CN100387616C - 获得可增强特异交叉反应性的抗原结构的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种获得具有高交叉反应性的抗原结构的方法，该结构能增强对全身和/或粘膜施用的肽抗原的免疫应答；还涉及利用该方法获得的化学结构，和从该结构获得的制剂及其用途。本发明描述的方法能够从树状体的选择和合成开始，获得与载体分子偶联的新的抗原结构。得到的结构能够方便地辅佐使用或者在导入了多种抗原的制剂中使用。对于交叉反应性和免疫原性，这些成份间有协同效应。而且，这些制剂可以含有稳定剂和保藏剂。本发明的抗原结构能在制药业中作为疫苗制剂，用于预防或治疗人类和动物疾病，以及用于诊断系统。

Description

获得可增强特异交叉反应性的抗原结构的方法
技术领域
本发明涉及医学的分支，特别是基于可增强交叉反应性的新抗原结构的疫苗制剂。
现有技术
肽的免疫原性较低，因此为了产生特异性抗体，它们必须与提供所需T细胞帮助的载体蛋白偶联(Herrington，D.A.等人，1987Nature328：257-259)。在肽与载体蛋白偶联的过程中，由于非特异性结合，抗原性可能丢失。肽能与载体蛋白在目的表位的主要部分上偶联。为了避免与肽偶联有关的问题，描述了另一种向免疫系统递呈肽的方法。例如多抗原肽(MAP)，其基于B和T细胞表位掺入赖氨酸的分支核心中(Tam，J.P.等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.86：5409-54132-5)(Tam，J.P.1989 Methods Enzymol.168：7-15)(Tam，J.P.1990WO 90/11778)(Tam，J.P.1993WO 93/03766)。该系统的主要优点是其结构和确定的组成，以及目的表位相对于总分子的高比例。在一些免疫学研究中，MAP好于肽的偶联(Wang，C.Y.等人，1991 Science254：285-288)。但是不总是如此，因为在其它研究中曾经出现相反的情况(Riley，E.M.等人，1996 Veterinary Immunology andImmunopathology 55：243-253)，这可能是与载体蛋白有关的现象。
以前已经描述了合成肽的交叉反应性和中和(Wang，C.Y.等人，1991 Science 254：285-288)。几名研究人员也曾经报道，抗HIV-1 V3区的抗肽抗体对不同现场分离物表现出交叉中和(Wang，C.Y.等人，1991 Science 254：285-288)。总之，交叉中和和反应性与肽的结构有关，例如，HIV-1的V3环的肽。
MAP策略已经用来在人体中产生抗V3的中和反应(Geoffrey，J.等人，1996 Journal of Infectious Diseases，173：330-3398)。该方法的缺点在于，为了获得中和作用，必须接种过量(500μg)的MAP(Kahn，J.等人，1994，第十届国际AIDS大会，横滨，日本，8月7-12日，第1卷)(Li，D.等人，1997 seized Pac J Allergy Immunol.15：105-13)。发现MAPs的混合物基于不同V3的选择，寻找临床分离物的最广谱中和，必需的MAP总微克数，这与常规的免疫实施不同。
交叉反应性定义为具有可与相关配体反应的免疫原的能力(Paul，Fundamental W.Immunology，第4版)。尽管交叉反应现象在免疫学开创时即已知，但直到现在，任何疫苗制品都基于交叉反应性。这或许解释了免疫计划中使用的大多数疫苗为什么不能保护对抗在几种临床分离物间具有高变异性的病原体。
同源肽之间的交叉反应性是每种序列的特性。根据向免疫系统递呈肽的形式，能得到增强。免疫原性提高引起交叉反应性增强并不明显。在应用T-B肽的研究中证明，具有交叉反应性和/或中和的抗体的诱导与肽的免疫原性无关(Kasmi，K.C，等人，1998 molecularImmunology 35：905-918)。
为了获得能识别病原体的大多数抗原变体的免疫应答，产生了不同的策略。其中之一包括对更重要的变体设计多表位重组多肽(MEPr)。B表位在MEPr系统中的递呈不总是一个可变项(Flynn，J.N，等人，1997J Virol 71：7586-92)。首先，嵌合多肽的产生意味着不必适当暴露所有表位的不可预测的三维结构的产生。这种设计更有利于对某些表位的应答，或者完全阻止对其它表位的应答。另一方面，在不同表位中将具有优势也是不可预测的。另一种策略是作为免疫原的肽库的产生。获得高可变区的肽库。它代表大量肽序列。然而，它具有每种表位代表性太差的困难。它在大量不同序列中稀释，这使得所需水平的免疫应答不可预测(Allen，D.等人，1998J.of Virol.27：651-659)(Jerome，E.等人，1994 Eur.J.Immunol.24：2789-2795)。
另一种策略是在HIV的情况中，为了覆盖广谱V3序列，产生共有序列肽。这基于现场分离物或临床分离物的表位变异性的研究，将每一位置定位于所有分离物中更保守的氨基酸(Holley，L.H.等人，1991Proc.Natl.Acad.Sci.88：6800-6804)。
