CN106337038A - 一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用。通过转肽酶剪切制备疫苗，实验结果表明，该方法简单方便、工艺稳定，所制备的嵌合VLP用作疫苗能有效激活保护性免疫反应，产生很高的中和抗体滴度。

Description

一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种新型的疫苗生产技术，采用新的抗原展示技术，通过蛋白剪切把抗原展示到VLPs表面，以生产疫苗。

背景技术

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是一种重要的疫苗工具。VLPs可以模拟病毒的感染，而且带有病毒的抗原，可以产生有效的免疫保护。再加上VLP不含有病毒的基因组，因此非常安全。此外，VLPs还有一个广泛的应用就是作为载体，展示异质抗原[1]。

目前，在VLPs上展示异质抗原，主要有两种方法：基因融合表达、化学偶联[2]。通过基因融合，可以把抗原和VLP融合表达，目的抗原就能展示在VLP表面。要生产不同疫苗，都需要从克隆开始，到表达，再到VLPs纯化，周期很长。化学偶联包括非共价结合和共价交联。非共价结合通过受体配体相互作用、链霉亲和素和生物素的高亲和力，把抗原结合在VLPs表面，但是这种方法产生的VLPs不一定有保护作用[3]。共价交联需要特异性修饰特定氨基酸，比如赖氨酸，使得氨基酸拥有活性基团，通过化学反应，把抗原共价结合到VLPs表面。化学反应可以在同一个VLPs上偶联不同抗原，发挥了VLPs展示平台多样性的优势。不过化学反应特异性不是很高，可能导致偶联的抗原构象不对，加上化学反应效率不理想[4]，可能降低抗原活性[5]，过程复杂等限制性因素，导致这种方法不是很理想。

因此本领域技术人员致力于开发新型简单、高效、方法可靠、工艺稳定的在VLPs上展示异质抗原的的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种嵌合VLP(病毒样颗粒)，所述嵌合VLP具有式I所示结构的多肽：

A-B-C (I)

其中，

元件A为载体蛋白；

元件B为转肽酶识别基序；

元件C为外源抗原肽；

“-”表示连接上述各元件的共价键或接头。

在另一优选例中，所述VLP选自下组：乙肝病毒病毒样颗粒、噬菌体Qβ病毒样颗粒、噬菌体MS2病毒样颗粒、豇豆花叶病毒样颗粒、人戊肝病毒样颗粒、和人肠道病毒E71病毒样颗粒等。

在另一优选例中，所述元件A为乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B coreprotein)或其片段(如50-120个氨基酸长度的多肽)。

在另一优选例中，所述元件A为乙肝病毒核心蛋白的N核心片段。

在另一优选例中，所述元件A为乙肝病毒核心蛋白的第1-79位氨基酸组成的多肽。

在另一优选例中，所述转肽酶为转肽酶A。

在另一优选例中，所述基序为LPXTG基序，优选地为LPETGG基序。

在另一优选例中，所述元件A与所述元件C来自不同的物种。

在另一优选例中，所述元件C为具有外源抗原表位的抗原肽。

在另一优选例中，所述外源抗原选自：人巨细胞病毒(HCMV)、肠道病毒(如肠道病毒EV71)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、引起自身免疫性疾病的抗原。

在另一优选例中，所述自身免疫性疾病选自：自身免疫性关节炎、风湿性心脏病、系统性红斑狼疮、系统性血管炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血等。

在另一优选例中，所述元件C选自：人巨细胞病毒(HCMV)抗原肽gB AD-4、肠道病毒EV71抗原肽SP55、和肠道病毒EV71抗原肽SP70、结核杆菌CFP-10(antigen culture filtrate protein 10，CFP-10)、自身免疫关节炎IL-Ra蛋白(IL-1 receptor antagonist(IL-1Ra))等。

在另一优选例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，优选地，所述元件A的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述元件C的序列如SEQ ID NO.:5、、SEQ ID NO.:6、或SEQ ID NO.:7所示。

在另一优选例中，所述共价键为肽键。

在另一优选例中，所述嵌合VLP具有2种以上的式I所示的多肽，其中不同的多肽具有相同的元件A和元件B，以及不同的元件C。

在另一优选例中，所述元件C的N端具有3～5个甘氨酸。

本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的VLP。

在另一优选例中，所述多核苷酸不包含编码元件C的序列。

本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体为质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、或腺相关病毒载体。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞(如大肠杆菌)或真核细胞(如CHO细胞、NS0细胞、或293细胞)。

