CN109966483B

CN109966483B - 一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109966483B
Application number: CN201910277824.6A
Authority: CN
Inventors: 张松平; 苏志国; 魏江雪; 李正军; 杨延丽
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2039-04-08
Also published as: CN109966483A

Abstract

本发明提供了一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用，所述基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗包括铁蛋白纳米颗粒载体蛋白、表面抗原和内腔抗原，所述表面抗原分布于铁蛋白纳米颗粒的表面，内腔抗原分布于铁蛋白纳米颗粒的内部空腔。本发明所述基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗结构模拟了流感病毒的天然空间构象，呈现了多种流感病毒抗原，能同时发挥多种流感病毒抗原的免疫原性，激发更全面的免疫效应，提供更广谱的抗流感病毒的免疫保护效果。同时，本发明所述铁蛋白载体在人及哺乳动物等生物机体内广泛存在，用作疫苗载体理论上具有很好的安全性，有在老人及小孩中适用的可能性。

Description

一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种流感疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种多抗原仿生流感疫苗及其制备方法和应用，主要涉及一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用，具体涉及一种将衍生自流感病毒的抗原蛋白分别负载于铁蛋白纳米颗粒的外表面和装载于铁蛋白纳米颗粒中空腔室内部，模拟流感病毒天然结构的流感疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

作为最严重的传染病之一，流感的预防却一直是困扰人类的一大难题。目前，防治流感最为有效的措施仍然是接种流感疫苗。市场上现行的多价流感疫苗，均是针对流感病毒的两种表面抗原血凝集素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)，具有很好的安全性及抗原性，但有效性却受到极大限制。这是由于流感病毒的HA及NA抗原极易发生抗原漂变，使得流感病毒极易发生变异，给每年流感流行毒株的预测和流感疫苗的研制带来极大困难。因此，研发和制备具有广谱抗性的对多种不同的流行毒株均具有有效抗性的通用流感疫苗则尤为迫切。利用各毒株间的保守肽或优势表位，通过强免疫原性载体的免疫增强作用，可诱导产生强的针对流感病毒的广谱中和抗体或广谱的细胞免疫反应，进而保护动物或人类免受多种流感毒株的感染，是当前通用流感疫苗研究的主要策略。

在流感病毒的众多表位中，流感病毒HA抗原免疫原性强的头部和保守的茎杆部，基质蛋白M2(matrix protein 2)胞外部分M2e和位于病毒包膜内的M1(matrix protein 1)抗原，以及核蛋白NP(nuclear protein)抗原均是目前通用流感疫苗最关注的靶点。其中，NP和M1抗原的部分氨基酸序列在A型流感病毒间高度保守，主要诱导宿主的细胞免疫特别是CTL反应。M2e抗原序列在各流感毒株间亦高度保守，主要诱导体液免疫，但其免疫原性弱，由天然感染或传统疫苗引起的抗M2e的免疫反应，几乎可以被忽略。HA是位于流感病毒脂质包膜表面的同源三聚体跨膜糖蛋白，由介导受体结合的头部和介导病毒包膜与靶细胞膜融合的茎秆区组成；HA头部蛋白含有众多优势表位，免疫原性强，能诱导针对HA受体结合区的中和抗体，但在各流感毒株间差异大；相反，HA茎杆部尤其是酶切位点及融合肽序列在各流感毒株间则高度保守。以融合表达或混合等方式制备的多抗原通用流感疫苗，因其更完善的免疫原性而表现出了更广谱的免疫保护效应，是目前通用流感疫苗研究的新思路，甚至已有多家公司的多抗原通用流感疫苗进入临床研究。

当前多抗原通用流感疫苗研究的主要策略，可以分为以下几类：(1)将多段、同种抗原肽融合至强免疫原性载体外部：例如基于乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒(HBc)的3M2e-HBc疫苗，即是将3段重复的M2e多肽序列串联融合插入至HBc载体序列中，以达到免疫增强的目的；(2)将多种抗原肽融合至强免疫原性载体上：例如基于HBc载体的3M2e-NP-HBc疫苗，即是将3段重复的M2e多肽和一段NP多肽序列串联融合插入至HBc载体序列中，以获得更完善的免疫原性；再例如Vaccitech公司的MVA-(NP+M1)疫苗，即是基于改造的重组安卡拉病毒(MVA)作为载体，融合表达NP和M1抗原，并利用MVA具有的一定的佐剂效应，但需与传统的三价季节性流感疫苗(TVA)联合使用，用以提高后者的免疫保护率；(3)分别将不同种抗原融合或偶联至强免疫原性载体外表面得到多种疫苗后，将多者混合使用：例如基于腺病毒载体的AdV-HA与AdV-NP的混合疫苗，即是将AdV-HA与AdV-NP两种颗粒疫苗混合使用，可获得更好的免疫效果；(4)不基于强免疫原性载体的、多种抗原串联的融合疫苗：例如以色列BiondVax公司所研发的Multimeric-001广谱流感疫苗，即是将9段保守的HA、NP或M1线性表位串联，经融合表达得到具有广谱免疫效果的Multimeric-001疫苗，但其需与季节性流感疫苗联用才能达到更理想的免疫效果；(5)不基于强免疫原性载体的、多种抗原肽直接混合的混合疫苗：例如英国Imutex公司所研发的FLU-v疫苗，则是四种保守的线性表位肽(分别衍生自流感病毒的M1、NP及M2表位)的混合物，具有一定的广谱免疫效果，但也需与季节性流感疫苗联用才能达到更理想的免疫效果。

综上所述，会发现目前实验室或临床上的多抗原通用流感疫苗常以“多抗原混合”或“多抗原串联”的融合表达形式呈现在载体外部。尽管呈现出一定的针对不同类型流感病毒的广谱性，但大多数的广谱保护效果存在一定局限性，或者需要辅以佐剂或季节性流感疫苗联合使用才能发挥最好的效果。因此，提供一种更高免疫原性及攻毒保护力的、更安全的广谱性流感疫苗仍然具有重要意义和广阔前景。

铁蛋白(ferritin)作为一种广泛存在于生物体内的、能自组装的球形蛋白，其表面每相邻两个亚单位的氨基端间距约为4.5-7.5nm，适合在外表面负载抗原，且表面负载抗原后能诱发很强的体液免疫反应及细胞免疫反应，是非常理想的载体，也常用作抗肿瘤小分子药物偶联载体。铁蛋白在流感疫苗方面的应用通常是将一种或两种抗原通过融合表达在外表面。Kanekiyo M等人将一种1999年流感病毒HA抗原序列与ferritin进行融合表达，发现其能中和1943年至2007年间发现的所有H1N1型病毒株。此外，也有研究人员将3端重复的M2e多肽序列串联融合表达至铁蛋白载体表面，制备得到3M2e-rHF多抗原疫苗，但其利用的仅是M3e这一种抗原，在通用性上具有一定的局限性。基于上述研究成果，说明ferritin作为一种在哺乳动物体内广泛存在的载体，其在通用流感疫苗的研究中是具备可行性和广泛前景的。然而现有设计疫苗在效果上还存在不足。

通过对Ferritin的结构进行分析，其作为生物体内储存Fe³⁺的重要场所，其中空腔室直径约7nm，在一定条件下ferritin发生可逆解聚并释放储存于其内部的Fe³⁺，而后在一定条件下发生重组形成不含Fe³⁺的apo-ferritin。Ferritin与apo-ferritin的这种转换特性，使研究者们开始利用apo-ferritin用于某些小分子的运载。Apo-ferritin具备良好的pH耐受性和热稳定性，因而被广泛用于肿瘤药物如cisplatin、DOX、photosensitizers的包载或金属氧化物如镍、铬的生物矿化等研究中。然而Ferritin的结构特征是否能够在内部装载抗原，能够装载多大、多少抗原，什么条件能够装载抗原都鲜有研究。若能同时利用生物相容性好的铁蛋白载体外表面负载抗原和内部空腔装载小分子的优势，仿生模拟天然流感病毒的结构，让不同的流感病毒抗原处于不同的空间位置并分别发挥其相应的免疫作用，可能获得针对不同流感毒株的更安全、更全面、更持久、更强的广谱免疫保护效果。

发明内容

针对现有通用流感疫苗设计和制备技术的不足及实际的需求，本发明提供一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用，制备过程简单高效且模拟了流感病毒本身表位分布的空间特点，使得所制备的流感疫苗具有更高的保护力，并具有针对不同毒株的广谱交叉保护力。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗，所述基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗包括铁蛋白纳米颗粒载体蛋白、表面抗原和内腔抗原，所述表面抗原分布于铁蛋白纳米颗粒的表面，内腔抗原分布于铁蛋白纳米颗粒的内部空腔。

本发明中，以铁蛋白纳米颗粒作为载体，在载体蛋白的内腔和表面均分布有抗原，这样的疫苗组分及结构模拟了流感病毒的天然空间构象，呈现了多种流感病毒抗原，能同时发挥多种流感病毒抗原的免疫原性，激发更全面的免疫效应，提供更广谱的抗流感病毒的免疫保护效果。

优选地，所述铁蛋白为去铁铁蛋白。

本发明中，所述去铁铁蛋白(Apo-ferritin，以下简称“FRT”)的特征在于去除了天然铁蛋白内部可能携带的铁离子，便于内腔抗原的装载。

优选地，所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白包括全长或部分截短的铁蛋白，优选为全长铁蛋白纳米颗粒。

优选地，所述部分截短的铁蛋白纳米颗粒为从N端第5个氨基酸起163个氨基酸的铁蛋白截短体，即FRT(5-167aa)。

优选地，所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白包括哺乳动物来源的铁蛋白、两栖类动物来源的铁蛋白、细菌来源的铁蛋白或植物来源的铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合，优选为哺乳动物来源的铁蛋白或细菌来源的铁蛋白。

优选地，所述哺乳动物来源的铁蛋白包括人源性铁蛋白、鼠源性铁蛋白或马脾脏铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述细菌来源的铁蛋白包括幽门螺杆菌铁蛋白或大肠杆菌铁蛋白。

优选地，所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白的来源包括天然提取产物、人工合成产物或基因工程技术产物中的任一种或至少两种的组合。

