JP2000229997A - 環状ペプチド及びエイズワクチン - Google Patents

環状ペプチド及びエイズワクチン

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JP2000229997A JP11032990A JP3299099A JP2000229997A JP 2000229997 A JP2000229997 A JP 2000229997A JP 11032990 A JP11032990 A JP 11032990A JP 3299099 A JP3299099 A JP 3299099A JP 2000229997 A JP2000229997 A JP 2000229997A
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cyclic peptide
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Shozo Shoji
省三 庄司
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 エイズの病原性ウイルス（ＨＩＶ−１ウイル
ス）がヒト感染時に利用する第２受容体を中和させるこ
とができる中和抗体をインビボで産出させるための立体
的な抗原を提供し、且つ該抗原を有効成分とするエイズ
ワクチンを提供する。 【解決手段】 Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒ
ｇを含むペプチド及びＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙを含むペプチドから選ばれた１種又は２種のペ
プチドを連続した構成鎖として含む環状ペプチド、及び
該環状ペプチドを有効成分とするエイズワクチン。好ま
しくは下記の式で示される環状ドデカペプチド及び該環
状ドデカペプチドを有効成分とするエイズワクチン。 【化１】 前記環状ペプチドに含まれるカルボキシル基、アミノ基
及び水酸基から選ばれた活性基は、置換基に結合されて
いることが生体内への吸収及び抗体発現において好まし
い。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＩＶ−１ウイル
スのヒト感染防止に有効な環状ペプチド及びエイズワク
チンに関する。さらに詳しくは、ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ
５と呼ばれ第２受容体を介してＨＩＶ−１ウイルス感染
を中和させることができる中和抗体を産出させるための
抗原としての環状ペプチド、及び該抗原を有効性分とす
るエイズワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】エイズの病原性ウイルス（ＨＩＶ−１ウ
イルス）がヒト感染時に利用する第２受容体（セカンド
レセプター）が１９９６年に発見されている（Yu Feng
et al., Science, 272, 872-877, 1996 ）。この第２受
容体はすでに報告されているケモカイン受容体のうちＣ
ＸＣＲ４及びＣＣＲ５と呼ばれている２種類の受容体で
ある。ＨＩＶ−１ウイルスは、どちらか一方の受容体を
利用して吸着侵入し、ヒトのリンパ球、マクロファー
ジ、樹状細胞に感染することが分かっている。
【０００３】一方、コーカサス人の約１〜２％の人々に
ＨＩＶ−１ウイルスの感染に対して抵抗性を示すことが
報告され、その原因はケモカイン受容体である第２受容
体（ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）の遺伝的欠損あるいは遺伝
的不完全性によるものであることが判明している（Rong
Liu, et al., 86, 367-377, 1996 ）。
【０００４】これらの知見から、ＨＩＶ−１ウイルスの
感染防止には第２受容体を中和させることの重要性が着
目され、近年該第２受容体を中和させることができる中
和抗体を産出させる試みがなされている。しかしなが
ら、現在までこのような中和抗体の産出に成功した報告
は見当たらない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、第２
受容体タンパク質の構成ペプチドを一平面的にとらえる
ような従来の手法を行わず、第２受容体タンパク質のル
ープ構造に着目し、立体的視点から第２受容体を中和さ
せることができる中和抗体をインビボで産出させること
ができる立体的な抗原を提供すること、及び該抗原を有
効成分とするエイズワクチンを提供することを目的とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、Ｔ−細胞系