发明内容
本发明的技术目的是发展一种获得高交叉反应性抗原结构的方法，它能提高通过全身和/或粘膜途径施用的肽抗原的免疫原性。该方法产生与载体蛋白以适当比例偶联的树状体(dendrimer)结构。加入携带其它B表位的类似结构可提高交叉反应性。除此之外，同时施用的抗原的免疫原性也得到提高。能够向该制剂中加入其它抗原和佐剂。
因此，本发明的目的之一是一种合成能提高特异交叉反应性的抗原结构的方法。
上述方法包括下列步骤：
A)目的表位的选择；
B)利用合成法获得含有步骤(A)选择的表位的树状体结构，该合成法可以是在赖氨酸或天冬氨酸核心上的合成；在有机分子核心上的合成；在树状体核心上的合成；于树状体核心上的肽偶联；或者B细胞表位、T细胞表位或此两者在单个核心上的混合；
C)利用偶联法使步骤(B)中获得的一个或几个树状体结构与一个或几个载体分子偶联，该偶联法能使用戊二醛、琥珀酸酐、β-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(ester of theβ-maleimidopropionic-N-hidroxisuccinimic acid)(MPS)，或者不含芳香侧链的间隔剂，因为这些基团可避免偶联的树状体结构的识别；
D)为了获得制剂，通过加入CD4结合肽或含有该表位的偶联物(它们可增强产生的抗原结构的交叉反应性和免疫原性)，混合步骤(C)中获得的偶联物；最后
E)用明矾或任何合适的佐剂辅佐。
在本发明的方法中，在步骤(B)中获得的结构的肽可以是来自HIV1或HIV2的区，更具体地是如同V3环的可变区。
也能使用来自其它病毒(如HCV、HBV和登革病毒)，具有一定变异性的区。
能使用来自脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)多糖区的其它抗原，或来自多糖抗原的模拟肽，或来自微生物或病原体的其它任何区。
另外，本发明的方法也能使用来自自身抗原或癌症疫苗相关抗原的区，例如，来自促性腺素释放激素的区。
能在本发明的方法中使用的载体蛋白包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、脑膜炎奈瑟球菌p64K蛋白、HIV核心抗原、乙型肝炎病毒核心抗原。多糖分子如葡聚糖也能用于同样目的。
本发明的方法包括步骤(B)中获得的一个或几个树状体结构与一个或几个载体分子通过共价结合或静电或疏水相互作用偶联。
本发明的另一个目的是利用上述方法获得的抗原结构，它能增强所含表位的特异交叉反应性。它包含以上描述为树状体抗原的表位，它们与占终结构1-30％的载体蛋白偶联。
所选择的表位可以是多糖或肽性质的。肽可以是根据亚型、亚组、血清型或者任何分类选择的可变区的共有序列肽。另外，它们也可以是来自微生物的肽库或模拟肽。
具体而言，树状体中的肽可以是HIV1或HIV2的可变区，位于V3环中；来自其它病毒如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和登革病毒，具有一定变异性和多样性的区。
这些结构包括来自脑膜炎奈瑟球菌的多糖区的抗原，多糖抗原的模拟肽或来自微生物或病原体的任何区。
另外，本发明的抗原结构也能使用自身抗原或癌症疫苗相关抗原的区，例如，来自促性腺素释放激素的区。本发明的方法能使用的载体蛋白包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、脑膜炎奈瑟球菌p64K蛋白、HIV核心抗原、乙型肝炎病毒核心抗原。多糖分子如葡聚糖也能用于相同目的。
本发明也涉及所述抗原结构用于传染病、自身免疫病或癌症疾病的诊断或预防或治疗性疫苗制剂的用途，它们能通过全身途径接种。
特别地，已证明对于V3环，加入在相同结构上含有CD4结合肽的偶联物--旨在增加抗可变区的肽的交叉反应性抗体，能大大提高交叉反应和交叉中和。
加入这些结构增强了抗-V3交叉反应和共同施用的抗原的免疫原性。实际上，该方法使交叉反应性抗体在基于它们的疫苗策略中出现变得更容易，但也不排除它在疫苗策略中只是提高同源肽的免疫原性的用途。
本发明提供了一种获得新化学结构的方法，基于来自变异微生物的B细胞表位向免疫系统的不同递呈。这种变异性可能与致病性有关。另外也能使用能引发保护性免疫应答的非变异性B细胞表位，以及来自细胞抗原的B细胞表位。它们全都在载体蛋白上的树状体结构中，能提高它们的交叉反应和免疫原性。
所述方法允许以非常规方法产生具有较高表位密度的疫苗抗原，它能提高免疫原性和抗肽交叉反应性。除了已经描述的新特征之外，由于不同的递呈，本方法也允许减少树状体结构的量，而产生较高的抗体效价。
重要地指出，对于来自可变区的肽，能提高交叉反应性而对其免疫原性没有任何影响，如实施例所述。
另一方面，该方法允许将不同的树状体结构与同一载体偶联。同样证明，本发明的结构与含有CD4结合肽的类似结构的混合物能提高抗V3免疫原性和交叉反应性。
该新结构可能含有只含B细胞表位的树状体部分，因为载体提供T细胞表位。用作疫苗成分的MAP结构不需使用载体，该结构的T细胞表位能任选地包含于合成部分或载体中。这一策略使B细胞表位能更好地递呈，因为它们不在紧密的簇中。利用与载体蛋白偶联的树状体，使用相对于单独的树状体(如MAPs)少量的免疫原，也能提高交叉反应和/或免疫原性。