优选地，所述铁蛋白包括突变氨基酸序列。

优选地，所述表面抗原包括HA抗原、M2e抗原或NA抗原中的任一种或至少两种的组合，例如可以是HA抗原和M2e抗原的组合，M2e抗原和NA抗原的组合，HA抗原和NA抗原的组合，或HA抗原、M2e抗原和NA抗原的组合，优选为HA抗原或M2e抗原中的任一种或两种的组合，进一步优选为HA和M2e的组合。

优选地，所述内腔抗原包括基质蛋白M1抗原、M2e抗原或核蛋白NP抗原中的任一种或至少两种的组合，例如可以是M1抗原和M2e抗原的组合，M1抗原和NP抗原的组合，M2e抗原和NP抗原的组合，或M1抗原、M2e抗原或NP抗原的组合，优选为NP抗原。

本发明中，由FRT与分布于内部空腔的抗原组成的流感疫苗，以“FRT+抗原”的形式表示，例如FRT+NP，FRT+M2e，FRT+M1，优选为FRT+NP疫苗。

优选地，所述表面抗原为一种或两种抗原的组合，内腔抗原为区别于表面抗原的另一种抗原。

优选地，所述多抗原通用流感疫苗的表面抗原为HA抗原或M2e抗原，内腔抗原为NP抗原。

进一步优选地，所述多抗原通用流感疫苗的表面抗原为HA抗原和M2e抗原的组合，内腔抗原为NP抗原。

通过对流感结构和侵染机制的研究，发明人发现，流感病毒各抗原在流感结构中的空间位置具有特定的空间分布，HA、NA分布在流感病毒衣壳表面，M2嵌合在流感病毒衣壳上，M1在流感衣壳内部，NP与RNA缠绕形成RNP位于流感病毒内部。其次，各抗原在流感病毒侵染过程中也具有时间先后顺序，简言之，就是HA与唾液酸受体结合，M2离子通道激活，HA构象发生变化，M1与RNP相互松动，RNP进入，利用宿主复制产生子代病毒，出芽NA裂解唾液酸，释放子代病毒。因此，如果能够让衍生自NP、M2e和HA的抗原蛋白模拟在流感病毒上的空间分布，装载在铁蛋白纳米颗粒载体蛋白上，使得疫苗不同抗原处于其应占据的位置更好的协同，仿生设计出多抗原的流感疫苗，各抗原间协同增效，使所得多抗原仿生流感疫苗获得更高的免疫原性和攻毒保护力，起到通用流感疫苗的作用。

本发明中，发明人发现，在FRT纳米颗粒表面分布一种或两种不同的表面抗原，内部空腔装载区别于表面抗原的另一种内腔抗原可以显著增强多抗原仿生流感疫苗的广谱性，例如可以是“HA抗原在FRT表面，NP抗原在FRT内腔中”、“HA抗原在FRT表面，M1抗原在FRT内腔中”、“HA抗原在FRT表面，M2e抗原在FRT内腔中”、“M2e抗原在FRT表面，NP抗原在FRT内腔中”、“M2e抗原在FRT表面，M1抗原在FRT内腔中”、“NA抗原在FRT表面，NP抗原在FRT内腔中”、“NA抗原在FRT表面，M1抗原在FRT内腔中”、“NA抗原在FRT表面，M2e抗原在FRT内腔中”、“HA和M2e抗原在FRT表面，NP抗原在FRT内腔中”、“HA和M2e抗原在FRT表面，M1抗原在FRT内腔中”、“HA和NA抗原在FRT表面，NP抗原在FRT内腔中”、“HA和NA抗原在FRT表面，M1抗原在FRT内腔中”或“HA和NA抗原在FRT表面，M2e抗原在FRT内腔中”的疫苗分布形式，优选为“HA抗原在FRT表面，NP抗原在FRT内腔中”、“M2e抗原在FRT表面，NP抗原在FRT内腔中”或“HA和M2e抗原在FRT表面，NP抗原在FRT内腔中”的疫苗分布形式。优选的基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗，具备多抗原的仿生设计，使得不同流感病毒抗原处于其应占据的位置更好的协同，充分发挥了多种不同流感病毒抗原的免疫原性，具有更突出的免疫刺激能力和更广谱的免疫保护效果，且各抗原所激发的抗体水平较非多抗原仿生流感疫苗中相应抗原有所增强，各抗原间存在协同增效的作用。

优选地，所述表面抗原通过基因融合表达或化学偶联法分布于铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面。

优选地，所述化学偶联法的化学交联剂包括琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)、琥珀酰亚胺基-马来酰亚胺多聚乙二醇(NHS-PEG_n-Mal)、N-ε-马来酰亚胺己酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-ε-马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、羧基-氨基多聚乙二醇(COOH-PEG_n-NH₂)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(Sulfo-DSS)、磺基双琥珀酰亚胺酯多聚乙二醇(NHS-PEG_n-NHS)等中的任一种或至少两种的组合，优选为Sulfo-SMCC或NHS-PEG_n-Mal交联剂。其中，所述PEG_n中的n为聚乙二醇中乙二醇单体的个数，所述聚乙二醇的分子量范围为2k-10k。

本发明中，通过化学偶联的手段，使FRT纳米颗粒与共价结合于外表面的抗原组合成化学偶联流感疫苗，以“抗原.FRT”的形式表示，例如HA.FRT，M2e.FRT，NA.FRT，HA.M2e.FRT，HA.NA.FRT或M2e.NA.FRT等，优选为HA.FRT，M2e.FRT，HA.M2e.FRT疫苗；由FRT纳米颗粒与共价结合于外表面的抗原和分布于内部的抗原共同组成的多抗原通用流感疫苗，则以“抗原(外表面).FRT+抗原(内腔)”的形式表示，例如M2e.FRT+NP，HA.FRT+NP，NA.FRT+NP，HA.M2e.FRT+NP，M2e.FRT+M1，HA.FRT+M1，NA.FRT+M1，HA.M2e.FRT+M1，NA.FRT+M2e，HA.FRT+M2e或FRT.HA.NA+M2e等，优选为HA.FRT+NP，M2e.FRT+NP，HA.M2e.FRT+NP疫苗。

本发明中，通过融合蛋白的形式，使FRT纳米颗粒与融合表达于外表面的抗原组成融合流感疫苗，以“FRT.抗原”的形式表示，例如FRT.M2e，FRT.HA，FRT.NA，FRT.HA.M2e，FRT.HA.NA或FRT.M2e.NA等，优选为FRT.M2e，FRT.HA，FRT.HA.M2e疫苗；由FRT纳米颗粒与融合表达于外表面的抗原和分布于内部的抗原共同组成的多抗原通用流感疫苗，以“FRT.抗原(外表面)+抗原(内腔)”的形式表示，例如FRT.M2e+NP，FRT.HA+NP，FRT.NA+NP，FRT.HA.M2e+NP，FRT.M2e+M1，FRT.HA+M1，FRT.NA+M1，FRT.HA.M2e+M1，FRT.HA+M2e，FRT.NA+M2e或FRT.HA.NA+M2e等，优选为FRT.M2e+NP，FRT.HA+NP或FRT.HA.M2e+NP疫苗。

优选地，所述表面抗原包括人源性流感病毒抗原蛋白、禽源性流感病毒抗原蛋白或猪源性流感病毒抗原蛋白中的任一种或至少两种的组合。

优选地，所述内腔抗原包括人源性流感病毒抗原蛋白、禽源性流感病毒抗原蛋白或猪源性流感病毒抗原蛋白中的任一种或至少两种的组合。

优选地，所述表面抗原包括突变氨基酸序列。

优选地，所述内腔抗原包括突变氨基酸序列。

本发明中所述的NA、M1、HA、NP和M2e既可以是衍生自流感病毒的完整的抗原蛋白，也可以是其中一段保守的抗原多肽片段。其是可以通过人工合成或基因工程技术手段得到的人源性、禽源性、猪源性流感病毒抗原蛋白及其突变氨基酸序列，在不影响抗原蛋白免疫原性的基础上，至少一个氨基酸突变后的序列对应的抗原蛋白也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了将上述抗原分布到FRT纳米颗粒表面的一种方法。通过基因工程技术将抗原插入至FRT载体蛋白序列中，经过合适的表达系统进行融合表达，自我组装成表面分布有流感病毒抗原的FRT纳米颗粒衍生物，经常规的蛋白分离纯化手段，方法参见例如(Kanekiyo M,Wei CJ,Yassine HM,McTamney PM,Boyington JC,Whittle JR,et al.Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizingH1N1antibodies.Nature.2013；499(7456):102-6.)(Qi M,Zhang XE,Sun X,Zhang X,YaoY,Liu S,et al.Intranasal Nanovaccine Confers Homo-and Hetero-SubtypicInfluenza Protection.Small.2018；14(13):e1703207.)，最终得到高纯度的表面分布有流感病毒抗原的FRT纳米颗粒衍生物。

在其中一个实验例中，详述了将衍生自流感病毒HA抗原的多肽序列插入至FRT载体蛋白序列N端，经大肠杆菌培养系统融合表达于FRT载体的表面，经常规纯化分离手段制备高纯度FRT.HA纳米颗粒疫苗的方法。

本发明还提供了将上述抗原分布到FRT纳米颗粒的另一种方法。通过化学偶联技术，将抗原通过化学键共价结合到FRT载体蛋白表面，制备表面分布有流感病毒抗原的FRT纳米颗粒衍生物。

在另一个实验例中，详述了将衍生自流感病毒的M2e多肽抗原通过NHS-PEG_n-Mal交联剂共价结合到FRT载体蛋白表面，制备表面分布有M2e抗原的M2e.FRT纳米颗粒疫苗的方法。

第二方面，本发明提供一种基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗的制备方法，包括以下步骤：将一种表面抗原装载到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白的表面，将另一种内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔，得到基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗。

优选地，所述双抗原通用流感疫苗的制备方法包括如下步骤：

(1)将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中；

(2)将第一种表面抗原通过化学偶联法装载至步骤(1)所得铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面，得基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗。

