PL230663B1

PL230663B1 - Szczepionka, sposob jej otrzymywania, wyizolowane chimeryczne bialko, wektor ekspresyjny, zestaw zawierajacy szczepionke oraz kompozycja do zastosowania w profilaktyce zakazen powodowanych przez HCV i/lub HBV

Info

Publication number: PL230663B1
Application number: PL410950A
Authority: PL
Inventors: Anna Czarnota; Katarzyna GRZYB; Katarzyna Grzyb
Original assignee: Univ Gdanski
Priority date: 2015-01-15
Filing date: 2015-01-15
Publication date: 2018-11-30
Also published as: EP3244921B1; PL3244921T3; EP3244921A1; WO2016114676A1; PL410950A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka do zastosowania w profilaktyce zakażeń spowodowanych wirusem HCV i/lub HBV oraz sposób jej otrzymywania. Przedmiotem wynalazku jest również chimeryczne białko oraz zestaw zawierający szczepionkę. Ponadto przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca chimeryczne białko oraz wektor ekspresyjny.

Wirus zapalenia wątroby typu C (ang. Hepatitis C Virus - HCV) zakaża około 170 milionów osób na całym świecie, co stanowi około 2-3% populacji. Największy odsetek zakażonych występuje w Egipcie, gdzie procent populacji zakażonej wirusem HCV sięga nawet 20%. W Polsce, w wyniku badań prowadzonych na terenie całego kraju, odsetek zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu C osiąga wartość od 1,9 do 4%. Jednakże ze względu na brak powszechnych badań mających na celu określenie rzeczywistej skali problemu liczbę zakażonych szacuje się na około 700 tys. osób. Do zakażeń wirusem HCV dochodzi różnymi drogami. Już na początku badań nad HCV zaobserwowano związek między objawami chorobowymi, a wcześniejszym kontaktem pacjenta z krwią lub produktami krwiopochodnymi. Obecnie, ze względu na obowiązujące procedury szpitalne, w krajach rozwiniętych rzadko dochodzi do zakażeń HCV podczas procedur medycznych. Jednak w krajach rozwijających się nadal pozostaje to jedną z częstszych dróg zakażeń. Najpopularniejszą drogą zakażeń w krajach rozwiniętych jest dożylne przyjmowanie narkotyków (około 60% nowych zakażeń), przeniesienie wirusa z matki na dziecko oraz kontakty seksualne. Ze względu na niezwykłą różnorodność ludzkich zachowań, które zawierają ryzyko kontaktu z krwią lub produktami krwiopochodnymi, można wymienić wiele więcej czynności potencjalnie niosących ze sobą ryzyko zakażenia wirusem HCV. Są to m.in. zabiegi kosmetyczne z użyciem igieł: kolczykowanie, tatuowanie czy akupunktura. Większość z tych zabiegów jest wykonywana w regionach, w których nie przeprowadza się rutynowych badań przesiewowych w kierunku infekcji HCV, trudno więc określić ich wpływ na rozprzestrzenianie się epidemii. Około 80% infekcji wirusem HCV przechodzi w fazę chroniczną, która przez lata może nie dawać żadnych specyficznych objawów, dlatego też zakażenia HCV często nazywa się „cichą epidemią”. Przewlekła postać choroby w 20% przypadków prowadzi do ciężkiego uszkodzenia wątroby, marskości wątroby i w efekcie często do rozwinięcia się raka wątrobowokomórkowego. Często jedynym ratunkiem dla chorych jest przeszczep wątroby, który nie prowadzi niestety do wyleczenia. Przeszczepiona wątroba jest od razu zakażana cząstkami wirusa krążącymi we krwi lub pozostającymi poza komórkami wątrobowymi. W ciągu kilku do kilkudziesięciu dni po przeszczepie u pacjentów odnotowuje się wzrost wiremii. Przez lata standardem leczenia antywirusowego była terapia dwulekowa, podczas której podawane były: inter feron i ribawiryna. Terapia ta obciążona była jednak poważnymi skutkami ubocznymi, a jej skuteczność nie przekraczała 50%. Intensywne badania prowadzone w ostatnich latach pozwoliły na dokładniejsze poznanie biologii wirusa HCV i w efekcie doprowadziły do odkrycia nowych leków działających bezpośrednio na cząsteczki wirusowe (ang. Direct acting antivirals - DAAs). Obecnie dostępne są leki działające zarówno na proteazy wirusowe - Telaprevir, Boceprevir, jak i na polimerazę RNA - Sofosbuvir, którego skuteczność osiąga nawet 90%. Jednak cena leków jak i koszt hospitalizacji zakażonych są bardzo wysokie i znacznie obciążają budżet zarówno pacjentów jak i państwa. Biorąc wszystkie powyższe aspekty pod uwagę opracowanie skutecznej i powszechnie dostępnej szczepionki chroniącej przed zakażeniem jest ważnym celem aktualnych badań nad HCV.

