CN114634578A - 针对新型冠状病毒感染的疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种新型冠状病毒病原样抗原(PLA)疫苗及其制备方法和应用，该病原样抗原疫苗由结构经改造的大肠杆菌噬菌体病毒样颗粒(VLP)及展示在其上的新型冠状病毒抗原构成，病毒样颗粒内部包裹有核酸。经改造形成的本发明的新冠病毒PLA疫苗有效避免了颗粒的聚集或沉淀，便利了疫苗的生产，确保疫苗效力的稳定，且相对于需额外添加佐剂的传统疫苗而言，本发明的PLA‑SARS‑CoV2疫苗能够诱导明显更高水平的特异性抗体和中和抗体，在攻毒试验中相对于传统疫苗具有明显更高的效力。

Description

针对新型冠状病毒感染的疫苗组合物
技术领域
本发明属于生物疫苗领域，具体涉及用于预防和/或治疗SARS-Cov2感染的病原样抗原疫苗组合物。
背景技术
新型冠状病毒病(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-Cov2)感染引起的急性呼吸道传染病。SARS-Cov2感染性极强，人群普遍易感，因此传播速度快。同时，由于病毒感染机制复杂、存在疫情长期化的风险，这些因素都加大了疫情防控的难度。疫苗是控制传染病最有效、也是最经济的手段。目前在世界范围内已经有上百种COVID-19疫苗正在紧急的研制过程中。其采用的疫苗构建策略各不相同，根据技术特点主要可以分成5种类型，包括：1)灭活病毒疫苗；2)病毒载体疫苗，如腺病毒载体疫苗；3)mRNA疫苗；4)DNA疫苗；和5)蛋白亚单位疫苗，如采用SARS-CoV2 S1蛋白或者RBD蛋白混合佐剂的疫苗。这5类疫苗的作用机理各异，但有效性、安全性等方面仍然存在各种缺陷和不确定性，因此目前尚不能保证这些疫苗策略能够生产出满足 COVID-19全球疫情防控所需的优质疫苗。
根据美国FDA等机构提出的要求，COVID-19疫苗需要满足多种性能要求，包括：1)有效性：保护力要求大于50％；2)安全性：要避免ADE/ERD等风险；3)能提供持久的免疫保护力。除此之外，由于需要接种和保护的人群数量巨大，疫苗研制还要求：1)疫苗保存和运输条件要求低，如采用4℃保存条件；2)经济性好，易于大规模、低成本生产。最后，为了应对SARS-Cov2因为突变导致的免疫逃逸，理想的疫苗策略需要能快速适应病毒变异产生的影响。
发明内容
为此，一方面，本发明涉及一种可溶性病原样抗原复合物，其包含：(1)病毒样颗粒(VLP)，其由第一融合蛋白自组装而成，所述第一融合蛋白包含位于其N端的病毒衣壳蛋白或其变体和其C端的SpyTag，(2)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含来自SARS-CoV2病毒S1蛋白的抗原或其变体和SpyCatcher，优选所述SpyCatcher在所述第二融合蛋白的N端；其中，所述病毒样颗粒还在其内部包裹核酸，和其中所述病毒样颗粒和所述来自于SARS-CoV2病毒S1蛋白的抗原通过所述SpyCatcher和所述SpyTag共价连接而使所述来自于SARS-CoV2病毒S1蛋白的抗原或其变体展示于所述病毒样颗粒的表面。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述病毒样颗粒内包裹的所述核酸为所述病毒样颗粒在其自组装时包裹的、来自用于表达所述病毒样颗粒的宿主细菌的核酸，优选所述宿主细菌为大肠杆菌，优选所述核酸是RNA。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述衣壳蛋白来自大肠杆菌噬菌体Q β、MS2或AP205，优选来自大肠杆菌噬菌体AP205。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述噬菌体AP205衣壳蛋白的序列与 SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述噬菌体AP205衣壳蛋白的序列为 SEQ ID NO：1。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述抗原为SARS-CoV2病毒S1蛋白的 RBD序列。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述抗原的序列与SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述抗原的序列为SEQ ID NO：2。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述SpyTag的序列与SEQ ID NO：3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性，SpyCatcher的序列与SEQ ID NO：4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中在第一融合蛋白中，噬菌体衣壳蛋白或其变体与SpyTag通过第一连接肽连接，在第二融合蛋白中，抗原或其变体与SpyCatcher通过第二连接肽连接。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述第一连接肽的序列为SEQ IDNO： 5，所述第二连接肽的序列为SEQ ID NO：6。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述第二融合蛋白与所述病毒样颗粒以小于或等于1:1的比率连接，优选以1:6～1:12的比率连接，再优选以1:6、1:7、1:8、1:9、1:10 的比率连接，以此确保病原样抗原复合物的可溶性和免疫原性，所述比率以第二融合蛋白上的SpyCatcher与病毒样颗粒上的SpyTag之比计算。
本发明的另一方面涉及一种病原样抗原疫苗组合物，其中包含根据本发明的可溶性病原样抗原复合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明的又一个方面涉及在有需要的受试者中预防和/或治疗SARS-CoV2病毒感染相关疾病的方法，其中向所述受试者施用预防和/或治疗有效量的本发明的可溶性病原样抗原复合物或疫苗组合物。
本发明的PLA-SARS-CoV2疫苗具有如下优点：
(1)能够通过调动B细胞抗原提呈功能来启动免疫反应，具有免疫原性强、产生抗体亲和力高、免疫保护力持久、安全性好的优点；
(2)本发明的疫苗在制备过程中避免了核酸的降解，在确保疫苗效力的同时，因无需额外添加佐剂，减少或者避免了额外添加佐剂所导致的过度炎症反应；
(3)本发明疫苗中所使用的底盘颗粒经改造能够避免颗粒聚集或沉淀，便利了疫苗的生产，确保疫苗效力的稳定，易于大规模生产；
(4)本发明的疫苗结构方便针对新冠病毒RBD抗原的变异作出调整，无需改变底盘颗粒的设计即可快速地生产出新的PLA疫苗。
附图说明
图1：AP205融合蛋白诱导表达前后的全细菌裂解，其中图1A是SC-AP205，图 1B是AP205-SC。
