CN113121704B

CN113121704B - 基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗

Info

Publication number: CN113121704B
Application number: CN202110307533.4A
Authority: CN
Inventors: 柯天一; 姚德惠; 劳芳; 张泽译; 丁凤姣; 王晓飞; 刘岩; 王闯; 成健伟; 欧阳芳幸
Original assignee: Kunshan Xinyunda Biotech Co ltd
Current assignee: Zhongke Xinyun Biotechnology (Kunshan) Co.,Ltd.
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-03-23
Also published as: CN113121704A

Abstract

本发明提供了一种基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗，所述疫苗包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含融合蛋白，其中所述融合蛋白包含冠状病毒科的病毒的S蛋白的至少一个免疫原性部分以及与所述S蛋白的至少一个免疫原性部分连接的自组装的、单体亚基的至少一部分，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述S蛋白的至少一个免疫原性部分。本发明的冠状病毒疫苗可用于预防和/或治疗冠状病毒感染。

Description

基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗。

背景技术

新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)导致的新冠状病毒肺炎(COVID-19)是继SARS之后对人类健康具有重大威胁的突发性疾病。

2020年1月7日，中科院武汉病毒所检测出新型冠状病毒并获得该病毒的全基因组序列。2月3日，其通过对比新型冠状病毒和实验室早期检测的冠状病毒的部分序列，发现该新型冠状病毒与蝙蝠样本的一株冠状病毒基因序列一致性高达96％。SARS-CoV-2能通过与SARS-CoV相同的方式，即与人ACE2细胞受体结合的方式入侵细胞。

SARS-CoV-2是一种包膜的单链正义RNA病毒，其刺突蛋白(S)从球形病毒体表面突出，并介导病毒进入宿主细胞。S蛋白包含两个功能性亚基S1和S2。其中，S1亚基主要由N端结构域(N-terminal domain，NTD)和C端结构域(CTD)组成。CTD直接与细胞受体人类血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)结合，并起受体结合域(receptor-binding domain，RBD)的作用。RBD由核心结构(core structure)和受体结合基序(receptor-binding motif，RBM)组成，负责直接与ACE2受体结合。

目前，全球众多研究机构和生物医药公司加入COVID-19新疫苗的开发中，且疫苗开发的类别涉及多个类目，既包括减毒疫苗、灭活病毒疫苗、重组蛋白疫苗等传统方式的疫苗类型，还包括DC疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗以及病毒载体疫苗的新型疫苗类型。核酸疫苗目前的安全性和稳定性还有待验证，而减毒和灭活疫苗的安全性则一直是一个问题。在这些众多的研究项目中，未见以纳米颗粒的形式来制备COVID-19疫苗的相关研究项目。

最近NanoViricides在新闻报道中宣布正在开发一种COVID-19疗法，其依赖于他们特定的Versatile Platform技术平台，即在纳米胶束表面展示能够被病毒S蛋白识别的受体-配体复合物，而后使得纳米颗粒与病毒脂质膜融合，从而达到杀灭病毒的目的。NanoViricides的这种技术需要先筛选能与病毒结合受体蛋白(如ACE-2受体)结合的配体，而后形成配体-受体蛋白复合物，开发难度大，制备程序复杂，且其无法在体内产生抗体，无法达到预防疫苗的效果，仅作为治疗用途。

铁蛋白具有均一、稳定的笼状结构。铁蛋白独特的笼状结构也使得其可以病毒样纳米颗粒的形式，作为有潜力的候选疫苗类型。而到目前为止，采用铁蛋白作为冠状病毒的纳米疫苗未见报道。因此，本领域仍旧需要发展新的、更有效、安全和稳定的疫苗形式，来预防和/或治疗包括新型冠状肺炎在内的疾病的发生。

发明内容

本发明通过分析冠状病毒科，尤其是新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白与其受体ACE2的结合位点，确定S蛋白的受体结合基序RBM。本发明旨在构建RBM与自组装的、单体亚基的融合蛋白，开发出用于新型冠状病毒感染的预防和/或治疗药物。

本发明对铁蛋白单体亚基序列进行Cys点突变，能够减少聚集体生成、提高蛋白可溶性表达和复性效率。

本发明提供了铁蛋白的单体亚基的截短突变体，使得RBM连接于铁蛋白C末端时有更好的伸展空间。

具体来说，本发明提出了如下技术方案：

在一方面，本发明提供了一种包含融合蛋白的纳米颗粒。

在一方面，本发明提供了一种用于生产前述纳米颗粒的方法。

在一方面，本发明提供了一种疫苗组合物。

在一方面，本发明提供了一种ACE-2受体拮抗剂。

在一方面，本发明提供了一种生成针对冠状病毒科的病毒的疫苗的方法。

在一方面，本发明提供了前述纳米颗粒、疫苗组合物或ACE-2拮抗剂、疫苗在制备药物中的用途。

在一方面，本发明提供了一种融合蛋白。

在一方面，本发明提供了一种核酸分子。

在一方面，本发明提供了一种表达构建体。

在一方面，本发明提供了一种重组细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的基于铁蛋白的冠状病毒疫苗通过将冠状病毒S蛋白的受体结合基序RBM负载于铁蛋白纳米颗粒的外表面，来模拟冠状病毒的球状结构，与单纯的S蛋白制备抗原相比，能诱发强体液免疫反应及细胞免疫反应，可以预防由冠状病毒引起的感染，具有很好的广谱免疫效果；

(2)本发明用大肠杆菌表达系统获得的融合蛋白，能够简单、高产量的自组装形成具有结合活性的笼状蛋白，制备方法简单，易操作，具有高成药价值和产业化价值。

(3)本发明在一些技术方案中，将野生型铁蛋白中的Cys突变，避免了铁蛋白纳米颗粒之间形成二硫键，从而降低了聚集体的生成，同时也使得纳米颗粒蛋白以包涵体形式表达后，复性工艺简单，复性成功率提高，同时也增加了蛋白的可溶性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面对所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为pET-22b(+)质粒图谱。

