．６６ミリモル）、ＢＯＰ（１１１m
g、０．２５ミリモル）及びＨｏＢｔ（３８mg、０．２
５ミリモル）と共に水２００mlに溶解した。一部をとっ
て分析し、線状ペプチドの残留を確認した後、別にＢＯ
Ｐ（１００mg、０．２５ミリモル）を加えた。更に室温
でインキュベートした後、１mlをとり蒸発させ５０％酢
酸に再び溶解しＨＰＬＣで分析した。この分析によれば
線状物質の全てが環状ペプチドに変換されていた。そこ
で全反応物を乾燥し、５０％酢酸に再び溶解しＨＰＬＣ
で精製した。試料を０．１％水性ＴＦＡで平衡化したＣ
18カラムに充填しペプチドを８０％ＣＨ3 ＣＮ／０．１
％ＴＦＡまでの勾配により６０分かけて溶離した。ピー
クＨＰＬＣ画分を合わせ乾燥しパラジウム触媒により水
素化した。触媒を濾別し試料を乾燥した後５０％酢酸に
溶解した。試料をＨＰＬＣで再び精製し、０．１％水性
ＴＦＡ−７０％ＣＨ3 ＣＮ／０．１％ＴＦＡ勾配中７０
分かけて溶離するピーク画分をプールし、乾燥した。質
量スペクトル分析によりｃＰＮＤ７２４の計算質量と一
致する分子量１３３６を得た。
【００２９】実施例２〜４ ｃＰＮＤ９７８、ｃＰＮＤ９５５及びｃＰＮＤ９７９の
製造 一次アミノ酸配列が異なるほかは実質的に実施例１と同
じ方法を用いて次の化合物を製造し、分子量を質量スペ
クトル分析によって確認した。
【化１４】
【００３０】実施例５ ＯＭＰＣ−ＳＨの製造 ＯＭＰＣ（３．２mg／ml）１０mlを４３，０００rpm 、
４℃で２時間遠心分離した。ＯＭＰＣ沈降物をチオール
化溶液（ＥＤＴＡ８５mg、ＤＴＴ１７mg及びＮ−アセチ
ルホモシステインチオラクトン４６mgをpH１１ホウ酸緩
衝液１０ml中で混合して調製）８mlに再浮遊させた。チ
オール化反応を室温で一晩進行させ、次にこの溶液を４
３，０００rpm ４℃で２時間遠心分離した。ＯＭＰＣ−
ＳＨを０．０１Ｍ、pH８リン酸緩衝液１０mlに再浮遊さ
せ、再び遠心分離し、０．０１Ｍ、pH８リン酸緩衝液
９．３mlに再浮遊させた。エルマン検定によりスルフヒ
ドリル力価は０．４９６μモル／mlであった。
【００３１】実施例６ ｃＰＮＤ−ＯＭＰＣ結合体による動物接種のためのプロ
トコール 一連の接種に於てミョウバンをアジュバントとして使用
した。結合体を生理食塩水に最終結合体濃度３００μg
／mlとなるよう溶解して接種物を調製した。予め調製し
たミョウバン（水酸化アルミニウムゲル）をこの溶液に
最終レベル５００μg ／mlアルミニウムとなるよう加え
た。結合体をミョウバンゲルに室温で２時間吸着させ
た。吸着後結合体を含むゲルを生理食塩水で２回洗浄
し、食塩水にタンパク質濃度３００μg ／mlとなるよう
再浮遊させた。ウサギ又はアフリカグリーンモンキーに
ミョウバンに吸着させた又はリビ(Ribi)アジュバントで
処方した結合体３００μg を３回又は１００μg を３回
個々に接種した。各投与物は筋肉内に注射した。投与物
は１ケ月離して投与した（０、４及び８週目）。動物か
らは２週間隔で採血した。血清試料を各血液から調製し
て次の実施例に記載される特異抗体の産生を検定した。
【００３２】実施例７ 血清の抗ペプチドＩｇＧ抗体に関する分析 各血清試料を酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）に
より分析する。ポリスチレンマイクロタイタープレート
を４℃に於てリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中合成ペ
プチド（ＯＭＰＣに結合していない）０．５μg ／ウェ
ルで被覆した。次に各ウェルを０．０５％トウイーン−
２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した。ＰＢ
Ｓ−Ｔで連続的に希釈した試験血清をペプチド含有ウェ
ルに加え吸着ペプチドと３６℃で１時間反応させた。Ｐ
ＢＳ−Ｔで洗浄した後アルカリ性ホスファターゼ結合ヤ
ギ抗ヒトＩｇＧを試験ウェルに加え３６℃で１時間反応
させた。次にウェルをＰＢＳ−Ｔで広範囲に洗浄した。
各ウェルに０．５mMＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏを含有する１
０％ジエタノールアミン、pH９．８中０．１％ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートを入れた。室温で３０分間付随
反応を進行させ、３．０Ｎ ＮａＯＨを加えて停止させ
た。
【００３３】試験血清中の抗体とペプチド基質との相互
作用が大きい程ウェルに結合するアルカリ性ホスファタ
ーゼの量が多くなる。ホスファターゼ酵素はｐ−ニトロ