Wirus HCV jest niewielkim, osłonkowym wirusem należącym do rodziny Flaviviridae. Jego materiał genetyczny stanowi pojedyncza nić RNA o dodatniej polaryzacji. Genom wirusa połączony jest z multimerycznym białkiem tworzącym rdzeń białkowy. Zewnętrzną część wirusa stanowi osłonka, która zbudowana jest z błony lipidowej i zakotwiczonych w niej glikoprotein osłonkowych E1 i E2, które tworzą niekowalencyjny heterodimer E1/E2. Oba białka są silnie glikozylowane i odgrywają istotną rolę w cyklu życiowym wirusa. Biorą udział w procesie wejścia cząsteczki wirusowej do komórki gospodarza oraz w procesie składania infekcyjnych cząsteczek wirusowych. Ze względu na materiał genetyczny w postaci RNA i brak aktywności korekcyjnej polimerazy RNA wirus HCV charakteryzuje się znaczną zmiennością genetyczną, która jest kluczowym czynnikiem pozwalającym wirusowi unikać odpowiedzi immunologicznej. Według najnowszych badań filogenetycznych wyróżnia się siedem genotypów oraz wiele subtypów wirusa, a poziom zróżnicowania między nimi sięga nawet 35%. Ponadto podczas infekcji organizmu wirus różnicuje się tworząc blisko spokrewnione warianty w obrębie jednego zainfekowanego organizmu. Co więcej sekwencja białka E2 posiada tzw. regiony hiperzmienne (ang. Hypervirable Regions - HVR), które pełnią kluczową rolę w procesie infekcji. Wysoka zmienność genetyczna wirusa

PL 230 663 B1 niezwykle utrudnia projektowanie nowych leków, a przede wszystkim szczepionek. Wirus posiada także inne strategie ucieczki przed układem immunologicznym gospodarza (ang. immune evasion) m.in. hamuje wewnątrzkomórkowe szlaki sygnalizacyjne odpowiedzialne za produkcję interferonów, upośledza pobudzanie komórek prezentujących antygen i odpowiedź komórkową oraz przemieszcza się bezpośrednio z komórki do komórki, bez narażania się na kontakt z układem immunologicznym gospodarza. Ponadto występowanie glikanów na powierzchni cząsteczki pozwala wirusowi maskować regiony immunogenne (ang. glycan shield). Powyższe strategie sprawiają, że zaprojektowanie skutecznej szczepionki przeciwko wirusowi HCV jest trudnym wyzwaniem.

Idealna szczepionka profilaktyczna powinna być skierowana przeciwko dostępnym na powierzchni wirusa, silnie konserwowanym epitopom, które indukowałyby zarówno silną odpowiedź komórkową ze strony limfocytów T jak i humoralną w postaci przeciwciał neutralizujących skierowanym przeciwko antygenom znajdującym się na glikoproteinach E1E2 wirusa HCV. Przeciwciała te poprzez efekt sferyczny lub poprzez wiązanie się z miejscem biorącym udział w oddziaływaniu cząsteczka wirusowa - receptor komórki gospodarza zapobiegają wnikaniu wirusa do komórki i rozprzestrzenianiu się infekcji. Jednym z epitopów dla przeciwciał neutralizujących jest silnie konserwo wany region QLINTNGSWHIN znajdujący się w pozycji 412 do 423 glikoproteiny osłonkowej E2. Region ten rozpoznawany jest przez przeciwciała neutralizujące o szerokim spektrum działania, które zdolne są do wiązania się z glikoproteiną E2 pochodzącą z większości genotypów HCV. Ponadto miejsce to odgrywa kluczową rolę w wiązaniu się wirusa do receptora komórkowego CD81 biorącego udział we wnikaniu wirusa do komórki gospodarza. Co więcej epitop ten ma charakter liniowy, tak więc w celu zwiększenia jego immunogenności przeciwwirusowej może być wykorzystany jako antygen peptydowy znajdujących się na powierzchni nośników tj. proponowanych w niniejszym wynalazku cząsteczek wirusopodobnych.

Cząsteczki wirusopodobne (ang. virus like particles - VLP) są małymi, wysoko immunogennymi strukturami tworzonymi z multimerów białek wirusowych. Dzięki multimerycznej, przestrzennej strukturze cząsteczki wirusopodobne powodują agregację receptorów BCR (ang. B cell receptor) na powierzchni limfocytów B i w efekcie aktywują odpowiedź humoralną organizmu. Jednocześnie są zdolne do pobudzania odpowiedzi limfocytów T, zarówno pomocniczych jak i cytotoksycznych oraz komórek dendrytycznych. Ze względu na dobre właściwości immunogenne są one wykorzystywane w szczepionkach nowej generacji np. w dostępnej w Polsce od roku 2007 szczepionce przeciwko wirusowi brodawczaka ludzkiego (ang. Human Papilloma Virus - HPV) czy w szczepionce przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu B (ang. Hepatitis B Virus - HBV).

Wirus zapalenia wątroby typu B posiada materiał genetyczny złożony z częściowo dwuniciowego DNA, które w czterech częściowo nachodzących na siebie ramkach odczytu koduje białka strukturalne i funkcjonalne wirusa. Wirion HBV ma około 42 nm średnicy i utworzony jest z rdzenia budowanego przez białko C. Rdzeń ten osłonięty jest osłonką białkowo-lipidową tworzoną przez antygen powierzchniowy wirusa HBV - HbsAg, występujący w trzech formach długiej, średniej i krótkiej. Krótka forma tego białka - sHBsAg o długości około 226 aminokwasów ma ciekawe właściwości tworzenia cząsteczek wirusopodobnych. Te małe struktury o średnicy około 22 nm pozbawione są wirulencji, jednakże są wysoko immunogenne i zdolne do wyzwalania silnej odpowiedzi immunologicznej. Struktura trzeciorzędowa sHBsAg tworzy hydrofilowe pętle. Na jednej z tych pętli znajduje się silnie konserwowana determinanta „a” przeciwko, której kierowana jest najsilniejsza odpowiedź immunologiczna. Ze względu na zdolność do tworzenia silnie immunogennych cząsteczek VLP oraz silnie konserwowaną i wyeksponowaną determinantę „a” białko sHBsAg jest wykorzystywane w dostępnych szczepionkach przeciwko wirusowi HBV. Szczepionki te zaprojektowane zostały przy wykorzystaniu techniki rekombinacji DNA i są produkowane w drożdżowym systemie ekspresji. System ten po zwala na uzyskanie prawidłowo sfałdowanego białka sHBsAg w dużej ilości i przy niskich kosztach. Białko to ulega ekspresji w wielu innych systemach, w tym w ssaczym, gdzie w przeciwieństwie do systemu drożdżowego jest prawidłowo glikozylowane i wyprowadzane do pożywki. Jednak ekspresja białek w komórkach ssaczych niesie ze sobą wysokie koszty produkcji.

