CN113355287A

CN113355287A - 一种猪圆环病毒2型及3型二价疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN113355287A
Application number: CN202010144300.2A
Authority: CN
Inventors: 王建超
Original assignee: Shanghai Jiewei Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Jiewei Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2021-09-07

Abstract

本发明属于免疫技术领域，具体公开了一种猪圆环病毒2型(PCV2)及3型(PCV3)二价病毒样颗粒(VLP)疫苗及其制备方法。所述二价疫苗包含具备免疫原性的重组PCV2和PCV3衣壳蛋白(Cap)VLP组合物。所述制备方法包括：(1)使用基因工程构建重组酵母；(2)利用重组酵母发酵生产PCV2和PCV3 Cap蛋白VLP；(3)发酵液经过细胞裂解、分离纯化等手段获得纯度较高的两种衣壳蛋白VLP；(4)组合两种Cap蛋白VLP并加入佐剂，经过处理制备二价疫苗。本发明采用酵母表达系统生产重组蛋白，同时对分离纯化手段进行改良，可经济、稳定、快速地获取大量高纯度PCV2和PCV3 Cap蛋白VLP，且提高了疫苗的安全性。

Description

一种猪圆环病毒2型及3型二价疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，进一步涉及多联疫苗及其制备技术，具体涉及一种猪圆环病毒2型及3型二价病毒样颗粒疫苗及其制备方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今发现最小的动物病毒之一，属于圆环病毒科圆环病毒属，是无囊膜的单股环状负链DNA病毒，20面体对称，直径17-20nm。已知PCV具有三个血清型，即猪圆环I型病毒(PCV1)、猪圆环II型病毒(PCV2)和猪圆环Ⅲ型病毒(PCV3)。其中，PCV1为非致病性病毒，PCV2和PCV3被认为与多种呼吸道、生殖道等疾病有关。

PCV对养猪业的危害巨大，在世界范围内广泛流行。猪感染后表现为消瘦、淋巴结肿大、气喘、拉稀，还会引起母猪的繁殖障碍性疾病。PCV还会破环感染猪体的免疫系统，造成免疫抑制，引发疫苗免疫失败。临床上，PCV往往跟猪瘟，高致病性蓝耳病，猪细小病毒等混合感染，在猪群中造成了很高的感染率和死亡率。目前，还没有针对该病的特效药物，疫苗接种仍然是防控PCV疾病的最有效措施。

更为严峻的是，我国养猪业中的PVC2已呈现感染日龄早(产房哺乳仔猪即可感染)的状况。因此PCV2已被认为是世界养猪业的重要病原，能引起猪的免疫抑制，造成二重或者三重感染，发病率和死亡率高，给养猪业带来重大危害、和严重的经济损失。目前，PCV疫苗已经成为继猪瘟、口蹄疫、蓝耳病和伪狂犬等疫苗后用量最大、用量最多的猪病疫苗品种，市场需求量大。另外，PCV2的疫苗并不能有效的产生PCV3的抗体，故仍有必要专门针对PCV3开发疫苗。

商品化的疫苗主要有灭活疫苗和亚单位疫苗(类病毒颗粒疫苗)两类，免疫效果都很好，对PCV疾病的防控具有重要意义。其中，亚单位疫苗因其安全性较高，免疫效果确切，成为临床使用的首选疫苗。

PCV病毒基因组中ORF1和ORF2是主要的开放阅读框，分别编码非结构蛋白Rep和结构蛋白Cap。Cap蛋白是病毒主要的衣壳蛋白，含有很多保护性抗原决定簇，是疫苗设计的靶标蛋白。目前市场上销售的PCV-Cap蛋白类病毒颗粒疫苗有两类：

A)一类是大肠杆菌制备的PCV类病毒颗粒(原核表达)，PCV的ORF2基因(Cap蛋白)插入大肠杆菌原核载体中去，利用大肠杆菌表达PCV Cap蛋白，制备亚单位疫苗。大肠杆菌表达系统具有生长速度快、易培养、表达蛋白产量高等特点，但其表达的蛋白大多以无活性的包涵体形式存在，经过蛋白变性复性等一系列操作后，可以得到可溶性蛋白。但是原核表达容易出现不具备活性的包涵体，需要进行蛋白复性来提高疫苗效果，成本高，生产周期长(每批次耗时约2-3个月)、效率低，获得的蛋白免疫原性较差；特别是大肠杆菌表达的蛋白虽然经过纯化，依然有可能残留内毒素，免疫动物会产生副反应。另外，原核表达系统也不具备糖基化等一些真核生物特有的翻译后修饰过程，可能会对重组抗原的免疫原性造成影响。