フェニルホスフェートを４０５nmの波長に於て光を吸収
する分子物質に分解することを仲介する。従ってＥＬＩ
ＳＡ反応の最後における４０５nmに於ける吸光度とペプ
チド結合抗体量との間には直接的な関係が存在する。ｃ
ＰＮＤ−ＯＭＰＣ結合体を接種したウサギは全てペプチ
ドに特異的に結合することができる抗体を産生した。
【００３４】実施例８ 血清のＨＩＶ感染性を特異的に中和する活性に対する分
析 ウイルス中和活性をロバートソン(Robertson) 等、Ｊ．
Virol.Methods 第２０巻、１９５〜２０２頁（１９８８
年）に記載されるアッセイにより求める。この検定は試
験血清に於ける特異的ＨＩＶ−中和活性を測定する。こ
の検定はＭＴ−４細胞、ヒトＴ−リンパ細胞系がＨＩＶ
の感染を容易に受けやすくウイルス複製後感染の結果と
して死ぬという観察に基づくものである。試験血清を検
定前に５６℃で６０分処理する。この処理はＨＩＶ複製
の非特異的抑制因子を取り除くために必要である。ＲＰ
ＭＩ−１６４０細胞培養培地で連続して希釈した熱処理
血清をＨＩＶの標準感染量と混合する。この用量は検定
培養液中のＭＴ−４細胞を７〜８日後に全て殺すのに必
要とされる最少量のウイルスを含有するように検定前に
決定される。血清−ウイルス混合液を３７℃で１時間相
互作用させる。次にこれを１０％ウシ胎児血清で補足し
たＲＰＭＩ−１６４０増殖培地に浮遊させた１．０×１
０5 ＭＴ−４細胞に加える。培養液を５％ＣＯ2 雰囲気
中３７℃で７日間インキュベートする。インキュベート
の終わりに代謝色素ＤＴＴを各培養液に加える。この色
素は黄色に見える。生存細胞があるとこの色素は代謝変
換されて青く見える分子化合物となる。中和されたＨＩ
Ｖは標的ＭＴ−４細胞では増殖することができないので
細胞を殺さない。従って陽性中和は代謝色素の添加後青
色が発生することによって評価する。
【００３５】実施例９ マレイミドプロピオニルｃＰＮＤ９５５、ＭＰＰ−ｃＰ
ＮＤ９５５の製造 実施例２−４に従って製造したｃＰＮＤ９５５を次の通
りマレイミド化した。ｃＰＮＤ９５５トリフルオロ酢酸
塩（９．５mg、７０％アセトニトリル０．８ml中）の冷
却溶液に０．５Ｍ重炭酸ナトリウム溶液６１μｌ次にマ
レイミドプロピオニル（Ｎ−ヒドロキシノスクシンイミ
ド２．３mgを加えた。この溶液を氷中で１時間攪拌し反
応過程の次に逆相ＨＰＬＣ（３０％ＭｅＣＮ／０．１％
ＴＦＡ）を行った。反応物をＴＦＡ２．３μｌで反応停
止させペプチドを分取用ＨＰＬＣにより勾配０．１％Ｔ
ＦＡ中２０〜４０％ＭｅＣＮを用いて３０分かけて単離
した。２１．６〜３０．６分で溶離するピークを集め、
濃縮し、凍結乾燥した。重量９．３mg、ＦＡＢ−ＭＳ、
ｍ／ｚ１４５４、Ｍ＋Ｈ。
【００３６】実施例１０ ＭＰＰ−ｃＰＮＤ９５５とＯＭＰＣ−ＳＨの結合 ＯＭＰＣ−ＳＨ（４．３ml、０．５４６μM ＳＨ／ml）
の浮遊液にマレイミドプロピオン酸（２０４μl 、４．
６１μM ／ml、０．４当量）を激しく混合することによ
って加えた。１０分後ＭＰＰ′９５５（２６８μl 、
５．２３μM ／ml、０．６当量）の溶液を加えこの混合
液を室温で１時間熟成した。この浮遊液をpH８、０．０
１Ｍリン酸緩衝液４リットルに対して冷所で一晩透析
し、透析物を滅菌管に移した。最終容量は４．８mlであ
った。ローリータンパク質＝３．６８mg／ml、Ｎｌｅ＝
２．９nm／ml、ペプチド付加＝８．６％。
【００３７】実施例１１ ウサギに於ける結合ｃＰＮＤ９５５の免疫原性の評価 実施例１０に従って製造したＯＭＰＣ−ｃＰＮＤ９５５
を使用してウサギに０、４及び８週目に筋肉内接種した
（実施例６と同じプロトコールを用いた）。各投与量は
結合体３００μg を含有し、フロインドアジュバント
（最初の投与には完全アジュバント、次の投与には不完
全アジュバント）中で乳化させた。ＥＬＩＳＡ及びウイ
ルス中和検定は実施例７及び８に記載される通り行なっ
た。抗ペプチド抗体の高力価はＥＬＩＳＡ検定で認めら
れＨＩＶ（ＭＮ単離物）中和抗体の高力価はこの結合体
を接種した２匹のウサギの各々に認められた。
【００３８】実施例１２ 本発明の結合ペプチドによる免疫応答に於けるＨＩＶ中
和抗体の産生 本発明のペプチドは実施例６で記載した通りウサギ又は
アフリカグリーンモンキーに於てＨＩＶ中和抗体を高め
る点で活性であり次のように実施例７、８及び１１で記
載した通り分析された。
【００３９】実施例１３ ナイセリアメニンギチジスＢ１１血清型ＯＭＰＣの調製 Ａ．発酵 １．ナイセリアメニンギチジスＢ１１型 ナイセリアメニンギチジスの凍結乾燥培養物（Dr. Ｍ．
アーテンスタイン、ウォルターリード陸軍研究所（ＷＲ