图2为pBAD质粒图谱。

图3为重组质粒图谱示意图。

图4为重组表达质粒双酶切电泳图。

图5示出了重组菌株(质粒为pET-22b(+))在LB平板(Amp+)上的生长情况。

图6示出了SDS-PAGE检测结果。

图7-1示出了目的蛋白复性液SEC-HPLC的检测结果。

图7-2示出了HFn SEC-HPLC检测图谱。

图8示出了RBM-HFn的透射电镜结果。

图9示出了RBM-HFn的DLS粒径结果。

图10示出了RBM-HFn与ACE2受体结合活性。

图11示出了RBM-HFn免疫小鼠血清与S蛋白的RBD的结合活性。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

术语“纳米颗粒”指从自组装的，单体亚基蛋白形成的颗粒。例如，铁蛋白亚基蛋白自组装成铁蛋白纳米颗粒。本发明的纳米颗粒的形状通常为球状或球状，尽管其他形状，例如杆状，立方体，片状，长圆形，卵形等也可用于实施本发明。

术语“自组装”蛋白质是指能够不借助特定诱导剂，在表达的同时通过规则排列形成多聚体而形成纳米颗粒的蛋白质。

术语“冠状病毒(Coronavirus)”属于冠状病毒科，冠状病毒属，可以感染哺乳动物和禽类，引起呼吸系统、消化和中枢神经的各种疾病。根据基因组和血清学差异可以将冠状病毒分成四个不同的属：α、β、γ和δ，目前只有α和β属冠状病毒感染人类。截至目前已鉴定出来自两个属(α和β)的6种人冠状病毒(HCoV)，α属冠状病毒包括NL63和229E，β属冠状病毒包括OC43、HKU1、急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)。

术语“铁蛋白”是指由蛋白外壳和铁内核两部分构成的储铁结构。天然情况下，铁蛋白的蛋白外壳是通常由24个亚基自组装形成的笼状蛋白结构(外径约12nm，内径约8nm)，而铁内核的主要成分为水铁矿。不含铁内核的铁蛋白的蛋白外壳也称为“去铁蛋白”。本文所述“铁蛋白”包括真核生物铁蛋白和原核生物铁蛋白，优选真核生物铁蛋白，更优选哺乳动物铁蛋白，例如人铁蛋白。真核生物铁蛋白通常包括重链铁蛋白单体亚基(H，21kDa)和轻链铁蛋白单体亚基(L，19kDa)。H亚基负责Fe(II)氧化成Fe(III)并包括催化性铁氧化酶位点，而L亚基在铁成核中发挥作用。H和L亚基共同组装成24聚体的杂聚体铁蛋白。在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有H和L亚基的比例有所不同。然而，通过重组方式，也可以获得仅由H亚基组装成的“H铁蛋白”或仅由L亚基组装成的“L铁蛋白”。

术语“人重链铁蛋白”(下文缩写为“人HFn”)是指仅由人铁蛋白的重链单体亚基组装成的铁蛋白。“人轻链铁蛋白”(下文缩写为“人LFn”)是指仅由人铁蛋白的轻链单体亚基组装成的铁蛋白。

术语“融合蛋白”是指由上述一种或多种分子组成的天然或合成分子，其中具有不同特异性的两种或多种基于肽或蛋白质(包括糖蛋白)的分子任选的通过化学的或基于氨基酸的接头分子融合在一起。该连接可通过C-N融合或N-C融合(以5′→3′方向)而实现。

表1缩略语表

在一方面，本发明提供了一种包含融合蛋白的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含冠状病毒科的病毒的S蛋白的至少一个免疫原性部分以及与所述S蛋白的至少一个免疫原性部分连接的自组装的、单体亚基的至少一部分，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述S蛋白的至少一个免疫原性部分。

优选地，所述冠状病毒科的病毒选自新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)、SARS-CoV、MERS-CoV、229E、NL63、OC43和HKU1。更优选地，所述冠状病毒科感染由SARS-CoV病毒引起。更优选地，所述冠状病毒科感染由新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)病毒引起。

在具体实施方案中，所述S蛋白的至少一个免疫原性部分衍生自冠状病毒科的病毒的S蛋白受体结合结构域；优选地，所述S蛋白的至少一个免疫原性部分为S蛋白受体结合基序；所述S蛋白受体结合基序包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述S蛋白受体结合基序的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明，本发明的自组装的单体亚基蛋白、单体亚基蛋白、自组装的(SA)蛋白质、自组装的亚基蛋白等是全长、单体多肽，或者其任何部分或变体，其能够引导单体自组装亚基蛋白自组装为纳米颗粒。此类蛋白质是本领域技术人员已知的。可用于制备本发明纳米颗粒的自组装蛋白的实例包括但不限于，优选地，所述单体亚基选自下组：铁蛋白单体亚基、单体encapsulin蛋白、单体03-33蛋白、单体硫加氧酶还原酶(SOR)蛋白、单体2,4-二氧四氢蝶啶合酶(lumazine synthase)(LS)蛋白、单体丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)蛋白、单体氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2)蛋白以及甲病毒(如基孔肯雅病毒)的包膜(Env)蛋白；优选地，所述铁蛋白单体亚基是来源于哺乳动物来源的铁蛋白、两栖类动物来源的铁蛋白、细菌来源的铁蛋白或植物来源的铁蛋白中的任意一种或至少两种组合的铁蛋白单体亚基，优选为哺乳动物来源或细菌来源的铁蛋白单体亚基。

优选地，所述哺乳动物来源的铁蛋白包括人源性铁蛋白、鼠源性铁蛋白或马脾脏铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述细菌来源的铁蛋白包括幽门螺杆菌铁蛋白、大肠杆菌铁蛋白或激烈火球菌铁蛋白。

优选地，所述铁蛋白的来源包括天然提取产物、人工合成产物或基因工程技术产物中的任一种或至少两种的组合。

优选地，所述铁蛋白单体亚基包括突变氨基酸序列；优选地，所述突变氨基酸为半胱氨酸(Cys)；更优选地，所述半胱氨酸突变为谷氨酸(Glu)或丙氨酸(Ala)。

优选地，所述铁蛋白单体亚基是截短突变体；优选地，所述截短突变体是重链铁蛋白单体亚基(H)C端的α-螺旋截短突变体；优选地，所述截短突变体是轻链铁蛋白单体亚基(L)C端的ε螺旋截短突变体。