图2：SC-AP205及AP205-SC蔗糖垫离心后核酸胶图，其中1为AP205-ST，2 为SC-AP205，3为AP205-SC。
图3：AP205融合蛋白氯化铯密度梯度离心后分层收样蛋白胶图，其中图3A是 SC-AP205，图3B是AP205-SC。
图4：AP205-ST诱导前后的全细菌裂解。
图5：AP205-ST氯化铯密度梯度离心后分层收样蛋白胶图。
图6：RBD-SC的降解。
图7：AP205-RBD(SC位于C端)的降解。
图8：SC-RBD与AP205-ST连接产物的稳定性。
图9：改造AP205对连接产物可溶性的影响，①为未改造的野生型AP205，②为本发明改造后的AP205，图9A和图9B分别为SDS-PAGE和核酸胶图。
图10：调整抗原比率对连接产物可溶性的影响，图10A、图10B和图10C分别为SDS-PAGE、核酸胶、Coomassie R-250图。
图11：纯化条件即溶液pH对VLP内部核酸完整性的影响，图11A和图11B分别为SDS-PAGE和核酸胶图。
图12：不同pH梯度下VLP内部核酸的变化。
图13：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫小鼠产生抗RBD IgG抗体的情况(初次免疫)。
图14：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫小鼠产生抗RBD IgG抗体的情况(二次免疫)。
图15：PLA-SARS-CoV2疫苗初次免疫和再次免疫后产生的RBD IgG型抗体滴度的变化。
图16：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫小鼠产生中和抗体的情况。
图17：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫猕猴产生抗RBD IgG抗体的情况。
图18：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫猕猴产生中和抗体的情况。
图19：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫猕猴后的肺部病毒载量。
具体实施方式
SARS-CoV-2病毒的S蛋白包含两个功能性亚基S1和S2，S1和S2由胞外结构域(ECD)和单个跨膜螺旋组成，分别介导受体结合和膜融合，S1由N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)组成，对决定组织嗜性和宿主范围至关重要，S蛋白即通过RBD与受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，介导病毒进入宿主细胞。
AP205蛋白(以下简称AP205)是最近新鉴定的AP205 RNA噬菌体的主要衣壳蛋白，其可自行组装成病毒样颗粒(VLP)。该VLP可将连接的有机分子以重复方式定向的展示在其表面，以增强有机分子的免疫原性。SpyTag/SpyCatcher体系以其在各种条件下均能自发形成稳定的异肽键而在蛋白质领域获得广泛应用，VLP与所展示的有机分子之间可以通过该SpyTag/SpyCatcher连接。
本发明人出乎意料地发现，噬菌体AP205衣壳蛋白序列(以下简称AP205序列) 与SpyCatcher序列构建的融合蛋白无法正常组装为病毒样颗粒，只有将SpyTag构建于 AP205序列C端形成的融合蛋白才能够正常组装(实施例1)。本发明人偶然发现， AP205序列的改造以及由此导致的颗粒结构的不同能够明显改善最终连接产物的可溶性(实施例3)；此外，底盘颗粒与抗原连接时两者的比率也会影响连接产物的可溶性(实施例4)。本发明人研究发现，VLP纯化过程中溶液的pH值过高会破坏VLP 中的RNA甚至将其完全降解，适当的pH值能够确保RNA成分在VLP颗粒内的留存，该VLP内的RNA核酸是无佐剂PLA疫苗发挥作用关键因素之一。
本发明人发现，将来自SARS-Cov2病毒的抗原与经过结构优化的AP205 VLP通过SpyTag/SpyCatcher连接，所形成的病原样抗原疫苗免疫原性强，产生抗体亲和力高，免疫保护力持久，安全性好，同时，这种疫苗的原料生产过程成熟，成本低且易于大规模生产，方便针对病毒抗原的变异作出调整。
因此，一方面，本发明涉及一种可溶性病原样抗原复合物，其包含：(1)病毒样颗粒(VLP)，其由第一融合蛋白自组装而成，所述第一融合蛋白包含位于其N 端的病毒衣壳蛋白或其变体和其C端的SpyTag，(2)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含来自SARS-CoV2病毒S1蛋白的抗原或其变体和SpyCatcher，虽然 SpyCatcher可以位于第二融合蛋白的N端和C端，但优选其位于所述第二融合蛋白的N端，所述病毒样颗粒还在其内部包裹核酸，和其中所述病毒样颗粒和所述来自于SARS-CoV2病毒S1蛋白的抗原通过所述SpyCatcher和所述SpyTag共价连接而使所述来自于SARS-CoV2病毒S1蛋白的抗原或其变体展示于所述病毒样颗粒的表面。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述病毒样颗粒内包裹的所述核酸为所述病毒样颗粒在其自组装时包裹的、来自用于表达所述病毒样颗粒的宿主细菌的核酸，优选所述宿主细菌为大肠杆菌，优选所述核酸是RNA。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述衣壳蛋白来自大肠杆菌噬菌体Qβ、MS2或AP205，优选来自大肠杆菌噬菌体AP205。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述噬菌体AP205衣壳蛋白的序列与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述噬菌体AP205衣壳蛋白的序列为SEQ ID NO：1。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述抗原为SARS-CoV2病毒S1 蛋白的RBD序列。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述抗原的序列与SEQ ID NO：2 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述抗原的序列为SEQ ID NO：2。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述SpyTag的序列与SEQ ID NO：3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性，SpyCatcher的序列与SEQ ID NO：4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中在第一融合蛋白中，噬菌体衣壳蛋白或其变体与SpyTag通过第一连接肽连接，在第二融合蛋白中，抗原或其变体与SpyCatcher通过第二连接肽连接。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述第一连接肽的序列为SEQ IDNO：5，所述第二连接肽的序列为SEQ ID NO：6。