最后，在这些偶联物的混合物中，免疫原性和交叉反应显示协同作用。
本发明的制剂能通过粘膜途径接种，通过这一今天极其重要的途径能使该技术实现其用途。
实施例
实施例1：获得抗原结构的方法
以前已经大体上描述了肽、MAPs和树状体的合成(Tam，J.P.等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.86：5409-5413)(Shao J.等人，1995J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899)。树状体结构与载体蛋白交联获得抗原结构。这利用琥珀酸酐(SA)作为间隔剂(spacer agent)进行.它允许通过氨基与两种抗原共价连接。为此，在pH 8.5的缓冲液中用琥珀酸酐活化载体蛋白30分钟。然后，透析除去反应性残余物，以避免在树状体分子(MAP)与不希望的肽之间的交联。通过用ECDI(可溶性碳二亚胺)活化蛋白质的羧基进行偶联。随后加入合成抗原。这些偶联物的分离通过凝胶过滤进行.最后，利用AcM和小鼠血清通过ELISA和Western Blotting表征。
实施例2：利用不同间隔剂获得抗原结构的方法
利用不同间隔剂实现抗原结构的获得。获得良好免疫质量的偶联物的一个必要条件是远离对于表位至关重要的残基进行蛋白质的结合。为了避免这一现象，使用不同的间隔剂：戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、碳二亚胺、β-马来亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MPS)、琥珀酸酐等。在免疫过程中，可能会产生抗载体蛋白和/或偶联剂的抗体。理想的是，一种良好的偶联剂应当不产生任何抗自身的抗体应答。
已经发现，对利用间马来亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)或β-马来亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MPS)或琥珀酸酐与两种不同载体蛋白偶联的，来自HIV-1 JY1分离物、基于V3的合成多抗原肽(MAP)的抗体应答显示不同的行为。在使用琥珀酸酐间隔剂的情况中观察到出色的抗-JY1应答，对偶联剂没有强烈应答。相反，MBS导致对偶联剂有强烈应答的抗体应答总体消除。这一结果证明，不是文献中报道的所有间隔剂都显示相同的行为，表明在获得这类抗原结构的过程中，现有技术中描述的间隔剂的应用并非显而易见。
实施例3：新树状体结构的设计、合成以及与HBsAg的偶联
考虑到前述抗原结构(即MAP-蛋白质偶联物)产生抗目的肽的高效价，合成了新的树状体结构。这次不需要Th表位，因为载体蛋白提供此表位。因此这些结构的合成变得更加容易，将包含更长的B细胞表位，并且由于B和Th表位之间的共线性避免了不希望的3D结构。如实施例1所述，树状体分别与HBsAg偶联。参考J.Tam等人，(1988)合成MAP。之后通过凝胶过滤层析分离树状体结构和偶联物，用考马斯法测定其浓度。
实施例4：免疫增强和交叉反应性提高的研究
为了研究MAP与载体蛋白偶联对免疫原性和交叉反应的影响，两组各10只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠经皮下途径用FCA/FIA免疫。分组如下：1，MAP8(TT-JY1)；2，HBsAg-MAP8(TT-JY1)。分别接种50μg和10μg的剂量。小鼠在第0-14-28-40天免疫，在第36天和第51天采血。如实施例1所述用琥珀酸酐作为间隔剂获得HBsAg-MAP8(TT-JY1)。MAP8(TT-JY1)具有8个拷贝的T细胞表位，来自破伤风毒素(TT)的氨基酸830-844，和8个拷贝的B细胞表位，包含来自HIV-1JY1分离物gp120 V3区的中心15个氨基酸(Cruz，L.J.等人，2000Journal of Peptide Science 6：217-224)。在第三次和第四次施用后，研究抗JY1表位和其它V3肽的抗体应答。利用与BSA偶联的肽，通过间接ELISA定量血清中的IgG应答(Gómez，C.E.等人，1998J.Virol.Methods.71：7-1618)。混合血清以100-1稀释使用。
利用Student检验进行统计分析。概率值低于0.05认为统计学显著，低于0.01认为非常显著。
在第三次施用后，尽管接种少5倍量偶联物，同源肽没有发现免疫原性不同。因此，利用偶联物能极大地节约抗原，这是一个重要优点(图1A)。在HBsAg-MAP8(JY1-TT)免疫组中，出现与其它V3肽的交叉反应，这与接种MAP8(TT-JY1)的小鼠相反，它们不是交叉反应性的，尽管能达到类似的抗体应答水平。在4次施用后，HBsAg MAP8(TT-JY1)比MAP8(TT-JY1)诱导更强的对JY1表位的应答。在MAP8(TT-JY1)组中产生一定的交叉反应性抗体，与HBsAg-MAP8(JY1-TT)相比数量有限。免疫原性的提高非常重要，因为曾经报道了用MAP混合物(cocktails)产生抗几种表位的抗体。然而，获得希望的作用(即中和等)所需的总量在某些情况中由于可能的副作用也许不能允许接种人类。因而，用有限量的抗原诱导强烈的抗体应答是非常重要的。因此，该方法中所述的这些结构(即MAP-载体蛋白偶联物)的优点是显然的。考虑到使用少量的抗原，能引发宽范围的交叉反应性应答，因而可降低混合物中接种的可变表位的量。最后，当载体本身是一种保护性免疫原如HBsAg时，使用这些偶联物将是一种产生双价疫苗的方法。