ＡＩＲ）、ワシントン、Ｄ．Ｃ．から入手）を含有する
管を開けユーゴン(Eugon) ブロス（ＢＢＬ）を加えた。
菌をミュラーヒントン寒天斜面に画線し５％ＣＯ2 、３
７℃で３６時間インキュベートし増殖物を１０％スキム
ミルク培地（ディフコ）に回収し、分注して−７０℃で
凍結した。微生物の同定はＷＲＡＩＲにより入手した特
異抗血清及びディフコから入手した型別血清による凝集
によって確認した。第２継代培養菌バイアルを解凍し１
０枚のコロンビアヒツジ血液プレート（ＣＢＡＢ−ＢＢ
Ｌ）に画線した。これらのプレートを５％ＣＯ2 、３７
℃で１８時間インキュベートした後増殖物を１０％スキ
ムミルク培地１００mlに回収し、０．５mlづつ分注し、
−７０℃で凍結した。微生物は特異抗血清による凝集、
糖発酵及びグラム染色が陽性であることで同定した。こ
の継代培養菌バイアルを解凍、ミュラー−ヒントンブイ
ヨンで希釈し４０枚のミュラー−ヒントン寒天プレート
に画線した。これらのプレートを６％ＣＯ2、３７℃で
１８時間インキュベートした後増殖物を１０％スキムミ
ルク培地１７mlに回収し０．３mlづつ分注し、−７０℃
で凍結した。微生物はグラム染色、特異抗血清による凝
集及びオキシダーゼテストが陽性であることで同定し
た。
【００４０】２．発酵及び細胞ペーストの回収 ａ．接種菌の調製−接種菌を上の（継代４）ナイセリア
メニンギチジスＢ群、Ｂ−１１の１本の凍結バイアルか
ら発育させた。１０個のミュラー−ヒントン寒天斜面に
接種し６個を約１８時間後に回収し、pH６．３５のゴッ
トシュリッヒ酵母透析物培地の３本の２５０mlフラスコ
に接種するのに使用した。Ｏ．Ｄ．660０．１８に調整
しＯＤ660 １〜１．８までインキュベートした。この培
養物１mlを２リットル５本の各々に接種した。三角フラ
スコ（各々培地１リットルを含有する、以下参照）を３
７℃に於てシェーカー中２００rpm でインキュベートし
た。接種後Ｏ．Ｄ．を１時間毎に監視した。Ｏ．Ｄ．
660 １．２８のブイヨン培養物４リットルを得た。 ｂ．７０リットル種発酵槽−種培養約４リットルを用い
て完全生産培地（以下参照）約４０リットルを含有する
７０リットル滅菌発酵槽に接種した。７０リットル発酵
の条件としては３７℃、１８５rpm とし、１０リットル
／分通気し、pHを約２時間約pH７．０に一定にした。こ
のバッチの最終Ｏ．Ｄ．660 は２時間後０．７３２であ
った。 ｃ．８００リットル生産発酵槽 種培養約４０リットルを用いて完全生産培地（以下参
照）５６８．２リットルを含有する８００リットルの滅
菌発酵槽に接種した。バッチを３７℃、１００rpm でイ
ンキュベートし、６０リットル／分通気し、pHをpH７．
０に一定にした。このバッチの最終Ｏ．Ｄ．は接種１３
時間後５．５８であった。
【００４１】三角フラスコ、７０及び８０リットル発酵
槽の完全培地 ─────────────────────────────────画分Ａ Ｌ−グルタミン酸 １．５ｇ／リットル ＮａＣｌ ６．０ｇ／リットル 無水Ｎａ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／リットル ＮＨ4 Ｃｌ １．２５ｇ／リットル ＫＣｌ ０．０９ｇ／リットルＬ−システインＨＣｌ ０．０２ｇ／リットル 画分Ｂ（ゴットシュリッヒ酵母透析物）：ディフコ酵母
エキス１２８０ｇを蒸留水６．４リットルに溶解した。
この溶液を３本のＨｌＯＳＭカートリッジを含むアミコ
ンＤＣ−３０中空糸膜透析ユニット２つで透析した。Ｍ
ｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３８４ｇ及びデキストロース３２
００ｇを透析物に溶解し、全容量を蒸留水で１５リット
ルにした。pHをＮａＯＨで７．４に調整し、０．２２μ
フィルターに通過させて滅菌し、画分Ａを含有する発酵
槽に移した。 三角フラスコの場合：画分Ａ １リットルと画分Ｂの２
５mlを加え、pHをＮａＯＨで７．０〜７．２に調整し
た。 ７０リットル発酵槽の場合：画分Ａ４１．８リットルと
画分Ｂ９００mlを加えpHをＮａＯＨで７．０〜７．２に
調整した。 ８００リットル発酵槽の場合：画分Ａ５５３リットルと
画分Ｂ １５．０リットルを加えpHをＮａＯＨで７．１
〜７．２に調整した。 ｄ．回収及び不活化 発酵が完了した後別の容器にフェノールを加えこれに細
胞ブイヨンを移し、最終フェノール濃度約０．５％とし
た。生菌がなくなるまで（約２４時間）穏やかに攪拌し
ながら室温に維持した。 ｅ．遠心分離 ４℃で約２４時間後、不活化培養液６１４．４リットル
をシャープレス連続流動遠心分離機により遠心分離し