Ze względu na silną immunogenność determinanty „a” białka HBsAg i jej zdolność do wzbudzania silnej odpowiedzi zarówno komórkowej jak i humoralnej jest ona często wykorzystywana jako potencjalny nośnik antygenów patogenów człowieka.

PL 230 663 B1

W ciągu ostatnich lat badane były potencjalne szczepionki oparte na białku sHBsAg niosącym antygeny m.in. wirusa polio, ludzkiego wirusa niedoboru odporności (ang. human immunod eficiency virus - HIV), zarodźca malarii oraz wirusa c hikungunya. Ponadto w opisie wynalazku EA 005313 B ujawniono sposób uzyskiwania wielowalentnych antygenów poprzez chemiczne łączenie peptydów w tzw. struktury dendrytyczne, a następnie przyłączanie tych struktur w sposób chemiczny do nośników epitopów np. białka HBsAg.

W innym opisie wynalazku US 8.551.484 A ujawniono przeciwciała, neutralizujące o szerokim spektrum działania oddziaływujące z regionem 412-423 glikoproteiny E2 wirusa HCV.

W poniższym badaniu w celu otrzymania biwalentnej szczepionki przeciwko wirusom HBV i HCV zaprojektowano chimeryczne białko, w którym do determinanty „a” białka HBsAg pochodzącego z wirusa HBV subtypu adw2 wstawiono rejon 412-425 z glikoproteiny E2 osłonki wirusa HCV. W celu ekspresji chimerycznego białka wykorzystano system oparty na pasożytniczym pierwotniaku - Leishmania tarentolae. L. tarentolae jest jednokomórkowym, eukariotycznym organizmem zakażającym gekony, nie wykazującym patogenności w stosunku do człowieka. System ekspresji białek oparty o L. tarentolae pozwala na uzyskiwanie wysokiej ekspresji prawidłowo sfałdowanych białek o wzorze N-glikozylacji zbliżonym do komórek ssaczych, przy zachowaniu niskich kosztów, łatwości obsługi i braku trudności w zwiększaniu skali hodowli porównywalnej do hodowli drożdżowych i bakteryjnych.

Celem wynalazku jest utworzenie cząsteczek wirusopodobnych i w efekcie stworzenie biwalentnej szczepionki przeciwko wirusom HBV oraz HCV.

Odpowiednio wynalazek zapewnia w sposób nieograniczający kilka następujących zalet:

- wzbudzanie odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał skierowanych przeciwko HBV i/lub HCV,

- biwalentna szczepionka do profilaktyki i/lub leczenia HBV i HCV, gdzie poprzez zastosowanie chroni i/lub hamuje zachorowalność powodowaną przez HBV i/lub HCV,

- zestaw szczepionki można stosować w celu prewencji/profilaktyki i/lub leczenia infekcji HBV i/lub HCV,

- otrzymanie czynnych biologicznie i immunogennych cząsteczek wirusopodobnych złożonych z małego białka powierzchniowego wirusa HBV (HBsAg), które charakteryzują się:

• wysoką immunogennością, • wzbudzaniem humoralnej oraz komórkowej odpowiedzi immunologicznej,

- wbudowany w determinantę „a” region 412-425 z glikoproteiny E2 wirusa HCV, który charakteryzuje się:

• małą zmiennością pomiędzy genotypami wirusa HCV, • obecnością miejsca wiązania dla przeciwciał neutralizujących wirusa, • charakterem liniowym,

- prawidłowa ekspozycja regionu E2 412-425 na powierzchni białka HBsAg i jego dostępność dla przeciwciał neutralizujących,

- otrzymanie po raz pierwszy cząsteczek wirusopodobnych w systemie Leishmaniatarentolae, którego zaletami są:

• prawidłowe fałdowanie białek, • obecność modyfikacji posttranslacyjnych (m.in. N-glikozylacja ze wzorem glikozylacji zbliżonym do wzoru ssaczego), • wysoka wydajność nadprodukcji białek, • niski koszt hodowli oraz łatwość jej obsługi, • prowadzenie hodowli w zawiesinie, co pozwala na bezproblemowe zwiększenie skali produkcji,

- łatwy proces oczyszczania cząsteczek HBsAg_412-425, składający się z jednoetapowego ultrawirowania na gradiencie.

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka, która zawiera:

a) determinantę „a” białka HBsAg wirusa HBV subtypu adw2 o sekwencji 5'-TGCACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCT CATGTTGCTGTACAAAACCTACGGACGGAAACTGCAC-3'

b) wraz z rejonem 412-425 glikoproteiny E2 osłonki wirusa HCV o sekwencji: 5’-CAACTGATCAACACCAACGGCAGTTGGCACATCAATAGCACG-3’.

