CN107652366A - 一种展示丙型肝炎病毒包膜蛋白e2的纳米颗粒的制备及应用 - Google Patents

一种展示丙型肝炎病毒包膜蛋白e2的纳米颗粒的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种展示丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的纳米颗粒的制备及应用。具体地,本发明将HCV 1b型Con1株的截短包膜蛋白sE2(384‑661)基因与幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白基因融合表达,通过铁蛋白单体的自我组装可以将sE2以正确构象展示于纳米颗粒表面,能够将其制备成具有良好抗原性和安全性的HCV纳米颗粒疫苗,而且融合蛋白的免疫原性显著提高。

Description

一种展示丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的纳米颗粒的制备及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地说,本发明涉及一种展示丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的纳米颗粒的制备及应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是危害全球公共健康的严重问题。目前全球已经有超过1.7亿HCV慢性感染病例,每年还有3到4百万新发病例。据统计,80%的HCV感染者会转为慢性感染,其中25%可能发展为肝硬化,其中又有20%可能发展为肝癌。
丙型肝炎病毒是黄病毒科肝炎病毒属的单链正义RNA病毒,基因组约9.6kbp。HCV基因组共编码10个病毒蛋白,包括核蛋白Core、包膜糖蛋白E1和E2在内的结构蛋白,以及包括P7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B在内的非结构蛋白。
丙型肝炎的传统治疗手段主要为利巴韦林合并干扰素治疗,该方法副作用较大、持续病毒学应答(sustained virologicalresponse,SVR)不高且存在显著的型间和人群间差异。2014年,随着多种针对HCV的新一代抗病毒药物(direct-acting antiviral agents,DAA)在国外上市,丙型肝炎治疗的SVR提高到90%以上。但由于DAA药物昂贵的价格,易存在耐药突变,不能排除治愈后再感染的可能性及对于晚期肝硬化肝癌患者束手无策等特点决定了DAA的上市并不意味着HCV的彻底根除。因此开发HCV的预防性疫苗具有重要意义。
国际上已有的HCV候选疫苗主要分为预防性与治疗性两种。预防性疫苗多在结构蛋白的基础上设计,以诱导高滴度的广谱中和抗体、中和入侵的HCV病毒为主要目的。而治疗性疫苗多在非结构蛋白的基础上设计,主要以诱导多功能T细胞反应、清除已存在的病毒感染为目的。目前已有多种HCV候选疫苗处于研发阶段,但进入临床试验的疫苗仅有少数,如预防性疫苗E1/E2重组蛋白联合MF59佐剂(CHO细胞表达),治疗性疫苗DNA疫苗ChronVac-C、人重组腺病毒疫苗Ad6NS、黑猩猩重组腺病毒疫苗AdCh3NS和重组麻疹病毒MVA-NS。
由于该病毒存在基因序列的高度变异性、糖基化漂移等免疫逃逸特质,目前尚无针对HCV的有效疫苗。但临床数据显示在高慢性化率之外,仍有20-25%的病人可通过早期产生的中和抗体及T细胞免疫反应自发地清除HCV病毒;另一些证据显示在黑猩猩和人身上存在的保护性免疫记忆能大量降低二次感染的病毒载量以及肝脏炎症反应等病理现象。这表明,感染早期的中和抗体产生对于抵抗和消除HCV的感染至关重要,另外有报道称除少数抗体表位位于包膜蛋白E1,大部分识别表位都位于其包膜蛋白E2上。因此设计一种能够诱导中和抗体产生的基于E2蛋白的HCV疫苗成为可能。也为预防性HCV疫苗的研究提供了理论基础和依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种展示丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的纳米颗粒的制备及应用。
本发明的第一方面,提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白是抗原肽与载体蛋白融合所形成的,其中所述抗原肽衍生自HCV包膜蛋白E2。
在另一优选例中,所述载体蛋白与所述抗原肽不是来自同一个蛋白,所述载体蛋白包含至少一个T细胞表位,所述载体蛋白可以增强所述抗原肽的免疫原性。
在另一优选例中,所述载体蛋白为幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白。
在另一优选例中,所述抗原肽连接于所述载体蛋白的C末端和/或N末端形成所述融合蛋白。
在另一优选例中,所述抗原肽和所述载体蛋白之间具有任选地连接肽。优选地,所述连接肽长度为3-30个氨基酸。更优选地,所述连接肽长度为4-20个氨基酸。最优选地,所述连接肽长度为7-17个氨基酸。
在另一优选例中,所述抗原肽和所述载体蛋白之间没有连接肽。
在另一优选例中,所述抗原肽和所述载体蛋白之间不具有连接肽。
在另一优选例中,所述抗原肽选自下组:
(a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽;
(b)将(a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且与载体蛋白融合后具有诱发针对HCV免疫反应功能的衍生多肽。
在另一优选例中,所述载体蛋白为幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白;优选地,所述幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白选自下组:
(a)具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽;
(b)将(a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。
在另一优选例中,所述融合蛋白选自:
(a)具有SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽;
(b)将(a)中多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且与载体蛋白融合后具有诱发针对HCV免疫反应功能的衍生多肽。
本发明的第二方面,提供了一种分离的多核苷酸,所述的多核苷酸编码本发明第二方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中,所述多核苷酸选自下组:
(a)编码如SEQ ID NO.3所示多肽的多核苷酸;
(b)序列如SEQ ID NO.4所示的多核苷酸;
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.4所示序列的同源性≥95%(较佳地≥98%)的多核苷酸;
(d)如SEQ ID NO.4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30,更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸;
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明的第三方面,提供了一种表达载体,所述表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