在其中一个实验例中，详述了先将衍生自流感病毒的NP多肽抗原装载至FRT纳米颗粒内腔中，而后通过NHS-PEG_n-Mal交联剂将流感病毒M2e多肽抗原装共价结合到FRT+NP颗粒表面，制备表面分布有M2e抗原、内腔中分布有NP抗原的M2e.FRT+NP纳米颗粒疫苗的方法。

(1’)将第一种表面抗原基因融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面，得表面分布有流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒；

(2’)将内腔抗原装载到步骤(1’)所得铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中，得基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗；

在另一个实验例中，详述了先将衍生自流感病毒的HA抗原融合表达至FRT载体蛋白外表面，而后将流感病毒NP多肽抗原装载至FRT.HA颗粒内腔中，制备表面分布有HA抗原、内腔中分布有NP抗原的FRT.HA+NP纳米颗粒疫苗的方法。

本发明中，基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗主要采用两种制备方法，第一种为先装载内腔抗原，再利用化学修饰方法装载表面抗原；第二种方法为先通过基因融合表达的方式将表面抗原装载到载体蛋白的表面，再将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔。

第三方面，本发明提供一种基于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗的制备方法，包括以下步骤：将两种表面抗原装载到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面，将一种内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒内部空腔。

优选地，所述制备方法包括如下步骤：

(A1)将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中；

(A2)将第一种表面抗原通过化学偶联法装载至步骤(A1)所得铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面；

(A3)通过化学偶联法在步骤(A2)所得铁蛋白纳米颗粒表面修饰第二种表面抗原，得基于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗。

在又一个实验例中，详述了先将衍生自流感病毒的NP多肽抗原装载至FRT纳米颗粒内腔中，而后通过NHS-PEG_n-Mal交联剂先后将流感病毒HA抗原和M2e抗原共价结合到FRT+NP颗粒表面，制备表面分布有HA抗原和M2e抗原、内腔中分布有NP抗原的HA.M2e.FRT+NP纳米颗粒疫苗的方法。

优选地，所述制备方法包括如下步骤：

(B1)将第一种表面抗原基因融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面，得表面分布有流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒；

(B2)将内腔抗原装载到步骤(B1)所得铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中；

(B3)在步骤(B2)所得铁蛋白纳米颗粒表面修饰第二种表面抗原，得基于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗。

在又一个实验例中，详述了先将衍生自流感病毒的HA抗原融合表达至FRT载体蛋白外表面，而后将流感病毒NP多肽抗原装载至FRT.HA颗粒内腔中，最后通过NHS-PEG_n-Mal交联剂将流感病毒M2e抗原共价结合到FRT.HA+NP颗粒表面制备表面分布有HA抗原和M2e抗原、内腔中分布有NP抗原的M2e.FRT.HA+NP纳米颗粒疫苗的方法。

优选地，所述制备方法包括如下步骤：

(C1)将两种不同的表面抗原基因均融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面，得到表面分布有两种流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒；

(C2)将内腔抗原装载到步骤(C1)所得铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中，得基于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗。

在另一个实验例中，详述了先将衍生自流感病毒的HA和M2e两种抗原序列以串联的形式插入至FRT载体蛋白序列N端，将二者融合表达至FRT载体蛋白外表面，而后将流感病毒NP多肽抗原装载至FRT.HA颗粒内腔中，制备表面分布有HA抗原和M2e抗原、内腔中分布有NP抗原的FRT.HA.M2e+NP纳米颗粒疫苗的方法。

所选流感病毒抗原的种类、序列长度、结构特征等因素均会影响上述五种多抗原通用流感疫苗制备方法的效率和难易程度，因此可以根据所选抗原和FRT载体的特点，选定相对更优的制备方法。

本发明中，基于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗主要采用三种制备方法，第一种为先装载内腔抗原，再将两种表面抗原依次化学偶联到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面；第二种为先将第一种表面抗原基因融合表达至载体蛋白的表面，再装载内腔抗原，最后将第二种表面抗原化学偶联到载体蛋白的表面；第三种为先将两种表面抗原的基因同时融合表达到载体蛋白的表面，再装载内腔抗原。

优选地，所述内腔抗原装载的方法包括加热法、酸碱调节法或变性剂法。

本发明中，基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗和三抗原通用流感疫苗的制备方法中均包含装载内腔抗原的步骤，所述内腔抗原装载的方法包括三种方式，即加热法、酸碱调节法或变性剂法。

优选地，所述加热法具体包括如下步骤：

1)将待装载的内腔抗原与FRT或表面分布有表面抗原的FRT纳米颗粒载体蛋白混合，加热；

2)去除未被装载的内腔抗原，纯化回收，得内部空腔中装载有内腔抗原的铁蛋白纳米颗粒；

优选地，步骤1)所述加热的温度为25-80℃，例如可以是25℃，30℃，35℃，37℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃或80℃，优选为25-50℃。

本发明中，通过调节适当的温度，使得内腔抗原简单高效地装载进FRT纳米颗粒的内部空腔中。若温度过低，FRT颗粒孔道膨胀度小，抗原难以通过孔道进入FRT颗粒内部或进入缓慢，导致FRT对抗原的装载效率低下或耗费时间长；若温度过高，抗原和FRT颗粒则易发生不可逆变性，影响装载效率和抗原免疫原性。因此，需要根据抗原和FRT载体的热稳定性来选择合适的包载温度。

优选地，步骤1)所述加热的时间为30-120min，例如可以是30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min、90min、95min、100min、105min、110min、115min或120min。

本发明中，通过配合加热的温度和时间，以提高内腔抗原的装载效率，并保障FRT载体颗粒结构完整性和抗原的免疫原性。若时间过短，则装载量低；若时间过长，则易导致抗原和病毒样颗粒发生不可逆变性。

优选地，步骤2)所述去除未被装载的内腔抗原的方法包括透析、超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析或超速离心中的任一种或至少两种的组合。

在其中一个实验例中，详述了将衍生自流感病毒NP抗原的多肽抗原与FRT VLP载体混合，50℃加热处理45min后经凝胶过滤层析除去未被装载到FRT载体颗粒内部的NP多肽抗原，制备得到FRT+NP颗粒疫苗的方法。

优选地，所述酸碱调节法具体包括如下步骤：

(a)配制1-10mg/ml的铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒溶液，盐酸溶液调节其pH值至2.2-2.6，4℃搅拌孵育5min；

(b)向步骤(a)所得铁蛋白酸性溶液中加入待装载的内腔抗原，将混合液于4℃搅拌孵育10-15min；

(c)氢氧化钠溶液调节步骤(b)所得混合液pH值至7.2-7.5，25℃搅拌孵育0.5-2h；

(d)去除步骤(c)所得混合液中未被装载的内腔抗原，纯化回收，得内部空腔中装载有内腔抗原的铁蛋白纳米颗粒疫苗。

优选地，步骤(a)所述pH值为2.2-2.6，例如可以是2.2、2.3、2.4、2.5或2.6。

优选地，步骤(c)所述pH值为7.2-7.5，例如可以是7.2、7.3、7.4或7.5。

优选地，步骤(d)所述去除未被装载的内腔抗原的方法包括透析、超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析或超速离心中的任一种或至少两种的组合。

优选地，所述变性剂法具体包括如下步骤：

1’)将铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒载体蛋白与变性剂混合得混合液，室温孵育；

2’)向步骤1’)所得混合液中加入待装载的内腔抗原，将混合液室温孵育；

3’)去除步骤2’)所得混合液中的变性剂以及未被装载的内腔抗原，纯化回收，得内部空腔中装载有内腔抗原的铁蛋白纳米颗粒疫苗；

优选地，步骤1’)所述变性剂包括脲素。

优选地，所述脲素的摩尔浓度为4-8M，例如可以是4M、5M、6M、7M或8M。

优选地，步骤1’)所述孵育的时间为1-3h，例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h或3h。

优选地，步骤2’)所述孵育的时间为0.5-6h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h。

优选地，步骤3’)所述去除未被装载的内腔抗原的方法包括透析、超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析或超速离心中的任一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗用于制备预防流感的药物中的应用。

在本发明的某些方面，所述的基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗能被用于任何保护人或动物预防流感的免疫方案中。在某些实施方案中，所述流感疫苗不与任何佐剂组合使用，而是被直接注入人或动物体内以发挥免疫作用。在另一些实施方案中，为了提高和延长免疫刺激，所述流感疫苗可与铝佐剂、弗氏佐剂等佐剂组合，以合适的配比和剂量注入人或动物体内以发挥免疫作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗通过将衍生自流感病毒的抗原蛋白分别负载于铁蛋白纳米颗粒的外表面和装载于铁蛋白纳米颗粒的中空腔室内部，来模拟流感病毒的结构，使之可以预防由多种亚型流感病毒引起的感染，具有很好的广谱免疫效果；

(2)本发明将流感抗原负载于铁蛋白载体内部的操作相对简单且不会破坏抗原、原有铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒结构及免疫原性，能更好的避开多抗原序列插入铁蛋白载体序列中融合表达导致的铁蛋白难以自组装、稳定性变差、纯化困难等问题，也能更好的避开多种抗原同时化学偶联至铁蛋白载体外表面过程中可能遇到的空间位阻大、偶联效率低甚至无法偶联等问题，因此具有很高的可操作性和技术价值。

附图说明

图1为实验例3所述未装载内腔抗原NP的HA.FRT颗粒疫苗TEM检测图；

图2为实验例7所述装载有内腔抗原NP的HA.FRT+NP颗粒疫苗TEM检测图；

图3为加强免疫14天后实验例3、7和9的疫苗免疫组对A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)毒株的小鼠存活率；

图4为加强免疫14天后实验例3、7和9的疫苗免疫组对A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)毒株的小鼠体重变化率。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实验例1

一种以马脾脏来源的FRT纳米颗粒(购买于Sigma-Aldrich Co.LLC.，以下实验例2-14所述FRT纳米颗粒载体同实验例1)为载体的表面共价结合有M2e抗原的单抗原流感疫苗M2e.FRT，其制备方法如下：