本发明的第五方面，提供了一种组合物，所述组合物中包括

(1)本发明第一方面所述的VLP、本发明第二方面所述的多核苷酸、和/或本发明第三方面所述的载体，和

(2)药用辅料(如药学上可以接受的载体、赋形剂、佐剂等)。

在另一优选例中，所述组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述组合物为疫苗组合物。

本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的VLP、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体的用途，用于制备疫苗；或者

用于制备针对所述外源抗原肽的抗体。

在另一优选例中，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、或抗血清。

本发明的第七方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的嵌合VLP的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)提供病毒样颗粒，

其中，至少一种构成所述病毒样颗粒的多肽C端具有转肽酶识别基序；

(2)提供外源抗原肽，

其中，所述抗原肽的N端具有3～5个(优选为3个)甘氨酸；和

(3)嵌合反应，

提供转肽酶，并配制反应体系进行嵌合反应从而制得所述嵌合VLP；所述反应体系中包括：步骤(1)提供的所述病毒样颗粒、步骤(2)提供的所述抗原肽、和所述转肽酶。

在另一优选例中，所述反应体系中，病毒样颗粒：抗原肽：转肽酶的摩尔量比为:30μM～50μM：50μM～100μM：120μM～500μM。

在另一优选例中，所述反应体系中反应时间为0.5小时～2小时。

在另一优选例中，所述病毒样颗粒为乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒，并且所述病毒样颗粒包括分成两段的N核心多肽片段和C核心多肽片段。

在另一优选例中，所述N核心多肽片段的C端具有转肽酶识别基序。

在另一优选例中，所述N核心多肽片段为乙肝病毒核心抗原的第1－79位氨基酸残基构成的多肽。

在另一优选例中，所述C核心多肽片段为乙肝病毒核心抗原的第80－185位氨基酸残基构成的多肽。

在另一优选例中，所述抗原肽为具有病毒抗原表位的抗原肽。

在另一优选例中，所述外源抗原选自：人巨细胞病毒(HCMV)、肠道病毒(如肠道病毒EV71)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、自身免疫性关节炎(任意已知抗原在N端加入3～5个甘氨酸均可展示)。

在另一优选例中，所述抗原肽选自：人巨细胞病毒(HCMV)抗原肽gB AD-4、肠道病毒EV71抗原肽SP55、和肠道病毒EV71抗原肽SP70、结核杆菌CFP-10(antigen culture filtrate protein 10，CFP-10)、自身免疫关节炎IL-Ra蛋白(IL-1 receptor antagonist(IL-1Ra))等。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1本发明的原理。转肽酶的184半胱氨酸先与VLPs形成中间产物，这个产物能被N端带有3个甘氨酸的异质抗原替换，这样异质抗原就能展示在VLPs表面的刺突上。

图2蛋白胶考马斯亮蓝染色检测硫酸铵沉淀浓缩、蔗糖梯度分离splitN-LPETGG-C(a)。非变性琼脂糖胶紫外(EB)以及考马斯亮蓝染色(CB)检测split N-LPETGG-C蔗糖梯度(b)

图3蛋白胶考马斯亮蓝染色检测Ni²⁺柱亲和纯化和弱阴离子交换monoQ进一步分离转肽酶S-6xHis(a)。AKTA弱阴离子monoQ纯化转肽酶S-6xHis紫外读数曲线(b)。

图4蛋白胶考马斯亮蓝染色检测Ni²⁺柱亲和纯化和弱阴离子交换monoQ进一步分离HCMV gB GGGS-AD-4-6xHis(a)。AKTA弱阴离子monoQ纯化HCMVgBGGGS-AD-4-6xHis紫外读数曲线(b)。

图5把HCMV gB GGGS-AD-4-6xHis高效展示到split HBc N-LPETGG-C VLPs表面不影响VLPs结构。该蛋白偶联到N-LPET的时间梯度，反应在1h接近最大(a)。该不同浓度的蛋白偶联到N-LPET的连接效率，240μM达最大(b)。蛋白电泳和非变性琼脂糖胶电泳检测蔗糖梯度分离目的产物(c)。透射电镜分析展示该蛋白前后VLPs的结构(d)。