本发明的第四方面,提供了一种宿主细胞,所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体,或者在基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
在另一优选例中,所述的宿主细胞包括S2细胞、大肠杆菌、酵母、CHO细胞、DC细胞等。
本发明的第五方面,提供了一种药物组合物,所述的组合物含有本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的宿主细胞,以及药学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中,所述的组合物为疫苗。
本发明的第六方面,提供了一种疫苗组合物,所述的组合物含有本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的宿主细胞,以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中,所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中,所述疫苗组合物为核酸疫苗组合物,所述核酸疫苗组合物中包含本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的表达载体。
在另一优选例中,所述的佐剂包括铝佐剂、氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。
本发明的第七方面,提供了如本发明第一方面所述的融合蛋白的用途,(a)用于制备针对HCV的抗体;和/或(b)用于制备治疗或预防与HCV相关的疾病的药物。
在另一优选例中,所述的疾病包括HCV感染。
本发明的第八方面,提供了一种制备本发明第一方面所述的融合蛋白的方法,包括步骤:
(i)在适宜条件下培养本发明第四方面所述的宿主细胞,从而表达本发明第一方面所述的融合蛋白;
(ii)纯化所述融合蛋白。
本发明的第十方面,提供了一种治疗方法,给需要的对象施用本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸或者本发明第三方面所述的表达载体或者本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的药物组合物或本发明第六方面所述的疫苗组合物。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1 sE2-Ferritin分泌蛋白的表达及鉴定。(A)sE2质粒构建图谱(B)sE2-Ferritin质粒构建图谱(C)Ferritin质粒构建图谱(D)左图为sE2的免疫印记,其大小为46KDa,右图为sE2-Ferritin的免疫印记,其大小为66KDa(E)sE2,sE2-Ferritin及Ferritin经SDS-PAGE后的考马斯亮蓝染色图,1-4分别为Marker,sE2,sE2-Ferritin,Ferritin。
图2 sE2-Ferritin的纯化及组装鉴定。(A)从左至右分别为sE2-Ferritin及Ferritin经蔗糖密度梯度超速离心后,分为12层收样,每层上样10ul,经SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色所得胶图。(B)sE2-Ferritin经蔗糖密度梯度超速离心后,分为12层收样,每层上样1ul,经SDS-PAGE及免疫印迹后所得图。(C))sE2-Ferritin经蔗糖密度梯度超速离心后,以Ferritin为对照组,分为12层收样,与鼠抗E2的构象抗体1B4孵育后,经ELISA检测所得OD450。(D)从左至右分别为Ferritin与sE2-Ferritin的冷冻电镜图。
图3 sE2-Ferritin与HCV中和抗体,病人血清及受体的结合活性。(A-B)通过酶联免疫吸附试验检测的sE2-Ferritin与线性中和抗体AP33和构象中和抗体AR3A的结合活性。(C)sE2-Ferritin与受体CD81结合活性。(D)酶联免疫吸附试验检测sE2-Ferritin与48例病人血清结合能力。
图4 sE2-Ferritin纳米颗粒三免后血清对部分HCVcc病毒株中和作用显著高于亚单位疫苗。(A)免疫原的剂量及佐剂。(B)三免后免疫原在小鼠体内产生的抗体滴度。(C)三免后,小鼠血清在1:40稀释度下对HCVcc的中和水平。
图5四免血清中和抗体水平较之三免有所提高且针对部分病毒纳米颗粒疫苗抗原性仍显著高于亚单位疫苗。(A)四免后免疫原在小鼠体内产生的抗体滴度。(B)四免后,小鼠血清在1:40稀释度下对HCVcc的中和水平。
图6 sE2-Ferritin纳米颗粒抗原性对免疫剂量的选择性且其抗体滴度可在小鼠体内终生持续。(A)免疫原的剂量及佐剂。(B)四免后免疫原在小鼠体内产生的抗体滴度。(C)四免后,不同剂量免疫原产生的血清在1:40稀释度下对HCVcc的中和水平。(D)小鼠在30周内产生抗体滴度水平。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,意外的发现将HCV 1b型Con1株的截短包膜蛋白sE2(384-661)基因与幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白基因融合表达,通过铁蛋白单体的自我组装可以将sE2以正确构象展示于纳米颗粒表面,能够将其制备成具有良好抗原性和安全性的HCV纳米颗粒疫苗,而且融合蛋白的免疫原性显著提高。
在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料,本文在此处例举优选的方法和材料。
术语
如本文所用,术语“载体蛋白”指在本发明的重组蛋白中作为蛋白结构骨架的蛋白。通常,所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白,例如病原体蛋白,代表性的例子包括(但并不限于):病毒蛋白、细菌蛋白、衣原体蛋白、支原体蛋白等。
如本文所用,术语“抗原肽”指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白的一段肽,该抗原肽是相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肽段。通常,抗原肽指免疫反应拟靶向的肽段,而不是来自所述载体蛋白。
抗原肽
在本发明中,“抗原肽”指源自HCV包膜蛋白E2的,并且能够与抗KCV抗体结合的活性多肽的统称。
在本发明中所述的抗原肽包括线性抗原肽与构象抗原肽。
本发明提供了一种源自HCV包膜蛋白E2的抗原肽,在本发明的一个优选地实施方式中,所述抗原肽具有HCV包膜蛋白E2的第384-661位氨基酸,优选地根据本发明的抗原肽的氨基酸序列如下:
其编码核苷酸序列如下:
Ggcacatacgtgacaggcggcacaatggccaagaacaccctgggcatcaccagcctgttcagccccggcagcagccagaaaatccagctggtgaacaccaacggcagctggcacatcaaccggaccgccctgaactgcaacgactccctgaataccggcttcctggccgccctgttctacgtgcacaagttcaacagcagcggctgccccgagcggatggccagctgtagccctatcgatgccttcgcccagggctggggccctatcacctacaacgagagccacagcagcgaccagcggccctactgctggcactacgcccccagaccttgcggcattgtgcctgccgctcaggtctgcggccctgtgtactgcttcacccccagccccgtggtggtgggaaccaccgatagattcggcgtgccaacctacagctggggcgagaacgagacagacgtgctgctgctgaacaacaccagacccccccagggcaattggttcggctgcacctggatgaacagcaccggcttcaccaagacctgcggcggacccccctgcaacatcggcggcatcggcaacaagaccctgacatgccccaccgattgcttcagaaagcaccccgaggccacctacaccaagtgcggctctggcccctggctgacccccagatgcctggtgcactacccctaccggctgtggcactacccttgcaccgtgaacttcaccatcttcaaagtgcggatgtatgtgggcggagtggaacaccggctggaagccgcctgcaactggaccagaggcgagcggtgcaacctggaagatcgggacagaagcgag(SEQ IDNO.4)。
载体蛋白
如本文所用,术语“载体蛋白”指在本发明的重组蛋白中作为蛋白结构骨架的蛋白。通常,所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白,例如病原体蛋白,代表性的例子包括(但并不限于):病毒蛋白、细菌蛋白、衣原体蛋白、支原体蛋白等。
如本文所用,术语“抗原表位(肽)”指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白的一段肽,该表位相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肽段。通常,抗原表位指免疫反应拟靶向的肽段,较佳地来源于哺乳动物(如人)蛋白的一段肽,而不是来自所述载体蛋白。
如本文所用,术语T细胞表位又称为T细胞抗原表位,是抗原分子经过抗原呈递细胞中酶解加工产生的一段肽,能够由主要组织相容性复合体(MHC)分子结合,呈递在细胞表面被T细胞受体(TCR)结合,激活T细胞,包括T辅助细胞表位等。
在本发明的一个优选的实施方式中,根据本发明的融合蛋白使用的载体蛋白为幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白;优选地,所述幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白的氨基酸序列如下:
SRSGGDIIKLLNEQVNKEMNSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS(SEQ ID NO.2),
其编码核苷酸序列如下:
Tctagaagtggcggcgacattatcaagctgctgaacgagcaggtgaacaaggagatgaatagtagtaatctgtatatgagtatgagtagttggtgctacacacacagcctggatggcgccggactgttcctgtttgaccacgccgccgaggagtatgagcatgccaagaagctgatcattttcctgaacgagaacaatgtgccggtgcagctgaccagcatctcggccccggagcacaagttcgagggcctgacgcagattttccagaaggcctacgagcacgagcagcatatttcggagagtatcaacaatattgtggatcacgccatcaagtcgaaggaccatgccacgttcaattttctgcagtggtacgtggccgagcagcacgaggaggaggtgctgttcaaggatattctggacaagatcgagctgattggaaacgagaatcatggactgtatctggccgaccagtatgtgaagggaatcgccaagagccgcaagagttgatga(SEQ ID NO.5)。
融合蛋白
丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内危害公共健康的重要问题,大量的慢性感染及以此为诱因的肝硬化和肝癌严重威胁了人类健康,然而目前并没有针对HCV的预防性疫苗。
病毒样颗粒(Virus Like Particles,VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,没有病毒的核酸(DNA/RNA),不能自主复制,其在形态上与真正病毒粒子相同或相似,可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。由于其免疫原性强,安全性好等特点,近年来受到人们的广泛关注。铁蛋白是一种常见的球体蛋白,由24个蛋白亚基构成,它能在所有类型的细胞中表达,是原核生物与真核生物用于储存铁离子的主要蛋白质。铁蛋白的主要功能是使铁离子的储存维持在溶解状态并且对细胞无害。
HCV包膜糖蛋白E2与宿主细胞受体CD81的结合是HCV进入细胞的关键步骤,且除少数中和表位位于E1,大部分中和表位位于E2。本研究将1b型Con1株的截短包膜蛋白sE2(384-661)基因与幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白基因融合转染至果蝇S2细胞中进行表达,通过筛选本发明人获得了表达目的蛋白的稳转细胞株,经SDS-PAGE,免疫印记及考马斯亮蓝染色鉴定,该单体蛋白分泌至上清,大小为66KDa左右。
经蔗糖密度梯度离心,将样品分为12层检测,免疫印记及酶联免疫吸附试验鉴定,该单体蛋白可组装为纳米颗粒,并分布于5,6,7层,冷冻电镜观察,该纳米颗粒大小为10nm。通过与HCVE2特异性线性及构象中和抗体,受体及感染病人血清结合活性试验可知,sE2以近乎天然构象展示在载体颗粒表面,且其相比单体蛋白sE2对于抗体及受体亲和能力显著提高。小鼠免疫试验表明,三免后,sE2-Ferritin相比sE2就展示了一定的抗原性,针对大部分HCVcc中和百分率可达60%。四免后血清在1:40的稀释度下,sE2-Ferritin组在针对大部分HCVcc病毒如1b型临床适应株PR79L9,PR52B6mt,2a型Jc1,JFH1,4a型ED43,5a型SA13等的中和百分率相比sE2组有显著性提高,并可达80%左右,且佐剂Alum+CpG较之Alum无论在抗体滴度还是中和水平上效果要更为理想。另外本发明人对于免疫原剂量的选择上进行了研究及分析,由于高剂量免疫处于饱和状态,低剂量免疫达不到较高的中和水平,只有当在单体摩尔数为0.217的条件下免疫sE2-Ferritin,其中和水平显著高于sE2。即以低于亚单位疫苗三倍免疫剂量达到了与其相同的中和百分率—90%,既减轻免疫原剂量,又最大限度展现了其抗原性。综上所述,本发明人研制了一种能在S2表达系统自我组装且分泌上清中并正确展示丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的纳米颗粒,该颗粒的抗原性显著强于亚单位疫苗,并具有安全,稳定等特点。
在本发明的一个优选地实施方式中,所述融合蛋白的氨基酸序列如下:
其编码核苷酸序列如下所示:
应理解,所述术语还包括本发明融合蛋白的衍生物,指本发明融合蛋白在经过1-3个氨基酸添加、1-2个氨基酸缺失并仍具有与抗HCV抗体结合活性的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多肽是没有分离纯化的,但同样的多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的肽”或“分离的蛋白”是指本发明多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它抗原性肽物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明多肽。基本上纯化的多肽(融合蛋白)在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。
一旦鉴定获得了相关的肽序列,就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(融合蛋白)。
此外,还可用化学方法直接合成相关肽序列。
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物,它含有:(i)本发明的融合蛋白或本发明的可编码融合蛋白的多核苷酸,以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。
本发明中,术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此,术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。
本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组蛋白或多核苷酸),也可以是多价的(含有多种重组蛋白或多核苷酸)。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型,其中包括(但并不限于):注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(i)药物组合物
本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组蛋白或多核苷酸。
本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量,或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此,预先指定准确的有效量是没用的。然而,对于某给定的状况而言,可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的,有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克,较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组蛋白。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组蛋白)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体:它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体,且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子,如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体,如水、盐水、甘油和乙醇。另外,这些载体中还可能存在辅助性的物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常,可将组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组蛋白),并且通常与“药学上可接受的载体”组合,这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子,如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外,这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外,抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于:(1)铝盐(alum),如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等;(2)水包油型乳剂配方,例如,(a)MF59(参见WO 90/14837),(b)SAF,和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT),(3)皂素佐剂;(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA);(5)细胞因子,如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、FIX、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等;(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体;以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如,可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂),通常含有稀释剂,如水,盐水,甘油,乙醇等。另外,辅助性物质,如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地,包括免疫原性组合物在内的疫苗,包含免疫学有效量的免疫原性多肽,以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内,可通过常规实验来确定。
通常,可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中,以增强佐剂效果。
此外,本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。
(iii)给药途径和剂量
一旦配成本发明的组合物,可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物,尤其是人。
当用作疫苗时,可用已知的方法将本发明的重组蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于):肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要,可以组合给药途径,或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予,且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予重组蛋白疫苗,即重组蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答,能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。
代表性的疾病包括(但并不限于):自身免疫性疾病、肿瘤等。
在各疫苗剂份中所选用的重组蛋白的量,是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常,在感染宿主细胞后,各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg,较佳地为1μg-100mg,更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后,可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。