PL 230 663 B1

Szczepionka to chimeryczne białko.

Szczepionka może pobudzać odpowiedź immunologiczną pacjenta.

Wyizolowane chimeryczne białko w postaci szczepionki zdefiniowanej powyżej ma zastosowanie przeciwko wirusom HBV i/lub HCV.

Zestaw zawierający szczepionkę jako chimeryczne białko zdefiniowane powyżej wraz z instrukcją zastosowania w profilaktyce zakażenia spowodowanego wirusem HBV i/lub HCV.

Sposób otrzymywania szczepionki zdefiniowanej powyżej, który zawiera następujące etapy:

- wprowadzenie poniższej sekwencji rejonu 412-425 glikoproteiny E2 osłonki wirusa HCV w pozycję odpowiadającą determinancie „a” białka HBsAg wirusa HBV subtypu adw2 5’-CAACTGATCAACACCAACGGCAGTTGGCACATCAATAGCACG-3’

- wklonowanie zsyntetyzowanego fragmentu przy użyciu miejsc restrykcyjnych Bglll oraz Notl do plazmidu pLEXSY_l-blecherry3 pod kontrolę promotora T7 z operatorem tetracyklinowym,

- użycie przygotowanego plazmidu do elektroporacji komórek Leishmania tarentolae,

- ekspresja białka HBsAg_412-425 w komórkach Leishmania tarentolae, liza komórek i formowanie cząsteczek,

- oczyszczanie cząsteczek wirusopodobnych poprzez jednoetapowe ultrawirowanie na gradiencie.

Kompozycja do zastosowania w profilaktyce zakażeń powodowanych przez HCV i/lub HBV u pacjenta, gdzie kompozycja zawiera chimeryczne białko zdefiniowane powyżej w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku.

Wektor ekspresyjny, gdzie jest nim plazmid pLEXSY_l_blecherry3, który zawiera sekwencję nukleotydową genu chimerycznego HBsAg_412-425 oraz miejsca restrykcyjne Bglll, Notl przedstawiony na Fig. 2.

Na potrzeby niniejszego wynalazku zdefiniowano następujące terminy:

HCV - oznacza Hepatitis C Virus, wirusowe zapalenie wątroby typu C;

HBV - oznacza Hepatitis B Virus, wirusowe zapalenie wątroby typu B;

antygen - oznacza jakąkolwiek substancję, która pobudza układ odpornościowy organizmu do produkcji przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi;

białko fuzyjne - oznacza to samo, co białko chimeryczne;

biwalentna szczepionka - oznacza szczepionkę wzbudzającą odpowiedź immunologiczną przeciwko dwóm różnym patogenom (lub dwóm różnym serotypom patogenów). W tym przypadku oznacza szczepionkę wzbudzającą odpowiedź immunologiczną zarówno przeciwko wirusowi HBV i/lub HCV;

białka chimeryczne - oznacza białka uzyskane w wyniku ekspresji genów rekombinowanych, powstałych w wyniku połączenia dwóch lub większej ilości genów, które wyjściowo kodowały różne białka. W tym przypadku oznaczają połączenie krótkiej formy antygenu powierzchniowego wirusa HBV (HBsAg) oraz regionu 412-425 glikoproteiny E2 wirusa HCV, w ten sposób, że region 412-425 E2 znajduje się wewnątrz determinanty „a” HBsAg;

determinanta „a” - oznacza wysoko immunogenny region małego białka powierzchniowego HBsAg, znajdujący się w pozycji 124-147 małego białka powierzchniowego wirusa HBV - sHBsAg (Genbank accession number - AF397207.1);

ekspresja - oznacza produkcję białek w wyniku translacji kodujących je genów;

region hiperzmienny - oznacza regiony w sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2, które charakteryzują się podwyższoną zmiennością. Zmienność ta jest kluczowym czynnikiem pozwalającym cząsteczce wirusa HCV unikać odpowiedzi immunologicznej;

odpowiedź komórkowa - oznacza swoistą odpowiedź immunologiczną organizmu związaną z występowaniem limfocytów T posiadających receptory na swojej powierzchni. Połączenie receptora ze specyficznym antygenem powoduje bezpośrednią, cytotoksyczną reakcję limfocytu T, lub wzbudzenie innych komórek efektorowych;

odpowiedź humoralna - oznacza swoistą odpowiedź immunologiczną organizmu związaną z produkcją przeciwciał przez pobudzone limfocyty B;

epitop, determinanta antygenowa - oznacza miejsce na antygenie specyficznie wiążące przeciwciało/immunoglobulinę (e.g. E2 region 412-423 specyficznie wiążący przeciwciało AP33). Epitopy możemy podzielić na liniowe - gdzie region wiążący przeciwciało jest ułożony w sposób ciągły, nie zależy od struktury trzeciorzędowej białka, a czynniki denaturujące nie wpływają na zdolność wiązania przeciwciała do epitopu oraz epitopy konformacyjne - gdzie wiązanie przeciwciała zależy od wyeksponowania epitopu w strukturze trzeciorzędowej białka;