图6用嵌合split HBc N-LPETGGGS-AD-4-6xHis-C免疫小鼠比GGGS-AD-4-6xHis产生更高的抗体滴度(a)。抗体滴度与免疫次数有关(b)。

图7蛋白胶考马斯亮蓝染色检测硫酸铵沉淀浓缩、蔗糖梯度分离HBc-SP55(a)。非变性琼脂糖胶紫外(EB)以及考马斯亮蓝染色(CB)检测HBc-SP55蔗糖梯度(b)。

图8为HBc-SP70蛋白胶(a)和非变性琼脂糖电泳(b)检测蔗糖梯度。

图9把EV71的GGG-SP55高效展示到split HBc N-LPETGG-C VLPs表面不影响VLPs结构。结构预测GGG-SP55偶联和SP55基因融合均能将该表位展示在VLPs表面(a)GGG-SP55偶联到N-LPET，连接效率高达90％(b)。蛋白电泳检测盒非变性琼脂糖电泳检测蔗糖梯度分离目的产物(c)。电镜观察基因融合的SP55、SP70与化学偶联的相关表位的VLPs结构(d)。

图10把EV71的GGG-SP70高效展示到split HBc N-LPETGG-C VLPs表面不影响VLPs结构。结构预测GGG-SP70偶联和SP70基因融合均能将该表位展示在VLPs表面(a)不同浓度的GGG-SP70偶联到N-LPET，240μM和480μM的底物使得偶联效率达到很高(b)。蛋白电泳检测盒非变性琼脂糖电泳检测蔗糖梯度分离目的产物(c)。

图11用转肽酶介导的酶化学偶联GGG-SP55和GGG-SP70到VLPs表面可以诱导针对EV71中和保护性抗体，抗体滴度与基因融合展示的表位VLPs相近。HBc为基础的VLPs均可以产生高滴度的N-LPETGG-C VLPs相关抗体(a)。酶化学偶联GGG-SP55到N-LPETGGG-C VLPs比HBc-SP55诱导高的多的抗体滴度(b)。与基因融合的嵌合型HBc-SP55 VLPs相比，酶化学偶联抗原表位GGG-SP55到VLPs表面，显著改善抗体识别GGG-SP55的能力(c)。酶化学偶联GGG-SP70到N-LPETGGG-C比HBc-SP70诱导更高一点的抗体滴度(d)。酶化学偶联抗原表位GGG-SP70到VLPs表面比HBc-SP70诱导更高更快的抗体滴度(e)。

图12酶化学偶联和基因融合展示的EV71表位均能产生较高滴度的中和性保护性抗体，酶化学偶联的抗体滴度至少和基因融合的相近。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法，实验结果表明，该方法简单方便、工艺稳定，所制备的嵌合VLP用作疫苗具有很高的滴度。

具体地，本发明通过使用转肽酶sortase，把N端带有3个甘氨酸的多肽和蛋白质剪切到VLP表面。酶的反应具有条件温和、特异性高、能识别蛋白构象、效率高等优点，大大的优于化学反应。使用的抗原多肽可以商业合成，时间远远短于蛋白合成，大大缩短了生产周期。因此，可以使用本发明的方法把已知的抗原表位展示到HBc VLPs表面，生产新的疫苗。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

术语

载体蛋白和抗原肽

如本文所用，术语“载体蛋白”指在本发明的重组VLP中作为蛋白结构骨架的蛋白。这些载体蛋白，应当是构成所述VLP的多肽元件之一。通常，所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白，例如病原体蛋白，代表性的例子包括(但并不限于)：病毒蛋白、细菌蛋白、衣原体蛋白、支原体蛋白等。

如本文所用，术语“抗原肽(表位)”指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白的一段肽，该外源抗原肽相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肽段。通常，抗原表位指免疫反应拟靶向的肽段，较佳地来源于其他病毒(如，人巨细胞病毒(HCMV)相关抗原、肠道病毒(如肠道病毒EV71)相关抗原、流感病毒M2相关抗原、II型登革热病毒衣壳蛋白的相关抗原、丙肝病毒相关抗原)，而不是来自所述载体蛋白。