此外,本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予,或者与其他治疗剂一起给予。
材料与方法
1细胞
果蝇Schneider 2(S2)细胞购于Invitrogen公司,S2细胞培养于添加10%胎牛血清(Gibco),1%双抗(Gibco),1%L-谷氨酰胺(Gibco)的Schneider’s Drosophila Media(Gibco)中或添加1%双抗(Gibco),1%L-谷氨酰胺(Gibco)的ExpressSFM培养基(Gibco)中,28℃培养箱培养。Huh7细胞培养于添加10%胎牛血清(Gibco),1%双抗(Gibco),1%L-Glutamine(Gibco),10mM HEPES buffer(Gibco),1%Nonessential AminoAcids(Gibco)的DMEM(Hyclone)中,37℃二氧化碳培养箱培养。
2病毒
本研究所用到的所有HCV病毒如表1所示。HCV 2a型病毒JFH-1按照前述方法制备(1),简言之,10μg pUC-vJFH重组质粒通过XbaI酶切线性化,回收线性DNA产物后取1μg作为模版按Ambion T7transcription kit说明进行体外转录,纯化后溶于30μL无核酸酶超纯水,储存于-80℃冰箱备用。Huh7细胞胰酶消化后用Opti-MEM重悬至细胞数1×107/mL,取400μL加入电转杯,并加入10μg上述RNA。将电击条件调至0.27kV,100Ohms和950μF,进行电击,而后将细胞吸出加入完全DMEM,37℃二氧化碳培养箱培养。传代至出现细胞病变效应时开始收取细胞上清,收取的病毒上清测定滴度后分装储存于-80℃冰箱备用。突变株病毒JFH-1/D183由本实验室保存(2)。嵌合的HCV1b型病毒Con1/JFH-1,1a型病毒H77/JFH-1,2a型病毒Jc1,按前述方法制备(3,4),嵌合病毒的Core到NS2第一个跨膜区由相应病毒株的氨基酸序列构成,基因组其余部分来源于JFH-1。构建2-7型嵌合病毒的重组质粒由University of Copenhagen的Dr.Jens Bukh馈赠,按上述方法电转扩增后收获,包括HCV2b型病毒J8/JFH1,3a型病毒S52/JFH1(I793S,K1404Q),4a型病毒ED43/JFH1(T827A,T977S),5a型病毒SA13/JFH1(A1022G,K1119R),6a型病毒HK6a/JFH1(F350S,N417T)以及7a型病毒QC69/JFH1.构建中国1b型临床株PR26C3mt、PR52B6mt、PR79L9和2a型临床株PR63嵌合病毒的重组质粒由本实验室构建和保存(5,6),并按上述方法电转扩增后收获。
表1.不同基因型HCVcc嵌合病毒标准株及临床适应株
3抗体
鼠抗HCV NS5A单抗来源于Abmart公司,人抗HCV E2单抗AR3A(7)获自The ScrippsResearch Institute的Dr.Denis Burton提供。鼠抗HCV E2单抗AP33(8)获自MRC-University of Glasgow的Dr.Arvind Patel。Western blot检测用鼠抗His标签单抗购于Abmart HRP标记山羊抗鼠IgG,购于Sigma,HRP标记山羊抗人IgG二抗购于Abcam.AlexaFluor-488标记山羊抗鼠IgG二抗及Alexa Fluor-555标记山羊抗鼠IgG二抗购于Invitrogen。
4质粒构建
昆虫细胞表达载体为pMT/BiP/V5-HisA与筛选质粒pCoBlast购自Invitrogen公司。重组质粒pcDNA3.1-CE1E2opti是由野生型的HCVCon1株结构蛋白Core-E1-E2编码基因经密码子优化(Geneart公司)后所构成。幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白单体基因合成由Geneart公司完成。
经过优化的Con1sE2基因序列以pcDNA3.1-CE1E2opti为模版经特异性引物(见表2)的PCR扩增后,序列两端均带有NcoI和XbaI两个酶切位点,将该序列插入昆虫表达载体pMT/Bip/V5-His A的NcoI和XbaI酶切位点,得到携带sE2基因的重组表达质粒pMT/Bip-sE2。以PUC-Ferritin为模版,利用特异性引物经PCR扩增后获得两端具有XbaI和ApaI的ferritin片段,将该片段插入位于质粒pMT/Bip-sE2的sE2基因后的XbaI和ApaI两酶切位点之间,ferritin后加终止密码子,得到重组表达质粒pMT/Bip-sE2-Ferritin。该质粒启动子为Metallothionein promoter,后为Bip信号肽序列有利于分泌型蛋白的表达,Bip后连接目的基因序列。
表2.基因序列扩增引物
5sE2-Ferritin,Ferritin及sE2在果蝇S2细胞中的表达
首先采用钙转方法在S2细胞中瞬时表达sE2-Ferritin,Ferritin及sE2。接种细胞3x106(1x106cells/ml)于六孔板中,28℃培养6~16个小时,当细胞密度达到2-4x106cells/ml时进行钙转。将36ul 2M CaCl2,19ug重组DNA及水加至300ul配置成A液,300ul的2xHEPES(50mM HEPES,1.5mMNa2HPO4,280mM NaCl,pH 7.1)配置成B液。将B液放置于震荡仪上,缓慢滴加A液于B液,并将此600ul混合液于室温下静置30~40min,均匀滴加混合液于细胞上,28℃培养16~24h后,将细胞800rpm,5min离心,以完全培养基洗三遍细胞,以除去钙颗粒。将细胞放置于28℃培养72h至细胞密度2-4x106cells/ml,取部分细胞,加入5uM氯化铬诱导目的基因表达蛋白,并以蛋白质印迹等方法检测其表达。若目的基因正常表达,则采用钙转方法筛选表达目的蛋白的稳转细胞系。将1ug pCoBlast筛选质粒与重组目的基因质粒按上述方法共转于S2细胞中,当细胞密度至2-4x106cells/ml,以25ug/mlBlasticidin筛选压筛选出阳性细胞,并检测其目的基因表达。
6sE2-Ferritin,Ferritin及sE2的纯化
稳定表达sE2-Ferritin,Ferritin及sE2的细胞系进行扩大培养,将培养基替换为无血清的含1%双抗,1%L-谷氨酰胺和10mg/mL的杀稻瘟菌素的ExpressSFM(Gibco),将细胞接种于磁力搅拌摇瓶中,培养至细胞密度4×106个/mL时加入终浓度为5uM的氯化铬诱导表达。8d后收取上清,经0.45um滤膜过滤后,sE2-Ferritin和Ferritin以10%蔗糖5ml,27000rpm,5h超离,将管底沉淀加入PBS溶解后,进行蔗糖密度梯度实验,梯度为10%-50%共五层,超离参数为39000rpm,3h。超离后样品分12层收集,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。取含有目的条带的蔗糖层混合后按上述条件进行超离,超离后管底沉淀以PBS溶解。sE2以3kDa的超滤离心管(Millipore)进行浓缩,浓缩约20-30倍体积并将溶液置换为binding buffer(0.5M NaCl,20mM Tris,10mM咪唑,pH7.9),而后经用镍柱(Novagen)纯化,结合在镍柱的蛋白用washing buffer(0.5M NaCl,20mM Tris,50mM咪唑,pH7.9)洗掉杂蛋白后再用eluting buffer(0.5M NaCl,20mM Tris,500mM咪唑,pH7.9)洗脱,最后上述所得纯化产物进行SDS-PAGE分析,并以sE2为标准品,通过Western blot进行sE2-Ferritin的定量分析。