1)人工合成衍生自A/Puerto Rico/8/1934 H1N1流感病毒的M2e多肽抗原(SEQ IDNO.1)。

2)以0.1M PBS(pH 7.4)配制终浓度1mg/mL的FRT载体溶液，向其加入10倍摩尔量的NHS-PEG_n-Mal交联剂，4℃摇床避光反应1h，使FRT的氨基端修饰上马来酰亚胺基，后取出并除去未反应的残余交联剂。经PEG交联剂修饰后的PEG-FRT溶液0.5mg/mL，同5倍于FRT亚基摩尔量的M2e多肽抗原混合，4℃摇床避光反应15h，使FRT的氨基端通过马来酰亚胺基团与M2e的巯基端共价结合。最终，经凝胶过滤层析即得表面共价结合有M2e抗原的M2e.FRT单抗原流感疫苗，其表面M2e抗原共价结合率为每个M2e.FRT分子偶联约12个M2e抗原多肽分子。(本例作为对比例)

SEQ ID NO.1：SLLTEVETPIRNEWGSRSNGSSD-C

实验例2

一种以FRT纳米颗粒为载体的表面分布有NP抗原的单抗原流感疫苗NP.FRT。

与实验例1相比，除了以人工合成的衍生自A/Puerto Rico/8/1934H1N1流感病毒的NP多肽抗原(SEQ ID NO.2)取代M2e抗原与FRT进行共价交联外，其制备方法同实验例1。最终，制得表面共价结合有NP抗原的NP.FRT单抗原流感疫苗，其表面NP抗原共价结合率为每个NP.FRT分子偶联约15个NP抗原多肽分子。(本例作为对比例)

SEQ ID NO.2：QIASNENMETMESSTL-C

实验例3

一种以FRT为载体的表面共价结合有HA全长蛋白抗原的单抗原流感疫苗HA.FRT，其制备方法如下：

1)重组表达A/Puerto Rico/8/1934H1N1流感病毒HA全长蛋白(SEQ ID NO.3)，并纯化，最终纯度90％以上。

2)参照实验例1所述方法，以0.1M PBS(pH 7.4)配制终浓度1mg/mL的FRT载体溶液，向其加入10倍摩尔量的NHS-PEG_n-Mal交联剂，4℃摇床避光反应1h，使FRT的氨基端修饰上马来酰亚胺基，后取出并除去未反应的残余交联剂。经PEG交联剂修饰后的PEG-FRT溶液0.5mg/mL，同2倍于FRT摩尔量的三(2-羧乙基)膦-盐酸盐(TCEP·HCl)还原处理后的重组HA抗原混合，4℃摇床避光反应15h，使FRT的氨基端通过马来酰亚胺基团与HA的巯基端共价结合。最终，经凝胶过滤层析即得表面共价结合有HA抗原的HA.FRT单抗原流感疫苗，其表面HA全长抗原蛋白共价结合率为每个HA.FRT分子偶联约1个HA抗原分子。

(本例作为对比例)

所采用HA全长蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)如下:

MKANLLVLLCALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNTVIEKMNIQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPKYSEESKLNREKVDGVKLE.

实验例4

一种以FRT纳米颗粒为载体的内部空腔装载有NP抗原的单抗原流感疫苗FRT+NP，其制备方法如下：

1)人工合成流感病毒NP多肽抗原(SEQ ID NO.2)。

2)在10mM PB(pH 7.4)溶液中，分别配制FRT终浓度为1mg/mL，NP抗原肽浓度为0.5mg/mL的反应体系，调节pH至7.4。将混合均匀的反应溶液于50℃水浴加热处理45min后，取出冷却至室温。采用Ellman试剂测定热处理后混合液中残余NP抗原肽的浓度，进而计算出FRT对NP多肽的包载量约为0.065mg NP/1mg FRT。

3)随后，以0.1M PBS(pH 7.4)为缓冲液，通过Sephadex G-25脱盐柱除去未被包埋的小分子NP抗原肽，即得纯的FRT+NP单抗原疫苗。(本例作为对比例)

实验例5

一种以FRT纳米颗粒为载体的内部空腔装载有M2e抗原的单抗原流感疫苗FRT+M2e。

与实验例4相比，除以人工合成的M2e多肽抗原(SEQ ID NO.1)替代NP多肽抗原(SEQ ID NO.2)与FRT载体溶液混合配制反应体系外，其他制备方法同实验例4。经Ellman试剂测得FRT+M2e的M2e包载量0.031mg M2e/1mg FRT。(本例作为对比例)

实验例6

一种以FRT纳米颗粒为载体的表面共价结合有M2e抗原、内部空腔装载有NP抗原的多抗原通用流感疫苗M2e.FRT+NP。

与实验例1相比，除以实验例4所述FRT+NP纳米颗粒替代FRT纳米颗粒载体外，其他制备方法同实验例1。

实验例7

一种以FRT纳米颗粒为载体的表面共价结合有HA全长抗原蛋白、内部空腔装载有NP抗原的多抗原通用流感疫苗HA.FRT+NP。

与实验例3相比，除以实验例4所述FRT+NP纳米颗粒替代FRT纳米颗粒载体外，其他制备方法同实验例3。

实验例8

一种以FRT纳米颗粒为载体的表面共价结合有NP抗原、内部空腔装载有M2e抗原的多抗原通用流感疫苗NP.FRT+M2e。

与实验例2相比，除以实验例5所述FRT+M2e纳米颗粒替代FRT纳米颗粒载体外，其他制备方法同实验例2。

实验例9

一种以FRT纳米颗粒为载体的表面共价结合有HA全长抗原蛋白、内部空腔装载有M2e抗原的多抗原通用流感疫苗HA.FRT+M2e。

与实验例3相比，除以实验例5所述FRT+M2e纳米颗粒替代FRT纳米颗粒载体外，其他制备方法同实验例3。

实验例10

一种以FRT为载体的表面同时共价结合有M2e抗原和NP抗原的多抗原流感疫苗M2e.NP.FRT，其制备方法如下：

1)人工合成流感病毒M2e多肽抗原(SEQ ID NO.1)和NP多肽抗原(SEQ ID NO.2)。

2)以0.1M PBS(pH 7.4)配制终浓度1mg/mL的FRT溶液，向其加入10倍摩尔量的NHS-PEG_n-Mal交联剂，4℃摇床避光反应1h，使FRT的氨基端修饰上马来酰亚胺基，后取出并除去未反应的残余交联剂。经PEG交联剂修饰后的PEG-FRT溶液0.5mg/mL，同1倍于FRT亚基摩尔量的M2e多肽抗原(SEQ ID NO.1)混合，4℃摇床避光反应30min后，加入1倍于FRT亚基摩尔量的NP多肽抗原(SEQ ID NO.2)继续反应15h后，使FRT的氨基端通过马来酰亚胺基团与M2e和NP抗原的巯基端共价结合。最终，经凝胶过滤层析即得表面同时共价结合有M2e和NP抗原的M2e.NP.FRT多抗原流感疫苗，其表面M2e和NP抗原共价结合率分别为每个M2e.NP.FRT分子偶联约8个M2e多肽抗原和5个NP多肽抗原。(本例作为对比例)

实验例11

一种以FRT为载体的表面同时共价结合有HA全长抗原蛋白和NP抗原的多抗原流感疫苗HA.NP.FRT，其制备方法如下：

1)重组表达流感病毒HA全长蛋白(SEQ ID NO.3)，并纯化，最终纯度90％以上。

2)人工合成流感病毒NP多肽抗原(SEQ ID NO.2)。

3)以0.1M PBS(pH 7.4)配制终浓度1mg/mL的FRT溶液，向其加入10倍摩尔量的NHS-PEG_n-Mal交联剂，4℃摇床避光反应1h，使FRT的氨基端修饰上马来酰亚胺基，后取出并除去未反应的残余交联剂。经PEG交联剂修饰后的PEG-FRT溶液0.5mg/mL，同2倍于FRT摩尔量的重组HA抗原混合，4℃摇床避光反应2h后，加入3倍于FRT亚基摩尔量的NP多肽抗原继续反应15h后，使FRT的氨基端通过马来酰亚胺基团与HA和NP抗原的巯基端共价结合。最终，即得表面同时共价结合有HA和NP的HA.NP.FRT多抗原流感疫苗，其表面HA和NP抗原共价结合率分别为每个HA.NP.FRT分子偶联约1个HA抗原和10个NP多肽抗原。(本例作为对比例)

实验例12

一种以FRT为载体的表面同时共价结合有HA全长抗原蛋白和M2e抗原的多抗原流感疫苗HA.M2e.FRT。

与实验例11相比，除以人工合成的M2e多肽抗原(SEQ ID NO.1)取代NP抗原与FRT进行共价交联外，其他制备方法同实验例11。最终，即得表面同时共价结合有HA和M2e的HA.M2e.FRT多抗原流感疫苗，其表面HA和M2e抗原共价结合率分别为每个HA.M2e.FRT分子偶联约1个HA抗原和9个M2e多肽抗原。(本例作为对比例)

实验例13

一种以FRT为载体的表面同时共价结合有HA全长抗原蛋白和NP抗原、内部空腔装载有M2e抗原的多抗原流感疫苗HA.NP.FRT+M2e。

与实验例11相比，除以实验例5所述FRT+M2e纳米颗粒替代FRT纳米颗粒载体外，其他制备方法同实验例11。

实验例14

一种以FRT为载体的表面同时共价结合有HA全长抗原蛋白和M2e抗原、内部空腔装载有NP抗原的多抗原流感疫苗HA.M2e.FRT+NP。

与实验例12相比，除以实验例4所述FRT+NP纳米颗粒替代FRT纳米颗粒载体外，其他制备方法同实验例12。

测试例1：基于FRT纳米颗粒载体的多抗原通用流感疫苗颗粒结构表征

通过HPSEC，分析各疫苗组分的均一性。HPSEC分析使用Agilent 1100HPLC系统进行，所用SEC柱为TSK3000SW_XL，所用缓冲液为50mM PB+0.15M NaCl(pH 7.4)，流速0.5ml/min，紫外检测波长260和280nm，上样量100μL。