本发明选用乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B core protein)或其片段组装成的VLPs(HBc VLPs)作为载体。HBc在大肠杆菌中大量表达并且组装成VLPs，在HBc VLPs上可以成功展示多种病毒的相关抗原。免疫这些抗原，均产生了病毒中和性抗体。另外，把HBc分成两段表达：N-core(N核心)1-79和C-core(C核心)80-185，也能组装成为VLPs。这种VLP可以在主要免疫区(majorimmunodominant region)展示外源的蛋白，比如GFP、整个外表面脂蛋白A(OSPA)等蛋白[6]。优选地，本发明使用split HBc N-LPETGG-C，在N-core的C端加入LPETGG motif，用于连接外源抗原。

本发明优选地实施方式中，所述N-core 1-79位氨基酸序列如下：

mdidpykefgatvellsflpsdffpsvrdlldtasalyrealespehcsphhtalrqailcwgelmtlatwvgnnledp(SEQ ID NO.:2)

其编码多核苷酸序列如下：

atggacattgacccttacaaagaatttggagctactgtggagcttctcagctttttgccttctgacttctttccttctgtcagggatctccttgacactgcctcagctctttatagggaagccttggagtctcctgagcattgctcacctcaccatactgcactcaggcaagccattctctgctggggagaattgatgactcttgctacctgggtgggtaacaatctagaggatcca(SEQ ID NO.:1)。

本发明优选地实施方式中，所述C-core 80-185位氨基酸序列如下：

asrdlvvnyvntnvglkirqllwfhiscltfgretvleylvsfgvwirtppayrppnapilstlpettvvrrrdrgrsprrrtpsprrrrspsprrrrsqsresqclehhhhhh(SEQ ID NO.:4)

其编码多核苷酸序列如下：

gcatccagagatcttgttgttaactatgttaatactaatgtgggtttgaagatcaggcaactcttgtggtttcatatatcttgccttacttttggaagagagactgtacttgaatatttggtctcttttggagtgtggattagaactcctccagcctatagaccaccaaatgcccctatcttgtcgactcttccagaaactactgttgttcgaagaagggacaggggcagatcccctagacgtagaactcccagccctagaagaaggagatccccatctcctaggaggagaaggtctcaatctagggaatctcaatgtctcgagcaccaccaccaccaccac(SEQ ID NO.:3)。

在本发明优选地实施方式中，人巨细胞病毒(HCMV)相关抗原(gB AD-4)的氨基酸序列如下：

gstsmkpinedldegimvvykrniagsgcqltfweasertirseaedsyhfssakmtatflskkqevnmsdsaldcvrdeainklqqifntsynqtyekygnvsvfetsgglvvfwqgikqkslehhhhhh(SEQ ID NO.:5)。

在本发明优选地实施方式中，肠道病毒EV71相关抗原SP55的氨基酸序列如下：

pdsreslawqtatnp，(SEQ ID NO.:6)。

在本发明优选地实施方式中，肠道病毒EV71相关抗原SP70的氨基酸序列如下：

yptfgehkqekdley，(SEQ ID NO.:7)。

转肽酶

转肽酶SortaseA在金黄色葡萄球菌中发现，可以识别LPXTG保守序列，断裂T、G共价键，并且可以把N端带有甘氨酸的多肽或者蛋白连接到T后边。。

通过转肽酶，成功把人巨细胞病毒(HCMV)的抗原片段(antigenic domain)gB AD-4展示在split HBc N-LPETGG-C VLPs表面，效率达70％以上。用N-LPETGGGS-AD-4-6xHis免疫小鼠诱导的抗体滴度远高于GGGS-AD-4-6xHis，但是2种抗原诱导的抗体不具有中和人巨细胞病毒(HCMV)功能。数据表明，把AD-4片段设计为人巨细胞病毒(HCMV)的疫苗不能产生有效保护性抗体。也成功把肠道病毒EV71的两个抗原SP55和SP70展示到VLPs表面，效率达90％以上。将形成的新的嵌合VLPs免疫小鼠，酶联免疫吸附实验(ELISA)检测到很高的抗体滴度。酶化学偶联和基因融合展示肠道病毒EV71的抗原在HBc VLPs表面，均能诱导较高滴度的中和性抗体。