本发明还涉及编码所述第一融合蛋白和第二融合蛋白的核酸序列或核酸分子以及包含该核酸序列或核酸分子的载体。
在一些实施方式中，本文所述的多核苷酸或核酸分子或载体可以被密码子优化。
在一些实施方式中，本文所述的多核苷酸或核酸分子或载体可以是其简并版本。
根据本发明的可溶性病原样抗原复合物，其中所述第二融合蛋白与所述病毒样颗粒以小于或等于1:1的比率连接，优选以1:6～1:12的比率连接，再优选以1:6、1:7、 1:8、1:9、1:10的比率连接，以此确保病原样抗原复合物的可溶性和免疫原性，所述比率以第二融合蛋白上的SpyCatcher与病毒样颗粒上的SpyTag之比计算。
本发明的另一方面涉及一种病原样抗原疫苗组合物，其中包含根据本发明的可溶性病原样抗原复合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明的又一个方面涉及在有需要的受试者中预防和/或治疗SARS-CoV2病毒感染相关疾病的方法，其中向所述受试者施用预防和/或治疗有效量的本发明的可溶性病原样抗原复合物或疫苗组合物。
在一些实施方式中，所述相关疾病可以是由SARS-COV-2病毒和/或其突变体引起。
在一些实施方式中，所述相关疾病可以是COVID-19。
本文中所用术语“融合蛋白”是指基因工程改造的蛋白质，其由两个或更多个结合在一起的完整或部分基因或一系列核酸形成的核苷酸序列所编码。可替代地，可通过结合两个或更多个异源肽来制造融合蛋白。
本文中使用的术语“连接肽”表示这样的一个或多个(例如，约2-10个)氨基酸残基：其在多肽的两个邻近的基序、区域或结构域之间，诸如在抗原性肽之间或在抗原性肽和由多重翻译前导序列编码的邻近肽之间，或在抗原性肽和间隔区或切割位点之间。连接肽可以源自融合蛋白的构建体设计(例如，在构建编码融合蛋白的核酸分子的过程中由限制性酶位点的使用引起的氨基酸残基)。
本文所述术语“变体”是指蛋白质或核酸分子，其序列与参考序列相似但不相同，其中变体蛋白(或由变体核酸分子编码的蛋白质)的活性没有明显改变。序列上的这些变异可以是天然发生的变异，或者可以通过使用本领域技术人员已知的遗传工程技术进行工程化改造。此类技术的实例可见于Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T et al.,inMolecularCloning--A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989,pp.9.31-9.57),或Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。关于变体，氨基酸或核酸序列的任何类型的改变都是允许的，只要所得的变体蛋白或多核苷酸的活性没有显著改变。此类变异的实例包括但不限于缺失、插入、取代及其组合。根据其性质，氨基酸可以分为带电荷的氨基酸、不带电荷的氨基酸、极性的不带电荷的氨基酸和疏水性氨基酸。因此，含有取代的蛋白质变体可以是其中氨基酸被来自相同组的氨基酸取代的那些蛋白质变体。此类取代被称为“保守”取代。
本文中使用的术语“抗原”或其变体表示可以刺激细胞产生免疫应答的多肽。
本文中使用的术语“病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。
本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有相应病毒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强受试者针对相应病毒的免疫反应。
本文中使用的术语“核酸”或“核酸分子”表示，例如通过聚合酶链式反应(PCR) 或通过体外翻译产生的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、片段中的任一种，和通过连接、切割、内切核酸酶作用或外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段。在某些实施方式中，本发明内容的核酸通过PCR产生。核酸可以由单体组成，所述单体是天然存在的核苷酸(诸如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)、天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的α-对映异构形式)或它们的组合。修饰的核苷酸可以具有在糖部分、或嘧啶或嘌呤碱基部分中或替代糖部分、或嘧啶或嘌呤碱基部分的修饰。
本文中使用的术语“构建体”表示含有重组核酸的任何多核苷酸。构建体可以存在于载体(例如，细菌载体、病毒载体)中，或可以整合进基因组中。“载体”是能够运输另一种核酸的核酸分子。载体可以是，例如，质粒、粘粒、病毒、RNA载体或线性或圆形DNA或RNA分子，其可以包括染色体、非染色体、半合成的或合成的核酸。示例性的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达它们所连接的核酸(表达载体)的那些载体。
本文中使用的术语“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以连接在本文阐述的蛋白质的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常在从细胞分泌后从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)切割下来。信号肽/前导序列连接在所述蛋白质的N端，长度为约9至200个核苷酸(3 至60个核酸)。本发明使用的信号肽可以是SARS-COV-2病毒S蛋白的信号肽序列或来自其它真核/病毒蛋白的信号肽序列。
本文中使用的术语“表达载体”表示含有与合适的控制序列可操作地连接的核酸分子的DNA构建体，所述控制序列能够实现所述核酸分子在合适的宿主中的表达。这样的控制序列包括用于实现转录的启动子、任选的用于控制这样的转录的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译的终止的序列。所述载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒，或简单地是潜在基因组插入物。病毒载体可以是基于DNA(例如，腺病毒或痘苗病毒)或RNA的，包括溶瘤病毒载体(例如， VSV)，能复制的或不能复制的。一旦转化进合适的宿主中，所述载体可以独立于宿主基因组而复制和起作用，或在某些情况下，可以整合进基因组本身中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”、和“载体”经常互换使用。