在具体实施方案中，所述纳米颗粒包含至少一个所述的铁蛋白单体亚基，优选地，所述铁蛋白单体亚基选自重链铁蛋白单体亚基(H)或轻链铁蛋白单体亚基(L)；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基(H)和/或轻链铁蛋白单体亚基(L)形成纳米颗粒，更优选地，所述纳米颗粒包含24个铁蛋白单体亚基，其中重链铁蛋白单体亚基(H)与轻链铁蛋白单体亚基(L)的比例为0:24-24:0；优选地，所述重链铁蛋白单体亚基(H)是人重链铁蛋白单体亚基(H)；优选地，所述轻链铁蛋白单体亚基(L)是人轻链铁蛋白单体亚基(L)。

优选地，所述重链铁蛋白单体亚基(H)包含与SEQ ID NO.2、3、4或5所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述重链铁蛋白亚基(H)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、3、4或5所示；优选地，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO.6、7、8或9所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、7、8或9所示。

优选地，所述轻链铁蛋白亚基(L)包含与SEQ ID NO.10、11、12或13所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述的轻链铁蛋白亚基(L)的氨基酸序列如SEQ ID NO.10、11、12或13所示，优选地，所述的融合蛋白包含SEQ ID NO.14、15、16或17所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.14、15、16或17所示。

在一方面，本发明提供了一种用于生产前述纳米颗粒的方法，所述方法包括将编码所述融合蛋白的一个或多个核酸分子导入细胞中，并在适合于表达编码的蛋白质和形成纳米颗粒的条件下温育所述细胞。

在一方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含前述纳米颗粒；优选地，所述的疫苗是针对冠状病毒的疫苗；更优选地，所述的疫苗是针对新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)的疫苗。

在一方面，本发明提供了一种ACE-2受体拮抗剂，其包含前述纳米颗粒，所述纳米颗粒通过结合ACE-2受体而发挥作用。

在一方面，本发明提供了一种生成针对冠状病毒科的病毒的疫苗的方法，该方法包括：a)表达融合蛋白，所述融合蛋白包含与冠状病毒科的病毒的S蛋白的至少一个免疫原性部分连接的自组装的、单体亚基的至少一部分，所述单体亚基自组装形成纳米颗粒，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述至少一个免疫原性部分，并且其中所述纳米颗粒能在动物中引发针对冠状病毒科的病毒的保护性免疫应答；和b)回收所述纳米颗粒；优选地，所述冠状病毒科的病毒选自新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)、SARS、MERS、229E、NL63、OC43和HKU1；更优选地，所述冠状病毒科的病毒为新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)。

在一方面，本发明提供了前述纳米颗粒、疫苗组合物、ACE-2拮抗剂或前述疫苗在制备药物中的用途。

在一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含与选自下组的序列至少80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO.6-9或14-17；优选地，所述融合蛋白选自SEQ ID NO.6-9或14-17。

在一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码前述的融合蛋白的核酸序列；优选地，所述核酸序列包含与SEQ ID NO.18所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述核酸序列如SEQ ID NO.18所示。

在一方面，本发明提供了表达构建体，其包含前述核酸分子。

在一方面，本发明提供了一种重组细胞，其包含前述核酸分子或前述表达构建体。

本发明将新型冠状病毒的RBM的编码序列连接于铁蛋白蛋白亚基的N端或C末端(或截断了C端一个α-螺旋的截短序列)，使得其在自组装成为24聚体后，形成在铁蛋白表面能展示多个RBM结构的纳米疫苗，达到预防新型冠状肺炎的目的。

实施例

下面，参考具体实施例更详细地描述本发明，然而，实施例仅用于说明目的，对于本发明不具有限制作用。下述实施例中所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的实验材料的设计与实验方法如下：

1实验材料的设计

1.1多肽、蛋白或融合蛋白的设计

为了制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗，根据新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白以及铁蛋白的氨基酸序列设计设计以下多肽、蛋白或融合蛋白。

(1)SARS-CoV-2的S蛋白的RBM多肽，其氨基酸序列如下(共计72个氨基酸)：

NSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPY(SEQ ID NO.1)

(2)候选HFn单体亚基蛋白

a)野生型HFn单体亚基蛋白，其氨基酸序列如下(共计183个氨基酸)：

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES(SEQ ID NO.2)

b)突变HFn1单体亚基蛋白(mHFn1)：将野生型HFn单体亚基蛋白C端的α-螺旋去掉，获得mHFn1，其氨基酸序列如下(共计163个氨基酸)：

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPE(SEQ ID NO.3)

c)突变HFn2单体亚基蛋白(mHFn2)：将野生型HFn单体亚基蛋白第91、103、131位的Cys分别突变为Glu、Ala、Ala，获得mHFn2，其氨基酸序列如下(共计183个氨基酸)：

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDEDDWESGLNAMEAALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES(SEQ ID NO.4)

d)突变HFn3单体亚基蛋白(mHFn3)：将野生型HFn单体亚基蛋白C端的α-螺旋去掉，并将第91、103、131位的Cys分别突变为Glu、Ala、Ala，获得mHFn3，其氨基酸序列如下(共计163个氨基酸)：

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDEDDWESGLNAMEAALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPE(SEQ ID NO.5)

(3)SARS-CoV-2的S蛋白的RBM多肽与HFn单体亚基蛋白的融合蛋白

a)RBM-HFn融合蛋白

将SARS-CoV-2S-RBM通过linker(G4S)3连接至野生型HFn单体亚基蛋白的N端形成融合蛋白，获得RBM-HFn融合蛋白，其氨基酸序列如下(共计270个氨基酸)：

MNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYGGGGSGGGGSGGGGSTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES(SEQ ID NO.6)

b)mHFn1-RBM融合蛋白

将SARS-CoV-2S-RBM通过linker(G4S)3连接至C端截短的HFn单体亚基蛋白(mHFn1)的C端形成融合蛋白，获得mHFn1-RBM融合蛋白，其氨基酸序列如下(共计250个氨基酸)：