7sE2-Ferritin,Ferritin及sE2的蛋白鉴定与分析
采用SDS-PAGE和Western blot检测,简要步骤为待检蛋白样品与loading buffer混合均匀后,100℃煮沸10min,经12%SDS-PAGE电泳分析,考马斯亮蓝染色10min后,10%冰醋酸脱色;样品经12%SDS-PAGE电泳后110V电压1.5h转到PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1h,1:1000稀释的鼠抗sE2单抗1C9为一抗室温孵育2h,1:4000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗室温作用1h,适量ECL化学发光试剂为底物,LAS4000扫描分析仪(Fujifilm)获取Western blot结果。
8sE2-Ferritin的电镜分析
将液氮盒装满液氮,待液面不沸腾时,将乙烷缓慢注入冷却的铜碗中,使之冷却为液态。用海绵吸取温水,使VitrobotTM Mark IV内保持湿度在100%;将0.1mg/mL的纳米颗粒吸附在200目的QUANTIFOIL R1.2/1.3HOLEY CARBON铜网中,吸水4s。迅速将样品转移到液氮中,以备后期冷冻照片的采集。病毒样品保存在-170℃的无定形冰里面,对电子剂量极为敏感,过大的电子辐射会造成样品的移动甚至损伤。因而,我们在数据采集的过程,采用了低剂量模式。电子剂量为欠焦值是-4um到-2um数据的采集是用装有Gatan公司像素为4K*4K的K2Direct Detection相机的Titan Krios电镜在300KV的Cryo-EM下采集。
9sE2-Ferritin与中和抗体的结合
将sE2-Ferritin,Ferritin及sE2按照单体等摩尔浓度包被ELISA96孔板,以起始包被87nmol/L每孔进行2倍比稀释,8个梯度稀释后放置4℃冰箱包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭1h,将AP33与AR3A两种中和抗体分别按照1:1000稀释后每孔50ul与包被抗原37℃孵育3h,PBST洗4-5遍,晾干后分别加入稀释度为1:5000的HRP标记的抗鼠二抗以及稀释度为1:3000的HRP标记的抗人二抗,每孔为50ul,37℃孵育1h,PBST洗5遍,TMB显色,室温避光作用2分钟,1M磷酸终止反应后,Thermo Scientific Varioskan Flash多功能读数仪测定样品在A450的吸光值。
10sE2-Ferritin与HCV构象中和抗体分子相互作用分析
将anti-Human Fc浸泡于0.1%BSA+0.02%Tween+PBS的缓冲液中10分钟后偶联于生物传感器,装载抗体为人外周血分离的HCV构象性中和单克隆抗体AR3A,100ug/mL每孔200ul。将单体摩尔浓度分别为260,130,65,32.5,16.25,8.125nmol/L的sE2及sE2-Ferritin加入一排结合孔,每孔200ul,以260nmol/L的Ferritin作为对照组。ForteBioOctet仪器测定样品信号值,其程序设定为Baseline60s,Loading300s,Baseline2120s,Association 300s,Dissociation 300s。
11sE2-Ferritin的受体结合试验
将人重组CD81(北京义翘神州有限公司)以起始浓度为10ug/ml进行2倍比稀释12个浓度梯度,将不同浓度梯度的CD81包被ELISA96孔板并放置4℃冰箱包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭1h后,以单体等摩尔浓度的sE214.14ug/mL,sE2-Ferritin20ug/mL,Ferritin5.86ug/mL与受体37℃孵育3h后,PBST洗涤5遍,以1C9(实验室制备HCV特异性鼠单抗)1:1000稀释后与上述免疫原受体复合物37℃孵育3h后,PBST洗涤5遍,以HRP标记的羊抗鼠抗体1:5000稀释37℃孵育1h,PBST洗涤5遍,TMB显色,室温避光作用2分钟,1M磷酸终止反应后,Thermo Scientific Varioskan Flash多功能读数仪测定样品在A450的吸光值。
12sE2-Ferritin与病人血清结合试验
将单体等摩尔数的sE2-Ferritin,sE2,Ferritin各71.7ng,50ng,21.7ng包被ELISA96孔板,4℃冰箱包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭1h后,分别与1:20000稀释的54例病人血清50ul(吉林大学白求恩第一医院1b及2a型)37℃孵育3h后,PBST洗涤5遍,加入以HRP标记的抗人抗体1:5000稀释37℃孵育1h,PBST洗涤5遍,TMB显色,室温避光作用2分钟,1M磷酸终止反应后,Thermo Scientific Varioskan Flash多功能读数仪测定样品在A450的吸光值。结果采用One-Way ANOVA Newman-Keuls分析sE2-Ferritin,sE2,Ferritin与病人血清结合的差异显著性。
13动物实验
以单体等摩尔数分三个剂量梯度分别为sE2 30ug,sE2-Ferritin 43ug,Ferritin13ug;sE2 10ug,sE2-Ferritin 14.3ug,Ferritin4.3ug以及sE2 3ug,sE2-Ferritin 4.3ug,Ferritin1.3ug为免疫原,以铝500ug,CpG25ug为佐剂腹腔注射6-8周龄BALB/c雌性小鼠,每组6只小鼠,并以PBS作为对照组。免疫程序为第0周进行初次免疫,第2,4,12周进行加强免疫共免疫四次。三、四免后两周分别从小鼠眼眶后静脉丛采血,将小鼠血液放置室温1h后,4℃静置过夜,待血清完全析出后,5000rpm,4℃离心30min后分离上层血清进行后续抗体效价测定。此后第22周及第30周分别采血检测免疫原产生抗体持续时间。
14血清抗体滴度检测
将小鼠血液放置室温1h后,4℃静置过夜,待血清完全析出后,5000rpm,4℃离心30min后分离上层血清,按上述方法离心两遍后得到不含红细胞的血清。将Con1sE2蛋白以1ug/mL每孔50ul包被ELISA96孔板,4℃包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭1h后,将处理后的血清以1:4000起始浓度进行2倍比稀释至1:8192000,Ferritin及PBS对照组则以起始浓度1:200进行2倍比稀释至409600,与包被抗原37℃孵育3h后,PBST洗涤5遍,TMB显色,室温避光作用2分钟,1M磷酸终止反应后,Thermo Scientific Varioskan Flash多功能读数仪测定样品在A450的吸光值。取OD值高于背景0.07-0.1左右值作为抗体的结合效价。经GraphPad Prism软件t-test检验统计各组之间的差异显著性。
15血清抗体的中和试验及IC50测定