本文中使用的术语“表达”表示基于基因的核酸序列而生产多肽的过程。所述过程包括转录和翻译。翻译可以开始于非常规起始密码子，诸如CUG密码子，或翻译可以开始于几种起始密码子(标准的AUG和非常规的)以产生比产生的mRNA更多的蛋白(基于每摩尔量)。
在将核酸序列插入细胞中的背景下，本文中使用的术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，且包括对核酸序列向真核或原核细胞中的整合的提及，其中所述核酸序列可以整合进细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体的DNA) 中，转化成自主复制子，或短暂地表达(例如，转染的mRNA)。
用于在细胞中表达外源或异源核酸的重组方法是本领域众所周知的。这样的方法可以参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory，New York(2001)；和Ausubel等人，Current ProtocolsinMolecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1999)。对编码融合抗原蛋白的核酸分子的遗传修饰可以给从它的天然存在状态改变的重组或非天然细胞赋予生化或代谢能力。
本文中使用的术语“宿主”指可以向其引入本发明构建体的任何生物或其细胞，无论真核或原核，特别地，其中出现RNA沉默的宿主。在具体的实施方案中，“宿主”包括大肠杆菌如E.coli。术语“宿主”在指真核生物，包括单细胞真核生物如酵母和真菌以及多细胞真核生物如动物，非限制性例子包括无脊椎动物(例如，昆虫、腔肠动物、棘皮动物、线虫等)；真核寄生体(例如，疟疾寄生体，如恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum)、蠕虫等)；脊椎动物(例如，鱼类、两栖类、爬行类、鸟、哺乳动物)；和哺乳动物(例如，啮齿类、灵长类如人类和非人灵长类)。因此，术语“宿主细胞”适当地涵盖这类真核生物的细胞以及衍生自这类真核生物的细胞系。
本文中使用的术语“佐剂”指通过增强巨噬细胞活性促进机体T细胞或B细胞的反应，参与半抗原或抗原免疫应答的天然的或合成的物质。
本文中使用的术语“预防和/或治疗”指抑制相应病毒的复制、传播或防止其在宿主体内定居，以及减轻病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
本文中使用的术语化合物或组合物的“治疗有效量(或剂量)”或“有效量(或剂量)”表示，足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种征状的改善的化合物的量。精确量取决于众多因素，例如，组合物的活性、采用的递送的方法、组合物的免疫刺激能力、预期的患者和患者考虑因素等，且可以由本领域普通技术人员容易地确定。治疗效果可以直接地或间接地包括疾病的一种或多种征状的减轻，治疗效果还可以直接地或间接地包括细胞免疫应答的刺激。
本文中使用的术语“药学上可接受的载体”包括本身不诱导产生对接受药物组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。
本文中使用的术语“受试者”可以是能够发生细胞免疫应答的任何生物体，诸如人类、宠物、家畜、展示动物、动物园样本或其它动物。例如，受试者可以是人、非人灵长类动物、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、马、牛、绵羊、山羊、猪等。需要施用如本文中所述的治疗剂的受试者包括已被SARS-COV-2病毒感染甚至已经出现病毒感染相关疾病，或者处于SARS-COV-2病毒感染风险中的受试者。
本文中使用的术语“有需要的受试者”表示处于疾病、障碍或病症的高危中或遭受疾病、障碍或病症的受试者，所述疾病、障碍或病症适合用本文所提供的化合物或其组合物治疗或改善。在某些实施方式中，有需要的受试者是人。
对于包含如本文中所述的病原样抗原复合物，期望的结果是能够以最小副作用诱导持久保护性免疫的安全产品，并且与其它策略(例如，完整活的或减毒的病原体) 相比，廉价地生产，使已经在其它方面(通常)与完整的或减毒的病毒免疫组合物的应用相关联的禁忌最小化或消除。对传染性疾病紧急事件快速响应的能力是本文公开的实施方式的有效应用的一个益处，无论在生物防御还是免疫疗法或技术的背景下。
本发明的病原样抗原疫苗可以通过例如肌肉内注射、皮下地、鼻内地、经粘膜呈递、静脉内地或通过真皮内或皮下施用。
以下将对有关病原性抗原疫苗发明通过具体实施的方式，对其进行举例说明。但应当理解这些实施例不以任何形式限制本发明的范围。
实施例
本发明的新冠病毒病原样抗原(PLA)疫苗作为一种无佐剂蛋白质工程疫苗，具备足够的结构稳定性，是可溶性的，不会聚集或沉淀，VLP内部存在的核酸作为 TLR刺激剂确保了该疫苗具备足够的免疫原性。与需要添加佐剂的传统疫苗相比，本发明的PLA-SARS-CoV2疫苗能够诱导明显更高水平的特异性抗体和中和抗体，在攻毒试验中相对于传统疫苗具有明显更高的效力。
实施例1：SpyCatcher(SC)和SpyTag(ST)与AP205的连接方式对VLP自组装的影响
(1)融合蛋白SC-AP205(SC位于AP205的N端)表达质粒的构建
SC的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，改造后的AP205(非野生型)的氨基酸序列为SEQID NO:1，两者通过连接序列SEQ ID NO:5连接。
I、构建AP205表达载体
人工合成全长393bp的编码AP205的cDNA(SEQ ID NO:9)片段，并在其5’端加上BamHI酶切位点和3’端加上GSGGSG连接、AgeI酶切位点、终止密码子TAA、KpnI酶切位点。用BamHI(Takara 1010A)和KpnI内切酶(Takara 1068A)分别对合成的AP205 cDNA 片段(1μg)和pET21质粒(1μg)置37℃消化2小时。然后在琼脂糖凝胶电泳分离消化的cDNA 片段和pET21a质粒片段。使用小量DNA产物纯化试剂盒(庄盟生物ZP201-3)分别将分离的cDNA片段和pET21a质粒片段纯化。进一步将纯化的cDNA片段与pET21a质粒片段进行 DNA连接反应以构建含有该cDNA片段的pET21a质粒(称为pET21a-AP205质粒)。连接酶为T4 DNA连接酶(Takara 2011A)，连接缓冲液为T4 DNA Ligase Buffer(Takara 2011A)，连接反应中pET21a质粒片段与AP205 cDNA片段的比率约为1：3，总DNA约为200ng，22 ℃连接2小时。如下将pET21a-AP205质粒转化到表达宿主中：将15μl的连接反应液加入到150μl的XLI-Blue感受态大肠杆菌(全式金CD401-02)，42℃，1分钟。吸取150μl在氨苄抗性LB平板上涂板，37℃培养14-16小时。在平板上取单一菌落，用质粒纯化试剂盒(全式金EM101-02)提取质粒DNA并进行酶切验证，确认成功构建pET21a-AP205质粒。