已有的实验数据表明，转肽酶的效率很高。嵌合VLPs作为疫苗，能产生很高的抗体滴度。展示已知的抗原表位，能产生较高滴度的病毒相关中和性抗体。由于展示外源抗原，可以诱导高滴度的特异性抗体，因此该技术也可以用来探索候选蛋白或者多肽能否作为疫苗设计靶位。

嵌合抗原的制备

目前把外源抗原表位展示到VLPs，可以通过基因融合和化学交联。基因融合耗时长，而且不同的疫苗生产纯化工艺复杂，成本高。化学交联的方法把外源抗原表位非共价结合和共价结合到VLPs表面，难于控制抗原的空间结构，有可能影响抗原性。另外，化学方法条件比较苛刻，成本高。

本发明中，以乙肝病毒核心抗原(HEPATITIS B CORE ANTIGEN，HBcAg)为疫苗载体，将HBcAg在抗原决定簇位置断开，分成N端和C端两个肽段同时在大肠杆菌表达，两者能够正确折叠组成类似天然核衣壳的病毒样颗粒(Virus-Like particle，VLP)。这样制备的HBc VLP抗原决定簇所在的刺突部位有一游离的羧基末端，设计时加上LPETGG保守序列，该序列可以被转肽酶Sortase A识别。在转肽酶Sortase A的作用下，N端带有3个甘氨酸的外源抗原肽或抗原蛋白可以剪切连接到HBc VLP的刺突部位。用这样的嵌合型VLP免疫小鼠，可产生高滴度的针对外源抗原的特异性抗体。通过转肽酶，可以把一种或多种不同的外源抗原展示在VLP表面，快速构建单价或多价疫苗。该模块化的新型VLP疫苗研发平台可以大大提高疫苗研发能力，降低疫苗生产成本。

在本发明中，“嵌合抗原”、“疫苗”、“本发明抗原”、“本发明嵌合抗原”可互换使用，指具有式I所述结构多肽的嵌合病毒样颗粒。此外，应理解，所述术语还包括嵌合抗原的活性片段和衍生物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明嵌合抗原有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

本发明嵌合抗原或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或嵌合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明嵌合抗原的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明嵌合抗原的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

应理解，所述术语还包括本发明嵌合抗原的衍生物，指本发明嵌合抗原在经过1-3个氨基酸添加或替换、1-2个氨基酸缺失并仍具有相应的免疫活性的抗原。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

一旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(嵌合蛋白)。

此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列(相关抗原肽元件)。

肽接头

本发明提供了一种嵌合蛋白，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对嵌合蛋白的稳定性的影响。

连接肽的长度一般为0-10个氨基酸，较佳地1-5个氨基酸。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的嵌合抗原或本发明的可编码嵌合抗原的多核苷酸，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种嵌合抗原或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多种嵌合抗原或多核苷酸)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(1)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明嵌合抗原或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组蛋白。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的重组蛋白)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明嵌合抗原)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予重组蛋白疫苗，即重组蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：自身免疫性疾病、肿瘤等。

在各疫苗剂份中所选用的重组蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。

本发明的主要优点在于：

(1)可以把合成的抗原肽通过在室温下蛋白质剪切的方法，展示到VLPs表面，在1小时内完成反应，反应速度快，剪切效率高；

(2)外源抗原多肽可以商业合成，大大缩短生产周期；

(3)可在同一VLPs载体上展示不同外源抗原，提高抗体效果，大大降低生产成本。

(4)所制备的嵌合VLP用作疫苗能有效激活保护性免疫反应，产生很高的中和抗体滴度。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

本发明实施例中使用的split HBc N-LPETGG-C为在1-79 N-core的C端接入LPETGG序列，80-185C端带有6xHis标签(制备方法可以参考文献[7])。EV71的SP55和SP70抗原表位，在N端带有3个甘氨酸，由上海吉尔公司完成多肽合成。基因融合的HBc-SP55和HBc-SP70是把SP55和SP70表位连接在1-79和80-185之间，展示在VLPs表面，作为对照。使用的HCMV gB AD-4来源于AD-169，AD-4由gB的112-132加IAGSG linker和344-438基因融合而成。在AD-4的N端加GGGS 4个linker，C端带有6xHis用于Ni²⁺柱亲和纯化。转肽酶S-6xHis、HMCV gB GGGS-AD-4-6xHis抗原以及使用的VLPs均在BL21 plysS中表达(购自北京鼎国公司)表达。