における第２受容体（略語：ＣＸＣＲ４）及びマクロフ
ァージ系細胞における第２受容体（略語：ＣＣＲ５）の
モデルを組立て、立体的視点から観察した。そこで、第
２受容体タンパク質分子中の第２小ループを構成する２
個のペンタペプチドとして、Ｔ−細胞系由来のＧｌｕ
179 −Ａｌａ180−Ａｓｐ181 −Ａｓｐ182 −Ａｒｇ
183 と、マクロファージ系細胞由来のＳｅｒ 169 −Ｇｌ
ｎ170 −Ｌｙｓ171 −Ｇｌｕ172 −Ｇｌｙ173 が、第２
受容体を中和させることができるＨＩＶ−１ウイルス感
染抑止抗体の産出のための新規な抗原の構成要素として
利用可能であるかどうかについて着目した。
【０００７】図１は、Ｔ−細胞系の第２受容体タンパク
質分子の該細胞膜上の配置（図１左上段）と、マクロフ
ァージ系細胞の第２受容体タンパク質分子の該細胞膜上
の配置（図１右上段）と、これらの第２受容体タンパク
質分子の各第２小ループのペプチドから合成された本発
明の環状ドデカペプチドを示す。図１においてＴ−細胞
系の第２受容体タンパク質分子（ＣＸＣＲ４）は第１ル
ープ、第２ループ、第３ループ及び第２小ループからな
る立体構造を有し、またマクロファージ系細胞の第２受
容体タンパク質分子（ＣＣＲ５）も第１ループ、第２ル
ープ、第３ループ及び第２小ループからなる立体構造を
有す。
【０００８】Ｔ−細胞系の第２受容体タンパク質分子
（ＣＸＣＲ４）中の第２小ループには、アミノ酸配列Ｇ
ｌｕ179 −Ａｌａ180 −Ａｓｐ181 −Ａｓｐ182 −Ａｒ
ｇ183が含まれており、またマクロファージ系細胞の第
２受容体タンパク質分子（ＣＣＲ５）中の第２小ループ
には、アミノ酸配列Ｓｅｒ169 −Ｇｌｎ170 −Ｌｙｓ17
1 −Ｇｌｕ172 −Ｇｌｙ173 が含まれている。
【０００９】前記ＣＸＣＲ４とＣＣＲ５の両第２小ルー
プのアミノ酸配列からなる両ペプチドをスペーサアーム
ジペプチドとして−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−を介して環を形成
させて、本発明の下記の式（１）で示される新規化合物
環状ドデカペプチドを得る（図１の下段の環状ペプチ
ド）。
【００１０】
【化２】
【００１１】前記式（１）で示される環状ドデカペプチ
ドに含まれるカルボキシル基、アミノ基及び水酸基から
選ばれた活性基は、置換基に結合されていることが生体
内への吸収及び抗体発現において好ましい。このような
置換基は、ＣＨ3 （ＣＨ2 ）n −ＣＯＯＨの脂肪酸残基
（ｎ：０−２０）、及びＣＨ3 （ＣＨ2 ）n −ＯＨのア
ルコール残基（ｎ：０−２０）、並びにこれらの化合物
残基の不飽和化合物残基が選ばれ、生体親和性があるの
で好ましい。好適な脂肪酸の例には、ラウリン酸、ミリ
スチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸
及びこれらの不飽和脂肪酸が挙げられ、また、好適な高
級アルコールの例には、ラウリルアルコール、ミリスチ
ルアルコール、パルミチルアルコール、ステアリルアル
コール、エイコサノール及びこれらの不飽和アルコール
が挙げられる。
【００１２】前記式（１）で示される環状ドデカペプチ
ドはＨＩＶ−１ウイルスの感染抑止性の第２受容体中和
抗体を産出するための免疫抗原として利用できる。該免
疫抗原について次に述べる。
【００１３】該環状ドデカペプチドを固相樹脂に結合さ
せ、抗体スクリーニング用アッセイ抗原とする。一方、
マウスを免疫抗原、例えば、環状ドデカペプチド−マル
チプル抗原ペプチド（略語：ＣＤＰ−ＭＡＰ）で免疫
し、常法のハイブリドーマ法によってモノクローナル抗
体を得る。ＨＩＶ−１ウイルスの感染防止性について
は、上記方法で得られた数種のハイブリドーマ（抗体を
産生するＢ細胞と癌細胞ミエローマ細胞との融合細胞）
を得、該ハイブリドーマの培養上清を用いて常法により
抗ＨＩＶ−１ウイルス活性を測定することにより、培養
上清がＨＩＶ−１ウイルスの感染を防止することが認め
られる。
【００１４】したがって、前記式（１）で示される環状
ドデカペプチドは、ＨＩＶ−１ウイルスの感染抑止効果
を有する抗体産出のための免疫抗原として利用可能であ
るので、エイズワクチンの有効成分として有用である。
【００１５】本発明のエイズワクチンは、アミノ酸配列
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇを含むペプチ
ド及びアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙを含むペプチドから選ばれた１種又は２種のペプ
チドを連続した構成鎖として含む環状ペプチドを有効成
分とすることができる。
【００１６】本発明のエイズワクチンは、前記環状ペプ