た。フェノール処理後細胞ペーストの重量は３．８７５
kgであった。
【００４２】Ｂ．ＯＭＰＣ単離工程１ 濃縮及びダイアフィルトレーション フェノール不活化培養物を約３０リットルに濃縮し、
０．１μ中空系膜フィルター（ＥＮＫＡ）を用いて滅菌
蒸留水でダイアフィルトレーションを行なった。 工程２ 抽出 同量の２×ＴＥＤ緩衝液［０．１Ｍ ＴＲＩＳ ０．０
１Ｍ ＥＤＴＡ緩衝液、pH８．５、０．５％デオキシコ
ール酸ナトリウムを含む］を濃縮透析ろ過細胞に加え
た。そのサスペンションをＯＭＰＣ抽出用温度調節タン
クに移し５６℃で３０分間攪拌した。抽出液をシャープ
レス連続流遠心分離機で約４℃に於て約１８，０００rp
m で遠心分離した。次に粘性上澄を集め、４℃で貯蔵し
た。抽出細胞ペレットを上記の通りＴＥＤ緩衝液で再抽
出した。上澄をプールし、４℃で貯蔵した。工程３ 限外濾過による濃縮 プールした抽出液をＡＧ−テック(Tech)０．１μポリス
ルホンフィルターに取り付けた温度調節容器に移した。
抽出液の温度は濃縮処理の間容器中２５℃に保持した。
試料を平均トランスメンブラン圧１１〜２４psi で１０
倍に濃縮した。工程４ ＯＭＰＣの収集及び洗浄 工程３で得た濃縮物を流速３００〜５００ml／分の連続
流遠心分離機中約７０℃、約１６０．０００xg（３５，
０００rpm ）で遠心分離し、上澄を捨てた。ＯＭＰＣペ
レットをＴＥＤ緩衝液（１９０ml緩衝液；２０ml/gペレ
ット）に懸濁させた。工程２及び工程４を２回繰り返し
た（工程３を飛ばす）。工程５ ＯＭＰＣ生成物の回収 工程４で得た洗浄ペレットを蒸留水１００mlにガラス棒
とダウンス(Dounce)ホモジナイザーで懸濁させて完全な
サスペンションにした。次にＯＭＰＣ水性サスペンショ
ンを０．２２μフィルターを通過させてフィルター滅菌
し、０．１μ中空糸膜フィルターを用いて滅菌蒸留水で
ダイアフィルトレーションしてＴＥＤ緩衝液を水に置き
換えた。
【００４３】実施例１４ ＯＭＰＣのＮ−（ブロモアセチル）−６−アミノカプロ
ン酸誘導体（ＢｒＡｃ−６−ＡＣＡ−ＯＭＰＣ）の製造 ＯＭＰＣ溶液（１０ml）（５９mg／ml）を４３Ｋrpm 、
４℃で２時間遠心分離した。ペレットをＤＯＵＮＣＥホ
モジナイザーを用いてpH９（ＫＯＬＴＨＯＦＦ）緩衝液
に再懸濁させ１mlのＮ−（ブロモアセチル）−６−アミ
ノカプロン酸ｐ−ニトロフェニルエステル溶液（アセト
ニトリル８５mg／ml）を加えた。得られた混合液を４５
時間攪拌した。低速遠心分離によって不溶性物質をペレ
ットにした後、上澄を４３Ｋrpm 、４℃で２時間遠心分
離した。そのペレットをＨ2 Ｏ１０mlに再懸濁させ、４
℃に於て４３Ｋで２時間再び遠心分離した。このペレッ
トをＨ2 Ｏ１０mlに再懸濁させてＢｒＡｃ−６−ＡＣＡ
−ＯＭＰＣを得た。アミノ酸分析は６−アミノカプロン
酸２６８ナノモル／mlとリシン１９６ナノモル／mlを示
した。タンパク質濃度は２．４mg／mlであった（４１％
回収）。ブロモアセチル化の可能性を検定するためにこ
の溶液１mlをＮ−アセチルシステアミン３０μl とpH８
で温置した。過剰の試薬を除去するために透析した後、
溶媒を蒸発させて標記化合物を得た。試料の一部を酸加
水分解し、スピンコ(Spinco)によって検定してＳ−カル
ボキシメチルシステアミン５４ナノモル／mlとリシン１
４０ナノモル／mlを示した（ＳＣＭＣ／リシン＝０．３
８）。これは存在するリシンの３８％がブロモアセチル
化部分であることを示す。
【００４４】実施例１５ ＰＲＰのシスタミン（ビス−２−アミノエチルジスルフ
ィド）誘導体（ＰＲＰ−Ｃｙｓ−ＮＨ2 ）の製造 ＰＲＰのテトラブチルアンモニウム塩（３００mg）をジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）１１mlに溶解した。次い
でカルボニルジイミダゾール３０mgを加え、この溶液を
室温（ｒ．ｔ．）で１時間攪拌した。次にＤＭＦ溶液を
シスタミン二塩酸塩（４５０mg／Ｈ2 Ｏ１０ml；ＮａＯ
ＨでpH１０．３に調整）の冷却（氷）溶液に攪拌しなが
ら加え、攪拌を氷浴中で１５分間続けた。次にこの溶液
を氷浴から除去し、透析バッグに移した後室温で４５分
間熟成した。次いで緩衝液を逐次変えて（ｖｓ．）透析
を次の通り行なった。 （ａ）ｖｓ．０．１Ｍ ＰＯ4 、pH７、４リットル
４．２時間 （ｂ）ｖｓ．０．０１Ｍ ＰＯ4 、pH７、４リットル
８時間 （ｃ）ｖｓ．０．０１Ｍ ＰＯ4 、pH７、４リットル
１６時間 （ｄ）ｖｓ．Ｈ2 Ｏ １６リットル ８時間 凍結乾燥により標記化合物、ＰＲＰのシスタミン誘導体
１５０mgを得た。この物質のＮＭＲはＰＲＰのシスタミ