将Huh7细胞按每孔10000个细胞接种于96孔细胞培养板(NUNC),37℃细胞培养箱培养12h。小鼠血清1:40稀释于150ul细胞完全培养基并与HCVcc各型病毒株150ul(约50-200FFU)混匀后于37℃细胞培养箱孵育1h后,将病毒血清复合物150ul加入Huh7细胞上,37℃细胞培养箱培养孵育4-5h后,弃细胞上清,以细胞完全培养基换液。同时,设定PBS免疫组血清及不加血清组对照。72h后,以4%多聚甲醛固定液固定细胞1h,PBS洗涤3遍,BSA封闭液封闭1h后,加入1:1000稀释的抗HCVNS5A鼠单抗30ul,室温孵育1h,PBS洗涤4遍,加入1:5000Hochest染核抗体和1:1000的Alexa Fluor 488荧光标记二抗混合液50ul,室温孵育1h后,PBS洗涤4遍,最后在荧光显微镜(Leica)下对每孔的荧光斑点数进行计数。不加血清组的荧光斑点数为基准,中和效果(%)=(不加血清组的荧光斑点数-相应孔中的荧光斑点数)/不加血清组的荧光斑点数*100%.经GraphPad Prism软件t-test检验统计各组之间的中和差异显著性。
为测定半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50),将各组6只小鼠的血清样品等体积混合后以起始稀释浓度1:20进行2倍比稀释,按上述中和实验方法测定每组对不同病毒的半数抑制浓度。经GraphPad Prism软件XY拟合曲线后,统计其IC50值。
本发明的主要优点在于:
(1)首次研发了一种可分泌表达,并自我组装的展示有HCV截短包膜蛋白E2的纳米颗粒,该纳米颗粒可以作为一种免疫原,并在小鼠体内诱导了高滴度的,具有良好中和活性的广谱性中和抗体。
(2)由生物膜干涉技术检测颗粒与AR3A构象抗体在液相的结合能力,发现sE2-Ferritin纳米颗粒显著高于sE2亚单位疫苗,结合受体结合试验及与病人血清结合试验的同样现象,可推测可能由于纳米颗粒有效的富集sE2均匀分布于颗粒表面,对于结合的检测抗体起到了放大信号的左右,也可能在载体颗粒表面sE2形成了多聚体或其它展示形式,增强了其对抗体及受体的亲和能力。这可能有助于发展HCV的检测试剂盒。
(3)与传统HCV疫苗相比,该候选疫苗具有无核酸复制的安全性,免疫原性及抗原性强等优点,能够以较低的免疫剂量诱导更高效的针对HCVcc的广谱性中和抗体。
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1 sE2-Ferritin可成功在果蝇S2细胞中分泌表达
用于在果蝇S2细胞中分泌表达sE2-Ferritin蛋白的重组质粒pMT/Bip/sE2-Ferritin-V5-HisA如图1A-C所示,将1b型HCV标准株Con1的包膜蛋白E2截断分泌段(384-661)基因密码子优化后连接于幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白载体基因上进行融合表达,以期通过铁蛋白的自身组装,将HCV包膜蛋白正确展示于该铁蛋白表面,从而形成能够自我组装且分泌于细胞上清的纳米颗粒,增强包膜蛋白的抗原性。另外,亚单位疫苗重组质粒pMT/Bip/sE2-V5-HisA及pMT/Bip/Ferritin-V5-HisA作为对照,为了不影响颗粒的组装,免去质粒上his标签的感染,本发明人分别于sE2-Ferritin及Ferritin基因片段后接终止密码子,而sE2蛋白则带有纯化标签his。将三种重组表达质粒转染S2细胞后48h取出2×106细胞加入终浓度为5μM的氯化铬诱导表达,72h后收取上清,以实验室制备的HCV特异性抗体1C9进行westernblot检测,所得结果如图1D,特异性抗体检测到了目的条带且sE2-Ferritin及sE2大小分别为66KDa和46KDa。将重组质粒与pCoBlast共转果蝇S2细胞,经过杀稻瘟菌素筛选,获得稳定细胞株。将细胞株分别置于1L旋转摇瓶中扩大培养,当细胞密度达到4×106个/mL时加入终浓度为5μM的氯化铬诱导表达,第8天离心收获上清,蛋白经超滤浓缩、镍柱纯化,纳米颗粒经蔗糖密度梯度离心及蔗糖垫纯化,通过12%SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色,结果如图1E显示,纯化的sE2及纳米颗粒蛋白条带较单一,纯度较高,分子量与免疫印记基本一致且Ferritin单体蛋白大小约为20KDa。
实施例2 sE2-Ferritin纳米颗粒可成功组装并纯化
为了确定单体sE2-Ferritin是否可以自我组装成纳米颗粒。本发明人将作为对照的分泌至上清的蛋白sE2通过镍柱进行纯化。分泌至上清的sE2-Ferritin及Ferritin经10%蔗糖垫后,以PBS重悬后进行10%-50%蔗糖密度梯度离心,并分为12层进行SDS-PAGE,酶联免疫吸附等试验。由图2A考马斯亮蓝染色可知sE2-Ferritin与Ferritin分别分布于5,6,7层及3,4,5层。图2B-C可知,以HCVE2特异的检测抗体1C9及构象抗体1B4分别进行免疫印记及酶联免疫吸附试验检测的sE2-Ferritin分布层均与考马斯亮蓝染色结果一致。暗示sE2-Ferritin及对照Ferritin可能组装成为纳米颗粒。图2D为冷冻电镜结果,由图可知sE2-Ferritins及Ferritin的确自我组装成为了纳米颗粒,且Ferritin表面光滑无刺突,而sE2-Ferritin表面粗糙有刺突,这预示着sE2展示在其表面。两颗粒大小均为10nm左右。
实施例3纳米颗粒所展示的HCVsE2包膜蛋白近乎天然构象
为了检测能够自我组装的纳米颗粒所展示的sE2是是否近乎于HCV包膜蛋白E2的天然构象,如图3A-B所示,本发明人分别用HCV的线性中和抗体AP33和构象中和抗体AR3A与sE2-Ferritin纳米颗粒进行结合,与对照Ferritin颗粒相比,在单体等摩尔数条件下,sE2-Ferritin与sE2均可与两种抗体相结合,且纳米颗粒的结合能力显著强于蛋白,并且该结合呈现为剂量依赖性。图3C显示纳米颗粒展示的sE2可与HCV受体CD81结合,且该结合显著高于sE2蛋白,并呈现剂量依赖性,以上预示纳米颗粒展示的HCV截断包膜蛋白近乎于天然构象。通过生物膜干涉技术检测构象中和抗体AR3A与sE2-Ferritin纳米颗粒及sE2蛋白的结合能力,在液相结合环境下,展示sE2的纳米颗粒的结合平衡常数(<1.0E-12)显著高于蛋白的结合平衡常数(3.13E-10),展现为极高的抗体亲和力,并且如图3D,以Ferritin作为对照颗粒,sE2-Ferritin与48例感染HCV的病人血清的结合能力显著高于sE2,预示着该纳米颗粒有助于开发HCV的检测试剂盒。
实施例4 sE2-Ferritin纳米颗粒抗原性显著高于亚单位疫苗sE2,且佐剂CpG可提高其免疫效果。
为了检验sE2-Ferritin(sF)纳米颗粒相对于单价苗sE2在免疫原性及抗原性是否有显著性提高,如图4A,本发明人将单体等摩尔数的免疫原sE2(10ug),sF(14.3ug),F(4.3ug)在佐剂Alum及Alum+CpG的辅助作用下分别注射至腹腔免疫小鼠。如图4B,三免后,检测血清抗体滴度,无论是否加佐剂CpG,以Ferritin(F)作为对照组,sF与sE2的抗体滴度均相当,但Alum+CpG组的抗体滴度显著高于Alum组。在佐剂Alum+CpG组中,血清抗体在1:40的稀释度下,针对部分HCVcc病毒株如图4C所示,1b型临床适应株PR79L9,PR26C3mt及标准株Con1,2a型JFH1,sF产生的血清抗体中和水平显著高于sE2,且sF产生血清的中和百分率针对大部分株型达60%以上。而在佐剂Alum组中,虽然有少数中和率可达60%,但绝大多数中和率为50%以下。四免后血清抗体滴度如图5A,无论是否加佐剂CpG,均可达到106左右。且在血清抗体在1:40的稀释度下针对部分HCVcc病毒株如图5B所示,1b型临床适应株PR79L9,PR52B6mt,2a型Jc1,JFH1,4a型ED43,5a型SA13,sF产生的血清抗体中和水平显著或极显著高于sE2,且sF四免产生血清的中和百分率针对大部分株型较之三免有所提高,可达80%以上。另外IC50结果(见表3)显示,针对绝大多数病毒,sE2-Ferritin纳米颗粒产生抗体的中和半数抑制倍数比亚单位疫苗sE2提高2-5倍不等。综上所述,sE2-Ferritin纳米颗粒的抗原性显著强于亚单位候选苗sE2,且四免后,在佐剂Alum+CpG的辅助免疫下,当血清稀释度为1:40,针对大部分HCV病毒株型,其中和百分率可达80%,具有中和广谱性。