チドを有効成分とし、該有効成分が置換基及び／又は付
加物により修飾され、或いは薬理的に許容される塩とな
っていてもよい。該薬理的に許容される塩には、塩酸、
硫酸、硝酸、亜硝酸、臭化水素酸、ヨウ素水素酸、リン
酸、有機酸が挙げられる。前記式（１）の化合物の置換
基が高級脂肪酸である場合の例を次に示す。
【００１７】
【化３】
【００１８】上記式（２）で示す環状ドデカペプチド−
ＭＡＰ１当量に９−フルオレニルメトキシルカルボニル
ジメチルスルホニウムメチルスルフェート（Ｆmoc −Ｄ
ＳＰ：商品名、Novabiochem 社製）５当量を加えて、該
環状ドデカペプチド−ＭＡＰのＫ4 のε−アミノ基をブ
ロックした後、カルボキシル基（Ｅ5 、Ｅ7 、Ｄ9 、Ｄ
10）をＥＤＣ、ＤＣＣ、ＢＯＰ等で活性化し、過剰の高
級アルコール類〔ＣＨ 3 （ＣＨ2 ）n −ＯＨ〕を加えて
エステル化する。また上記式（２）で示す環状ドデカペ
プチド−ＭＡＰのＳｅｒの水酸基を酸クロライド〔ＣＨ
3 −（ＣＨ2 ） n −ＣＯＣｌ〕法によりエステルとして
脱Ｆmoc した後、ペプチドワクチンの基材として用い
る。該ワクチンを生体に投与すると、リンパ組織に移行
し、エステルが分解され、元の式（２）で示す環状ペプ
チド−ＭＡＰとなり、該ペプチド−ＭＡＰが免疫系を活
性化し、抗体を産生し、エイズウイルスの感染を中和す
ることになる。
【００１９】本発明のエイズワクチンは、経口剤或いは
非経口剤の形態で医薬組成物として用いることができ
る。経口剤の形態は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル
剤、マイクロカプセル剤、液剤の形態が挙げられる。ま
た非経口剤の形態は、液剤の形態で主として注射液、或
いは座薬の形態で用いる。これらの製剤は、通常、周知
の製剤化補助成分、例えば、担体、賦形剤、結合剤、崩
壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等を添加することが
できる。
【００２０】その使用量は、症状、年齢により異なる
が、経口投与の場合には、一日当たり０．１〜１０００
ｍｇ／ｋｇ体重を通常成人に対して投与することができ
る。
【００２１】
【実施例】〔実施例１〕 （１）ＨＩＶ−１第２受容体２種の第２小ループ形成キ
メラ環状ペプチドの合成 ペプチドの固相合成に用いられる樹脂は、各アミノ酸残
基の保護基を傷めず、弱酸でペプチドを遊離できる２−
クロロトリシルクロライド樹脂０．２５ｍｍｏｌ（３６
８ｍｇ）を秤量して用いた。ペプチド合成はＦｍｏｃ
（９−フルオレニルメトキシカルボニル）ケミストリー
に従って、次の１）〜１２）の各Ｆｍｏｃ−側鎖保護ア
ミノ酸（１．０ｍｍｏｌ）を用いて、ペプチド合成機に
より全自動でＣ末端から合成し、Ｆｍｏｃ−側鎖保護ペ
プチド樹脂を得た。
【００２２】 １）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ ２）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル ３）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ ＯｔＢｕ：ｏ−ｔ−ブチル ４）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ ５）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ ６）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ ７）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ ８）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ ９）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ Ｂｏｃ：ベンジルオキシカルボニル 10）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ Ｔｒｔ：トリチル 11）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ ｔＢｕ：ｔ−ブチル 12）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ １．０ｍｍｏｌ ＯＢｚｌ：Ｏ−ベンジル 前記工程で得られた保護ペプチド樹脂（３００ｍｇ）を
酢酸／トリフロロエタノール／ジクロロメタン（１：
１：８）混液５ｍｌを加え、室温で３０分撹拌し、濾過
して弱酸で遊離した側鎖保護ペプチドと樹脂に分け、常