II、构建SC-AP205表达载体
通过PCR(上游引物(SEQ ID NO：13)：acgggatccATGTCGTACTACCATCACCATC，下游引物(SEQ ID NO：14)：cccggatccactgccgctacctccAATATGAGCGTCACCTTTAGTTGC， PCR程序为①94℃5分钟②94℃30秒③58℃30秒④72℃1分钟，②③④循环30次，⑤72℃ 5分钟⑥4℃保持)人工合成全长276bp的编码SC的cDNA(SEQ ID NO：10)片段，并在其 5’和3’端均加上BamHI酶切位点。用BamHI内切酶(Takara 1010A)分别对合成的SC cDNA 片段(1μg)和pET21a-AP205质粒(1μg)置37℃消化2小时。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离消化的cDNA片段和pET21a-AP205质粒片段。使用小量DNA产物纯化试剂盒(庄盟生物 ZP201-3)分别将分离的cDNA片段和pET21a-AP205质粒片段纯化。进一步将纯化的cDNA 片段与pET21a-AP205质粒片段进行DNA连接反应以构建含有该cDNA片段的 pET21a-AP205质粒(称为pET21a-SC-AP205质粒)。连接酶为T4 DNA连接酶(Takara 2011A)，连接缓冲液为T4 DNA LigaseBuffer(Takara 2011A)，连接反应中pET21a-AP205 质粒片段与SC cDNA片段的比率约为1：3，总DNA约为200ng，22℃连接2小时。如下将 pET21a-SC-AP205质粒转化到表达宿主中：将15μl的连接反应液加入到150μl的XLI-Blue 感受态大肠杆菌(全式金CD401-02)，42℃，1分钟。吸取150μl在氨苄抗性LB平板上涂板，37℃培养14-16小时。在平板上取单一菌落，用质粒纯化试剂盒(全式金EM101-02) 提取质粒DNA并进行酶切验证，确认成功构建pET21a-SC-AP205质粒。
(2)融合蛋白AP205-SC(SC位于AP205的C端)表达质粒的构建
用与上述(1)相同的方法制备融合蛋白AP205-SC表达质粒，不同之处在于通过PCR(上游引物：acgaccggtATGTCGTACTACCATCACCATC(SEQ ID NO：15),下游引物为：cccaccggtAATATGAGCGTCACCTTTAGTTGC(SEQ ID NO：16)，PCR程序为①94 ℃5分钟②94℃30秒③58℃30秒④72℃1分钟，②③④循环30次，⑤72℃5分钟⑥4℃保持) 人工合成全长276bp的SCcDNA片段，在其5’和3’端均加上AgeI酶切位点。用AgeI内切酶(NEB R0552V)分别对合成的SC cDNA片段(1μg)和pET21a-AP205质粒(1μg)进行消化并连接以构建pET21a-AP205-SC质粒。
(3)融合蛋白AP205-ST(ST位于AP205序列的C端)表达质粒的构建
用与上述(1)相同的方法构建融合蛋白AP205-ST表达质粒，不同之处在于通过以下过程合成ST的编码DNA序列(gcccacatcgtgatggtggacgcctacaagccgacgaag)(所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4)：
人工合成引物：
F:ccggtggtagcggcgcccacatcgtgatggtggacgcctacaagccgacgaaga(SEQ ID NO：17)
R：ccggtcttcgtcggcttgtaggcgtccaccatcacgatgtgggcgccgctacca(SEQ ID NO：18)
通过退火PCR(5μl 200μM引物-F，5μl 200μM引物-R，2μl 10x退火缓冲液(100mMTris 8.0,1M NaCl,10mM EDTA)，8μl dH2O。设置PCR程序为99℃ 3min,99-20℃每30秒温度下降0.5℃,最后保持在4℃)的方式得到编码ST的DNA序列。用AgeI内切酶(NEB R0552V) 对pET21a-AP205质粒(1μg)置37℃消化2小时。然后在琼脂糖凝胶电泳分离消化的 pET21a-AP205质粒片段。使用小量DNA产物纯化试剂盒(庄盟生物ZP201-3)将分离 pET21a-AP205质粒片段纯化。进一步将PCR获得的ST DNA片段与纯化的pET21a-AP205质粒片段进行DNA连接反应以构建含有该DNA片段的pET21a-AP205质粒(称为 pET21a-AP205-ST质粒)。连接酶为T4 DNA连接酶(Takara 2011A)，连接缓冲液为T4 DNA Ligase Buffer(Takara 2011A)，连接反应中pET21a-AP205质粒片段与ST DNA片段的比率约为1：3，总DNA约为200ng，22℃连接2小时。如下将pET21a-AP205-ST质粒转化到表达宿主中：将15μl的连接反应液加入到150μl的XLI-Blue感受态大肠杆菌(全式金 CD401-02)，42℃，1分钟。吸取150μl在氨苄抗性LB平板上涂板，37℃培养14-16小时。用质粒纯化试剂盒(全式金EM101-02)提取质粒DNA并进行酶切验证，确认成功构建 pET21a-AP205-ST质粒。
(4)融合蛋白表达和自组装成VLP、纯化VLP
融合蛋白表达：采用测序验证正确的、转化有前文构建的质粒的BL21(DE3)感受态大肠杆菌(CD601-02)，挑取单克隆到氨苄抗性LB培养基中过夜摇菌，37℃、220rpm。第二天扩大培养，在对数生长期OD值为0.6-0.9时加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(翊圣生物10902ES08)以诱导表达融合蛋白，诱导5小时后收菌。
纯化：将收获的大肠杆菌离心(6000rpm 10分钟)得到细胞沉淀。使用20mM pH7.5Tris 重悬沉淀。超声破碎菌体得到裂解上清，两次离心(5000rpm 10分钟，20000g 30分钟)除去细胞碎片等不溶性杂质，再通过30％蔗糖垫离心沉淀颗粒性蛋白(在12毫升离心管中，底部加2毫升30％蔗糖，其上加10ml裂解液上清，33000rpm 3.5小时)，用1毫升PBS(KCl2.6mM，KH2PO4 1.47mM，NaCl 136mM，Na2HPO4.12H2O 8mM)重悬颗粒性蛋白，再通过氯化铯密度梯度(在5毫升超离管中，依次加2毫升50％氯化铯，2毫升24％氯化铯，最后加1毫升样品)离心将杂蛋白与目的蛋白分离(200000g，22小时)。分层收样跑蛋白胶确认目的融合蛋白所在位置，取相应层蛋白透析至PBS保存。
(5)结果
SC-AP205、AP205-SC和AP205-ST表达质粒均可很好的表达相应融合蛋白。