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPEGGGGSGGGGSGGGGSNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPY(SEQ ID NO.7)

c)mHFn3-RBM融合蛋白

将SARS-CoV-2S-RBM通过linker(G4S)3连接至C端截短并将Cys突变的HFn单体亚基蛋白(mHFn3)的C端形成融合蛋白，获得HFn3-RBM融合蛋白，其氨基酸序列如下(共计250个氨基酸)：

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDEDDWESGLNAMEAALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPEGGGGSGGGGSGGGGSNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPY(SEQ ID NO.8)

d)RBM-mHFn2融合蛋白

将SARS-CoV-2S-RBM通过linker(G4S)3连接至Cys突变的HFn单体亚基蛋白(mHFn2)的N端形成融合蛋白，获得RBM-mHFn2融合蛋白，其氨基酸序列如下(共计270个氨基酸)：

MNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYGGGGSGGGGSGGGGSTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDEDDWESGLNAMEAALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLADFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES(SEQ ID NO.9)

(4)候选LFn单体亚基蛋白

a)野生型LFn单体亚基蛋白，其氨基酸序列如下(共计174个氨基酸)：

SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID NO.10)

b)突变LFn1单体亚基蛋白(mLFn1)：将野生型LFn的126位的Cys突变为Ala(LFnC126A)，获得mLFn1，其氨基酸序列如下(共计174个氨基酸)：

SSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLADFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID NO.11)

c)突变LFn2单体亚基蛋白(mLFn2)：将野生型LFn单体亚基蛋白C端的α-螺旋去掉，获得mLFn2，其氨基酸序列如下(共计157个氨基酸)：

MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGG(SEQ ID NO.12)

d)突变LFn3单体亚基蛋白(mLFn3)：将野生型LFn单体亚基蛋白C端的α-螺旋去掉，并将第127位的Cys分别突变为Ala，获得mLFn3，其氨基酸序列如下(共计157个氨基酸)：

MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLADFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGG(SEQ ID NO.13)

(5)SARS-CoV-2的S蛋白的RBM多肽与LFn单体亚基蛋白的融合蛋白

a)RBM-LFn融合蛋白

将SARS-CoV-2S-RBM通过linker(G4S)3(省略一个S)连接至野生型LFn单体亚基蛋白的N端形成融合蛋白，获得RBM-LFn融合蛋白，其氨基酸序列如下(共计261个氨基酸)：

MNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYGGGGSGGGGSGGGGSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID NO.14)

b)RBM-LFn1融合蛋白

将SARS-CoV-2S-RBM通过linker(G4S)3(省略一个S)连接至野生型LFn单体亚基蛋白的N端，LFn的126位的C突变为A(LFn C126A)，获得RBM-LFn1融合蛋白，其氨基酸序列如下(共计261个氨基酸)：

MNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYGGGGSGGGGSGGGGSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLADFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID NO.15)

c)RBM-LFn2融合蛋白

将LFn C端的ε螺旋(158-175)去掉后，将SARS-CoV-2S-RBM融合至截短的C端，利用156、157位的GG组成一个(G4S)3linker，连接两个蛋白，获得RBM-LFn2融合蛋白，其氨基酸序列如下(共计242个氨基酸)：

MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGGGSGGGGSGGGGSNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPY(SEQ ID NO.16)

d)RBM-LFn3融合蛋白

将LFn C端的ε螺旋(158-175)去掉并将126位的C突变为A后，RBM融合至突变LFn的截短C端，利用156、157位的GG组成一个(G4S)3linker，连接两个蛋白，获得RBM-LFn3融合蛋白，其氨基酸序列如下(共计242个氨基酸)：

MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLADFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGGGSGGGGSGGGGSNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPY(SEQ ID NO.17)

1.2编码基因的设计

根据宿主菌的密码子偏爱性合成上述多肽、蛋白或融合蛋白的编码基因。

1.3表达载体的构建

选择大肠杆菌表达外源蛋白的常用载体pET-22b(+)，氨苄青霉素抗性(Amp⁺)，选择Nde I和Bam H I酶切位点嵌入目的基因，获得重组pET-22b质粒。经酶切图谱和基因测序确证表达载体构建成功。其中，pET-22b(+)的质粒图谱如图1所示。

选择大肠杆菌表达外源蛋白的载体pBAD，氨苄青霉素抗性(Amp⁺)，选择Sac I和Hind III酶切位点嵌入目的基因，获得重组pBAD质粒。经酶切图谱和基因测序确证表达载体构建成功。其中，pBAD的质粒图谱如图2所示。

1.4重组菌株的构建

选择E.coli BL21(DE3)作为宿主菌，将含有目的基因的重组pET-22b质粒转化至宿主菌感受态细胞中，通过含氨苄青霉素的抗性平板筛选阳性克隆，确定重组菌株。

选择E.coli origami(DE3)作为宿主菌，将含有目的基因的重组pBAD质粒转化至宿主菌感受态细胞中，通过含氨苄青霉素的抗性平板筛选阳性克隆，确定重组菌株。

2.实验方法

2.1重组菌株构建

2.1.1重组质粒重悬

取重组pET-22b质粒和重组pBAD质粒冻干粉10μg，分别用200μl TE缓冲液重悬均匀，10μl/管分装，分别留1管备用，其余冻存于-80℃冰箱备用。

2.1.2转化

(1)从-80℃冰箱中取出E.coli BL21(DE3)或E.coli origami(DE3)感受态细胞，放置在冰上融化后(约5min左右)，在冰浴中，取0.5～1μl质粒重悬液加入到20μl感受态细胞中充分混匀，在冰上静置孵育30min。

(2)将上述样品于42℃水浴热激90s后，立即放置到冰上，静置2min。

(3)取280μL无菌LB液体培养基，加入到热激后的样品中，在37℃，220rpm活化1h。

(4)分别取上述转化后的菌液150μl涂布于含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素(氨苄青霉素母液浓度100mg/mL)的LB平板上，37℃培养箱培养过夜，观察菌落生长情况。