PL 230 663 B1 neutralizacja wirusa - oznacza zdolność przeciwciał neutralizujących do związania się z cząsteczką wirusową w taki sposób, że nie jest ona w stanie wniknąć do wnętrza komórki gospodarza;

wzór glikozylacji - oznacza wzór cząsteczek węglowodanów połączonych kowalencyjnie z cząsteczką białka;

rejon 412-425 - oznacza rejon znajdujący się w pozycji 412 do 425 glikoproteiny E2 wirusa HCV izolatu H77 (Genbank accession number - AF011751) o sekwencji aminokwasowej QLINTNGSWHINST. Region ten zawiera silnie konserwowany epitop liniowy rozpoznawany przez przeciwciała neutralizujące o szerokim spektrum działania, które zdolne są do wiązania się z glikoproteiną E2 pochodzącą z większości genotypów HCV. W tym przypadku rejon 412-425 został użyty do utworzenia chimerycznego białka HBsAg_412-425, gdzie znajduje się on wewnątrz determinanty „a” białka HBsAg;

peptyd 412-425 - oznacza zsyntetyzowany peptyd o sekwencji aminokwasowej QLINTNGSWHINST;

przeciwciało AP33 - oznacza mysie przeciwciało monoklonalne wiążące się z liniowym epitopem glikoproteiny E2 wirusa HCV o sekwencji QLINTNGSWHIN. Przeciwciało to posiada właściwości neutralizujące wirusa HCV. (A. Owsianka, A.W. Tarr, V. S. Juttla et al, „Monoclonal antibody AP33 defines a broadly neutralizing epitope on the hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein, Journal of Virology, vol. 79, no. 17, pp. 11095-11104, 2005);

subtyp adw wirusa HBV - oznacza wariant wirusa HBV posiadający determinanty „a”, „d” oraz „w”. Wirus HBV posiada trzy determinanty, z których determinanta „a” jest uniwersalna i wspólna dla wszystkich subtypów. Regiony flankujące determinantę „a” nazywane są determinantami d/y oraz w/r. Ze względu na rodzaj aminokwasu w pozycji 122 dla determinanty d/y oraz 160 dla determinanty w/r każdy izolat wirusa HBV można przypisać do danego subtypu;

pacjent - oznacza osobę niezakażoną wirusami HBV i/lub HCV, która podlega szczepieniu chimerycznym białkiem HBsAg_412-425 w celu profilaktyki zakażeń wirusami HBV i/lub HCV;

profilaktyka zakażeń - oznacza zapobieganie nowym zakażeniom wirusami HBV i/lub HCV poprzez stosowanie szczepień profilaktycznych chimerycznym białkiem HBsAg_412-425 wśród osób narażonych na zakażenia wirusami HBV i/lub HCV. Szczepienia te wywołują trwałą odpowiedź immunologiczną w postaci komórek pamięci, które w przypadku zetknięcia z wirusem HBV i/lub HCV są w stanie neutralizować i eliminować wirusa HBV i/lub HCV z organizmu osoby zaszczepionej.

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia schemat chimerycznego konstruktu HBsAg_412-425 użytego w poniższym badaniu. Rejon 412-425 pochodzący z glikoproteiny E2 osłonki wirusa HCV został umieszczony w pozycji P127/A128 małego białka powierzchniowego wirusa HBV (HBsAg) w obrębie determinanty „a”.

Fig. 2 - przedstawia schemat plazmidu pLEXSY_l-blecherry3 z wklonowanym fragmentem kodującym białko HBsAg_412-425 pod kontrolą promotora tetracyklinowego;

Fig. 3 - przedstawia frakcje po ultrawirowaniu zawierające białko HBsAg_412-425, rozdzielone na żelu SDS-PAGE w warunkach redukujących po barwieniu Coomassie Blue. Na figurze zaznaczono strzałką monomeryczną formę białka HBsAg_412-425 o masie ~27 kDa. Marker masy cząsteczkowej w kDa umieszczono po lewej stronie żelu;

Fig. 4 - przedstawia wynik testu ELISA potwierdzającego pozytywną reakcję przeciwciał z chimerycznymi cząsteczkami HBsAg_412-425. Płytki opłaszczono lizatem L. tarentolae zawierającym chimeryczne białko HBsAg_412-425 w rozcieńczeniach od 1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000. Następnie przeprowadzono inkubację z przeciwciałami AP33 (Fig. 4A) oraz anty-HBsAg (Fig. 4B). Słupki błędu wyznaczają odchylenie standardowe;

Fig. 5 - przedstawia zdjęcie preparatu cząstek wirusopodobnych HBsAg_421 -425 oglądanych w mikroskopie elektronowym. W eksperymencie zastosowano barwienie negatywowe octanem uranylu. Czarna strzałka wskazuje pojedynczą cząsteczkę wirusopodobną złożoną z chimerycznego białka HBsAg_412-425;

Fig. 6 - A - przedstawia oznaczanie miana przeciwciał w surowicach myszy immunizowanych białkiem HBsAg_412-425. Oczyszczone chimeryczne cząsteczki wirusopodobne naniesiono na płytkę 96 dołkową w ilości 10 μg/ml. Białko wykrywano surowicami w rozcieńczeniach 10⁴, 10⁵, 2*10⁵, 4*10⁵, 8*10⁵, 10⁶;

B - wcześniej zsyntetyzowany peptyd 412-425 naniesiono na płytkę 96-dołkową w ilości 20 pg/ml. Peptyd wykrywano surowicami w rozcieńczeniach 10², 10³, 1,25*10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶.

PL 230 663 B1

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.