B)另一类由杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达制PCV类病毒颗粒疫苗由杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达的类病毒颗粒(真核表达)，用PCV的ORF2基因(Cap蛋白)插入到昆虫杆状病毒，用昆虫细胞培养，获得重组的PCV Cap蛋白，经纯化、与免疫佐剂混合后获得，在临床上以注射方式免疫，真核表达的工艺要求较高，产品中可能会混有杆状病毒颗粒，产生副反应，存在一定的生物安全风险。

因此，本领域迫切需要开发一种猪圆环病毒2型及3型二价疫苗及其制备技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种猪圆环病毒2型及3型二价疫苗及其制备技术。

在本发明的第一方面，提供了一种基因工程细胞组合，所述基因工程细胞组合中包括第一基因工程细胞和第二基因工程细胞；

其中，所述第一基因工程细胞为真核细胞I，并且所述真核细胞I的基因组中整合有一猪圆环病毒外壳蛋白X的第一表达盒，或者所述真核细胞I中含有一表达载体，所述表达载体含有所述猪圆环病毒外壳蛋白X的第一表达盒；并且所述第一基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白X，且所述外壳蛋白X在所述第一基因工程细胞内部形成第一病毒样颗粒；

并且，所述第二基因工程细胞为真核细胞II，并且所述真核细胞II的基因组中整合有一猪圆环病毒外壳蛋白Y的第二表达盒，或者所述真核细胞II中含有一表达载体，所述表达载体含有所述猪圆环病毒外壳蛋白Y的第二表达盒；并且所述第二基因工程细胞在胞内表达所述外壳蛋白Y，且所述外壳蛋白Y在所述第二基因工程细胞内部形成第二病毒样颗粒；

并且，所述猪圆环病毒外壳蛋白X和猪圆环病毒外壳蛋白Y是猪圆环病毒的两种不同亚型。

在另一优选例中，所述的猪圆环病毒外壳蛋白X为猪圆环病毒2型；和/或所述的猪圆环病毒外壳蛋白Y为猪圆环病毒3型。

在另一优选例中，所述第一病毒样颗粒为猪圆环病毒2型Cap蛋白形成的病毒样颗粒；和/或所述第二病毒样颗粒为猪圆环病毒3型Cap蛋白形成的病毒样颗粒。

在另一优选例中，所述猪圆环病毒2型为选自下组的亚型：猪圆环病毒2a亚型、猪圆环病毒2b亚型，或猪圆环病毒2d亚型。

在另一优选例中，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、5或7所示；和/或所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述真核细胞I和II均为酵母细胞。

在另一优选例中，所述酵母选自下组：酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

在另一优选例中，所述真核细胞I和II均为巴斯德毕赤酵母细胞，更优选地均为毕赤酵母X-33菌株。

在另一优选例中，所述第一表达盒包括5’至3’可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述猪圆环病毒外壳蛋白X的ORF序列和终止密码子；优选地，所述的起始密码子和所述猪圆环病毒外壳蛋白X的ORF序列直接相连；和/或

所述第二表达盒包括5’至3’可操作地连接的以下元件：启动子、起始密码子、所述猪圆环病毒外壳蛋白Y的ORF序列和终止密码子；优选地，所述的起始密码子和所述猪圆环病毒外壳蛋白Y的ORF序列直接相连。

在另一优选例中，所述启动子是毕赤酵母甲醇氧化酶1(AOX1)启动子，并且所述终止密码子是AXO1(TT)终止子序列。

在另一优选例中，所述的第一表达盒和/或第二表达盒不含有分泌表达元件。

在另一优选例中，所述的第一表达盒和/或第二表达盒不含有分泌肽、引导肽，或信号肽。

在另一优选例中，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白和/或所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的基因序列是经密码子优化的。

在另一优选例中，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的基因序列如SEQ ID NO:3、6或8所示；和/或所述猪圆环病毒3型Cap蛋白的基因序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述真核细胞I和/或真核细胞II中含有的表达载体是pPICZ A和pPICZ B载体。