法に従って濾液にエーテルを加えて、生じた沈殿に適当
量アセトニトリルを加えて凍結乾燥した。この側鎖保護
直鎖ドデカペプチドのＣ末端Ｇｌｙのカルボキシル基と
アミノ末端Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）のアミノ基を結合させ、
環状ドデカペプチドを次のように合成した。
【００２３】側鎖保護直鎖ドデカペプチド１３０ｍｇを
１０％トリフロロエタノールを含むジメチルホルムアミ
ド溶液に溶かし、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−ト
リス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオ
ロフォスフェート（略語：ＢＯＰ）をペプチドの５倍量
加えて２４時間、室温で放置し反応させ、常法に従って
側鎖保護環状ペプチド８０ｍｇを得た。
【００２４】この側鎖保護環状ドデカペプチドをジメチ
ルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、パラジウム炭素５０
ｍｇを加えて水素ガスで２４時間接触還元し、常法に従
ってカルボキシメチル側鎖保護環状ドデカペプチド（１
５ｍｇ）を得た。なお、環状ドデカペプチドの確認は全
保護基を常法により、脱保護し、レーザーマス（ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計）で確認した。下記の表１に
レーザーマスによる環状ペプチド及び側鎖（非環状）ペ
プチドの理論値及び実測値を示した。図２に、環状ペプ
チド及び側鎖（非環状）ペプチドのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ
型質量分析スペクトルを示す。この結果（脱水縮合よ
り、環を形成し、水分子質量１８が減少する）より環状
ドデカペプチドを確認した。
【００２５】
【表１】
【００２６】（２）環状ドデカペプチド−ＭＡＰ（略
語：ＣＤＰ−ＭＡＰ）からなる免疫抗原の調製 カルボキシメチル側鎖保護環状ドデカペプチド（略語：
ＣＭ−ＳＢＣＤＰ）のカルボキシル基とＭＡＰ−樹脂の
４分枝ポリリジンのアミノ基をＢＯＰ法により次のよう
にして結合させた。
【００２７】ＭＡＰ−樹脂（０．４６ｍｍｏｌ ４分枝
ポリリジン／樹脂）７０ｍｇ（３２μｍｏｌ）をジメチ
ルホルムアミドで膨潤させ、２０％ピペリジン／ジメチ
ルホルムアミド（略語：ＤＭＦ）１０ｍｌで３回、ＭＡ
Ｐ−樹脂の脱保護（脱Ｆｍｏｃ）を行い、イソプロパノ
ール５ｍｌで3 回洗浄し、イソプロパノールを除去して
４分枝ポリリジンのアミノ末端を露出させた。このＭＡ
Ｐ−樹脂にカルボキシメチル側鎖保護環状ドデカペプチ
ドジメチルホルムアミド溶液１０ｍｌ（３２μｍｏｌ）
を加え、ＢＯＰ法で結合させた。側鎖保護環状ドデカペ
プチド（略語：ＳＢＣＤＰ）−ＭＡＰ−樹脂に対して常
法に従ってトリフルオロ酢酸（略語：ＴＦＡ）でペプチ
ドを切り離し、環状ドデカペプチド−ＭＡＰ（略語：Ｃ
ＤＰ−ＭＡＰ）１２ｍｇを得て、抗環状ドデカペプチド
（略語：Ａｎｔｉ−ＣＤＰ）モノクローナル抗体を調製
するための免疫抗原とした。
【００２８】（３）抗環状ドデカペプチド（Ａｎｔｉ−
ＣＤＰ）モノクローナル抗体を調製するためのアッセイ
用抗原であるＣＤＰ−ピン樹脂（クラウン樹脂）の調製 抗ＣＤＰ単クローン抗体を培養液上清から効率よく作出
するためのアッセイ用抗原は、次のようにして調製し
た。エピトープスキャニングキットマニュアル（Chiron
Mimotopes Pty Ltd, Clayton，Victoria，Australia
）に従って、側鎖保護環状ドデカペプチドをピン樹脂
（クラウン樹脂）の先端のβ−Ａｌａに結合させて、Ｃ
ＤＰ−ピン樹脂（クラウン樹脂）を得た。
【００２９】（４）モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの調製 免疫抗原ペプチドとして環状ドデカペプチド−ＭＡＰを
用いてＢａｌ／ｃマウスを基礎免疫し、常法に従い骨髄
腫細胞（Ｐ３Ｕ１）とポリエチレングリコールを用いて
細胞融合を行った。融合後、ＨＡＴ培地で選別培養し、
ハイブリドーマ細胞がコロニーを形成したウエルについ
て、その培養上清中の抗体価を抗原ペプチドを用いたマ
ルチ−ピンエライザ法により測定し、抗体陽性と判断し
た細胞群を限外希釈により２回クローニングを行い、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを常法に従い確立
した。基礎免疫は、免疫抗原ペプチド凍結乾燥品を１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（−）に溶解し、これと免疫賦