SC-AP205和AP205-SC表达质粒诱导前后的全细菌裂解液对比蛋白胶图如图1，显示目的融合蛋白得以表达。但在纯化SC-AP205和AP205-SC时，蔗糖垫离心后离心管底部沉淀难以被重悬，说明SC-AP205和AP205-SC的自组装存在问题，无法得到良好分散的、非聚集的VLP(参见图2)。氯化铯密度梯度离心分层取样，13层之前肉眼可见浑浊，14层及以后澄清，但从蛋白胶条带上看，无法将目的蛋白与杂蛋白分开，而且产量非常少(参见图3)。
对于AP205-ST表达质粒，在后续纯化中则得到了从AP205-ST成功自组装的VLP(参见图2、4)。氯化铯密度梯度离心分层收样蛋白胶图中在14层到20层可见明显的目的融合蛋白条带(参见图5)，取相应层透析至PBS即得到纯化的、从AP205-ST组装的、良好分散的、非聚集的VLP(AP205-ST VLP)。在实验室阶段每升菌可得到50-60mg VLP。
实施例2：SpyCatcher(SC)与抗原的连接方式对PLA稳定性的影响
(1)融合蛋白RBD-SC(SC位于RBD的C端)表达质粒的构建
人工合成全长1068bp的编码RBD-SC的cDNA(SEQ ID NO：11)片段，并在其5’端加调控蛋白表达的Kozak序列GCCACC及KpnI酶切位点和3’端加上XhoI酶切位点。用KpnI和XhoI内切酶(Takara)分别对合成的RBD-SC cDNA片段(1μg)和pCEP4质粒(1μg)置37℃消化2小时。然后在琼脂糖凝胶电泳分离消化的cDNA片段和pCEP4质粒片段。使用小量DNA产物纯化试剂盒(庄盟生物ZP201-3)分别将分离的cDNA片段和pCEP4质粒片段纯化。进一步将纯化的cDNA片段与pCEP4质粒片段进行DNA连接反应以构建含有该cDNA片段的pCEP4质粒(称为pCEP4-RBD-SC质粒)。连接酶为T4 DNA连接酶(Takara 2011A)，连接缓冲液为T4 DNALigase Buffer(Takara 2011A)，连接反应中pCEP4质粒片段与RBD-SC cDNA片段的比率约为1：3，总DNA约为200ng， 22℃连接2小时。如下将pCEP4-RBD-SC质粒转化到表达宿主中：将15μl的连接反应液加入到150μl的XLI-Blue感受态大肠杆菌(全式金CD401-02)，42℃，1分钟。吸取150μl在氨苄抗性LB平板上涂板，37℃培养14-16小时。在平板上取单一菌落，用质粒纯化试剂盒(全式金EM101-02)提取质粒DNA并进行酶切验证，确认成功构建 pCEP4-RBD-SC质粒。
使用无内毒素大提试剂盒(天根生物DP117)从宿主细菌提取pCEP4-RBD-SC质粒。使用PEI试剂(polyscience 23966-1)将提取的pCEP4-RBD-SC质粒转染到293F细胞系(Lifetechnologies)中。配置转染混合物：①300微克质粒加15毫升SMM 293-TII培养基(Sinobiological M293TII)，②1.5毫升PEI加15毫升SMM 293-TII培养基，两者混匀后室温静置2分钟。将转染混合物①②充分混匀室温静置15分钟，之后将转染混合物加入300毫升细胞密度为2x105细胞/毫升的细胞液中，混匀后置于37℃，5％二氧化碳，125rpm摇床培养。中间每两天添加7毫升补料SMS 293-SUPI(Sino biological M293-SUPI)，第七天时收细胞。
两步离心(500g 10分钟，8000rpm 30分钟)除去细胞碎片等不溶性杂质，取上清过0.2μm滤膜进一步除去不溶性杂质。使用Ni-NTA预装重力柱(BBI C600791-0005)纯化所表达的目标蛋白，步骤如下：
a、平衡：先用50毫升超纯水洗，然后用50毫升结合缓冲液(5mM咪唑，500mM 氯化钠，20mM Tris，10％甘油，pH7.9)；
b、上样：将细胞上清通过镍柱，重复三次上样；
c、洗脱：先用50毫升洗涤缓冲液(30mM咪唑，500mM氯化钠，20mM Tris，10％甘油，pH7.9)洗去杂蛋白。再用50毫升洗脱缓冲液(250mM咪唑，500mM氯化钠，20mM Tris，10％甘油，pH7.9)洗脱收取目标蛋白。将目标蛋白液浓缩至5毫升左右再透析至PBS 保存。
所得融合蛋白RBD-SC稳定性差，4℃放置三天时严重降解(因此在图6中没有再显示3天以后的情况)(参见图6)。
(2)RBD-SC与AP205-ST VLP的连接
RBD-SC与AP205-ST VLP以1：10的比率(一个VLP由180条AP205-ST序列自组装而成，即有180个ST，该比率指RBD上的SC与其所要连接的VLP上的ST的比率，下同)在PBS缓冲液中4℃孵育1小时，由此ST氨基酸序列第7位的Asp和SC氨基酸序列的第31位的Lys自发形成异肽共价键，使RBD-SC通过共价键偶联到AP205-ST VLP 上。这个反应过程不需要任何特殊的酶和缓冲液体系。
由此得到的连接产物AP205-ST VLP/RBD-SC在4℃放置9天时完全降解(参见图7)。
(3)融合蛋白SC-RBD(SC位于RBD的N端)表达质粒的构建以及SC-RBD与 AP205-STVLP的连接
用与上述(1)相同的方法构建融合蛋白SC-RBD表达质粒，并用与上述(2)相同的方法连接SC-RBD与AP205-ST VLP。融合蛋白SC-RBD序列为SEQ ID NO:8。人工合成全长1059bp的SC-RBD cDNA(SEQ ID NO：12)片段，并在其5’端加调控蛋白表达的 Kozak序列GCCACC及HindIII酶切位点和3’端加上XhoI酶切位点。用HindIII和XhoI 内切酶(Takara)分别对合成的SC-RBD cDNA片段(1μg)和pCEP4质粒(1μg)置37℃消化2小时。
所得融合蛋白SC-RBD与前述融合蛋白RBD-SC相比稳定性明显提高。而且，同样在4℃下在采用SC-RBD与AP205-ST VLP的连接比率为1:10时，连接产物AP205-ST VLP/SC-RBD在5天内稳定，直到第7天时才出现少量抗原脱落现象，并且在14天时绝大部分仍为完整连接产物(参见图8)。可见AP205-ST VLP/SC-RBD的稳定性明显优于在相同条件下在第9天即完全降解的AP205-ST VLP/RBD-SC。
实施例3：AP205的序列对PLA可溶性的影响
为了研究AP205的序列对PLA可溶性和AP205-ST VLP承载外接抗原的能力的影响，发明人将本发明所用的改造后的AP205衣壳蛋白序列(即在野生型(WT) AP205衣壳蛋白序列N末端添加了五个氨基酸MEFGS，除非另有说明，本文所用 AP205及相应的VLP和疫苗产物均使用该改造后的AP205制得)与未改造的WT AP205衣壳蛋白序列作了一系列的对比试验。
以前述相同方法获得WT AP205-ST VLP。然后将其与融合蛋白SC-RBD以与前述连接方法相同的方法连接在一起获得相应的连接产物。将连接产物还原变性后跑 SDS-PAGE以显示抗原与VLP之间的共价连接；并通过跑核酸胶电泳来检测连接产物的可溶性，具体测量过程和条件为：上样量为10μg PLA或者连接产物，1％核酸胶，90伏，20分钟。