实施例1 硫酸铵沉淀富集和蔗糖梯度分离两步法纯化VLPs

本发明中使用的split HBc N-LPETGG-C和HBc-SP55与HBc-SP70的基因插入pET28a载体(购自Novagen公司)上，而后转化到BL21plysS中表达。OD为0.6-0.8时，加入0.5mM IPTG，18℃、250rpm过夜诱导。菌液在BeckmanJLA10,500转子5000rpm、4℃、10min离心后，用50mM Tris pH7.5，150mM NaCl(NT buffer)中洗涤一次。把菌液转移到50ml的离心管中，5000rpm、4℃、10min离心。弃上清，菌液可以-80℃长期保存。1L的菌液，用30ml的NT buffer重悬(加入50μg/ml的RNaseA)后，超声破碎：工作5s，停5s，共30min。超声破碎产物在Beckman JA25,50转子12,000rpm、4℃、30min离心后，取上清用450μm滤器进一步过滤。

硫酸铵沉淀法富集VLPs步骤：

1.过滤好的VLPs上清，加入0.2g/ml的硫酸铵粉末，而后在冷库摇床90rpm缓慢混匀5min。

2.把混匀的样品，在Beckman JA25,50转子12,000rpm、4℃、30min离心后，弃上清。把6ml的NT buffer加入到离心管中，冷库摇床120rpm旋转，以溶解VLPs沉淀，混匀15min。

3.把重悬好的VLPs，加入到截留量为3kD的透析袋中，在1L的NT buffer中冷库透析过夜。

蔗糖梯度分离VLPs步骤：

1.配置蔗糖梯度：取2ml的10％-50％W/V(质量比体积)的蔗糖溶液(溶解在NT buffer中)，浓度从低到高，依次从底部缓缓加入到超离管中。

2.取2.5ml的样品加入超离管中，用电子天平两两配平。用Beckman SW41转子超离分离，条件：39,000rpm、4℃、2h。加速、减速均为max。而后分管收集，每管1ml。再用Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳(15％)和非变性琼脂糖电泳(1.5％)分析蔗糖梯度的样品。

3.收集目的条带所在的管，在1L的NT buffer中冷库透析过夜。再用100kD的超滤管浓缩到2mg/ml左右。-80℃冻存备用。

实施例2 Ni²⁺柱亲和纯化以及阴离子交换两步法纯化转肽酶和蛋白

本发明中的两个蛋白：转肽酶S-6xHis和GGGS-AD-4-6xHis均是在pET28a载体上，转化到BL21plysS中表达。诱导条件和VLPs的诱导条件一样。超声条件也一样。将超声后离心的上清，进行Ni²⁺柱亲和纯化和离子交换纯化。所用的buffer均为NT buffer。