活化剤であるＦｒｅｕｎｄ完全アジュバンド（ＦＣＡ）
またはＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバンド（ＦＩＡ）と
１：１．２〜１：１．４の比率で混和し、調和したエマ
ルジョンを用いた。このエマルジョンを１週間毎に１
回、計４回４００μｌ／マウスの用量で腹腔投与を行っ
た。最初の２回はＦＣＡ、後の２回はＦＩＡとのエマル
ジョンを用いた。最終免疫は、基礎免疫終了後１カ月経
過してから、免疫抗原ペプチド（ＭＡＰ）凍結乾燥品を
２００μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（−）に溶解したもの
を用い、２００μｌ／マウスの用量で尾静脈より投与し
た。
【００３０】脾細胞の調製及び細胞融合 脾細胞の調製及び細胞融合は常法に従って行った。最終
免疫から３〜４日後にマウスを瀉血致死させ、脾細胞を
摘出し、ＨＢＳＳ中でほぐして、溶血バッファー処理及
び遠沈により赤血球を除去したものを脾細胞とした。Ｐ
３Ｕ１：脾細胞＝１：８〜１：１０の比率で混合し遠沈
を行い、得られたペレットにポリエチレングリコール溶
液を添加することで融合を行った。融合処理後、ＨＡＴ
培地に穏やかに懸濁したものを４８ウエルプレートにま
き、３７０℃で融合細胞がコロニーを形成するまで培養
を行った。
【００３１】抗体産生ハイブリドーマのスクリーニン
グ 特異抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、免疫
抗原ペプチドを固相化抗原として用いるエライザ法によ
る一次スクリーニング及びマルチ−ピンペプチドを固相
化抗原として用いる二次スクリーニングを連続して行う
ことにより、目的ハイブリドーマを選別した。エライザ
には、一次抗体としてハイブリドーマの培養上清、二次
抗体としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩ
ｇＧ、発色基質としてＴＭＢＺ（3 ，3 ’，5 ，5 ’一
テトラメチルベンジジン）、及び発色停止液として０．
３Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 を用い、主波長４５０ｎｍ、参照波長
６３０ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】目的抗体産生ハイブリドーマのクローニ
ング スクリーニングアッセイで高い抗体価を示したモノクロ
ーナルハイブリドーマ株を、１個／ウエルになるように
限外希釈を行い、マウス胸腺より調製した支持細胞とと
もに９６ウエルプレートにまき培養を行った。２回クロ
ーニング操作を行ない得られたモノクローナル細胞群に
関して、抗原ペプチドを用いたマルチピンエライザによ
るスクリーニングを行ない、両者のエライザにおいて最
も高い抗体価を示した細胞株をモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマとし、その培養上清からモノクローナル
抗体を常法にしたがって精製した。本モノクローナル抗
体のサブクラスはＩｇＭκであった。このハイブリドー
マは、平成１１年２月３日に工業技術院生命工学技術研
究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７１９８として寄託さ
れている。確立した細胞は拡張し、培養後、液体窒素タ
ンク中で凍結保存した。
【００３３】（５）抗ＨＩＶ活性の測定 抗ＨＩＶ活性は前田らの方法（Y.Maeda, et al．12th W
orld AIDS ConferenceGeneva, Abstract P4, June 28-J
uly 3, 1998）に従って測定した。本発明者が作出した
抗ＣＤＰモノクローナル抗体を産生する細胞の培養液及
びその対照として本抗体を産生しない同細胞の同条件下
における培養液を用いた。本抗体を含む培養液（２００
ｍｌ）は、ＨＩＶ−１ウイルスの感染率を対照と比較し
て、３０分で対照の６１％、６０分で３５％に低下さ
せ、ＨＩＶ−１ウイルスの感染性を阻害することが認め
られた。
【００３４】
【発明の効果】本発明の環状ペプチドは、新規化合物で
あり、ＣＸＣＲ４及び／又はＣＣＲ５と呼ばれ第２受容
体を介してＨＩＶ−１ウイルス感染を中和させることが
できる中和抗体（抗ＨＩＶ−１ウイルス活性のある抗
体）を生体内で産出させるための抗原として有用であ
り、また、エイズワクチンの有効成分として有用であ
る。
【００３５】