结果发现：SC-RBD与野生型和改造后的AP205-ST VLP在不同比率(1:6、1:8、1:10)均能很好地连接(参见图9A)；但与WT AP205-ST VLP形成的连接产物极易聚集，生成可见沉淀，在核酸胶孔中可见沉积，而改造后的AP205-ST VLP形成的连接产物的可溶性有明显改善，无明显的可见沉淀，特别是在1:8和1:10比率下(参见图9B，图中①为改造前的，②为改造后的)。
实施例4：抗原与VLP的比率对PLA可溶性的影响
本发明人研究了抗原与VLP的比率对连接产物PLA的可溶性的影响，以期通过调整该比率来进一步改善连接产物的可溶性。发明人采用SC-RBD与AP205-ST VLP，分别测试了1:2、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:10的比率，测试方法同实施例3。图10A显示了在这些比率下均可成功获得连接产物；图10B表明当抗原与VLP的比率较高(1:2、1:4、1:5)) 时在核酸胶孔可见明显沉积，而且有明显肉眼可见沉淀生成，说明此时存在PLA聚集，而降低抗原与VLP的连接比率如连接比率在1:6、1:7、1:8、1:10时基本无肉眼可见沉淀，同时没有蛋白沉积在核酸胶孔；图10C是对琼脂糖凝胶的蛋白染色结果，显示了RNA与 AP205蛋白在电泳中伴随运动的情况，同样可以看出，在高比率连接时，胶孔中出现EB 荧光和蛋白染色，说明发生PLA聚集。可见，降低抗原与VLP的比率能够明显提高连接产物的可溶性。由上述实验结果可知，适合于所述新冠病毒抗原RBD的连接比率在大约 1:6～1:12，例如1:6、1:7、1:8、1:9、1:10。
实施例5：VLP纯化条件对其内部的RNA的存在与否的影响
在对VLP的工业化纯化工艺进行探索时，发明人发现当离子交换溶液的pH为10.5时纯化的VLP内部的RNA消失(参见图11)，提示该溶液的酸碱度可能影响 VLP内RNA的存在。因此，发明人在实施例1记载的VLP纯化条件的基础上，检测了溶液pH对VLP内部RNA的存在的影响。具体方法为：分别用盐酸和NaOH调整 PBS的酸碱度，然后将2.5微克纯化的VLP放置37℃水浴2小时，然后通过琼脂糖凝胶电泳和EB染色来检测溶液酸碱度对VLP内RNA的存在的影响。
结果显示：在pH4.5-8.5的范围内VLP内部的RNA含量稳定，pH 9.5时开始减少，在pH 10.5及以上时VLP内部的RNA大幅减少，pH 11.0时已检测不到内部的 RNA，VLP外出现RNA，表明RNA在这样的碱性条件下会从VLP内部释放出来(参见图12)。PLA的VLP内部的RNA对于PLA的B细胞相关免疫活化机理起到关键作用(Sheng Hong et al.,B Cells Are theDominant Antigen-Presenting Cells that Activate Naive CD4+T Cells uponImmunization with a Virus-Derived Nanoparticle Antigen， Immunity,2018.10,49:1-14)。检测发现，当PLA的VLP内部存在RNA时，所述RNA 充当TLR刺激剂，使PLA能够依靠B细胞相关免疫机制发挥作用，免疫效果优于VLP 内部不存在RNA的PLA。因此，发明人提出VLP的纯化工艺需要在合适的pH条件下，例如pH 4.0-9.0，应避免pH 10.5以上的强碱性条件。
实施例6：PLA-SARS-CoV2疫苗诱导抗新冠病毒RBD抗体的能力
将C57BL/6小鼠(购自斯贝福)分为四组：(1)RBD抗原混合铝佐剂(Alum，购自Pierce)，12只，10μg/只；(2)RBD抗原混合CpG1826佐剂(序列为 tccatgacgttcctgacgtt)，4只，10μg/只(CpG用量为50μg/只)；(3)S蛋白胞外段混合铝佐剂，4只，50μg/只；(4)PLA-SARS-CoV2(即对AP205改造后形成的VLP 与SARS CoV2 RBD抗原连接而成的疫苗复合物，下同)，21只，10μg/只。采用腹腔免疫方式。在第一次免疫14天时取血，记为一免血清，第一次免疫21天进行第二次免疫，第二次免疫7天(即第一次免疫28天)时采血，记为二免血清。
Elisa检测RBD特异性抗体反应。RBD抗原包被量为2μg/ml，50μl/孔，4℃过夜。血清进行梯度(血清初始稀释为1：1000，再继续做5倍稀释，共做8梯度)稀释，室温下与包被RBD的Elisa 96孔板孵育3小时。二抗IgG-HRP(Bethyl Laboratories) 室温孵育1小时。显色，酶标仪读取相应孔OD值。取未孵育血清的孔作为空白对照， 4-8个空白对照孔OD值的平均值加10倍标准偏差值为基准值，大于基准值的血清最低稀释度记为抗体滴度。
不同分组的具体测定值，纵坐标为OD读值，横坐标为血清稀释度的Log值。可以看出在免疫一次后小鼠就能产生较高滴度的RBD IgG抗体(参见图13)；再次免疫后RBD IgG抗体滴度可以达到3x106左右(参见图14)。与免疫RBD抗原混合铝佐剂、RBD抗原混合CpG佐剂、以及免疫新冠病毒S蛋白胞外段混合铝佐剂相比， PLA-SARS-CoV2疫苗无论初次免疫还是再次免疫后产生的RBD IgG型抗体滴度都能提高100倍左右(参见图15)。
实施例7：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫小鼠产生中和抗体的情况
同样使用RBD抗原混合铝佐剂、RBD抗原混合CpG1826佐剂、S蛋白胞外段混合铝佐剂和PLA-SARS-CoV2，通过如下中和抗体检测方法比较了诱导中和抗体的情况：血清稀释于300μl 2％DMEM培养基，3倍稀释。200μl不同稀释度的血清与MOI 0.01活病毒(10μl)37℃共孵育1h。200μl感染48孔板VERO-E6细胞。1h后换液，细胞置2％DMEM培养基培养24h。用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit (Takara)收取150μl上清提取RNA，用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara)反转录出cDNA。用标准曲线法测拷贝数(ABI 7500(Takara TB
Figure RE-GDA0003006281040000191
Premix Ex Taq II))，引物靶向S基因。
上游引物(5’-3’):CAATGGTTTAACAGGCACAGG(SEQ ID NO：19)；下游引物(5’-3’):CTCAAGTGTCTGTGGATCACG(SEQ ID NO：20)。
纵坐标是ELISA检测的中和抗体滴度(ID50 titer)，显示本发明的 PLA-SARS-CoV2诱导中和抗体的水平超过其它混合佐剂的传统疫苗100倍(参见图16)。
实施例8：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫猕猴产生抗RBD IgG抗体的情况