ン誘導化を確認した。３ppm （ＣＨ2 −Ｓ）を中心にし
た２つのメチレン共鳴をグリコシドプロトン（５．１pp
m ）又は全ＰＲＰプロトン積分と比較することによって
４８シスタミン部分／１００リボシル−リビトールホス
フェート部分（即ちＰＲＰ単量体単位）を計算した。
【００４５】実施例１６ ＰＲＰ−ＳＨを得るＰＲＰ−Ｃｙｓ−ＮＨ2 の還元 pH８．０緩衝液（ＰＯ4 中０．０１Ｍ、ＥＤＴＡ中０．
００５Ｍ、＝緩衝液Ａ）９．０mlにＰＲＰ−Ｃｙｓ−Ｎ
Ｈ2 （製造の実施例１５参照）４０mgを加えた。完全に
溶解した後（１５分）、固形ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）４２mgを加えた。この混合液を脱気し、窒素化し、
室温で４．５時間熟成した。次にこの溶液を透析管に移
し、次のように緩衝液を変えて透析した。 （１）ｖｓ．緩衝液Ａ４リットル、１６時間 （２）ｖｓ．緩衝液Ａ４リットル、７．２５時間 （３）ｖｓ．ＥＤＴＡ（緩衝液Ｂ）中０．１Ｍ ＰＯ4
緩衝液pH８、０．００５Ｍ１リットル、１７時間 この時点でこの溶液のエルマン(Ellman)検定はチオール
力価２．０４ミリモルＳＨ／ml、従って７．５ml容量に
対して標記ＰＲＰ−ＳＨ全量１５．３ミリモルを示し
た。
【００４６】実施例１７ マレイミドプロピオニル−ＯＭＰＣ（ＭＰ−ＯＭＰＣ）
の製造 ＯＭＰＣ（３．２ng/nl)１０mlを４３，０００ＲＰＭ、
４℃で２時間遠心分離しペレットを１：１のＨ2 Ｏ：Ｍ
ｅＣＮ中重炭酸ナトリウム１．６mgの冷却溶液８mlに再
懸濁させる。マレイミドプロピオニルＮ−ヒドロキシス
クシンイミド（２．６mg）を加え、この混合液を氷中で
１時間攪拌する。０．１Ｍリン酸緩衝液pH６．２mlを加
え、この混合液を４３，０００ＲＰＭ、４℃で２時間遠
心分離する。マレイミド化ＯＭＰＣを０．０１Ｍ緩衝液
pH７に再懸濁させ、再び遠心分離し、０．１Ｍリン酸緩
衝液pH８に再懸濁させる。マレイミド含有量は一部を既
知量のＮ−アセチルシステインと反応させた後エルマン
検定で定量する。
【００４７】実施例１８ チオール化スクシノイルＯＭＰＣの製造 ＯＭＰＣ（３．２mg／ml）１０mlを４３，０００ＲＰ
Ｍ、４℃で２時間遠心分離し、ＯＭＰＣペレットをホウ
酸緩衝液pH１１、６．３mlに再懸濁させる。ＯＭＰＣサ
スペンション２mlを３本の試験管の各々に加え氷で冷却
する。コハク酸無水物（アセトニトリル中０．１Ｍ）を
各試験管に激しく攪拌しながら加える。コハク酸無水物
溶液は試験管＃１（８μl)、試験管＃２（１６μl)及び
試験管＃３（３２μl)を加える。反応物を０℃で２時間
及び室温で１時間進行させ、次にチオール化溶液（ＥＤ
ＴＡ８５mg、ＤＴＴ１７mg及びＮ−アセチルホモシステ
インチオラクトン４６mgをホウ酸緩衝液pH１１、１０ml
に混合して調製）２mlを各試験管に加える。チオール化
反応を室温で一晩進行させた後、各試験管を４３，００
０ＲＰＭ、４℃で２時間遠心分離する。各試験管から得
られるチオール化スクシノイルＯＭＰＣを０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液pH８、１０mlに再懸濁させ、再び遠心分離
し、０．０１Ｍリン酸緩衝液pH８、２mlに再懸濁させ
る。各試験管のスルフヒドリル力価をエルマン検定によ
って定量する。
【００４８】実施例１９及び２０ ペプチド、ｃＰＮＤ５０２及びｃＰＮＤ５３５及び類似
ペプチドを含有する環状γアミノ酪酸の合成 ペプチドを２方法（ｉ）Ｂｏｃ化学又は(ii)Ｆｍｏｃ化
学の１つで合成する。両方の方法を以下に示す。 Ｂｏｃ化学： 典型的にはアミノ酸樹脂０．５ミリモル
を反応容器に移し、ペプチド自動シンセサイザーに充填
する。Ｂｏｃ化学にはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によ
るアミノ酸のα−アミノ基からｔ−ブチルオキシカルボ
ニル（Ｂｏｃ）基の除去が含まれる。次にアミノ官能基
を塩化メチレンで数回洗浄した後、ジイソプロピルエチ
ルアミン（ＤＩＥＡ）で中和する。次いで樹脂上のこの
アミノ酸にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を用
いて次のアミノ酸を結合する。所望の長さのペプチドが
合成されるまでこのサイクルを繰り返す。アニソールの
ような捕捉剤の存在下無水フッ化水素酸（ＨＦ）を用い
てペプチドを樹脂から切断する。切断は約０℃で約１時
間行なう。次にＨＦを留去し、ペプチド樹脂をエーテル
で洗浄する。ペプチドを１０％酢酸で抽出し、凍結乾燥
する。次に乾燥末を逆相ＨＰＬＣにより適当な勾配を用