【配列表】 <110> Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Cyclo dodecapeptide and aids vaccine <130> NSM0034 <160> 1 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> peptide <221> chain <300> <301> Shozo Shoji <302> Synthesis of Cyclo-oligo peptide and its biological aictivity <303> Japan Pharmacology Academy Kyushu branch Mass meeting Lecture summary collection <306> 43 <307> 1998-11-10 <400> Arg Asp Asp Ala Glu Gly Glu Lys Gln Ser Asp Gly 5 10
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｔ−細胞系の第２受容体タンパク質分子の細胞
膜上の配置（左上段）と、マクロファージ系細胞の第２
受容体タンパク質分子の該細胞膜上の配置（右上段）
と、これらの第２受容体タンパク質分子の各第２小ルー
プのペプチドの配列を基にして合成した本発明の環状ド
デカペプチドを示す。
【図２】環状ペプチド及び側鎖（非環状）ペプチドのＭ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析スペクトルを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１１年９月１７日（１９９９．９．１
７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】側鎖保護直鎖ドデカペプチド１３０ｍｇを
１０％トリフロロエタノールを含むジメチルホルムアミ
ド溶液に溶かし、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキ
シ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサ
フルオロフォスフェート（略語：ＢＯＰ）をペプチドの
５倍量加えて２４時間、室温で放置し反応させ、常法に
従って側鎖保護環状ペプチド８０ｍｇを得た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】脾細胞の調製及び細胞融合 脾細胞の調製及び細胞融合は常法に従って行った。最終
免疫から３〜４日後にマウスを瀉血致死させ、脾細胞を
摘出し、ＨＢＳＳ中でほぐして、溶血バッファー処理及
び遠沈により赤血球を除去したものを脾細胞とした。Ｐ
３Ｕ１：脾細胞＝１：８〜１：１０の比率で混合し遠沈
を行い、得られたペレットにポリエチレングリコール溶
液を添加することで融合を行った。融合処理後、ＨＡＴ
培地に穏やかに懸濁したものを４８ウエルプレートにま
き、３７℃で融合細胞がコロニーを形成するまで培養を
行った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】抗体産生ハイブリドーマのスクリーニン
グ 特異抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、免疫
抗原ペプチドを固相化抗原として用いるエライザ法によ
る一次スクリーニング及びマルチ−ピンペプチドを固相
化抗原として用いる二次スクリーニングを連続して行う
ことにより、目的ハイブリドーマを選別した。エライザ
には、一次抗体としてハイブリドーマの培養上清、二次
抗体としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩ
ｇＧ、発色基質としてＴＭＢＺ（3 ，3 ’，5 ，5 ’−
テトラメチルベンジジン）、及び発色停止液として０．
３Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 を用い、主波長４５０ｎｍ、参照波長
６３０ｎｍの吸光度を測定した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】（５）抗ＨＩＶ活性の測定 抗ＨＩＶ活性は前田らの方法（Y.Maeda, et al．12th W
orld AIDS ConferenceGeneva, Abstract P4, June 28-J
uly 3, 1998）に従って測定した。本発明者が作出した
抗ＣＤＰモノクローナル抗体を産生する細胞の培養液及
びその対照として本抗体を産生しない同細胞の同条件下
における培養液を用いた。本抗体を含む培養液（２００
μｌ）は、ＨＩＶ−１ウイルスの感染率を対照と比較し
て、３０分で対照の６１％、６０分で３５％に低下さ
せ、ＨＩＶ−１ウイルスの感染性を阻害することが認め