Ni²⁺柱亲和纯化步骤

1.把30ml上清加入NT buffer平衡好的Ni²⁺柱中，冷库摇床混匀30min，转速90rpm。

2.让未结合Ni²⁺柱的溶液重力流出，收集起来，标记为flowthrough。

3.加入10ml含有25mM imidazole的NT buffer，进行第一次wash，标记为wash 1。

4.加入10ml含有50mM imidazole的NT buffer，进行第二次wash，标记为wash 2。

5.加入10ml含有75mM imidazole的NT buffer，进行第三次wash，标记为wash 3。

6.加入10ml含有500mM imidazole的NT buffer，进行洗脱，标记为elution。

阴离子交换进一步纯化蛋白

1.把Ni²⁺柱亲和纯化的蛋白溶液，在1L的50mM Tris pH7.5的buffer中透析过夜，用截留量为3kD的超滤管浓缩到2ml左右。

2.把2ml的样品，加入到用50mM Tris pH7.5buffer平衡好的monoQ中，用AKTA系统进行纯化。

3.设置程序用4ml的Tris洗涤未结合的蛋白，而后用线性梯度洗脱，0到1M Nacl，30ml。分管收集，每管1ml。

4.取UV读数高的管30μl样品，蛋白电泳检测。

5.把目的条带的产物，在1L的NT buffer中冷库透析过夜。而后用3kD的超滤管，浓缩到10mg/ml左右。-80℃冻存备用。

实施例3 嵌合VLP的制备

N端带有3个甘氨酸的蛋白和多肽剪切到spl it HBc N-LPETGG-C VLPs表面转肽酶在反应的过程中，需要CaCl₂来稳定中间产物，本发明中均使用2mMCaCl₂。反应温度为室温，18℃-25℃均可。工作buffer：50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl。反应体系：40μM split N-LPETGG-C VLPs+50μM S-4-6xHis+240μMGGGS-AD-4-6xHis或者480μM GGG-SP55/70。

实施例4 透射电镜分析剪切前后VLPs的结构

透射电镜数据均是委托国家蛋白中心电镜平台进行实验和数据采集。具体操作：

1.染色将稀释好的VLPs溶液(0.1mg/ml)左右，取20μl加入到铜网中，15秒后在滤纸上吸干后，加入0.1mg/ml的醋酸铀20μl，室温放置15秒。

2.漂洗把染色好的样品，把铜网放置在滤纸上吸干，再加入20μl的ddH₂O，15秒后再用滤纸吸干。红外线烘5分钟。将制备好的样品，在120Kv的电子显微镜下观察，看样品是否以VLPs的形式存在。

实施例5 免疫小鼠

本发明目前已用来免疫的小鼠有8组：PBS对照，剪切前的splitN-LPETGG-C VLPs对照，GGGS-AD-4-6xHis、N-LPETGGGS-AD-4-6xHis-C；HBc-SP55(基因融合展示的表位VLPs,载体蛋白氨基酸序列和抗原氨基酸序列与本发明的嵌合VLPs中的一致，作为阳性对照组，与实验组的序列是一致的)、N-LPETGGG-SP55-C，HBc-SP70(基因融合展示的表位VLPs,载体蛋白氨基酸序列和抗原氨基酸序列与本发明的嵌合VLPs中的一致)和N-LPETGGG-SP70-C。选6-8周龄的雌性Balb/c小鼠做抗原免疫原性分析，每组6只小鼠。将铝佐剂(Invivogen Alhydrogel 2％)与抗原按1:1(体积比，V/V)混合，移液器吹打混匀后，腹腔注射小鼠，每只小鼠100μl的抗原佐剂混合物，含有10μg的蛋白或VLPs。分3次免疫，每次免疫隔两周。每次免疫后两周，眼眶取血500μl用于ELISA分析。采取的血液先在37℃培养箱中放置30分钟，凝血后转移到4℃冷库，放置过夜使血清析出。之后在4℃,3000rpm(900xg)离心30min将上层血清转移到新的EP管后储存于-80℃冰箱。实验用小鼠均在本所SPF级动物平台饲养和进行实验。

实施例6 酶联免疫吸附(ELISA)测定抗体浓度

使用ELISA法测定血清中特异性抗体的滴度。将split HBc N-LPETGG-CVLPs(50ng/孔)，GGGS-AD-4-6xHis蛋白(200ng/孔)，合成多肽GGG-SP55或GGG-SP70(200ng/孔)用PBS溶液稀释后包被到96孔ELISA板(50μl/孔)，在4℃孵育12h。PBST洗板3次后，用含5％脱脂奶粉的PBST(200μl/孔)在37℃封闭1h。封闭结束后，用PBST洗3次，而后用含1％脱脂牛奶的PBST 1:1000稀释的血清样品(50μl/孔，每个样品两个复孔)在37℃孵育2h。再用PBST洗3次，而后添加含1％脱脂牛奶的PBST 1:5000稀释的HRP标记的小鼠二抗(50μl/孔)在37℃孵育1h。PSBT洗4次，彻底洗去未结合的二抗。再用50μl的TMB溶液显色至蓝色出现，最后用50μl的1M磷酸溶液终止，并用酶标仪测定OD450nm吸光值。