いて精製する。分析用ＨＰＬＣによってペプチドの純度
を分析し、質量分光法によって確認する。これらのペプ
チド全てに於て、リシン残基の側鎖アミノ官能基をフル
オレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によっ
て保護する。これは、側鎖アミノ官能基が次の工程であ
る環化に関与することを防止するためである。
【００４９】ペプチドの環化は精製ペプチドをジメチル
ホルムアミドに濃度約０．００１Ｍまで溶解することに
よって達成される。溶液のpHをＤＩＥＡで約８に調整し
た後、３当量のＢＯＰ試薬を加える。反応をＨＰＬＣで
監視する。反応が完了した時、ＤＭＦを回転蒸発器で除
去し、ペプチドを再びＨＰＬＣで精製した後凍結乾燥す
る。次にペプチドをＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理し
てＦｍｏｃ基を除去し、ペプチドをＨＰＬＣで１回以上
精製した後タンパク質に結合し、生物検定に送る。 Ｆｍｏｃ化学： Ｆｍｏｃ化学はα−アミノ基の保護基
がＦｍｏｃであってＢｏｃでない点でのみＢｏｃ化学と
異なる。Ｆｍｏｃ基は塩基活性であるのでＴＦＡの代わ
りにピペリジンによって除去する。アミノ酸のカップリ
ングはＢｏｃ化学と同様である。ペプチドの切断は９５
％ＴＦＡ、２．５％チオアニソール及び２．５％エタン
ジチオールによって達成される。切断反応は室温で約４
〜５時間行なわれる。混合液を濾過し、ＴＦＡを回転蒸
発器で除去し、ペプチドをエーテルで沈降させる。ペプ
チドをＨＰＬＣで精製した後上記の通り環化する。この
記述に従って次の環状ＨＩＶＰＮＤペプチドを合成し
た。
【化１５】 これらのペプチドの各々をマレイミド化し、チオール化
ＯＭＰＣに結合した。ｃＰＮＤ５０２−ＯＭＰＣ結合体
は１３．３％のペプチド付加となったが、ｃＰＮＤ５３
５は１２．３％のペプチド付加であった。前述の説明は
本発明の原理を教示し、実施例は具体的説明のためのも
のであるが、本発明の実施が特許請求の範囲及びその等
価物の範囲内に含まれる通常の変更、修正、改変又は削
除を全て包含することは理解されるであろう。
【００５０】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１ 他の情報：Ａｃｐ、環 ６−アミノカプロン酸のカルボキシル基がＬｙｓのαア
ミノ基と、Ａｃｐのアミノ基が遊離のＰｈｅのカルボキ
シル基と環を形成。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：２ 他の情報：Ｎｌｅ、環 Ｌｙｓのεアミノ基はコンジュゲーション用の遊離のア
ミノ基を有するＮｌｅと結合；Ｌｙｓのαアミノ基はＡ
ｃｐと環を形成。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：３ 他の情報：Ａｃｐ ６−アミノカプロン酸 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１１ 他の情報：環 Ｐｈｅのカルボキシル基がＡｃｐのアミノ基とアミド結
合；Ａｃｐのカルボキシル基がＬｙｓのαアミノ基とア
ミド結合して環を形成。
【００５１】配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１ 他の情報：Ａｃｐ、環 ６−アミノカプロン酸（Ａｃｐ）のカルボキシル基がＬ
ｙｓのαアミノ基と、Ａｃｐのアミノ基が遊離のＰｈｅ
のカルボキシル基と結合して環を形成。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：２ 他の情報：Ｎｌｅ、環 Ｌｙｓのεアミノ基は結合用の遊離のアミノ基を有する
Ｎｌｅと結合；Ｌｙｓのαアミノ基が環形成用架橋とし
てＡｃｐと結合。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１０ 他の情報：環 Ｐｈｅのカルボキシル基がＡｃｐのアミノ基とアミド結
合；Ａｃｐのカルボキシル基がＬｙｓのαアミノ基とア
ミド結合してアミド結合環を形成。
【００５２】配列番号：３ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１ 他の情報：Ａｃｐ、環 ６−アミノカプロン酸、Ａｃｐのカルボキシル基がＬｙ
ｓのαアミノ基と、Ａｃｐのアミノ基が遊離のＰｈｅの
カルボキシル基と環を形成。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：２ 他の情報：Ｎｌｅ、環 Ｌｙｓのεアミノ基がコンジュゲーション用の遊離のア