实施例5：用MAP8(TT-JY1)和TAB9免疫的小鼠的体液应答研究
为了研究与向免疫系统(I.S.)递呈JY1表位有关的差异，在单个实验中比较了重组蛋白TAB9((Duarte，C.A.等人，1994 AIDS Res HumRetroviruses.10：235-243)，含有来自几种HIV-1分离物的V3肽；依次为LR150，JY1，RF，MN，BRVA和IIIB.它们有15个氨基酸长，包括V3环的中心部分)和MAP8(TT-JY1)。研究了对TAB9中包含的V3肽的识别，利用横跨整个JY1序列的Ala替换肽通过表位作图估计了差异。当序列中存在Ala时，它被Gly替换。两组各10只6-8周龄雌性Balb/c小鼠用CFA/IFA中的100μgTAB9蛋白和16.4μgMAP8(TT-JY1)经皮下途径免疫。使两种免疫原的量在JY1表位的量上相等。小鼠在第0、14、28、56天免疫，在第67天采血。血清的抗-JY1 IgG应答通过ELISA测定。
用Student检验进行统计学分析。概率值低于0.05认为统计学显著，低于0.01认为非常显著。
为了研究与V3肽的交叉反应，利用与BSA偶联的肽通过间接ELISA定量血清的IgG应答(Gómez，C.E.等人，1998J.Virol.Methods.71：7-1618)。混合血清100-1稀释使用。
以前Ronald Frank(Frank，R.1992 Tetrahedron 48：9217-9232)描述了纤维素膜上的表位作图。
四个剂量后用几种V3肽检测来自各组的混合血清。发现MAP8(TT-JY1)免疫的小鼠能检测所测5种V3中的4种(LR150，RF，MN，BRVA)。其中3种(RF，MN，BRVA)具有高于1.25的吸光度值(A492nm)，为强反应性。特别是对于RF肽，A492nm高于2.5。上述结果说明了MAPs对于向免疫系统递呈B细胞表位的优点。对于含有所有肽的TAB9蛋白，所检测的两种肽(RF和BRVA)不被识别。肽MN和IIIB检测到极低的A492nm值，低于0.75。只有JY1和LR150肽以极高的A492nm值识别。我们的结论是，MAP向免疫系统递呈使得与免疫原中不含的其它V3肽出现交叉反应成为可能。因此，涉及总体同源序列的策略中所包括的抗原的量将被优化。TAB9蛋白的结果证明，重组蛋白中含有几种序列不总是可行的技术方案。实际上，MAP8(TT-JY1)显示更好的应答。
为了找出向免疫系统递呈表位的不同，利用来自JY1序列的重叠和Ala替换肽进行表位作图。发现来自两组的混合血清识别同一氨基酸序列，LGQALY。对于MAP8(TT-JY1)组，氨基酸L-Q--Y直接参与了与抗体的相互作用.相反，对于TAB9，氨基酸L-Q-LY主要参与。只有一个氨基酸的细微差异似乎是对所测V3肽的识别不同的原因。但是能推测出表位显示于这两种免疫原的不同3D结构中。总之，与MAP相比，TAB9蛋白中的肽不同地暴露于免疫系统。该实验证明这种不同的暴露是这两种免疫原交叉反应性分布图的原因。
实施例6：向免疫系统递呈肽的不同方式之间的免疫原性比较
为了估计向免疫系统递呈肽的几种方式的免疫原性，接种9组各8只雌性Balb/c小鼠。动物在第0-14-28天免疫，并在最后一次免疫10天后采血。所有数据均总结于表2中。MAP4(TT-JY1)含有4个B细胞表位(全部都是JY1)和4个T细胞表位(全部都是TT830-844)。该肽(TT-JY1)含有串联的B(JY1)和T(TT)细胞表位。通过聚合由在上述肽两端添加的Cys合成线性聚合物(Cruz，L.J.等人，2000Biotecnologia Aplicada 17：35-38)。此肽也在葡聚糖珠表面合成。HBsAg-肽(TT-JY1)、HBsAg-MAP4(TT-JY1)和HBsAg-MAP8(TT-JY1)如实施例1所述用琥珀酸酐(AS)作为间隔剂通过偶联获得。加入HBsAg组(第9组)作为安慰剂。血清的抗-JY1 IgG应答通过ELISA测定。
用student检验进行统计学分析。概率值低于0.05认为统计学显著，低于0.01认为非常显著。
证明MAP-HBsAg偶联物(第7和第8组)与MAPs和聚合物相比，引起显著更高的抗JY1表位的抗体应答。上述各组明显优于肽(第4组)。葡聚糖-肽(第5组)(图3B)与HBsAg-MAP偶联物没有不同。然而，应当考虑到接种的偶联物量少4倍。该实验证明，与MAPs相比，MAPs与HbsAg偶联显著增强了抗JY1表位的抗体应答。尽管发展MAPs旨在避免肽与载体蛋白偶联，但是我们证明，偶联后的免疫应答强于单独接种4倍量引发的抗体应答。结论是MAP-载体蛋白(即HBsAg)偶联物是所测试的最佳免疫原。
实施例7：合成肽向免疫系统的不同递呈方式引起的交叉反应性的研究