实验使用8只青年健康猕猴(雄性，年龄3-6岁,均来源于中国科学院昆明灵长类研究中心)。免疫试验分成两组(各4只)分别接受PLA-SARS-CoV2(20微克/ 只/次)或者生理盐水(PBS，对照组)肌肉注射两次(间隔3周)。在第一次注射后14天和第二次注射后7天分别采集血液分离血清。抗RBD IgG抗体滴度检测方法参考实施例6描述的ELISA方法。仅将二抗换成HRR标记的山羊抗猴IgG(购自 Abcam，货号ab112767)。图17显示了初次免疫后14天(1st)和再次免疫(2nd) 后7天后血清中的抗RBD IgG抗体水平(纵坐标是ELISA检测的抗体滴度)，表明初次免疫时血清中抗RBD IgG抗体水平是PBS对照的约100倍以上，再次免疫后的抗RBD IgG抗体水平相对于PBS对照提高1000倍以上。
实施例9：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫猕猴产生中和抗体的情况
发明人进一步测试了本发明的PLA-SARS-CoV2疫苗诱导猕猴产生中和抗体的情况。免疫过程和条件同上述实施例8。血清中和抗体滴度检测方法同上述实施例7。图18显示了再次免疫(2nd)7天后血清中的新冠病毒中和抗体的水平相对于PBS对照提高数十倍。
实施例10：PLA-SARS-CoV2疫苗免疫猕猴后的肺部病毒载量
发明人接下来测试了PLA-SARS-CoV2疫苗免疫猕猴后肺部病毒载量情况。 PLA-SARS-CoV2疫苗免疫猕猴的过程同实施例8。实验采用的病毒为新型冠状病毒 107株(由中国广东省疾病预防控制中心提供)，病毒株经Vero-E6细胞株扩培，半数组织培养感染剂量测定方法为Reed-Muench法。
病毒攻毒试验是在再次免疫后10天进行。攻毒途径为组合方式，滴鼻(0.4mL/ 鼻孔)和气管内(1.2mL，纤维支气管镜)，总病毒滴度为1×107TCID50mL，使用无菌0.9％生理盐水稀释。
两组动物在7天后的肺部病毒载量(viral load)通过RT-PCR进行了检测。采用试剂盒(Roche德国)提取拭子和气管刷总RNA，组织样本RNA采用TRIzol试剂法提取(ThermoUSA)。病毒RNA检测采用探针一步法实时定量PCR试剂盒检测 (TOYOBO，Japan)。引物和探针分别为：上游引物 5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'(SEQ ID NO：21)、下游引物 5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'(SEQ ID NO：22)和 FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'(SEQ ID NO：23)。每个检测样本稀释参照中国计量科学研究院标准，最后计算每一个样本的拷贝数。
结果显示，使用本发明的PLA-SARS-CoV2疫苗免疫后猕猴肺部病毒几乎完全消失(图19，图纵坐标显示的是每微克RNA中的病毒拷贝数的对数值)。而且，根据前述实施例中本发明PLA-SARS-CoV2疫苗诱导特异性抗体和中和抗体的结果，可以合理推知本发明的疫苗相对于其它需额外添加佐剂的传统疫苗在攻毒试验中也将具有明显更优的效果。
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Claims (14)

1.一种可溶性病原样抗原复合物，其包含：
(1)病毒样颗粒(VLP)，其由第一融合蛋白自组装而成，所述第一融合蛋白包含位于其N端的病毒衣壳蛋白或其变体和其C端的SpyTag，
(2)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含来自SARS-CoV2病毒S1蛋白的抗原或其变体和SpyCatcher，优选所述SpyCatcher在所述第二融合蛋白的N端；
其中，所述病毒样颗粒还在其内部包裹核酸，和
其中所述病毒样颗粒和所述来自于SARS-CoV2病毒S1蛋白的抗原通过所述SpyCatcher和所述SpyTag共价连接而使所述来自于SARS-CoV2病毒S1蛋白的抗原或其变体展示于所述病毒样颗粒的表面。
2.根据权利要求1所述的可溶性病原样抗原复合物，其中所述病毒样颗粒内包裹的所述核酸为所述病毒样颗粒在其自组装时包裹的、来自用于表达所述病毒样颗粒的宿主细菌的核酸，优选所述宿主细菌为大肠杆菌，优选所述核酸是RNA。
3.根据权利要求1或2的可溶性病原样抗原复合物，其中所述衣壳蛋白来自大肠杆菌噬菌体Qβ、MS2或AP205，优选来自大肠杆菌噬菌体AP205。
4.根据权利要求3所述的可溶性病原样抗原复合物，其中所述噬菌体AP205衣壳蛋白的序列与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
5.根据权利要求4所述的可溶性病原样抗原复合物，其中所述噬菌体AP205衣壳蛋白的序列为SEQ ID NO：1。
6.根据权利要求1的可溶性病原样抗原复合物，其中所述抗原为SARS-CoV2病毒S1蛋白的RBD序列。
7.根据权利要求6的可溶性病原样抗原复合物，其中所述抗原的序列与SEQ ID NO：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
8.根据权利要求7的可溶性病原样抗原复合物，其中所述抗原的序列为SEQ ID NO：2。
9.根据前述权利要求中任一项所述的可溶性病原样抗原复合物，其中所述SpyTag的序列与SEQ ID NO：3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性，SpyCatcher的序列与SEQ ID NO：4具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
10.根据权利要求1所述的可溶性病原样抗原复合物，其中在第一融合蛋白中，噬菌体衣壳蛋白或其变体与SpyTag通过第一连接肽连接，在第二融合蛋白中，抗原或其变体与SpyCatcher通过第二连接肽连接。
11.根据权利要求10所述的可溶性病原样抗原复合物，其中所述第一连接肽的序列为SEQ ID NO：5，所述第二连接肽的序列为SEQ ID NO：6。
12.根据前述权利要求中任一项所述的可溶性病原样抗原复合物，其中所述第二融合蛋白与所述病毒样颗粒以小于或等于1:1的比率连接，优选以1:6～1:12的比率连接，再优选以1:6、1:7、1:8、1:9、1:10的比率连接，以此确保病原样抗原复合物的可溶性和免疫原性，所述比率以第二融合蛋白上的SpyCatcher与病毒样颗粒上的SpyTag之比计算。
13.一种病原样抗原疫苗组合物，其中包含权利要求1-12任一项所述的可溶性病原样抗原复合物和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
14.一种在有需要的受试者中预防和/或治疗SARS-CoV2病毒感染相关疾病的方法，其中向所述受试者施用预防和/或治疗有效量的权利要求1-13任一项所述的可溶性病原样抗原复合物或疫苗组合物。
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