P r z y k ł a d 1

Uzyskanie ekspresji białka HBsAg_412-425 w komórkach pierwotniaka Leishmania tarentolae i oczyszczenie cząsteczek wirusopodobnych poprzez ultrawirowanie na gradiencie.

Ekspresja

Gen kodujący białko HBsAg wirusa HBV został zsyntetyzowany (Life Technologies Inc. USA) w oparciu o sekwencję z bazy danych (GenBank accesion number - AF397207.1), w pozycję odpowiadającą determinancie „a” wprowadzono sekwencję dla rejonu 412-425 - 5'-CAACTGATCAACACCAACGGCAGTTGGCACATCAATAGCACG-3’ (Fig. 1). Następnie przy użyciu miejsc restrykcyjnych Bglll oraz Notl zsyntetyzowany fragment został wklonowany do plazmidu pLEXSY_l-blecherry3 (Jenna Bioscience GmBH, Germany) pod kontrolę promotora T7 z operatorem tetracyklinowym. Poprawność wprowadzenia insertu sprawdzono sekwencjonowaniem. Tak przygotowany wektor ekspresyjny (Fig. 2) użyto do elektroporacji komórek L. tarantolae. Elektroporację, selekcję poliklonalną, hodowlę komórek oraz indukcję ekspresji chimerycznego białka przeprowadzano wg. procedury dla systemu lexsy (Jenna Bioscience GmBH).

Liza i formowanie cząsteczek wirusopodobnych

Indukowane hodowle (OD600-4.5) były wirowane (4500 rpm, 10 min). Osady komórek ze 100 ml hodowli były przemywane buforem PBS a następnie lizowane w 10 ml buforu (0,6% Triton X-100, 0,6 mM redukowany glutation w PBS) oraz sonifikowane. Następnie całość lizatu wirowano (8500 rpm. 30 min). Po wirowaniu zebrano supernatant, który inkubowano w temperaturze pokojowej przez (12-48 h).

Oczyszczanie

W celu oczyszczenia cząstek FIBsAg_412-425 przygotowano gradient OpitPrep (Sigma) w PBS z frakcjami od 6% do 30%, na który nanoszono po 5 ml otrzymanego lizatu komórkowego. Całość wirowano (28000 rpm, 4°C, 16 h). Wszystkie powstałe na gradiencie frakcje zostały zbadane na obecność białka FIBsAg_412-425 metodą western blot z użyciem przeciwciał AP33. Czystość białka zbadano poprzez elektroforezę poliakrylamidową SDS-PAGE (Fig. 3). Na żelu wybarwionym Coomassie Blue można zaobserwować główny prążek odpowiadający masie monomerycznej formy białka HBsAg_412-425 (27 kDa) oraz 3 dodatkowe prążki o większych masach prawdopodobnie odpowiadające multimetrycznym formom białka HBsAg_412-425.

Frakcje zawierające najwięcej poszukiwanego białka były zbierane i zagęszczane przy pomocy filtrów do wirowania Amicon 30 NMLW (Millipore Inc. USA). Do pomiaru stężenia białka zastosowano metodę Bradforda (A = 595 nm). Oszacowano, że ilość białka wynosi około 20 mg/l hodowli. Tak oczyszczony preparat przechowywano w 4°C lub w -70°C z dodatkiem (5-20%) glicerolu.

Powyższe procedury pozwoliły na otrzymanie chimerycznego białka oraz na efektywne, jednoetapowe oczyszczenie cząstek wirusopodobnych złożonych z fuzyjnego białka HBsAg_412-425.

P r z y k ł a d 2

W celu potwierdzenia obecności cząsteczek wirusopodobnych wykonano test ELISA i zdjęcia mikroskopem elektronowym.

ELISA

W celu wykonania testu ELISA płytkę 96-dołkową opłaszczono lizatem komórkowym w rozcieńczeniach od 1 do 1:10000 w PBS i blokowano 5% mlekiem w PBS-T (0,05% Tween20 w PBS). Następnie nanoszono przeciwciała l-rzędowe - antyHBsAg (1:1000) w PBST (Fig. 4A) lub AP33 (1:1500) w PBST (Fig. 4B). W doświadczeniu zastosowano przeciwciała II-rzędowe sprzężone z FIRP rozcieńczone 1:2000. Reakcję wywoływano używając substratu TMB, a wynik odczytywano przy długości fali 450 nm. Pozytywna reakcja przeciwciał z chimerycznymi cząsteczkami HBsAg_412-425 potwierdza prawidłową ekspozycję regionu 412-425 na powierzchni białka HBsAg i dostępność dla przeciwciał produkowanych po zetknięciu się z antygenem.

Mikroskopia elektronowa

W celu potwierdzenia obecności cząstek wirusopodobnych 10 μl próbki nanoszono na niklowe siatki pokryte błoną węglową z dodatkiem formvaru i barwiono octanem uranylu. Preparaty oglądano z wykorzystaniem mikroskopu elektronowego (Fig. 5). Wyniki z mikroskopii elektronowej potwierdziły obecność cząsteczek wirusopodobnych o średnicy ~ 22 nm, co jest zgodne z danymi literaturowymi.