为了评价JY1肽的不同递呈方式引起的交叉反应水平，对应于不同免疫程序的混合血清设置为约10-5抗-JY1效价，并且比较它们与来自不同HIV-1分离物的一系列5种V3肽交叉反应的能力.在所有情况中，每组10只雌性Balb/c小鼠经皮下途径以100μL体积接种。一般免疫程序是在第0、14、28、56、99天.动物在最后一次施用10天后采血。所有组都不接种第5次。数据总结于表3中。具有相同程序号的组抽自同一实验。
该实验的结果证明，交叉反应是JY1 V3肽本身的一个特征，因为它在所测试的向免疫系统的每种递呈方式中都存在(第2、3、8、9组)。另外，这种交叉反应可高于包含所有测试肽的免疫原引发的应答(第1、2、3、8、9组)(图4B)。对于交叉反应，MAP4(TT-JY1)、MAP8(TT-JY1)、HBsAg-MAP4(TT-JY1)和HBsAg-MAP8(TT-JY1)不同。然而重要的是观察到，偶联物免疫的小鼠接受少量蛋白质只有4次而不是象MAPs接种组一样有5次。4次施用后对MAPs的交叉反应分析(实施例4)显示比偶联物更低的水平，这证明偶联后作用增强。因此，该实验支持了实施例4的结果。
实施例8：新的树状体-HBsAg偶联物的免疫学评价。对一系列V3肽的血清识别。
为了评估疫苗制剂中不同偶联物之间可能的相互作用，并且为了证明偶联物混合物的免疫原性和交叉反应性的活性增强，在小鼠中进行实验。
10组各10只雌性Balb/c小鼠以100μL体积经皮下途径接种。免疫组分布如下：1，HBsAg-MAP4(来自V3的共有序列肽)；2，HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)；3，偶联物HBsAg-MAP4(来自V3的共有序列肽)与HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)的混合物；4，HBsAg-MAP4(V3序列的肽库)；5，偶联物HBsAg-MAP4(V3序列的肽库)与HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)的混合物.肽序列总结于表5中。在第1、2、4组中接种10μg的剂量；对于第3组和第5组，每个偶联物只接种5μg。小鼠在第0、14、28、56、84天免疫。在最后一次免疫10天后采血。数据总结于表4中。
研究与一系列50种V3肽的交叉反应性抗体，这些肽来自于不同的HIV-1分离物，在纤维素膜上合成。也用ELISA评价了与图1的实例中测试的5种肽的交叉反应性抗体。来自每组的混合血清1/100稀释使用。
血清的抗体应答通过ELISA测定，测定对共有序列肽、来自gp120的CD4结合肽和V3序列的肽库的抗I gG应答。
用Student检验进行统计学分析。概率值低于0.05认为统计学显著，低于0.01认为非常显著。
在5个剂量后，HBsAg-MAP4(V3序列的肽库)和HBsAg-MAP4(来自V3的共有序列肽)组中抗共有序列肽的抗体应答极弱(表6)。有趣地注意到，来自于HBsAg-MAP4(V3序列的肽库)免疫动物的混合血清不与所测试的任何V3肽反应，也不与MAP4(来自V3的共有序列肽)或与BSA偶联的共有序列肽反应。然而，在接种HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)与HBsAg-MAP4(V3序列的肽库)的混合物的组中，出现抗共有序列肽和MAP4(V3序列的肽库)的强抗体应答。这些应答不是抗-CD4结合肽抗体的结果，因为来自于HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)免疫小鼠的血清不与任何这些肽反应。因此，结论是，由于偶联物混合物中的协同作用，抗共有序列肽和V3库的抗体应答增强。因而MAP4(来自gp120的CD4结合肽)对抗-V3应答有免疫增强作用，与单独接种的偶联物相比，在混合物中使用少两倍的免疫原量可引起极强的应答。在HBsAg-MAP4(来自V3的共有序列肽)和HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)组中存在相同的协同作用。
该实验证明，偶联物混合物免疫的小鼠(第3组和第5组)产生抗制剂中所含B细胞表位的抗体(表6)。这些偶联物分别制备，然后混合在一起，以避免各自比例不同。因此，3种不同的偶联物混合物产生相似的抗肽抗体应答水平。
当HBsAg-MAP4(来自V3的共有序列肽)和HBsAg-MAP4(V3序列的肽库)与来自gp120的CD4结合肽混合接种时，抗共有序列肽和抗肽库抗体应答显著高于单独免疫。抗共有序列肽应答增强，抗-肽库似乎达到一个重要水平，如图5b所示(图表1和2)。然而，在该混合物中各偶联物接种半数剂量。该结果证明，用含有MAP4(来自gp120的CD4结合肽)的制剂能增强抗-V3应答(图5，图表1和2)。