2.2蛋白表达

2.2.1摇瓶培养

分别取抗性平板上大且饱满的克隆3个，分别接种于40～60mL LB培养基中(摇瓶)，于37℃培养至OD₆₀₀ 1.0-1.5左右，加入0.25～0.5mM IPTG，25℃诱导表达3-8h或16℃诱导过夜，经SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。

2.2.2检测样品制备

菌体裂解：取30mL菌液，5000-8000r/min离心10-30min，弃上清，加入30mL 20mMTris-HCl，pH8.0缓冲液重悬均匀，于高压均质机800-1000bar破碎3次。

SDS-PAGE样品制备：取上述菌体裂解液100μL，8000-10000rpm离心10-20min，取20μL上清液至另一离心管中，加入5μL 5×上样缓冲液(Loading buffer)混匀，85-95℃孵育5min，此为裂解液上清样品；将剩余的沉淀，加入100μL 20mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液重悬沉淀，取20μL重悬液加入5μL 5×上样缓冲液混匀，85-95℃孵育5min，此为裂解液沉淀样品。

2.3蛋白活性检测方法：

使用间接ELISA法检测复性液中的蛋白与ACE2受体的结合活性，由此证明复性液中是否存在具有结合活性的目的蛋白，即SARS-CoV-2的S蛋白的RBM多肽与HFn单体亚基蛋白的融合蛋白。

实验操作流程如下：

1)包板：96孔板包被待测样品或参考品，放入4℃冰箱孵育过夜；

2)洗板：利用PBST(取300μl Tween-20加入PBS 100ml中混匀使用)清洗3次；

3)封闭：加入5％BSA封闭液300μL/孔，覆上封板膜，37℃培养箱中孵育2h；

4)洗板：将酶标板用1×PBST于洗板机洗3次；

5)孵育受体ACE2蛋白：利用缓冲液将ACE2蛋白溶解并稀释至工作浓度为1.0～1.5μg/mL，100μL/孔，覆上封板膜，37℃培养箱中孵育2h；

6)洗板：将酶标板用1×PBST于洗板机洗3次；

7)孵育一抗：将Anti-ACE2抗体用蛋白稳定剂(购自湖州英创生物科技有限公司，PR-SS-002)稀释(1:1000)，100μL/孔，覆上封板膜，37℃培养箱中孵育1.5h；

8)洗板：将酶标板用1×PBST于洗板机洗3次；

9)孵育HRP酶标二抗：将酶标二抗用5％BSA稀释(1:5000)，100μL/孔，覆上封板膜，37℃培养箱中孵育0.5h；

10)洗板：将酶标板用1×PBST于洗板机洗3次；

11)显色：加入TMB一步显色液，注意避光，100μL/孔，避光5min、10min和30min分别检测一次，立即用酶标仪于650nm检测吸光值。

实施例1：RBM-HFn融合蛋白的构建、表达、活性检测和纯化

1.RBM-HFn融合蛋白的构建

构建RBM-HFn融合蛋白，并根据大肠杆菌的密码子偏爱性优化编码基因序列，获得优化的RBM-HFn(编号：XYD-403-000)基因，其具体序列如下：

ATGAATAGTAATAATCTGGATTCTAAAGTGGGCGGCAATTATAATTATCTGTATCGCCTGTTTCGTAAATCAAATCTGAAACCGTTTGAACGCGATATTAGTACCGAAATTTATCAGGCAGGCTCTACCCCGTGTAATGGTGTTGAAGGCTTTAATTGTTATTTTCCGCTTCAAAGCTATGGCTTTCAGCCGACCAATGGCGTTGGCTATCAGCCGTATGGTGGTGGCGGTTCAGGCGGCGGTGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGTACCACCGCAAGCACCTCACAGGTTCGTCAGAATTATCATCAGGATAGCGAAGCAGCAATTAATCGCCAGATTAATCTGGAACTGTATGCAAGCTATGTGTATCTGAGTATGTCTTATTATTTTGATCGCGATGATGTTGCACTGAAAAATTTTGCAAAATATTTTCTGCATCAGTCTCATGAAGAACGCGAACATGCAGAAAAACTGATGAAACTCCAAAATCAGCGTGGTGGTCGCATTTTTCTTCAAGATATTAAAAAACCGGATTGTGATGATTGGGAAAGTGGCCTGAATGCAATGGAATGTGCACTGCATCTGGAAAAAAATGTTAATCAGTCACTGCTGGAACTGCATAAACTGGCAACCGATAAAAATGATCCGCATCTGTGTGATTTTATTGAAACCCATTATCTGAATGAACAGGTTAAAGCAATTAAAGAACTGGGTGATCATGTGACCAATCTGCGTAAAATGGGCGCACCGGAAAGCGGCCTGGCAGAATATCTGTTTGATAAACATACCCTGGGCGATAGCGATAATGAAAGT(SEQ ID NO.18)

2.表达载体构建

选择大肠杆菌表达外源蛋白的常用载体pET-22b(+)，氨苄青霉素抗性(Amp+)，选择Nde I和Bam H I酶切位点嵌入目的基因XYD-403-000，得重组pET-22b-XYD-403-000质粒，其重组质粒图谱如图3所示。重组pET-22b-XYD-403-000质粒抽提后检测质粒纯度和样品浓度，符合要求。

将重组pET-22b-XYD-403-000质粒经Xho I和XbaI双酶切(分别临近Nde I和BamHI)，得到的酶切片段含有目的基因，长度大约810bp，经双酶切后，电泳图中有两条基因条带(图4)，750～1000bp之间的是目的基因条带，大小在理论值附近，表明目的基因已构建至表达质粒中。重组质粒经测序100％序列正确。

3.重组菌株抗性筛选

将重组pET-22b-XYD-403-000质粒转化E.coli BL21(DE3)，转化后的菌液140μl涂布于含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素(氨苄青霉素母液浓度100mg/mL)的LB平板上，37℃培养箱培养过夜。菌落生长情况如图5所示，重组菌株在含有抗性的LB平板上均能够生长，且克隆数量多，由此判断重组菌株均具有相应抗性，与菌株构建时选用的质粒pET-22b(+)的抗性一致。