られた。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アミノ酸配列Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
    Ａｓｐ−Ａｒｇを含むペプチド及びアミノ酸配列Ｓｅｒ
    −Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙを含むペプチドから
    選ばれた１種又は２種のペプチドを連続した構成鎖とし
    て含む環状ペプチド。
  2. 【請求項２】 下記の式で示される環状ペプチド。 【化１】
  3. 【請求項３】 前記環状ペプチドに含まれるカルボキシ
    ル基、アミノ基及び水酸基から選ばれた活性基が置換基
    に結合されている請求項１又は２記載の環状ペプチド。
  4. 【請求項４】 前記置換基が、 ＣＨ3 （ＣＨ2 ）n −ＣＯＯＨの脂肪酸残基（ｎ：０−
    ２０）、及びＣＨ3 （ＣＨ2 ）n −ＯＨのアルコール残
    基（ｎ：０−２０）、並びにこれらの化合物残基の不飽
    和化合物残基から選ばれたものである請求項３記載の環
    状ペプチド。
  5. 【請求項５】 請求項１記載の環状ペプチドを有効成分
    とするエイズワクチン。
  6. 【請求項６】 請求項２記載の環状ペプチドを有効成分
    とするエイズワクチン。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003516940A (ja) * 1999-11-15 2003-05-20 モニケイド・コーポレイション ケモカイン受容体に対するヒトＩｇＭ抗体
WO2006057339A1 (ja) * 2004-11-25 2006-06-01 Mitsubishi Pharma Corporation 抗体の製造方法
JP2010506575A (ja) * 2006-10-19 2010-03-04 ゲルハルト，マルクス ピロリ菌感染を治療するための新規の方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2389196A1 (en) 1999-10-28 2001-05-03 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. Cyclic peptides and aids vaccines

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2058876A1 (en) * 1991-12-19 1993-06-20 Maria A. Bednarek Cyclic hiv principal neutralizing determinant peptides
JPH0827184A (ja) * 1994-07-15 1996-01-30 Nippon Paper Ind Co Ltd ペプチド化合物、及びその製造方法、並びに抗ヒト免疫不全ウイルス剤
AU3390297A (en) * 1996-06-14 1998-01-07 Aaron Diamond Aids Research Center, The Uses of a chemokine receptor for inhibiting hiv-1 infection
US6388055B1 (en) * 1996-10-03 2002-05-14 Smithkline Beecham Corporation Mouse CC-CKR5 receptor polypeptide

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003516940A (ja) * 1999-11-15 2003-05-20 モニケイド・コーポレイション ケモカイン受容体に対するヒトＩｇＭ抗体
WO2006057339A1 (ja) * 2004-11-25 2006-06-01 Mitsubishi Pharma Corporation 抗体の製造方法
JP2010506575A (ja) * 2006-10-19 2010-03-04 ゲルハルト，マルクス ピロリ菌感染を治療するための新規の方法
US9090676B2 (en) 2006-10-19 2015-07-28 Imevax Gmbh Method for treating Helicobacter pylori infections
US9821048B2 (en) 2006-10-19 2017-11-21 Imevax Gmbh Method for treating Helicobacter pylori infections

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