通过HPSEC凝胶柱与多角度激光散射(MALLS)和示差检测器(RI)联用，即SEC-LS-RI分析纯化后各多抗原流感疫苗的平均分子量(MW)，确定FRT纳米颗粒及其衍生物对各抗原的偶联率。采用Ellman’s试剂分析FRT纳米颗粒及其衍生物对各抗原共价结合或包埋前后各抗原浓度变化，以确定FRT对各抗原的偶联率或包埋量。通过透射电镜(TEM)，分析检测纯化后各多抗原流感疫苗颗粒结构的完整性。

以优选实验例7为例，图1为通过TEM检测到的实验例3所述未装载NP抗原的HA.FRT颗粒疫苗的结构，图2为实验例7所述装载有NP抗原的HA.FRT+NP多抗原通用流感疫苗颗粒结构完整性，说明热处理包埋过程及偶联过程未对FRT的纳米颗粒结构产生破坏。

测试例2：基于FRT纳米颗粒载体的多抗原通用流感疫苗免疫原性评价

取8周龄的Balb/C雌鼠，每8只为一个免疫组，各组分别通过腹腔注射免疫25μg实验例1-14所述的纳米颗粒疫苗，并以免疫有25μg M2e或NP多肽、4μg HA蛋白及PBS(pH 7.0～7.2)的小鼠为对照组，注射体积均为100μL。初次免疫两周后(14days)，收集血清并进行同等剂量加强免疫。加强免疫两周后(28days)，再次采集血清，并进行相关血清学检测。

免疫血清中，M2e、NP或HA抗原特异性IgG、IgG1及IgG2a抗体水平以ELISA实验进行测定。其中，加强免疫两周后各免疫组血清中抗原特异性IgG抗体几何平均效价如表1所示。

免疫血清中，毒株特异性血凝抑制滴度以血凝抑制实验进行评价。将分离得到的血清以RDE酶于37℃温育处理18-20h，以除去血清中非特异性血凝抑制因子。而后以原倍鸡红cell于4℃吸附1h左右，以除去非特异性血凝因子。处理后血清初始稀释度即为1:10，以世界卫生组织(WHO)的标准进行血凝抑制实验。A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)毒株特异性血凝抑制滴度结果如表2所示。

表1加强免疫两周后基于FRT纳米颗粒载体的各疫苗免疫组血清中抗原特异性IgG抗体几何平均滴度

由表1可知，无论是将流感病毒抗原共价结合至FRT纳米颗粒载体表面(例如实验例1、实验例2或实验例3)，还是包载于FRT载体的内部空腔中(例如实验例4和5)，制备得到的流感疫苗其所激发的特异性抗体水平较纯抗原组(M2e、NP或HA)均显著增强，这表明基于FRT纳米颗粒载体的流感疫苗能更好的刺激免疫应答。此外，对比实验例1和5、2和4会发现，当M2e和NP抗原分布于FRT载体表面时，激发的特异性抗体水平较其分布于FRT载体内部空腔中时更高。

由表1还可知，比较双抗原与单抗原疫苗的免疫原性：对比实验例1与实验例6或10，当除了表面抗原M2e外引入另一种抗原NP时，无论NP抗原是分布于FRT载体表面还是内腔中，M2e的特异性抗体水平均有所提高；对比实验例3与实验例7或11、实验例3与实验例9或12，当除了表面抗原HA外引入另一种抗原NP或M2e时，无论NP或M2e抗原是分布于FRT载体表面还是内腔中，HA的特异性抗体水平均有所提高；对比实验例5与实验例8或9则会发现，在FRT+M2e疫苗外表面结合NP或HA抗原后，内腔抗原M2e的特异性抗体水平会有所提高；对比实验例4与实验例6或7则发现，在FRT+NP疫苗外表面结合HA或M2e抗原后，内腔抗原NP的特异性抗体水平也会有所提高。比较三抗原与双抗原疫苗的免疫原性：对比实验例13与实验例11或9，无论是在FRT载体表面还是内腔中负载第三种抗原，所制得的三抗原流感疫苗所激发的另两种抗原特异性抗体水平较双抗原疫苗组均有所增强；对比实验例14与实验例12或7，也会发现无论是在FRT载体表面还是内腔中负载第三种抗原，所制得的三抗原流感疫苗所激发的另两种抗原特异性抗体水平较双抗原疫苗组均有所增强。以上结果表明，分别分布于FRT载体表面和内部空腔的多种流感抗原间具有免疫协同增强效应。

表2加强免疫两周后基于FRT纳米颗粒载体的HA疫苗免疫组血清几何平均血凝抑制滴度

表2所示为各HA疫苗免疫组小鼠血清对A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)毒株的特异性血凝抑制滴度结果。由表2可知，将HA全长蛋白抗原共价结合于FRT载体外表面制备得到实验例3所述的单抗原流感疫苗，其对受试H3N2毒株的血凝抑制效价更高。进一步对比实验例3与实验例7、9或实验例11-14，当在FRT载体的内腔中或外表面同时负载区别于表面HA抗原的第二种甚至第三种抗原，制得的多抗原流感疫苗对受试H3N2毒株的血凝抑制效价较HA.FRT单抗原疫苗会进一步提高。以上结果表明，多抗原的负载能协同增强HA抗原的广谱免疫原性。

由表2还可知，对比实验例7和11，当NP抗原负载于FRT载体内腔中时，所得疫苗对受试H3N2毒株的血凝抑制效价更高；对比实验例9和12，与NP抗原不同的是，当M2e抗原负载于FRT载体外表面时，所得疫苗对受试H3N2毒株的血凝抑制效价更高；对比实验例13与14，当HA和M2e抗原负载于FRT载体外表面、而NP抗原负载于FRT载体内腔中时，所得疫苗对受试H3N2毒株的血凝抑制效价最高。以上结果表明，仿生模拟流感病毒各表位分布的空间结构，即HA和M2e抗原位于FRT载体的外表面而NP表位分布于FRT载体的内部空腔中时，制备得到实验例7、12或14尤其是实验例14所示的多抗原仿生流感疫苗，其对受试H3N2毒株的血凝抑制效价更高，意味着其具有更好的潜在攻毒保护效力，也具有更优的广谱保护效果。

测试例3:基于FRT纳米颗粒载体的多抗原通用流感疫苗保护效力评价

在测试例2所述加强免疫两周后(28days)，各免疫组小鼠通过滴鼻攻毒感染10LD50致死剂量的A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)毒株或A/An Hui/1/2005(H5N1)毒株，记录各免疫组小鼠感染14天内体重变化及存活率。各免疫组小鼠存活率见表3。

表3加强免疫两周后基于FRT纳米颗粒载体的各疫苗免疫组免疫保护效果

由表3可知，对比实验例6与实验例8和10所述流感疫苗的抗原分布特点，会发现三者均为基于FRT纳米颗粒载体的、同时携带有M2e和NP抗原的双抗原流感疫苗，其区别在于：实验例6中，M2e和NP模拟了流感病毒自身表位的空间位置分布，M2e分布于FRT外表面，而NP则分布于FRT载体的内部空腔中，即双抗原仿生流感疫苗；实验例8，M2e分布于FRT载体内部空腔中，NP分布于FRT的外表面，与流感病毒自身表位的空间位置分布恰好相反，即双抗原非仿生流感疫苗；实验例10中，M2e和NP均分布于FRT载体外表面，与流感病毒自身表位的空间位置分布也并不相同，也是双抗原非仿生流感疫苗。若进一步对比实验例6与实验例8和10所述流感疫苗的保护效力则会发现，实验例6所述双抗原仿生流感疫苗组，其对受试H1N1毒株的免疫保护率为100％，高于实验例8或10所述双抗原非仿生流感疫苗组；同时，实验例6对受试H5N1毒株的免疫保护率也显著高于实验例8或10的。这说明，实验例6所述“M2e分布于FRT载体外表面，而NP分布于FRT载体内腔中”的双抗原仿生流感疫苗，广谱免疫保护效力优于实验例8和10所述的双抗原非仿生流感疫苗。

由表3还可知，实验例3、实验例7、实验例9和实验例11-14所述七种表面共价结合有全长HA蛋白抗原的流感疫苗组，可能因其表面结合的HA全长蛋白强的免疫原性，其对受试H1N1毒株的免疫保护率也均为100％，但不同疫苗组对受试H5N1毒株的免疫保护率存在较大差异。进一步对比实验例7与实验例11和3、实验例12与实验例9和3会发现，在FRT载体表面负载HA抗原的同时，再在其表面或空腔中负载另一种抗原，可提高前者HA疫苗的广谱免疫效果；且当NP抗原负载于FRT载体内部空腔中，而M2e负载于FRT载体外表面时，所得疫苗的广谱免疫效果最佳。进一步扩展至三抗原疫苗，对比实验例13与14，同样会发现当HA和M2e分布于FRT载体外表面，而NP分布于FRT载体内腔中时，所得三抗原仿生流感疫苗的广谱免疫保护效果最佳。

结合免疫原性和免疫保护的实验结果，尽管NP抗原分布于FRT载体内腔中时较分布于FRT外表面时激发的特异性抗体水平低，但依前者所述方式制得的多抗原仿生流感疫苗广谱保护效果更佳，这也表明疫苗的实际保护效果并不完全取决于特异性抗体的滴度水平。

以实验例3、9以及优选的实验例7为例，图3显示了加强免疫14天后实验例7所述HA.FRT+NP多抗原仿生流感疫苗对A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)毒株的免疫保护效果。从图3中可以看出，与实验例7所述HA.FRT+NP多抗原仿生疫苗组相比，实验例3所述HA.FRT单抗原疫苗组和实验例9所述HA.FRT+M2e多抗原非仿生疫苗组小鼠对受试H1N1毒株的保护率都能达到100％；由图4可知，虽然三者的免疫保护效果均为100％，但实验例3和实验例9两者的小鼠体重恢复速度均慢于实验例7免疫组的。

由此可知，不同抗原在FRT载体上的空间分布会影响多抗原疫苗的广谱免疫效果；当M2e或HA抗原分布于FRT载体的外表面，而NP抗原分布于FRT载体的内部空腔中时，得到的多抗原仿生流感疫苗较单抗原疫苗或多抗原非仿生流感疫苗具有更好的广谱免疫效果。又由于将NP抗原负载于FRT载体内部的操作相对简单且不会破坏抗原、原有铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒结构及免疫原性，因此具有很高的可操作性和技术价值。