取抗性平板上的表达量较高的单菌落进行扩增，OD₆₀₀至1.5～2.0时分别加入终浓度20％的甘油，分装1mL/管，此为甘油菌。甘油菌储存于-80℃冰箱，待后续发酵使用。

4.RBM-HFn融合蛋白的表达及蛋白活性检测

4.1.发酵样品制备

取甘油菌于室温融化后以1％接种于LB培养基中，于37℃，220rpm摇床培养至OD₆₀₀至1.0，加终浓度为0.5mM IPTG，于25℃诱导目的蛋白表达，诱导5h终止培养。

4.2.菌体收集

取上述发酵液，于4℃，10000rpm离心25min收集菌体。

4.3.菌体裂解

取30mL菌液，5000r/min离心15min，弃上清，加入30mL 20mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液重悬均匀，于高压均质机1000bar破碎3次。

4.4.样品检测

4.4.1发酵样品目的蛋白可溶性检测

(1)样品制备

菌体裂解：取30mL菌液，5000r/min离心15min，弃上清，加入30mL 20mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液重悬均匀，于高压均质机1000bar破碎3次。

SDS-PAGE样品制备：取上述菌体裂解液100μL，10000rpm离心10min，取20μL上清液至另一离心管中，加入5μL 5×上样缓冲液混匀，95℃孵育5min，此为裂解液上清样品(SQ)；将剩余的沉淀，加入100μL 20mM Tris-HCl，pH8.0缓冲液重悬沉淀，取20μL重悬液加入5μL5×上样缓冲液混匀，95℃孵育5min，此为裂解液沉淀样品(CD)。样品于95℃～100℃加热5分钟，冷却后离心，混匀待检。

(2)SDS-PAGE检测

上样量为10μL，恒定电压90～125V，设定电流上限200mA，设定电泳时间60～90分钟。

(3)实验结果

如图6所示，目的蛋白(分子量30.4kD)分布于沉淀中，说明蛋白在表达过程中形成了包涵体。对包涵体进行复性，具体步骤为：将收集的包涵体用8mol/L尿素溶解，采用浓度梯度透析复性。复性透析溶液分别是6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素与20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl配制的pH值8.0的溶液，各浓度的复性透析溶液透析8h，复性后的溶液于5000×g，离心20min收集上清。

4.4.2目的蛋白分子量检测

复性结束后，取样送检SEC-HPLC，据分子量初步判断复性液中是否存在目的蛋白。图7-1示出了复性液SEC-HPLC检测图谱，图7-2示出了HFn SEC-HPLC检测图谱。如图所示，复性液在保留时间8.7min左右检测到明显蛋白峰，较HFn(分子量504kD)的保留时间短(11.3min左右)，复性液中蛋白分子量较HFn大，该成分为复性后目的蛋白(分子量720kD)。

4.4.3纳米颗粒的形态和粒径检测

TEM检测RBM-HFn纳米颗粒形态：

将蛋白样品(20μL，0.1mg/mL)滴加到处理后的铜网中，用1％的乙酸铀酰染色1分钟，然后用JEM-1400 80kv TEM(JEOL，Japan)成像。透射电镜结果(图8)表明，RBM-HFn呈现均匀、规则的笼状蛋白结构，直径在大约12-16nm之间。

DLS粒径检测：

选用仪器Nano ZSE Nanosizer(Malvern,UK)检测样品粒径，参数设置Material为Protern，Dispersant为pH 8.0 50mM的Tris缓冲液。选择自动模式扫描。

样品均为储存在pH 8.0 50mM Tris缓冲液中，RBM-HFn的蛋白浓度3.78mg/mL。结果如图9所示，RBM-HFn的平均粒径为14.27nm。

4.4.4结合活性检测—间接ELISA法

使用间接ELISA法检测复性液中的蛋白与ACE2受体的结合活性，由此证明复性液中是否存在具有结合活性的目的蛋白即RBM-HFn。

活性检测结果如图10所示，结果表明，RBM-HFn具有ACE2受体结合活性，且具有浓度依赖性。

4.4.5RBM-HFn复性液中蛋白的纯化

将实施例1制备的蛋白复性液经100kD超滤管超滤浓缩后，离心收集上清液，用Sephadex G-25(Cytiva)换液至pH中性的缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)中，最后经Superdex 200pg(Cytiva)进行分子筛层析纯化，获得纯度大于99％的二十四聚体RBM-HFn蛋白，分子筛层析的缓冲液是：50mM Tris-HCl，pH 8.0。过滤除菌后保存于-20℃待用。

实施例2RBM-HFn抗血清的制备和血清效果检测

1.小鼠免疫和抗血清的制备

将实施例1得到的RBM-HFn测定蛋白浓度，而后用生理盐水进行稀释至工作浓度，使用佐剂的组稀释为工作浓度的2倍浓度，与免疫佐剂504(成都依斯康医药科技有限公司)等体积混合并乳化。

对6-8周龄的Balb/C小鼠进行分组免疫，每组10只。各组免疫方案见表2。通过皮下注射的方式，每只小鼠分别在第0天，第14天，第28天接受3次抗原蛋白免疫；在第-3天，第7天，第21天、第35天进行眼眶取血。小鼠血清在静置一段时间待血清析出后，通过4℃，2800rpm离心15分钟获得，立刻用于SARS-CoV-2的S蛋白RBD结合活性检测实验。

表2

样本	RBM-HFn量(μg/只/次)	佐剂504(μg/只/次)
			1	1.1	-
2	3.3	-
			3	10	-
4	3.3	165
			PBS对照	-	-

2.血清结合S-RBD活性检测

上述的小鼠血清与S-RBD的结合活性通过以下方法检测：

实验操作流程如下：

1)包板：S-RBD(北京义翘神州科技股份有限公司)用抗原包被液(0.15M Na₂CO₃，0.35M的NaHCO₃)稀释蛋白至1μg/mL，96孔板包被S-RBD稀释液，放入4℃冰箱孵育过夜；