PL 230 663 B1

P r z y k ł a d 3

Immunizacja myszy w celu potwierdzenia immunogenności cząstek wirusopodobnych oraz zbadanie miana przeciwciał w otrzymanych surowicach przeciwko antygenowi HBsAg_412-425

W celu zbadania immunogenności cząstek wirusopodobnych do szczepień zastosowano model mysi. Oczyszczony antygen HBsAg_412-425 został zawieszony w PBS oraz zmieszany w stosunku 1:1 z adiuwantem (Addavax; Invivogen, USA) bezpośrednio przed szczepieniem. Grupa w postaci sześciu myszy BALB/c została zaszczepiona podskórnie mieszaniną antygen/adiuwant w dawce 15 μg/mysz. Grupa kontrolna złożona z dwóch myszy BALB/c została zaszczepiona mieszaniną PBS/adiuwant. W dniu 14 i 28 od pierwszego szczepienia myszy zostały doszczepione mniejszą ilością antygenu w dawce 10 μg/mysz, natomiast grupie kontrolnej podano mieszaninę PBS/adiuwant. W dniu 42 wszystkie myszy zostały skrwawione, a w zebranej su rowicy oznaczono miano przeciwciał skierowanych przeciwko całemu antygenowi HBsAg_412-425 oraz dodatkowo rejonowi 412-425. Miano oznaczano wykorzystując metodę ELISA (Fig. 6A i B). W powyższym eksperymencie potwierdzono obecność przeciwciał skierowanych przeciwko białku HBsAg_412-425, których miano wynosi około 8*10⁵ oraz obecność przeciwciał skierowanych przeciwko rejonowi 412-425, których miano wynosi około 1,25*10³. W obu przypadkach jako wynik negatywny przyjęto wartości (n<0,15), gdzie 0,15 stanowi trzykrotność wartości kontroli negatywnej (A450 = 0,05). Wyniki immunizacji potwierdzają silną odpowiedź immunologiczną w postaci przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi w postaci chimerycznego białka HBsAg_412-425, w tym także przeciwko rejonowi 412-425 specyficznym dla wirusa HCV.

Literatura:

1. Hindman S.J. i wsp. 2014: Historical epidemiology of hepatitis C virus (HCV) in selected countries. J. Viral Hepat. Suppl 1:5-33.

2. Frank C., Mohamed M.K., Strickland G.T., Lavanchy D., Arthur R.R., Magder L.S., El Khoby T., Abdel-Wahab Y., Aly Ohn E.S., Anwar W., Sallam I. 2000: The role of parenteral antischistosomal therapy in the spread of hepatitis C virus in Egypt. Lancet. 355: 887-891.

3. Halota W., Pawłowska M. 2002: Wirusowe zapalenia wątroby typu C - dominujący problem hepatologii. Przegl Epid. 56. supl. 4:46-50.

4. 2003: Stanowisko grupy ekspertów w dziedzinie chorób zakaźnych dotyczące leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C. Medical Science Monitor, vol 9. supl. 6.

5. Garfein R. S., Vlahov D., Galai N. Doherty M. C., Nelson K. E. 1996: Viral infections in shortterm injection drug users: the prevalence of the hepatitis C, hepatitis B, human immunodeficiency, and human T-lymphotropic viruses. Am J Public Health. v.86(5).

6. Stramer S. L., Glynn S. A., Kleinman S. H., Strong D. M., Caglioti S., Wright D. J., Dodd R. Y., Busch M.P. 2004: Detection of HIV-1 and HCV infections among antibody-negative blood donors by nucleic acid amplification testing. N Engl J Med. 351 (8):760-8.

7. Alter M.J. 2007: Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13(17):2436-2441.

8. Kimberly A. Powers, Ruy M. Ribeiro, Keyur Patel, Stephen Pianko, Lisa Nyberg, Paul Pockros, Andrew J. Conrad, John McHutchison, Alan S. Perelson 2006: Kinetics of Hepatitis C Virus Reinfection After Liver T ransplantation. Liver T ransplantation, 12:207-216.

9. Ghany M. G., Nelson D. R., Strader D. B., Thomas D. L. Seeff L. B. 2011: Practice Guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases.

10. Mangia A., Marcellin P., Kwo P. i wsp. 2014: All oral fixed-dose combination sofosbuvir/ledipasvir with or without ribavirin for 12 or 24 weeks in treatment-naive genotype 1 HCV-infected patients: the phase 3 ION-1 study. 49th European Association for the Study of the Liver International Liver Congress London, April 9-13, 2014. Abstract.

11. Dubuisson J. 2007: Hepatitis C virus proteins. World J Gastroenterol. 13(17):2406-2415.

12. Zein N. 2000: Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes. Clin Microbiol Rev. 13(2):223-235.

PL 230 663 B1

13. Kelly P. Burke, Andrea L. Cox 2010: Hepatitis C Virus Evasion of Adaptive Immune Responses - A Model for Viral Persistence. Immunol Res. 47(1-3):216-227.

14. Helle F., Duverlie G., Dubuisson J. 2011: The Hepatitis C Virus Glycan Shield and Evasion of the Humoral Immune Response. Viruses. 3(10), 1909-1932.

15. Ania Owsianka, Alexander W. Tarr, Vicky S. Juttla, Dimitri Lavillette, Birke Bartosch, Francois-Loic Cosset, Jonathan K. Ball, Arvind H. Patel 2005: Monoclonal Antibody AP33 Defines a Broadly Neutralizing Epitope on the Hepatitis C Virus E2 Envelope Glycoprotein. Journal of Virology. 11095-11104.

16. Teresa J. Broering, Kerry A. Garrity, Naomi K. Boatright, Susan E. Sloan, Frantisek Sandor, William D. Thomas, Jr., Gyongyi Szabo, Robert W. Finberg, Donna M. Ambrosino, Gregory J. Babcock 2009: Identification and Characterization of Broadly Neutralizing Fluman Monoclonal Antibodies Directed against the E2 Envelope Glycoprotein of Hepatitis C Virus. Journal of Virology, 12473-12482.