在本发明的第二方面，提供了一种病毒样颗粒组合，所述病毒样颗粒组合中包括第一病毒样颗粒和第二病毒样颗粒，所述第一病毒样颗粒和第二病毒样颗粒分别由本发明第一方面所述的基因工程细胞组合中的第一基因工程细胞和第二基因工程细胞表达。

在本发明的第三方面，提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物是二价疫苗组合物，包括以下组分：

(i)如本发明第二方面所述的病毒样颗粒组合；和

(ii)疫苗上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组分(i)占所述疫苗组合物总重量的0.1-99.9wt％，优选地10-80wt％，更优选地30-60wt％。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物包括：口服剂、注射剂型。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述佐剂包括：无机佐剂或有机佐剂。

在另一优选例中，所述无机佐剂选自下组：氢氧化铝、明矾，或其组合。

在另一优选例中，所述有机佐剂选自下组：微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)，或其组合。

在另一优选例中，所述佐剂还包括合成佐剂。

在另一优选例中，所述合成佐剂选自下组：人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷，或其组合。

在另一优选例中，所述佐剂还包括油剂。

在另一优选例中，所述油剂选自下组：费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油，或其组合。

在另一优选例中，所述的佐剂选自下组：磷酸钙、羟基磷灰石、氢氧化铝、SDA7749、SDA GEL701、SDA 15A、YT108，或其组合。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为二价疫苗或多联疫苗。

在本发明的第四方面，提供了一种制备如本发明第二方面所述的病毒样颗粒组合的方法，包括步骤：

(i)在适合表达的条件下，培养如本发明第一方面所述基因工程细胞中的第一基因工程细胞和第二基因工程细胞，从而表达第一病毒样颗粒和第二病毒样颗粒；和

(ii)分离所述的第一病毒样颗粒和第二病毒样颗粒。

在另一优选例中，所述适合表达的条件包括但不限于摇瓶发酵或发酵罐发酵。

在另一优选例中，所述分离包括回收和裂解培养后的所述第一基因工程细胞和第二基因工程细胞。

在另一优选例中，所述回收包括：将所述培养后的所述第一基因工程细胞和第二基因工程细胞进行自然沉降或高速离心。

在另一优选例中，所述裂解包括：酸洗玻璃珠震荡、溶菌酶消化、高压均质、反复冻融，或其组合。

在另一优选例中，所述分离的方法包括离子交换层析、分子筛层析、疏水作用层析、亲和层析或硫酸铵沉淀中的任一种或几种并用。

在本发明的第五方面，提供了一种经密码子优化的分离的多核苷酸的组合，所述组合中包括编码SEQ ID NO:1、5或7所示多肽的第一多核苷酸和编码SEQ ID NO:2所示多肽的第二多核苷酸；

其中，所述第一多核苷酸选自下组：

(a1)序列如SEQ ID NO:3、6或8所示的多核苷酸；

(b1)核苷酸序列与SEQ ID NO:3、6或8所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(c1)如SEQ ID NO:3、6或8所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(d1)与(a1)-(c1)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸；

并且，所述第二多核苷酸选自下组：

(a2)序列如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸；

(b2)核苷酸序列与SEQ ID NO:4所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(c2)如SEQ ID NO:4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(d2)与(a2)-(c2)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了一种表达载体组合，所述表达载体组合中包括第一表达载体和第二表达载体；

其中，所述第一表达载体含有如本发明第五方面所述的多核苷酸组合中的第一多核苷酸，并且所述第二表达载体含有如本发明第五方面所述的多核苷酸组合中的第二多核苷酸。

在本发明的第七方面，提供了一种宿主细胞组合，所述宿主细胞组合中包括第一宿主细胞和第二宿主细胞；

其中，所述第一宿主细胞含有如本发明第六方面所述的表达载体组合中的第一表达载体，或者在基因组中整合有如本发明第五方面所述的多核苷酸组合中的第一多核苷酸；

并且，所述第二宿主细胞含有如本发明第六方面所述的表达载体组合中的第二表达载体，或者在基因组中整合有如本发明第五方面所述的多核苷酸组合中的第二多核苷酸。

在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物中含有如本发明第二方面所述的病毒样颗粒组合、如本发明第五方面所述的多核苷酸组合、如本发明第六方面所述的表达载体组合，或如本发明第七方面所述的宿主细胞组合，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物是注射剂。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。