4)洗板：将酶标板用1×PBST于洗板机洗3次；

5)血清样本用1％的BSA稀释至特定浓度，混匀后取100μL/孔，覆上封板膜，37℃培养箱中孵育2h；

6)洗板：将酶标板用1×PBST于洗板机洗3次；

9)将HRP标记山羊抗小鼠二抗(北京百奥莱博)用1％BSA稀释(1:5000)，100μL/孔，覆上封板膜，37℃培养箱中孵育1h；

10)洗板：将酶标板用1×PBST于洗板机洗3次；

11)显色：加入TMB一步显色液(湖州英创生物科技有限公司)，注意避光，100μL/孔，避光孵育10min，用酶标仪在652nm波长下依序测量吸光度。

活性结果如图11所示，结果表明，RBM-HFn能够刺激小鼠体内生成IgG，且血清中的抗体滴度具有浓度和时间依赖性，10μg剂量下第35d的抗体滴度可达40500。

序列表

<110> 昆山新蕴达生物科技有限公司

<120> 基于纳米颗粒的冠状病毒疫苗

<130> MTI20043

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 72

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2 S蛋白受体结合基序(Human coronavirus)

<400> 1

Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile

20 25 30

Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu

35 40 45

Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr

50 55 60

Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

65 70

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> HFn(Human)

<400> 2

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu

165 170 175

Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 3

<211> 163

<212> PRT

<213> HFn1(Human)

<400> 3

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu

<210> 4

<211> 183

<212> PRT

<213> 突变HFn2(Human)

<400> 4

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Glu Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Ala Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Ala Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu

165 170 175

Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 5

<211> 163

<212> PRT

<213> 突变HFn3(Human)

<400> 5

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Glu Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Ala Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Ala Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu

<210> 6

<211> 270

<212> PRT

<213> RBM-HFn 融合蛋白(Human)

<400> 6

Met Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

20 25 30

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

35 40 45

Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

50 55 60

Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val

85 90 95

Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile

100 105 110

Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu

130 135 140

His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu

145 150 155 160

Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro

165 170 175

Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu

180 185 190

His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu

195 200 205

Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His

210 215 220

Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val

225 230 235 240

Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr

245 250 255

Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

260 265 270

<210> 7

<211> 250

<212> PRT

<213> mHFn1-RBM 融合蛋白(Human)

<400> 7

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn

180 185 190

Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg

195 200 205

Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly

210 215 220

Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln

225 230 235 240

Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

245 250

<210> 8

<211> 250

<212> PRT

<213> mHFn3-RBM 融合蛋白(Human)

<400> 8

Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp

1 5 10 15

Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser

20 25 30

Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg

50 55 60

Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg

65 70 75 80

Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Glu Asp Asp Trp Glu Ser

85 90 95

Gly Leu Asn Ala Met Glu Ala Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn

100 105 110

Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro

115 120 125

His Leu Ala Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys

130 135 140

Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly

145 150 155 160

Ala Pro Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn

180 185 190

Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg

195 200 205

Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly

210 215 220

Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln

225 230 235 240

Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

245 250

<210> 9

<211> 270

<212> PRT

<213> mHFn2-RBM 融合蛋白(Human)

<400> 9

Met Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

20 25 30

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

35 40 45

Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

50 55 60

Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val

85 90 95

Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile

100 105 110

Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr

115 120 125

Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu

130 135 140

His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu

145 150 155 160

Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro

165 170 175

Asp Glu Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn Ala Met Glu Ala Ala Leu

180 185 190

His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu

195 200 205

Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Ala Asp Phe Ile Glu Thr His

210 215 220

Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val

225 230 235 240

Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr

245 250 255

Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser

260 265 270

<210> 10

<211> 174

<212> PRT

<213> LFn(Human)

<400> 10

Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val

1 5 10 15

Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser

20 25 30

Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser

35 40 45

His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg

50 55 60

Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp

65 70 75 80

Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met

85 90 95

Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp

100 105 110

Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe

115 120 125

Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met

130 135 140

Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala Gly

145 150 155 160

Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp

165 170

<210> 11

<211> 174

<212> PRT

<213> 突变LFn1(Human)

<400> 11

Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val

1 5 10 15

Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser

20 25 30

Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser

35 40 45

His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg

50 55 60

Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp

65 70 75 80

Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met

85 90 95

Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp

100 105 110

Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Ala Asp Phe

115 120 125

Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met

130 135 140

Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala Gly

145 150 155 160

Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp

165 170

<210> 12

<211> 157

<212> PRT

<213> 突变LFn2(Human)

<400> 12

Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala

1 5 10 15

Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu

20 25 30

Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu

50 55 60

Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln

65 70 75 80

Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala

85 90 95

Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu

100 105 110

Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp

115 120 125

Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys

130 135 140

Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly

145 150 155

<210> 13

<211> 157

<212> PRT

<213> 突变LFn3(Human)

<400> 13

Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala

1 5 10 15

Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu

20 25 30

Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu

50 55 60

Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln

65 70 75 80

Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala

85 90 95

Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu

100 105 110

Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Ala Asp

115 120 125

Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys

130 135 140

Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly

145 150 155

<210> 14

<211> 261

<212> PRT

<213> RBM-LFn融合蛋白(Human)

<400> 14

Met Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

20 25 30

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

35 40 45

Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

50 55 60

Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser

85 90 95

Thr Asp Val Glu Ala Ala Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln

100 105 110

Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp

115 120 125

Val Ala Leu Glu Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu

130 135 140

Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly

145 150 155 160

Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp

165 170 175

Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys

180 185 190

Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr

195 200 205

Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu

210 215 220

Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Glu Ala Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu

245 250 255

Thr Leu Lys His Asp

260

<210> 15

<211> 261

<212> PRT

<213> RBM-LFn1 融合蛋白(Human)

<400> 15

Met Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

20 25 30

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

35 40 45

Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

50 55 60

Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser

85 90 95

Thr Asp Val Glu Ala Ala Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln

100 105 110

Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp

115 120 125

Val Ala Leu Glu Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu

130 135 140

Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly

145 150 155 160

Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp

165 170 175

Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys

180 185 190

Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr

195 200 205

Asp Pro His Leu Ala Asp Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu

210 215 220

Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Glu Ala Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu

245 250 255

Thr Leu Lys His Asp

260

<210> 16

<211> 242

<212> PRT

<213> RBM-LFn2 融合蛋白(Human)