17. Jane A. Potter, Ania M. Owsianka, Nathan Jeffery, David J. Matthews, Zhen-Yong Keck, Patrick Lau, Steven K., H. Foung, Garry L. Taylor and Arvind H. Patel 2012: Toward a Hepatitis C Vaccine: The Structural Basis of Hepatitis C Virus Neutralization by AP33, a Broadly Neutralizing Antibody. J. Virol., 86(23):12923.

18. Natasha Kushnir, Stephen J. Streatfield, Vidadi Yusibov 2012: Virus-like particles as a highly efficient vaccine platform: Diversity of targets and production systems and advances in clinical development. Vaccine, 31 58-83.

19. Stephen Locarnini, Fabien Zoulim 2010: Molecular genetics of HBV infection. Antiviral Therapy, 15 Suppl 3:3-14.

20. RTS,S Clinical Trials Partnership 2011: First Results of Phase 3 Trial of RTS,S/AS01 Malaria Vaccine in African Children. New England Journal of Medicine, 367 (24) 2284-95.

21. VRC311 Study Team 2014: Safety and tolerability of chikungunya virus-like particle vaccine in healthy adults: a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet.

22. Netter H. J., MacNaughton T. B., Wai-Ping Woo, Tindle R., Gowans E. J. 2000: Antigenicity and Immunogenicity of Novel Chimeric Hepatitis B Surface Antigen Particles with Exposed Hepatitis C Virus Epitopes. Journal of Virology, 2130-2141.

23. Wan-Shoo Cheong, Heidi Edelgard Drummer, Hans-Jurgen Netter 2009: Delivery of a foreign epitope by sharing amino acid residues with the carrier matrix. Journal of Virological Methods, 158 35-40.

24. Romuald Patient, Christophe Hourioux, Pascal Vaudin, Jean-Christophe Pages, Philippe Roingeard 2009: Chimeric hepatitis B and C viruses envelope proteins can form subviral particles: implications for the design of new vaccine strategies. New Biotechnology, 25 (4).

25. Elodie Beaumont, Romuald Patient, Christophe Hourioux, Isabelle Dimier-Poisson, Philippe Roingeard 2013: Chimeric Hepatitis B Virus/Hepatitis C Virus Envelope Proteins Elicit Broadly Neutralizing Antibodies and Constitute a Potential Bivalent Prophylactic Vaccine. Hepatology, 57:1303-1313.

26. Breitling R., Klingner S., Callewaert N., Pietrucha R., Geyer A., Ehrlich G., Hartung R., Muller A., Contreras R., Beverley S. M. i wsp. 2002: Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expr Purif., 25(2):209-218.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczepionka, która zawiera:

a) determinantę „a” białka HBsAg wirusa HBV subtypu adw2 o sekwencji 5’-TGCACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCT

CATGTTGCTGTACAAAACCTACGGACGGAAACTGCAC-3’

b) wraz z rejonem 412-425 glikoproteiny E2 osłonki wirusa HCV o sekwencji: 5’-CAACTGATCAACACCAACGGCAGTTGGCACATCAATAGCACG-3’.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że szczepionka to chimeryczne białko.
3. Szczepionka według zastrz. 1-2, znamienna tym, że może pobudzać odpowiedź immunologiczną pacjenta.
4. Wyizolowane chimeryczne białko w postaci szczepionki zdefiniowanej w zastrz. 1-3 ma zastosowanie przeciwko wirusom HBV i/lub HCV.
5. Zestaw zawierający szczepionkę jako chimeryczne białko zdefiniowane w zastrzeżeniu 1 -3 wraz z instrukcją zastosowania w profilaktyce zakażenia spowodowanego wirusem HBV i/lub HCV.
6. Sposób otrzymywania szczepionki zdefiniowanej w zastrz. 1-3, znamienny tym, że zawiera następujące etapy: wprowadzenie poniższej sekwencji rejonu 412-425 glikoproteiny E2 osłonki wirusa HCV w pozycję odpowiadającą determinancie „a” białka HBsAg wirusa HBV subtypu adw2. 5’-CAACTGATCAACACCAACGGCAGTTGGCACATCAATAGCACG-3’

- wklonowanie zsyntetyzowanego fragmentu przy użyciu miejsc restrykcyjnych Bglll oraz Notl do plazmidu pl_EXSY_l-blecherry3 pod kontrolę promotora T7 z operatorem tetracyklinowym,

- użycie przygotowanego plazmidu do elektroporacji komórek Leishmania tarentolae,

- ekspresja białka HBsAg_412-425 w komórkach Leishmania tarentolae, liza komórek i formowanie cząsteczek,

- oczyszczanie cząsteczek wirusopodobnych poprzez jednoetapowe ultrawirowanie na gradiencie.
7. Kompozycja do zastosowania w profilaktyce zakażeń powodowanych przez HCV i/lub HBV u pacjenta, znamienna tym, że kompozycja zawiera chimeryczne białko zdefiniowane w zastrzeżeniach 1-3 w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku.
8. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że jest nim plazmid pLEXSY_l_blecherry3, który zawiera sekwencję nukleotydową genu chimerycznego HBsAg_412-425 oraz miejsca restrykcyjne Bglll, Notl przedstawiony na Fig. 2.