抗-V3肽ELISA证明了交叉反应性的增强。用图1所示的TAB9蛋白中的一系列V3肽检测来自该实验的血清。对于共有序列肽与CD4肽之间的相互作用，观察到该混合物产生高效价，因为HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)的增强作用提高了CD4肽产生的交叉反应性抗体和共有序列肽的正常反应性。另外，在4次和5次施用后用一系列50种V3肽分析来自第3组和第5组的混合血清。对于第5组(偶联物HBsAg-MAP4(V3序列的肽库)与HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)的混合物)，在4次施用后，26％(13/50)的测试肽被识别。在5次施用后百分数达到30％(15/50)。在4次施用后，53％(7/13)的被识别的肽具有极强的反应性，在5次施用后其中46％(7/15)有极强的反应性。
第3组的混合物(HBsAg-MAP4(来自V3的其有序列肽)和HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽))在四次施用后与72％(36/50)的肽反应，在五次施用后与其中92％(46/50)反应。在四次施用后，50％(18/36)的被识别的肽具有极强的反应性，在五次施用后其中48％(22/46)有极强的反应性。
结论是，混合物HBsAg-MAP4(来自V3的共有序列肽)和HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)比与肽库的类似混合物引发更广的交叉反应性应答。由于共有序列肽是由在一系列50种肽的每一位置选择更常见的氨基酸产生的，并且文库是由同一系列产生的，我们的结论是，产生交叉反应性抗体的最佳策略是一种制剂，其含有与载体蛋白偶联的共有序列肽的MAP加上具有协同作用的另一种偶联物的混合物。
实施例9：与不同载体蛋白偶联的线性V3(JY1)肽与MAP产生的免疫应答的比较
为了研究树状体结构(这里是MAPs)与不同载体蛋白偶联对免疫原性和交叉反应性的影响，将线性JY1肽及其MAP结构与不同载体蛋白(HBsAg，KLH，P64k)偶联。
第5至9组中用琥珀酸酐法将肽和MAP与使用的不同载体蛋白偶联。第10组的MAP用MPS作为偶联剂与HBsAg偶联。
9组各8只Balb/c雌性小鼠在第0-14-28-56天接种，最后一次接种10天后抽取。免疫组、所使用的剂量和佐剂示于表8中。
抗体应答用ELISA定量血清中抗JY1肽的IgG。也应用如实施例5所述的一系列肽经ELISA评价交叉反应性，另外用无关肽作对照。
用分析方差均匀性的F检验，随后用student t检验分析结果。p＜0.05的值认为统计学上不同，p＜0.01认为非常显著。
对偶联物蛋白质-MAPs的抗体应答在所有情况下均优于偶联物肽-蛋白质产生的应答(图6B)。对HBsAg-MAP8(TT-JY1)的应答类似于KLH-MAP8(TT-JY1)的应答，两者都显著优于用偶联物P64k-MAP8(TT-JY1)获得的应答。另一方面，抗MAPs偶联物的抗体应答也显著优于(p＜0.05)单独的MAPs引起的应答。除了P64k-MAP8(TT-JY1)的情况以外，尽管重要的是该偶联物中抗原总量较低。这些结果证明，使用与载体蛋白偶联的树状体结构优化了将要使用的免疫原的总量，除此之外还显著提高了免疫应答。
相对于2种以上的异源V3肽，用所有偶联物免疫观察到交叉反应性，且在第三次和第四次施用后增强(图6C)。此外，也能证明偶联的MAPs交叉反应性显著优于未偶联的MAPs(图6C)。
实施例10：用树状体结构不同的V3分离物免疫后，血清免疫原性和交叉反应性的测定
为了证明对免疫原性和交叉反应性的增强作用不取决于所选择的V3序列，在用对应于V3分离物的不同V3肽的树状体结构免疫后测定免疫原性和交叉反应性。RF肽的序列示于表1、图1中。
8-10周龄的雌性Balb/C小鼠在第0、14、28天接种，在免疫前和第三次施用后抽取。接种的抗原是MAP8(TT-RF)，和利用如实施例1所述的琥珀酸酐作为偶联剂将基于RF的MAP与HBsAg偶联获得的树状体结构。使用的剂量分别是40μg和10μg。
由图7清晰所见，与HBsAg偶联的树状体结构以及MAP都产生明显的交叉反应水平，在统计学分析后证明来自树状体偶联物HBsAg-MAP8(TT-RF)免疫组的血清的免疫原性和交叉反应性显著提高。
实施例11：与载体蛋白偶联的不同MAPs的免疫学分析
为了研究与载体蛋白共价连接的不同MAP对免疫原性的增强作用，合成了四体(tetrameric)MAPs，以及相应的线形肽。MAP4-(NM)和MN肽含有来自脑膜炎奈瑟球菌B385株OMP P1.15的环4的表位(HYTRQNNADVFVPAVVG)。MAP4-(D)和D肽含有来自登革2型病毒preM/M蛋白的表位(LTTRNGEPHMIVSRQEKGKSLL FKTGDGVG)。
用β-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(the ester of theβ-maleimidopropionic-N-hidroxisuccinimide acid)(MPS)作为偶联剂，使MAP4-(NM)和MN肽与载体蛋白KLH和P64k偶联。通过用溶于50mmol/L磷酸缓冲液，DMF，pH 6的过量间隔剂衍化蛋白质30分钟，进行偶联反应。透析除去过量的MPS。在合成MAP4-(NM)和MN肽的过程中，在C末端添加一个半胱氨酸，产生-SH基。在室温下，用马来酰亚胺衍生的蛋白质自发地与各个肽和MAP上的游离硫醇(tiol)基反应3小时。这些偶联物的纯化通过凝胶过滤层析进行。