<400> 16

Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala

1 5 10 15

Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu

20 25 30

Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu

50 55 60

Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln

65 70 75 80

Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala

85 90 95

Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu

100 105 110

Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp

115 120 125

Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys

130 135 140

Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser Asn Asn Leu Asp

165 170 175

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

180 185 190

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

195 200 205

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

210 215 220

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

225 230 235 240

Pro Tyr

<210> 17

<211> 242

<212> PRT

<213> RBM-LFn3 融合蛋白(Human)

<400> 17

Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala

1 5 10 15

Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu

20 25 30

Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu

50 55 60

Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln

65 70 75 80

Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala

85 90 95

Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu

100 105 110

Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Ala Asp

115 120 125

Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys

130 135 140

Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser Asn Asn Leu Asp

165 170 175

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

180 185 190

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

195 200 205

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

210 215 220

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

225 230 235 240

Pro Tyr

<210> 18

<211> 810

<212> DNA

<213> RBM-HFn 基因(human)

<400> 18

atgaatagta ataatctgga ttctaaagtg ggcggcaatt ataattatct gtatcgcctg 60

tttcgtaaat caaatctgaa accgtttgaa cgcgatatta gtaccgaaat ttatcaggca 120

ggctctaccc cgtgtaatgg tgttgaaggc tttaattgtt attttccgct tcaaagctat 180

ggctttcagc cgaccaatgg cgttggctat cagccgtatg gtggtggcgg ttcaggcggc 240

ggtggtagcg gcggtggcgg tagtaccacc gcaagcacct cacaggttcg tcagaattat 300

catcaggata gcgaagcagc aattaatcgc cagattaatc tggaactgta tgcaagctat 360

gtgtatctga gtatgtctta ttattttgat cgcgatgatg ttgcactgaa aaattttgca 420

aaatattttc tgcatcagtc tcatgaagaa cgcgaacatg cagaaaaact gatgaaactc 480

caaaatcagc gtggtggtcg catttttctt caagatatta aaaaaccgga ttgtgatgat 540

tgggaaagtg gcctgaatgc aatggaatgt gcactgcatc tggaaaaaaa tgttaatcag 600

tcactgctgg aactgcataa actggcaacc gataaaaatg atccgcatct gtgtgatttt 660

attgaaaccc attatctgaa tgaacaggtt aaagcaatta aagaactggg tgatcatgtg 720

accaatctgc gtaaaatggg cgcaccggaa agcggcctgg cagaatatct gtttgataaa 780

cataccctgg gcgatagcga taatgaaagt 810

Claims

1. 一种包含融合蛋白的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含新型冠状肺炎病毒SARS-CoV-2的S蛋白受体结合基序以及与所述S蛋白受体结合基序连接的重链铁蛋白单体亚基，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述S蛋白受体结合基序；所述S蛋白受体结合基序的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述重链铁蛋白单体亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。

2.用于生产权利要求1的纳米颗粒的方法，所述方法包括将编码所述融合蛋白的一个或多个核酸分子导入细胞中，并在适合于表达编码的蛋白质和形成纳米颗粒的条件下培养所述细胞。

3.一种疫苗组合物，其包含权利要求1的纳米颗粒。

4.一种权利要求3所述的疫苗组合物，所述的疫苗是针对新型冠状肺炎病毒SARS-CoV-2的疫苗。

5.一种ACE-2受体拮抗剂，其包含权利要求1的纳米颗粒，所述纳米颗粒通过结合ACE-2受体而发挥作用。

6. 一种生成针对新型冠状肺炎病毒SARS-CoV-2的疫苗的方法，该方法包括：a)表达融合蛋白，所述融合蛋白包含新型冠状肺炎病毒SARS-CoV-2的S蛋白受体结合基序以及与所述S蛋白受体结合基序连接的重链铁蛋白单体亚基，所述重链铁蛋白单体亚基自组装形成纳米颗粒，并且其中所述纳米颗粒在其表面上展示所述S蛋白受体结合基序；和b)回收所述纳米颗粒，其中所述S蛋白受体结合基序的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述重链铁蛋白单体亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.权利要求1所述的纳米颗粒、根据权利要求2的方法生产的纳米颗粒、权利要求3或4所述的疫苗组合物、根据权利要求5所述的ACE-2拮抗剂或根据权利要求6的方法产生的所述疫苗在制备预防新型冠状肺炎病毒SARS-CoV-2感染的药物中的用途。

8. 一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。

9.一种核酸分子，其编码权利要求8的所述融合蛋白。

10. 权利要求9所述的核酸分子，所述核酸序列为与SEQ ID NO. 18所示核苷酸序列具有80％以上同一性的核苷酸序列。

11. 根据权利要求10所述的核酸分子，所述核酸序列为与SEQ ID NO. 18所示核苷酸序列具有85%以上同一性的核苷酸序列。

12. 根据权利要求11所述的核酸分子，所述核酸序列为与SEQ ID NO. 18所示核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列。

13. 根据权利要求12所述的核酸分子，所述核酸序列为与SEQ ID NO. 18所示核苷酸序列具有95%以上同一性的核苷酸序列。

14. 根据权利要求13所述的核酸分子，所述核酸序列为与SEQ ID NO. 18所示核苷酸序列具有96%以上同一性的核苷酸序列。

15. 根据权利要求14所述的核酸分子，所述核酸序列为与SEQ ID NO. 18所示核苷酸序列具有97%以上同一性的核苷酸序列。

16. 根据权利要求15所述的核酸分子，所述核酸序列为与SEQ ID NO. 18所示核苷酸序列具有98%以上同一性的核苷酸序列。

17. 根据权利要求16所述的核酸分子，所述核酸序列为与SEQ ID NO. 18所示核苷酸序列具有99%以上同一性的核苷酸序列。

18. 根据权利要求16所述的核酸分子，所述核酸分子的核酸序列如SEQ ID NO. 18所示。

19.表达构建体，其包含权利要求9-18中任一项所述的核酸分子。

20.一种重组细胞，其包含权利要求9-18中任一项所述的核酸分子或权利要求19所述的表达构建体。