实验例15

一种基因工程菌表达的幽门螺杆菌来源的FRT载体蛋白，其制备方法如下：

1)PCR扩增能编码幽门螺杆菌FRT的基因序列(SEQ ID NO.4)，并在其N-端接入GGGGS序列连接桥。

所采用的全长FRT载体核苷酸序列(Gene ID 890319，SEQ ID NO.4)如下：

TTAAGATTTCCTGCTTTTAGCGATCCCTTTGACATACTGATCGGCTAAATACAAGCCATGGTTTTCATTACCAATCAACTCAATTTTATCCAAAATATCCTTGAAAAGCACTTCTTCTTCATGCTGTTCAGCCACATACCATTGCAAGAAATTGAAAGTCGCATGATCTTTGCTTTTTATGGCGTGATCTACGATATTGTTAATAGACTCGCTGATGTGTTGCTCATGTTCATAGGCTTTTTGGAAAATTTGAGTCAAACCTTCAAACTTATGCTCAGGCGCGCTGATGCTGGTCAATTGCACAGGCACATTGTTTTCATTCAAGAAGATAATAAGCTTTTTAGCATGCTCGTATTCTTCAGCCGCATGGTCAAACAAGAAAAGCCCCGCGCCATCTAAGCTATGGGTATAGCACCATGAACTCATGCTCATATACAAGTTGGAAGAGTTCATTTCCTTATTCACTTGTTCGTTTAGCAACTTAATGATGTCTTTTGATAACAT.

所采用的全长FRT载体的氨基酸序列(Protein ID WP_000949190.1，SEQ IDNO.5)如下:

MLSKDIIKLLNEQVNKEMNSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS.

2)经酶切作用，将1)所得FRT载体序列克隆至质粒pET-28a中，由此得到重组质粒pET-28a-FRT并转入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统。

3)将转化完成的BL21(DE3)细胞接种至含有卡那霉素(Kana)和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)的25mL LB琼脂培养皿中，于37℃培养过夜。从该LB琼脂培养皿上挑取白色饱满的单菌落即阳性菌落，加入至含50mL LB的一级种子液中37℃活化培养。

3)取一级种子液5mL，按1％的接种量加入至500mL LB培养基中，37℃扩增培养至OD600达到0.5。此时加入终浓度为1mM的IPTG，于20℃诱导FRT蛋白表达约16h后，菌体基本不再生长，于4℃，4000rpm，离心30min收集菌体沉淀。

4)收集的菌体按1/10的w/v比，重悬于破碎缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.5)中，4℃超声破碎菌体，破碎条件为40％功率下3s on/2s off共60min。超声破碎后的菌液于4℃，10000rpm离心30min收集上清。上清液再于60℃，加热处理10min后，10000rpm离心30min，收集上清，得到FRT蛋白的纯化前上样液。

5)将4)所得FRT蛋白液进料到20mM PBS(pH 7.5)平衡的Superose 6凝胶过滤层析柱中(GE Healthcare，USA，XK 16/70)中，收集样品峰并进一步进行蔗糖密度梯度离心。收集含有FRT蛋白的组分，通过Sephadex G25脱盐柱(GE Healthcare，USA)将FRT置换于PBS缓冲液(pH 7.4)中即可得到纯化的完整的FRT纳米颗粒载体。

实验例16

一种以FRT为载体的表面融合表达有HA抗原的单抗原流感疫苗FRT.HA，其制备方法如下：

1)在实验例15的基础上，将一条衍生自A型流感病毒HA表位的11个氨基酸序列(SEQ ID NO.6)经GGGGS序列独立连接至实验例1所述FRT基因序列的N-端，由此构建编码FRT.HA的重组质粒pET-28a-FRT.HA并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统。

2)参照实验例1所述方法，将转化完成的BL21(DE3)细胞接种至LB培养基中进行筛选及活化培养，当OD600达到0.8时加入IPTG至1mM终浓度，进行目的蛋白的诱导表达及菌体收集。

3)将收集的菌体重悬于破碎缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.5)中，4℃超声破碎菌体，并参照实验例1所述方法进行菌体破碎、收集及后续蛋白纯化。最终，即得纯化的完整的FRT.HA纳米颗粒疫苗。(本例作为对比例)

SEQ ID NO.6：GLFGAIAGFIE.

实验例17

一种以FRT为载体的表面融合表达有M2e抗原的单抗原流感疫苗FRT.M2e。

与实验例16相比，除连接至实验例15所述FRT载体序列N-端的多肽抗原为衍生自A型流感病毒M2e表位的24个氨基酸序列(SEQ ID NO.7)外，其他制备方法同实验例16。(本例作为对比例)

SEQ ID NO.7：MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD

实验例18

一种以FRT为载体的表面融合表达有NP抗原的单抗原流感疫苗FRT.NP。

与实验例16相比，除连接至实验例15所述FRT载体序列N-端的多肽抗原为衍生自A型流感病毒NP表位的16个氨基酸序列(SEQ ID NO.8)外，其他制备方法同实验例16。(本例作为对比例)

SEQ ID NO.8：QIASNENMETMESSTL

实验例19

一种以FRT为载体的表面同时融合表达有HA和M2e抗原的多抗原流感疫苗FRT.HA.M2e。

与实验例16相比，除连接至实验例15所述FRT载体序列N-端的多肽抗原为流感病毒的HA抗原序列(SEQ ID NO.6)和M2e抗原序列(SEQ ID NO.7)的串联序列(GLFGAIAGFIE-MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD)外，其他制备方法同实验例16。(本例作为对比例)

实验例20

一种以FRT为载体的表面融合表达有HA、内部空腔装载有M2e抗原的多抗原通用流感疫苗FRT.HA+M2e，其制备方法如下：

1)参照实验例16所述方法，表达及纯化制备实验例16所述FRT.HA纳米颗粒疫苗。

2)人工合成流感病毒M2e抗原序列(SEQ ID NO.9)

3)在10mM PBS(pH 7.4)溶液中，分别配制FRT.HA终浓度为1mg/mL，M2e抗原肽浓度为0.5mg/mL的反应体系，调节pH至7.4。将混合均匀的反应溶液于50℃水浴加热处理30min后，取出冷却至室温。采用Ellman试剂测定热处理后混合液中残余M2e抗原肽的浓度，进而计算出FRT.HA对M2e多肽的包载量约为0.022mg M2e/1mg FRT.HA。

3)随后，以0.1M PBS(pH 7.4)为缓冲液，通过Sephadex G-25脱盐柱除去未被包埋的小分子M2e抗原肽，即得纯的FRT.HA+M2e单抗原疫苗。

SEQ ID NO.9：MSLLTEVETPIRNEWGSRSNGSSD-C

实验例21

一种以FRT为载体的表面融合表达有M2e、内部空腔装载有HA抗原的多抗原通用流感疫苗FRT.M2e+HA，其制备方法如下：

1)参照实验例17所述方法，表达及纯化制备实验例17所述FRT.M2e纳米颗粒疫苗。

2)人工合成流感病毒HA抗原序列(SEQ ID NO.10)

3)参照实验例20步骤3)所述方法，配制FRT.M2e终浓度为1mg/mL，HA抗原肽浓度为0.5mg/mL的反应体系，于50℃水浴加热处理30min，取出冷却至室温。采用Ellman试剂测定热处理后混合液中残余HA抗原肽的浓度，进而计算出FRT.M2e对HA多肽的包载量约为0.102mg HA/1mg FRT.M2e。

3)随后，以0.1M PBS(pH 7.4)为缓冲液，通过Sephadex G-25脱盐柱除去未被包埋的小分子HA抗原肽，即得纯的FRT.M2e+HA单抗原疫苗。

SEQ ID NO.10：GLFGAIAGFIE-C

实验例22

一种以FRT为载体的表面同时融合表达有HA和M2e抗原、内部空腔装载有NP抗原的多抗原通用流感疫苗FRT.HA.M2e+NP，其制备方法如下：

1)参照实验例19所述方法，表达及纯化制备实验例19所述FRT.HA.M2e纳米颗粒疫苗。

2)人工合成流感病毒NP抗原序列(SEQ ID NO.2)

3)参照实验例20步骤3)所述方法，配制FRT.HA.M2e终浓度为1mg/mL，NP抗原肽浓度为0.5mg/mL的反应体系，于50℃水浴加热处理30min，取出冷却至室温。采用Ellman试剂测定热处理后混合液中残余NP抗原肽的浓度，进而计算出FRT.HA.M2e对NP多肽的包载量约为0.044mg NP/1mg FRT.HA.M2e。

3)随后，以0.1M PBS(pH 7.4)为缓冲液，通过Sephadex G-25脱盐柱除去未被包埋的小分子NP抗原肽，即得纯的FRT.HA.M2e+NP单抗原疫苗。

实验例23

一种以FRT为载体的表面融合表达有HA抗原、内部空腔装载有NP抗原的多抗原通用流感疫苗FRT.HA+NP。

与实验例20相比，除以人工合成的NP多肽抗原(SEQ ID NO.2)替代M2e多肽抗原(SEQ ID NO.9)与FRT.HA载体溶液混合配制反应体系外，其他制备方法同实验例20。经Ellman试剂测得FRT.HA对NP包载量约为0.058mg NP/1mg FRT.HA。

实验例24

一种以FRT为载体的表面融合表达有HA抗原、内部空腔装载有NP抗原同时表面共价结合有M2e抗原的多抗原通用流感疫苗M2e.FRT.HA+NP，其制备方法如下：

1)参照实验例23所述方法，制备得到实验例23所述FRT.HA+NP疫苗。NP包载量为0.058mg NP/1mg FRT.HA。

2)参照实验例1所述方法，以0.1M PBS(pH 7.4)配制终浓度1mg/mL的FRT.HA+NP溶液，向其加入10倍摩尔量的NHS-PEG_n-Mal交联剂，4℃摇床避光反应1h，使FRT的氨基端修饰上马来酰亚胺基，后取出并除去未反应的残余交联剂。经PEG交联剂修饰后的FRT.HA+NP溶液0.5mg/mL，同3倍于FRT亚基摩尔量的M2e多肽抗原(SEQ ID NO.9)混合，4℃摇床避光反应15h，使FRT的氨基端通过马来酰亚胺基团与M2e的巯基端共价结合。最终，经凝胶过滤层析即得表面同时分布有M2e和HA抗原、内部空腔装载有NP抗原的M2e.FRT.HA+NP多抗原流感疫苗，其表面M2e抗原共价结合率为每个M2e.FRT.HA+NP分子偶联约10个M2e抗原多肽分子。