ミノ基を有するＮｌｅと結合；Ｌｙｓのαアミノ基がＡ
ｃｐとアミド結合環を形成。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：３ 他の情報：Ａｃｐ ６−アミノカプロン酸 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１１ 他の情報：環 Ｐｈｅのカルボキシル基がＡｃｐのアミノ基とアミド結
合；Ａｃｐのカルボキシル基がＬｙｓのαアミノ基とア
ミド結合してアミド結合環を形成。
【００５３】配列番号：４ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１ 他の情報：Ａｕｎｄ、環 １１−アミノウンデカン酸、Ａｕｎｄのカルボキシル基
がＬｙｓのαアミノ基と、Ａｕｎｄのアミノ基が遊離の
Ｐｈｅのカルボキシル基と環を形成。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：２ 他の情報：Ｎｌｅ、環 Ｌｙｓのεアミノ基がコンジュゲーション用の遊離のア
ミノ基を有するＮｌｅと結合；Ｌｙｓのαアミノ基がＡ
ｕｎｄと環を形成。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：３ 他の情報：Ａｕｎｄ １１−アミノウンデカン酸 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１１ 他の情報：環 Ｐｈｅのカルボキシル基がＡｕｎｄのアミノ基とアミド
結合；Ａｕｎｄのカルボキシル基がＬｙｓのαアミノ基
とアミド結合してアミド結合環を形成。
【００５４】配列番号：５ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１ 他の情報：Ａｃｐ、環 ６−アミノカプロン酸のカルボキシル基はＬｙｓのαア
ミノ基と、Ａｃｐのアミノ基は遊離のＰｈｅのカルボキ
シル基とアミド結合環を形成できる。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：２ 他の情報：Ｎｌｅ、環 Ｌｙｓのεアミノ基がＣｂｚ保護アミノ基を有するＮｌ
ｅと結合；Ｌｙｓのαアミノ基がＡｃｐのカルボキシル
基とアミド結合。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：３ 他の情報：Ａｃｐ ６−アミノカプロン酸 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１１ 他の情報：環 Ｐｈｅのカルボキシル基はＡｃｐのアミノ基とアミド結
合でき；Ａｃｐのカルボキシル基はＬｙｓのαアミノ基
とアミド結合している。
【００５５】配列番号：６ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１ 他の情報：環 Ｌｙｓのεアミノ基は複合体形成に用いることができ
る；Ｌｙｓのαアミノ基はＰｈｅのカルボキシル基とア
ミド結合して環を形成。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：２ 他の情報：Ａｂｕ γアミノ酪酸 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１０ 他の情報：環 Ｐｈｅのカルボキシル基がＬｙｓのα−アミノ基とアミ
ド結合環を形成。
【００５６】配列番号：７ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：環状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１ 他の情報：環 Ｌｙｓのεアミノ基は結合体形成に用いることができ
る；Ｌｙｓのαアミノ基がＧｌｙのカルボキシル基とア
ミド結合して環を形成。 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：２ 他の情報：Ａｂｕ γアミノ酪酸 特徴を表わす記号：modified-site 存在位置：１８ 他の情報：環 Ｇｌｙのカルボキシル基がＬｙｓのαアミノ基とアミド
結合して環を形成。 配列： Lys Xaa Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr 1 5 10 １５ Ｉｌｅ Ｇｌｙ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 リチャード エル．トルマン アメリカ合衆国，07059 ニュージャーシ ィ，ウオーレン，アッパー ウオーレン ウェイ 29