对于MAP4-(D)和D肽，用可溶性碳二亚胺直接法与蛋白质KLH和P64k偶联。MAP4-(D)和D肽在C末端含有一个羧基，使其能直接结合载体蛋白(KLH和P64k)的氨基。
为了评价不同偶联的MAP的免疫原性，12组各8只雌性Balb/c小鼠用皮下途径免疫。在第0-14-28天接种。小鼠在最后一次接种后10天采血。免疫组和所使用的剂量和佐剂示于表8中。
抗体应答通过ELISA定量，以测定血清中抗相应肽的总IgG。
用分析方差均匀性的F检验，随后用student t检验分析结果。p＜0.05的值认为统计学上不同，p＜0.01认为非常显著。
由图8B可见，较高的效价对应于偶联物KLH-MAP4-(D)和P64k-MAP4-(D)。在所有情况中，偶联物蛋白质-MAPs的效价显著高于偶联物蛋白质-肽，达到与单独MAP免疫组类似的应答强度。我们从该实验得出结论，含有不同病原体序列的树状体结构与载体蛋白偶联使得所选肽的免疫原性显著提高成为可能。
实施例12：用树状体偶联物经鼻免疫后对交叉反应性的研究
为了证明鼻免疫后产生具有高交叉反应性的抗体应答，每组8只10-12周龄的雌性Balb/c小鼠接种10μg与(TT-JY1)MAP8偶联的HBsAg。我们用施用40μg(TT-JY1)MAP8的每组8只小鼠作为对照，利用ELISA估计对两种免疫原的抗体应答，估计抗JY1肽的总IgG，我们也分析了与一系列5种V3肽的交叉反应性。对照组不产生可检测到的抗JY1应答，与此不同，偶联物HBsAg-MAP8(TT-JY1)免疫的组在所有情况中都产生对同源肽的强烈应答，也发现与该组中2种以上肽的交叉反应性应答，其随接种数量而增强。这些结果证明了偶联对产生应答的关键作用；抗原颗粒的特征提高了对偶联的MAP的免疫应答。此外，可能第一次证明了粘膜免疫后血清和粘膜表面上的强烈免疫应答。
利用来自乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒和登革病毒的核心抗原作为载体分子，按照实施例2和3制备具有相同结果的其它树状体。
此外，当利用来自促性腺素释放激素的肽作为与上述抗原偶联的树状体结构的合成部分时，注意到与单独用肽免疫的对照和未免疫的小鼠相比性腺大小明显减小。
实施例13：利用具有高水平交叉反应性的血清获得的不同HIV-1分离物的交叉中和分析
为了评价具有高交叉反应性的血清对V3环的交叉中和，利用不同实验室HIV-1分离物进行体外试验.对于这些试验，考虑到交叉反应性水平选择混合血清。HBsAg-MAP8(TT-JY1)(实施例4)、HBsAg-MAP8(TT-RF)(实施例10)和混合HBsAg-MAP4(CD4)与HBsAg-MAP4(共有序列)(实施例8)。
这些研究显示，每种免疫原诱导的抗体应答都具有诱导异源分离物中和作用的能力。
也已经证明，与CD4的混合物能提高交叉中和水平。单个肽或它们的偶联物不能产生可检测的交叉中和。
实施例14：利用不同核合成树状体结构
为了增加每分子单位B表位的数量，间接合成分别包括核和肽的合成。
该系统避免了合成大序列所固有的错误，并且使B和T表位更高地掺入充分功能化的核中。
利用双环己基碳二亚胺(DCC)作为激活剂，通过1，6-二氨基己烷的氨基与氨基酸Boc-Lys(Boc)-OH的羧基反应进行树状体核的合成。之后，用三氟乙酸(TFA)在二氯甲烷(DCM)中的37％溶液去保护，获得具有4个反应性末端的核，产生四价树状体化的可能性，和对于Boc-Lys(Boc)-OH的第二和第三级的偶联，使用相同的反应循环获得具有16个氨基反应性末端的核。之后，我们使这些基团与溴乙酸的羧基反应。该核用C8柱经RP-HPLC纯化。事先合成在C末端含有半胱氨酸的JY1肽，它以充足的比例与获得的核反应。在碱性条件(pH，8-9)(图9)下，该核的杂原子基团与半胱氨酸的巯基相互作用，产生硫醚。结合程度用SDS-PAGE和凝胶过滤层析测定。获得40-50kD的树状体肽。
利用实施例2所述的偶联剂使树状体结构与不同载体蛋白偶联。产生的由蛋白质和MAPs构成的树状体结构然后在已经证明其免疫原性和交叉反应性优越性的不同免疫程序中使用。
该系统具有不同的优点，例如，分别制备的不同肽B或T能掺入充分功能化的独特基质(4-6H)中。能够合成抗原肽，并按需要通过C端和N端偶联，这使得能够纯化个别决定簇，并且能避免长序列合成所固有的错误。
附图简述
图1.
A)三次和四次施用后的免疫原性研究。分组：1，MAP8(TT-JY1)；2，HBsAg-MAP8(TT-JY1).剂量分别是50μg和10μg。
B)三次和四次施用后交叉反应性抗体的研究。来自两组的混合血清以100-1的固定稀释度检测。进行用V3-BSA偶联物包被的间接ELISA。
C)表1.来自所测HIV-1的V3肽的氨基酸序列。
图2.
四次施用后混合血清对几种V3肽的识别研究。分组：1，MAP8(TT-JY1)；2，TAB9。剂量分别为16.4μg和100μg。
图3.
A)表2.免疫程序概述。
B)向免疫系统递呈JY1表位的不同方式之间免疫原性的比较研究。
图4.