实验结果如图11所示，图11中a为使用HBc N-LPETGG-C为底物，进行ELISA检测的结果，反映出免疫以HBc为载体平台的样品，均能诱导HBc相关抗体。图b为使用GGG-SP55为底物，反映出只有含有GGG-SP55表位的VLPs才能诱导产生针对GGG-SP55的抗体。图c为取3次免疫小鼠的血清样本，以GGG-SP55为底物，检测特异性抗体的增长速度。发现用酶催化的化学偶联展示的GGG-SP55到VLPs表面与基因融合的嵌合HBc-SP55VLPs相比，能显著地提高抗体识别GGG-SP55的能力。图d为使用GGG-SP70为底物，反映出只有含有GGG-SP70表位的VLPs才能诱导产生针对GGG-SP70的抗体。图e为酶化学交联GGG-SP70到VLPs比基因融合的HBc-SP70诱导的抗体，识别GGG-SP70的能力要稍微强一些。

实验结果显示，转肽酶能高效的剪切外源蛋白和多肽表位到VLPs表面，以此嵌合VLPs免疫小鼠能产生高滴度的特异性抗体。

实施例7 滴定抗肠道病毒EV71的抗体中和滴度(neutralizing assay)

在BSL2中进行抗体的中和滴度滴定。先将血清样品在56℃水浴锅中孵育30min以灭活补体，而后把抗体以2倍梯度在96孔板中进行稀释(50μl/孔)，初始稀释度为8倍，最高稀释度为512倍。而后加入50μl/孔的浓度为2x10³TCID50/ml肠道EV71病毒，混匀后在37℃5％CO₂的培养箱中孵育1h。再加入100μl/孔浓度为1.5x10⁶cells/ml的RD细胞，混匀后，在37℃,5％CO₂的培养箱继续培养。3天后，用倒置相差显微镜下观察细胞病变(CytopathicEffect，CPE)，血清样本中的中和滴度被定义为能完全保护细胞不产生CPE的最高稀释度。

实验结果如图12所示，从图中可以看出用基因融合和酶催化的化学交联展示EV71的表位所产生的嵌合型疫苗，诱导出相近滴度的中和性保护抗体。说明通过酶催化的化学交联展示的表位，效率与基因融合方法生产的嵌合型VLPs疫苗相当。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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9.Schagger,H.Tricine-Sds-Page.Nat Protoc.2006,1,16-22.

Claims (10)

1.一种嵌合VLP(病毒样颗粒)，其特征在于，所述嵌合VLP具有式I所示结构的多肽：

A-B-C (I)

其中，

元件A为载体蛋白；

元件B为转肽酶识别基序；

元件C为外源抗原肽；

“-”表示连接上述各元件的共价键或接头。

2.如权利要求1所述的嵌合VLP，其特征在于，所述VLP选自下组：乙肝病毒病毒样颗粒、噬菌体Qβ病毒样颗粒、噬菌体MS2病毒样颗粒、豇豆花叶病毒样颗粒、人戊肝病毒样颗粒、和人肠道病毒E71病毒样颗粒等；

优选地，所述元件A为乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B core protein)或其片段(如50-120个氨基酸长度的多肽)。

3.如权利要求1所述的嵌合VLP，其特征在于，所述元件C为具有外源抗原的抗原表位的抗原肽；

优选地，所述外源抗原选自：人巨细胞病毒(HCMV)、肠道病毒(如肠道病毒EV71)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、引起自身免疫性疾病的抗原。

4.如权利要求1所述的嵌合VLP，其特征在于，所述元件C的N端具有3～5个甘氨酸。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的VLP。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

8.一种组合物，其特征在于，所述组合物中包括

(1)权利要求1所述的VLP、权利要求2所述的多核苷酸、和/或权利要求3中所述的载体，和

(2)药用辅料(如药学上可以接受的载体、赋形剂、佐剂等)。

9.权利要求1所述的VLP、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述的载体的用途，用于制备疫苗；或者

用于制备针对所述外源抗原肽的抗体。

10.一种制备权利要求1所述的嵌合VLP的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)提供病毒样颗粒，

其中，至少一种构成所述病毒样颗粒的多肽C端具有转肽酶识别基序；

(2)提供外源抗原肽，

其中，所述抗原肽的N端具有3～5个(优选为3个)甘氨酸；和

(3)嵌合反应，

提供转肽酶，并配制反应体系进行嵌合反应从而制得所述嵌合VLP；所述反应体系中包括：步骤(1)提供的所述病毒样颗粒、步骤(2)提供的所述抗原肽、和所述转肽酶。