表3 sE2-Ferritin纳米颗粒产生的血清对HCVcc的IC50
实施例5 sE2-Ferritin纳米颗粒抗原性对免疫剂量具有选择性且其抗体滴度可在小鼠体内终生持续
为了研究sE2-Ferritin纳米颗粒的抗原性是否具有剂量依赖性,本发明人腹腔注射,如图6A以单体等摩尔数0.65nmol(sF:43ug,sE2:30ug,F:13ug),0.217nmol(sF:14.3ug,sE2:10ug,F:4.3ug),0.065nmol(sF:4.3ug,sE2:3ug,F:1.3ug)为免疫原,以Alum+CpG为佐剂分别免疫小鼠。如图6B,四免后,抗体滴度均可达近106左右。如图6C所示,在血清抗体稀释度为1:40时,0.65nmol的免疫剂量基本饱和,纳米颗粒及亚单位疫苗产生血清抗体对于Con1和JFH1的中和能力并无显著差异,且其中和百分率可达90%左右。在0.065nmol免疫剂量下,也无差异,且中和百分率只有60%-70%。只有当免疫剂量为0.217nmol时,sE2-Ferritin纳米颗粒产生血清的中和能力极显著高于亚单位疫苗sE2。且此时sE2-Ferritin纳米颗粒产生血清的中和百分率仍可达90%以上。图6D显示,小鼠四免后,每隔8周采血检测血清抗体滴度,直致30周,sE2-Ferritin纳米颗粒及亚单位疫苗抗体滴度均可维持在106左右,几乎持续了小鼠的终生。以上说明sE2-Ferritin纳米颗粒在低剂量免疫时其产生抗体中和水平较低,高剂量时过于饱和,只有在适当剂量下(0.217nmol),才可以既减轻免疫原剂量,又最大限度提高其抗原性。本试验中sE2-Ferritin纳米颗粒以低于亚单位疫苗三倍免疫剂量达到了与其相同的中和百分率(90%),且其抗体滴度可几乎在小鼠体内终生存在。
讨论
丙型肝炎病毒是世界范围内危害公共健康的严重问题。目前全球已经有超过1.7亿HCV慢性感染病例,每年还有3到4百万新发病例。虽然新的DAA疗法已将丙型肝炎的SVR提高到90%以上,但药物价格昂贵,可引起病毒耐药突变,再感染等状况,且无法挽救因感染而至的肝硬化及肝癌患者。因此开发预防性的HCV疫苗尤为重要。
本研究将HCV截短包膜蛋白E2与幽门螺旋杆菌非血红素铁蛋白在S2细胞中融合表达,获得了稳定表达的稳转细胞系,sE2可通过该铁蛋白的24个单体的自身组装从而展示在表面,由于融合蛋白N端具有信号肽,因此本发明人成功在分泌上清中检测到目的蛋白的表达,并且经过蔗糖垫,密度梯度离心等方法将其纯化并鉴定其有所组装。电镜下观察,颗粒大小为10nm与对照颗粒相比,可见包膜蛋白的刺突样结构,指示其成功展示于载体颗粒表面。通过sE2-Ferritin与HCV中和抗体,病人血清及受体的结合活性分析可知,该颗粒可剂量依赖性结合HCVE2特异性线性及构象抗体,对于受体及病人血清也具有结合活性,指示sE2展示在载体颗粒表面并维持了近乎天然的正确构象。由生物膜干涉技术检测颗粒与AR3A构象抗体在液相的结合能力,发现sE2-Ferritin纳米颗粒显著高于sE2亚单位疫苗,结合受体结合试验及与病人血清结合试验的同样现象,可推测可能由于纳米颗粒有效的富集sE2均匀分布于颗粒表面,对于结合的检测抗体起到了放大信号的左右,也可能在载体颗粒表面sE2形成了多聚体或其它展示形式,增强了其对抗体及受体的亲和能力。这可能有助于发展HCV的检测试剂盒。
对于纳米颗粒的抗原性,本发明人通过小鼠免疫试验进行检验,三免后,sE2-Ferritin相比sE2就展示了一定的抗原性,针对大部分HCVcc中和百分率可达60%。四免后血清在1:40的稀释度下,sE2-Ferritin组在针对大部分HCVcc病毒如1b型临床适应株PR79L9,PR52B6mt,2a型Jc1,JFH1,4a型ED43,5a型SA13等的中和百分率相比sE2组有显著性提高,并可达80%左右。并且佐剂Alum+CpG较之Alum无论在抗体滴度还是中和水平上效果要更为理想。另外本发明人对于免疫原剂量的选择上进行了研究及分析,如图6可知,由于高剂量免疫处于饱和状态,低剂量免疫达不到较高的中和水平,只有当在单体摩尔数为0.217的条件下免疫sE2-Ferritin,其中和水平显著高于sE2。即以低于亚单位疫苗三倍免疫剂量达到了与其相同的中和百分率—90%,既减轻免疫原剂量,又最大限度展现了其抗原性。表3更加系统全面的根据IC50比对了sE2-Ferritin纳米颗粒与sE2组的差别,可达2-5倍。
综上所述,本发明人采用S2昆虫表达系统,表达了能够自我组装且分泌于上清中的正确展示HCV包膜蛋白E2的纳米颗粒,与传统HCV疫苗相比,该候选疫苗具有无核酸复制的安全性,免疫原性及抗原性强等优点,能够以较低的免疫剂量诱导针对HCVcc的广谱性中和抗体,具有一定开发潜力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (10)

1.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白是抗原肽与载体蛋白融合所形成的,其中所述抗原肽衍生自HCV包膜蛋白E2;优选地,所述抗原肽具有HCV包膜蛋白E2的第384-661位氨基酸。
2.一种分离的多核苷酸,所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
3.一种表达载体,所述表达载体含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞,所述的宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体,或者在基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种药物组合物,所述的组合物含有权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或者权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的宿主细胞,以及药学上可接受的载体和/或辅料。
6.一种疫苗组合物,所述的组合物含有权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或者权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的宿主细胞,以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
7.如权利要求6所述的疫苗组合物,其特征在于,所述的疫苗组合物还含有佐剂。
8.如权利要求1所述的融合蛋白的用途,(a)用于制备针对HCV的抗体;和/或(b)用于制备治疗或预防与HCV相关的疾病的药物。
9.一种制备权利要求1所述的融合蛋白的方法,包括步骤:
(i)在适宜条件下培养权利要求4所述的宿主细胞,从而表达权利要求1所述的融合蛋白;
(ii)纯化所述融合蛋白。
10.一种治疗方法,给需要的对象施用权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的多核苷酸或者权利要求3所述的表达载体或者权利要求4所述的宿主细胞或权利要求5所述的药物组合物或权利要求6所述的的疫苗组合物。
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