A)表3.免疫程序总结。
B)接种以不同方式向免疫系统递呈JY1表位的抗原后产生的血清对V3肽的识别研究。
图5a.
表4.免疫程序总结。
表5.来自gp120的CD4结合肽、来自V3的共有序列肽和来自HIV-1的V3序列的肽库的氨基酸序列。
表6.四次和五次施用后的免疫原性结果。
图5b.
图表1.五次施用后，来自表3第2、3、6组的血清中交叉反应性抗体的研究。
图表2.五次施用后，来自表3第4、5、6组的血清中交叉反应性抗体的研究。
图5c.
表7.对纤维素膜上合成的一系列V3肽的识别研究。质量分布图显示四次和五次施用后混合血清识别的相对强度。1和2，偶联物HBsAg-MAP4(V3序列的肽库)与HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)的混合物；3和4，偶联物HBsAg-MAP4(来自V3的共有序列肽)与HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)的混合物；5，五次施用后，HBsAg；6，五次施用后，HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)。四种不同的颜色强度显示抗体与肽相互作用的质量。白色：不识别，浅灰：弱阳性，深灰：阳性，黑色：强阳性。
图5d.
对应于表5所示结果的图片。图片：1和2，偶联物HBsAg-MAP4(V3序列的肽库)与HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)的混合物；3和4，偶联物HBsAg-MAP4(来自V3的共有序列肽)与HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)的混合物；分别在四次和五次施用后；5，五次施用后，HBsAg；6，五次施用后，HBsAg-MAP4(来自gp120的CD4结合肽)。来自所有组的混合血清以100-1的固定稀释度检测。
图6.
A)表8.免疫程序概述。
B)三次施用后不同组免疫原性的测定。
C)图表1.三次施用后，与来自表3所述第4-10组的血清的交叉反应性研究。混合血清以1/100的固定稀释度测定。用与BSA偶联的不同肽包被平板进行间接ELISA。
图表2.第四次施用后，与来自表3所述第4-10组的血清的交叉反应性研究。混合血清以1/100的固定稀释度测定。用与BSA偶联的不同肽包被平板进行间接ELISA。
图7.
A)三次施用后混合血清对不同V3肽的识别研究。组别1，MAP8(TT-RF)；2，HBsAg-MAP8(TT-RF)。剂量分别为40μg和10μg。
图8.
A)表8.免疫程序概述。
B)三次施用后利用ELISA的免疫原性评价。
图9.
树状体肽和抗原结构的获得。

Claims (21)

1.获得能增强特异交叉反应性的抗原结构的方法，其包括下列步骤：
A)目的表位的选择；
B)利用合成法获得含有步骤(A)中选择的表位的树状体结构，该合成法选自：1)在天冬氨酸或赖氨酸的核上合成；2)在有机分子核上合成；和3)肽直接偶联于树状体核上，B细胞和T细胞表位能在同一核上混合；
C)利用偶联法将步骤(B)中获得的一个或多个树状体结构与一个或多个载体分子偶联，该偶联法选自：1)利用戊二醛偶联，2)利用琥珀酸酐偶联，3)利用β-马来酰亚胺基丙酸N一羟基琥珀酰亚胺酯(MPS)偶联，和4)不需使用含芳香侧链的间隔剂的任何方法；
D)混合步骤(C)中获得的偶联物，包括加入CD4结合肽或含有它的偶联物；和
E)得到的制剂用明矾或其它任何合适的佐剂辅佐。
2.根据权利要求1的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽属于1型或2型人类免疫缺陷病毒的区域。
3.根据权利要求2的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽属于1型或2型人类免疫缺陷病毒的可变区。
4.根据权利要求3的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽属于1型或2型人类免疫缺陷病毒的第三个可变区(V3)。
5.根据权利要求1的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽属于乙型肝炎病毒。
6.根据权利要求1的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽属于丙型肝炎病毒。
7.根据权利要求1的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽属于登革病毒。
8.根据权利要求1的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的寡聚物属于脑膜炎奈瑟球菌的多糖区。
9.根据权利要求1的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽是抗原多糖的模拟肽。
10.根据权利要求1的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽属于微生物或病原体的抗原区。
11.根据权利要求1的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽属于自身抗原。
12.根据权利要求11的方法，其中由步骤(B)获得的结构中所含的肽属于促性腺素释放激素。
13.根据权利要求1的方法，其中步骤(C)的载体分子是乙型肝炎表面抗原HBsAg。
14.根据权利要求1的方法，其中步骤(C)的载体分子是脑膜炎奈瑟球菌p64K蛋白。
15.根据权利要求1的方法，其中步骤(C)的载体分子是人类免疫缺陷病毒核心蛋白。
16.根据权利要求1的方法，其中步骤(C)的载体分子是乙型肝炎核心抗原或丙型肝炎核心抗原。
17.根据权利要求1的方法，其中步骤(C)的载体分子是多糖。
18.根据权利要求17的方法，其中步骤(C)的载体分子是葡聚糖。
19.根据权利要求1的方法，其中步骤(C)的载体分子和树状体结构共价、静电或通过疏水性偶联。
20.含有通过权利要求1-19任一项的方法获得的抗原结构的疫苗制剂，其被方便地吸收或辅佐。
21.全身或粘膜使用的根据权利要求20的疫苗制剂。
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