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 構造 【化１】 ｛式中 Ｒ1 はａ）水素又は ｂ）ノルロイシン、オルニチン、β−アラニン及びγア
    ミノ酪酸から選択される標識アミノ酸を任意に含むアミ
    ノ酸である。 Ｒ2 はａ）価標又はアミノ酸又は、 ｂ）２〜１７個のアミノ酸を有するペプチドである。Ｒ
    3 はアミノ酸又は２〜１７個のアミノ酸を有するペプチ
    ドである。 Ｒ7 はａ）価標又は ｂ）式−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ−（ｎは１〜２０である）
    を有する低級ヘテロアルキレンである。Ｒ8 は価標又は
    −（ＣＨ2 ）4 −である。但しＲ2 を構成する少なくと
    も１個のアミノ酸が一般式−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ
    −型を有しない場合にはＲ7 は−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ−
    でなければならない。｝を有する環状ＨＩＶ ＰＮＤペ
    プチド。
  2. 【請求項２】 構造 【化２】 ｛式中Ｒ1 は水素又はノルロイシンである。Ｒ8 は価標
    又は−（ＣＨ2 ）4 −である。Ｒ7 は価標又は−（ＣＨ
    2 ）n −ＮＨ−（ｎは１〜２０である）である。Ｒ2 は
    Ｘn Ｘ1 Ｘ2 からなり、Ｘ2 がＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒ
    ｇ配列に最も近接している。 Ｘ1 はａ）セリン、 ｂ）プロリン、 ｃ）アルギニン ｄ）ヒスチジン、 ｅ）グルタミン及び ｆ）スレオニンから選択されるＲ2 の一成分である。 Ｘ2 はａ）イソロイシン、 ｂ）アルギニン、 ｃ）バリン、 ｄ）メチオニン及び ｅ）−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ−（ｎは１〜２０であ
    る）から選択されるＲ2 の一成分である。Ｘn はＲ2 の
    一成分であり、価標、アミノ酸又は２〜１５個のアミノ
    酸を有するペプチドであり、該アミノ酸の０又は１個は
    構造 −ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ− （ｎは１〜２０である） を有する。Ｒ3 はＸ3 Ｘ4 Ｘm からなり、Ｘ3 がＧｌｙ
    ＰｒｏＧｌｙＡｒｇ配列に最も近接している。 Ｘ3 はａ）アラニン、 ｂ）アルギニン及び ｃ）バリンから選択されるＲ3 の一成分である。Ｘ4 は
    Ｒ3 の一成分であり ａ）フェニルアラニン、 ｂ）イソロイシン、 ｃ）バリン、 ｄ）ロイシンから選択される。Ｘm はＲ3 の一成分であ
    り、価標、アミノ酸又は１５個までのアミノ酸を有する
    ペプチドであり、該アミノ酸の０又は１個は構造 −ＮＨ−（ＣＨ2 ）n −ＣＯ− （ｎは１〜２０である） を有する。但し、Ｒ2 を構成する少なくとも１個のアミ
    ノ酸が一般式−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n−ＣＯ−型を有しな
    い場合にはＲ7 は−（ＣＨ2 ）n −ＮＨ−でなければな
    らない。｝を有する請求項１記載の環状ペプチド。
  3. 【請求項３】 構造 ａ）ｃＰＮＤ７２４，［配列番号１，Ｓｅｑ．Ｉｄ．：
    １：］ 【化３】 ｂ）ｃＰＮＤ９７８，［配列番号２，Ｓｅｑ．Ｉｄ．：
    ２：］ 【化４】 ｃ）ｃＰＮＤ９５５，［配列番号３，Ｓｅｑ．Ｉｄ．：
    ３：］ 【化５】 ｄ）ｃＰＮＤ９７９，［配列番号４，Ｓｅｑ．Ｉｄ．：
    ４：］ 【化６】 ｅ）ｃＰＮＤ５０２，［配列番号６，Ｓｅｑ．Ｉｄ．：
    ６：］ 【化７】 ｆ）ｃＰＮＤ５３５，［配列番号７，Ｓｅｑ．Ｉｄ．：
    ７：］ 【化８】 を有する請求項２記載の環状ペプチド。
  4. 【請求項４】 ペプチドを免疫学的担体に結合させ結合
    体の免疫学的有効量で哺乳類を免疫することを特徴とす
    る請求項１記載の環状ＨＩＶ ＰＮＤの使用方法。
JP4006576A 1991-12-19 1992-01-17 環状ｈｉｖ主要中和決定基ペプチド Pending JPH05170797A (ja)

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