实验例25

一种以FRT为载体的表面融合表达有M2e、内部空腔装载有NP抗原的多抗原通用流感疫苗FRT.M2e+NP。

与实验例21相比，除以人工合成的NP多肽抗原(SEQ ID NO.2)替代HA多肽抗原(SEQ ID NO.10)与FRT.M2e载体溶液混合配制反应体系外，其他制备方法同实验例21。经Ellman试剂测得FRT.M2e对NP包载量约为0.052mg NP/1mg FRT.M2e。

实验例26

一种以FRT为载体的表面融合表达有M2e抗原、内部空腔装载有NP抗原同时表面共价结合有HA抗原的多抗原通用流感疫苗HA.FRT.M2e+NP，其制备方法如下：

1)参照实验例25所述方法，制备得到实验例25所述FRT.M2e+NP疫苗。NP包载量为0.052mg NP/1mg FRT.M2e。

2)参照实验例24步骤2)所述方法，配制1mg/mL的FRT.M2e+NP溶液，向其加入10倍摩尔量的NHS-PEG_n-Mal交联剂于4℃反应1h后取出并除去未反应的残余交联剂。经PEG交联剂修饰后的FRT.M2e+NP溶液0.5mg/mL，同3倍于FRT亚基摩尔量的HA多肽抗原(SEQ IDNO.10)混合，4℃反应15h后取出，经凝胶过滤层析即得表面同时分布有M2e和HA抗原、内部空腔装载有NP抗原的HA.FRT.M2e+NP多抗原流感疫苗，其表面HA抗原共价结合率为每个HA.FRT.M2e+NP分子偶联约16个HA抗原多肽分子。

实验例27

一种以FRT为载体的表面同时融合表达有HA、M2e和NP抗原的多抗原通用流感疫苗FRT.HA.M2e.NP。

与实验例16相比，除连接至实验例15所述FRT载体序列N-端的多肽抗原序列为流感病毒的HA抗原序列(SEQ ID NO.6)、M2e抗原序列(SEQ ID NO.7)和NP抗原序列(SEQ IDNO.8)的串联序列(GLFGAIAGFIE-MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD-QIASNENMETMESSTL)外，其他制备方法同实验例16。(本例作为对比例)

测试例4

采用Ellman’s试剂分析FRT纳米颗粒及其衍生物对各抗原共价结合或包埋前后各抗原浓度变化，以确定FRT纳米颗粒及其衍生疫苗颗粒对各抗原的偶联率或包埋量。

通过常规的HPSEC高效液相色谱法，分析各疫苗组分的均一性。通过还原性SDS-PAGE凝胶电泳分析多抗原流感疫苗的纯度、抗原融合和偶联情况。其中，SDS-PAGE凝胶电泳的蛋白上样量约4μg，样品与还原性SDS-PAGE上样缓冲液按4/1的体积比混合，并在上样前于100℃加热处理5～10min。HPSEC分析使用Agilent 1100HPLC系统进行，所用SEC柱为TSK3000SW_XL，所用缓冲液为50mM PB+0.15M NaCl(pH 7.4)，流速0.5ml/min，紫外检测波长260和280nm，上样量100μL。

通过HPSEC凝胶柱与多角度激光散射(MALLS)和示差检测器(RI)联用，即SEC-LS-RI分析纯化后各多抗原流感疫苗的平均分子量(MW)，确定FRT纳米颗粒及其衍生物对各抗原的偶联率。通过透射电镜(TEM)，分析检测纯化后各多抗原流感疫苗颗粒结构的完整性。

测试例5

取8周龄的Balb/C雌鼠，每8只为一个免疫组，各组分别通过腹腔注射免疫25μg实验例15-27所述的纳米颗粒疫苗，并以免疫有25μg NP(SEQ ID NO.2)、M2e(SEQ ID NO.9)或HA(SEQ ID NO.10)多肽及PBS(pH 7.0～7.2)的小鼠为对照组，注射体积均为100μL。初次免疫两周后(14days)，收集血清并进行同等剂量加强免疫。加强免疫两周后(28days)，再次采集血清，并进行相关血清学检测。

免疫血清中，M2e、NP或HA抗原特异性IgG、IgG1及IgG2a抗体水平以ELISA实验进行测定。其中，加强免疫两周后各免疫组血清中抗原特异性IgG抗体几何平均效价如表4所示。

免疫血清中，毒株特异性血凝抑制滴度以血凝抑制实验进行评价。将分离得到的血清以RDE酶于37℃温育处理18-20h，以除去血清中非特异性血凝抑制因子。而后以原倍鸡红cell于4℃吸附1h左右，以除去非特异性血凝因子。处理后血清初始稀释度即为1:10，以世界卫生组织(WHO)的标准进行血凝抑制实验。A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)毒株特异性血凝抑制滴度结果如表5所示。

表4加强免疫两周后基于FRT纳米颗粒载体的各疫苗免疫组血清中抗原特异性IgG抗体几何平均滴度

由表4可知，若将流感病毒抗原融合表达至FRT纳米颗粒载体表面(例如实验例16、17或18)，制备得到的流感疫苗其所激发的特异性抗体水平较纯抗原组(M2e、NP或HA)均显著增强，这表明FRT纳米颗粒载体显著增强流感抗原的免疫原性。

由表4还可知，对比双抗原疫苗与单抗原疫苗的免疫原性：对比实验例16与实验例19、20或23，当除了表面融合抗原HA外引入另一种抗原M2e或NP时，无论M2e或NP抗原是分布于FRT载体表面还是内腔中，HA的特异性抗体水平均有所提高；对比实验例17与实验例19、21或25，当除了表面抗原M2e外引入另一种抗原NP或HA时，无论HA或NP抗原是分布于FRT载体表面还是内腔中，M2e的特异性抗体水平均有所提高。比较三抗原与双抗原疫苗的免疫原性：对比实验例22与实验例19、23或25，无论是在FRT载体表面融合表达还是在内腔中包埋负载第三种抗原，所制得的三抗原流感疫苗所激发的另两种抗原特异性抗体水平较双抗原疫苗组均有所增强；对比实验例24与实验例23、实验例26与实验例25则会发现，当在FRT载体表面通过化学偶联法负载第三种抗原时，所制得的三抗原流感疫苗所激发的另两种抗原特异性抗体水平较双抗原疫苗组也均有所增强。以上结果表明，无论抗原以何种负载方式分布于FRT载体上，分别分布于FRT载体表面和内部空腔的多种流感抗原间具有免疫协同增强效应。

表5加强免疫两周后基于FRT纳米颗粒载体的HA疫苗免疫组血清几何平均血凝抑制滴度

表5所示为各HA疫苗免疫组小鼠血清对A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)毒株的特异性血凝抑制滴度结果。由表5可知，纯HA多肽抗原免疫血清对受试H3N2毒株的血凝抑制效价低，而将HA融合表达与FRT载体外表面后，其免疫血清的血凝抑制效价显著升高。进一步对比实验例16与实验例19、20、27或实验例22-24，当在FRT载体的内腔中或外表面同时负载区别于表面融合HA抗原的第二种甚至第三种抗原，制得的多抗原流感疫苗对受试H3N2毒株的血凝抑制效价较FRT.HA单抗原疫苗会进一步提高。以上结果表明，多抗原的负载能协同增强HA抗原的广谱免疫原性。

由表5还可知，对比实验例19与实验例20或21，当HA和M2e抗原同时负载于FRT载体外表面时，所得疫苗对受试H3N2毒株的血凝抑制效价最高；对比实验例27与实验例22、24或26，当NP抗原负载于FRT载体内腔中时，所得疫苗对受试H3N2毒株的血凝抑制效价更高。以上结果表明，仿生模拟流感病毒各表位分布的空间结构，即HA和M2e抗原分布于FRT载体的外表面而NP表位分布于FRT载体的内部空腔中时，制备得到实验例22、24或26所示的多抗原仿生流感疫苗，其对受试H3N2毒株的血凝抑制效价更高，意味着其具有更好的潜在攻毒保护效力，也具有更优的广谱保护效果。这也与测试例2所得结果相符。

测试例6

在测试例5所述加强免疫两周后(28days)，各免疫组小鼠通过滴鼻攻毒感染10LD50致死剂量的A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)毒株或A/An Hui/1/2005(H5N1)毒株，记录各免疫组小鼠感染14天内体重变化及存活率。各免疫组小鼠存活率见表6。

表6加强免疫两周后基于FRT纳米颗粒载体的各疫苗免疫组免疫保护效果

由表6可知，对比实验例19与实验例20和21所述流感疫苗的抗原分布特点，三者均为基于FRT纳米颗粒载体的、同时携带有M2e和HA抗原的双抗原流感疫苗，其区别在于：实验例19中，M2e和HA模拟了流感病毒自身表位的空间位置分布，均分布于FRT载体外表面；实验例20中，HA分布于FRT载体外表面，而M2e则分布于FRT的内部空腔中，与流感病毒自身表位的空间位置分布并不相同，即双抗原非仿生流感疫苗；实验例21中，M2e分布于FRT载体外表面，而HA则分布于FRT的内部空腔中，与流感病毒自身表位的空间位置分布也并不相同，也是双抗原非仿生流感疫苗。若进一步对比实验例19与实验例20和21所述流感疫苗的保护效力则会发现，三者对受试H1N1毒株的免疫保护率均为100％，但实验例19对受试H5N1毒株的免疫保护率则显著高于实验例20或21的。这说明，实验例19所述“HA和M2e抗原分布于FRT载体外表面”的双抗原仿生流感疫苗，广谱免疫保护效力远优于实验例20和21所述的双抗原非仿生流感疫苗。对比实验例27与实验例22、24或26，当NP抗原负载于FRT载体内腔中时，所得疫苗对受试H5N1毒株的免疫保护率最高，即广谱免疫效果最佳。以上结果表明，当HA和M2e抗原分布于FRT载体外表面，而NP分布于FRT载体内腔中时，所得三抗原仿生流感疫苗的广谱免疫保护效果最佳。

综合测试例1-6的实验结果可知，FRT纳米颗粒载体能显著增强流感抗原的免疫原性；基于FRT纳米颗粒载体的多抗原通用流感疫苗较单抗原流感疫苗的免疫原性又会有进一步增强；而在多抗原通用流感疫苗中，不同抗原在FRT载体上的空间分布会影响多抗原疫苗的广谱免疫效果：当M2e或HA抗原分布于FRT载体的外表面，而NP抗原分布于FRT载体的内部空腔中时，得到的多抗原仿生流感疫苗较单抗原疫苗或多抗原非仿生流感疫苗具有更好的广谱免疫效果。又由于将NP抗原负载于FRT载体内部的操作相对简单且不会破坏抗原、原有铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒结构及免疫原性，因此具有很高的可操作性和技术价值。

综上所述，本发明基于FRT铁蛋白纳米颗粒制备得到的多抗原通用流感疫苗中，所述抗原衍生自流感病毒，其可通过基因工程手段融合表达于FRT载体表面，也能经合适的交联剂共价结合于FRT外表面；抗原在FRT载体内部空腔的分布，能通过热处理、变性复性剂处理、酸碱处理等手段实现，且该操作相对简单且不会破坏抗原、原有铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒结构及免疫原性，具有很高的可操作性和技术价值。本发明中所述优选的多抗原仿生流感疫苗，其各抗原组分及结构分布模拟了流感病毒的天然空间构象，呈现了多种流感病毒抗原，能同时发挥多种流感病毒抗原的免疫原性，激发更全面的免疫效应，提供更广谱的抗流感病毒的免疫保护效果。根据表面负载抗原的不同，所设计的通用仿生流感疫苗免疫机理也会有所不同，可根据需求选择合适的抗原组合模式。此外，FRT纳米颗粒不仅具有良好的抗原提呈能力及免疫刺激能力，又因其在人及哺乳动物体内广泛存在，所以具有很好的生物相容性。因此本发明中以FRT纳米颗粒为载体蛋白不仅可以增强其上所负载流感抗原的免疫原性，提高疫苗的免疫保护效应，其理论上也具有很好的安全性，有在老人及小孩中适用的可能性。

以上详细描述了本发明的部分优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，比如FRT.NA+NP，FRT.NA.M2e+NP，FRT.NA.M2e+NP，NA.FRT+NP，NA.M2e.FRT+NP等。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院过程工程研究所

<120> 一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用

<130> 2019

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

1 5 10 15

Arg Ser Asn Gly Ser Ser Asp Cys

20

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Gln Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu

1 5 10 15

Cys

<210> 3

<211> 522

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 3

Met Lys Ala Asn Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ala Ala Ala Asp

1 5 10 15

Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr

20 25 30

Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn

35 40 45

Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile

50 55 60

Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly

65 70 75 80

Asn Pro Glu Cys Asp Pro Leu Leu Pro Val Arg Ser Trp Ser Tyr Ile

85 90 95

Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Ile Cys Tyr Pro Gly Asp Phe

100 105 110

Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe

115 120 125

Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Asn

130 135 140

Thr Asn Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Glu Gly Lys Ser Ser Phe

145 150 155 160

Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Glu Gly Ser Tyr Pro Lys

165 170 175

Leu Lys Asn Ser Tyr Val Asn Lys Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu

180 185 190

Trp Gly Ile His His Pro Pro Asn Ser Lys Glu Gln Gln Asn Leu Tyr

195 200 205

Gln Asn Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Thr Ser Asn Tyr Asn Arg

210 215 220

Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Glu Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Ala

225 230 235 240

Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile

245 250 255

Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Met Tyr Ala Phe Ala

260 265 270

Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met

275 280 285

His Glu Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Ser

290 295 300

Ser Leu Pro Tyr Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro

305 310 315 320

Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn

325 330 335

Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

340 345 350

Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His

355 360 365

His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr

370 375 380

Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Thr Val Ile Glu

385 390 395 400

Lys Met Asn Ile Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu

405 410 415

Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu

420 425 430

Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu

435 440 445

Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys

450 455 460

Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys

465 470 475 480

Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg

485 490 495

Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn

500 505 510

Arg Glu Lys Val Asp Gly Val Lys Leu Glu

515 520

<210> 4

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

ttaagatttc ctgcttttag cgatcccttt gacatactga tcggctaaat acaagccatg 60

gttttcatta ccaatcaact caattttatc caaaatatcc ttgaaaagca cttcttcttc 120

atgctgttca gccacatacc attgcaagaa attgaaagtc gcatgatctt tgctttttat 180

ggcgtgatct acgatattgt taatagactc gctgatgtgt tgctcatgtt cataggcttt 240

ttggaaaatt tgagtcaaac cttcaaactt atgctcaggc gcgctgatgc tggtcaattg 300

cacaggcaca ttgttttcat tcaagaagat aataagcttt ttagcatgct cgtattcttc 360

agccgcatgg tcaaacaaga aaagccccgc gccatctaag ctatgggtat agcaccatga 420

actcatgctc atatacaagt tggaagagtt catttcctta ttcacttgtt cgtttagcaa 480

cttaatgatg tcttttgata acat 504

<210> 5

<211> 167

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 5

Met Leu Ser Lys Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys

1 5 10 15

Glu Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr

20 25 30

Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala

35 40 45

Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn

50 55 60

Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe

65 70 75 80

Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His

85 90 95

Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys

100 105 110

Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His

115 120 125

Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile

130 135 140

Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly

145 150 155 160

Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser

165

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 6

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu

1 5 10

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 7

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

1 5 10 15

Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp

20

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 8

Gln Ile Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu

1 5 10 15

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 9

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

1 5 10 15

Ser Arg Ser Asn Gly Ser Ser Asp Cys

20 25

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 10

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Cys

1 5 10

Claims

1.一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗，其特征在于，所述基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗包括铁蛋白纳米颗粒载体蛋白、表面抗原和内腔抗原，所述表面抗原分布于铁蛋白纳米颗粒的表面，内腔抗原分布于铁蛋白纳米颗粒的内部空腔；

所述铁蛋白为去铁铁蛋白；

所述表面抗原为HA抗原和M2e抗原的组合；

所述内腔抗原为NP抗原；

所述通用流感疫苗的制备方法包括以下步骤：将表面抗原装载到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面，将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒内部空腔；

所述表面抗原通过基因融合表达或化学偶联法分布于铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面；

所述内腔抗原装载的方法包括加热法、酸碱调节法或变性剂法；

所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白为全长铁蛋白纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的多抗原通用流感疫苗，其特征在于，所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白为哺乳动物来源的铁蛋白或细菌来源的铁蛋白。

3.根据权利要求2所述的多抗原通用流感疫苗，其特征在于，所述哺乳动物来源的铁蛋白为马脾脏铁蛋白。

4.根据权利要求2所述的多抗原通用流感疫苗，其特征在于，所述细菌来源的铁蛋白为幽门螺杆菌铁蛋白。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的多抗原通用流感疫苗，其特征在于，所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白的来源包括天然提取产物、人工合成产物或基因工程技术产物中的任一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求5所述的多抗原通用流感疫苗，其特征在于，所述化学偶联法的化学交联剂包括琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)、琥珀酰亚胺基-马来酰亚胺多聚乙二醇(NHS-PEG_n-Mal)、N-ε-马来酰亚胺己酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-ε-马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、羧基-氨基多聚乙二醇(COOH-PEG_n-NH₂)、双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(Sulfo-DSS)、磺基双琥珀酰亚胺酯多聚乙二醇(NHS-PEG_n-NHS)中的任一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求6所述的多抗原通用流感疫苗，其特征在于，所述化学偶联法的化学交联剂为Sulfo-SMCC或NHS-PEG_n-Mal交联剂；

其中，所述PEG_n中的n为聚乙二醇中乙二醇单体的个数，所述聚乙二醇的分子量范围为2k-10k。

8.如权利要求1-7中任一项所述的基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将表面抗原装载到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面，将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒内部空腔；

所述内腔抗原装载的方法包括加热法、酸碱调节法或变性剂法。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(A1)将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中；

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(C1)将两种不同的表面抗原基因均融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面，得表面分布有两种流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒；

12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述加热法具体包括如下步骤：

1)将待装载的内腔抗原与铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒载体蛋白混合，加热；

2)去除未被装载的内腔抗原，纯化回收，得内部空腔中装载有内腔抗原的铁蛋白纳米颗粒。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤1)所述加热的温度为25-80℃。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤1)所述加热的温度为25-50℃。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤1)所述加热的时间为30-120min。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤2)所述去除未被装载的内腔抗原的方法包括透析、超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析或超速离心中的任一种或至少两种的组合。

17.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酸碱调节法具体包括如下步骤：

(d)去除步骤(c)所得混合液中未被装载的内腔抗原，纯化回收，得内部空腔中装载有内腔抗原的铁蛋白纳米颗粒疫苗；

步骤(d)所述去除未被装载的内腔抗原的方法包括透析、超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析或超速离心中的任一种或至少两种的组合。

18.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述变性剂法具体包括如下步骤：

3’)去除步骤2’)所得混合液中的变性剂以及未被装载的内腔抗原，纯化回收，得内部空腔中装载有内腔抗原的铁蛋白纳米颗粒疫苗。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤1’)所述变性剂包括脲素；

所述脲素的摩尔浓度为4-8M；

步骤1’)所述孵育的时间为1-3h；

步骤2’)所述孵育的时间为0.5-6h；

步骤3’)所述去除未被装载的内腔抗原的方法包括透析、超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析或超速离心中的任一种或至少两种的组合。

20.一种如权利要求1-7任一项所述的基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗用于制备预防流感的药物中的应用。