在本发明的第九方面，提供了一种分离的重组多肽的组合，所述重组多肽包括第一重组多肽和第二重组多肽；

其中，所述第一重组多肽中具有猪圆环病毒2型Cap蛋白的氨基酸序列，并且所述第一重组多肽被包装为第一病毒样颗粒；

并且，所述第二重组多肽中具有猪圆环病毒3型Cap蛋白的氨基酸序列，并且所述第二重组多肽被包装为第二病毒样颗粒。

在另一优选例中，所述第一重组多肽具有如SEQ ID NO:1、5或7所述的氨基酸序列；和/或所述第二重组多肽具有如SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述重组多肽组合具有以下特性：

(a)所述第一重组多肽能够特异性地与抗猪圆环病毒2型的抗体结合，并且所述第二重组多肽能够特异性地与抗猪圆环病毒3型的抗体结合；

(b)能够同时诱发动物体同时产生针对猪圆环病毒2型和3型的免疫反应。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pPICZ-PCV2d Cap表达质粒的图谱

图2显示了实施例1.1中BstBI和KpnI酶切鉴定的结果图。

图3显示了实施例1.4中SDS-PAGE的结果图。

图4显示了实施例1.5中电镜观察到的病毒样颗粒的照片。

图5显示了pPICZ-PCV3 Cap表达质粒的图谱

图6显示了实施例2.1中PCV3基因和pPICZ-PCV3电泳图。

图7显示了实施例2.4中SDS-PAGE的结果图。

图8显示了pPICZ-PCV2b Cap表达质粒的图谱。

图9显示了pPICZ-PCV2d Cap的SDS-PAGE的蛋白电泳图像。

图10显示了电镜观察到的pPICZ-PCV2d Cap的VLP照片。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种猪圆环病毒2型及3型二价疫苗的制备方法。具体地，本发明人根据毕赤酵母密码子偏爱性，合成了经密码子优化的编码PCV2、PCV3 Cap蛋白的基因序列，合成所得的基因连接到毕赤酵母表达载体上，得到表达衣壳蛋白的表达质粒(非分泌表达质粒)。重组质粒通过基因工程方法整合到毕赤酵母基因组中，经大规模筛选得到高表达菌株。以此重组表达菌株为种子，发酵表达得到衣壳蛋白，并自组装成为VLP。通过柱层析等纯化方法获得高纯度、形态均一、性状稳定的VLP，纯化后的VLP吸附适当的佐剂成为重组疫苗制剂。经动物实验验证含有本发明方法制备的PCV2、PCV3 Cap蛋白VLP的重组疫苗制剂具有较好的免疫原性。在此基础上完成了本发明。

猪圆环病毒

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14－17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强。

在本发明中，所述的猪圆环病毒2型可以是猪圆环病毒2a亚型、2b亚型，或2d亚型。

在一个实施方式中，本发明的猪圆环病毒2d亚型(PCV2d)Cap蛋白VLP的氨基酸序列如下：

MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLLHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSIYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP(SEQ ID NO:1)。

优选地，经密码子优化后的所述猪圆环病毒2d亚型(PCV2d)Cap蛋白的编码核苷酸序列如下：

ATGACTTACCCTAGAAGAAGATACAGACGTAGAAGACACAGACCTCGTTCTCATCTGGGACAAATCTTGAGAAGGAGACCTTGGCTGTTGCACCCAAGACACCGTTACAGATGGAGAAGAAAGAACGGCATCTTCAACACCAGATTGTCCAGAACCTTCGGTTACACTATCAAGAGAACCACTGTCAAGACCCCATCTTGGGCTGTTGACATGATGAGATTCAACATCAACGACTTCCTGCCTCCAGGTGGAGGCTCGAACCCTAGATCCGTTCCATTTGAATACTACAGAATCCGTAAGGTGAAGGTTGAGTTCTGGCCTTGCTCTCCAATCACTCAGGGAGACAGAGGTGTCGGTTCCTCGGCAGTTATCTTGGATGACAACTTCGTGACCAAGGCTACTGCCCTGACCTACGACCCATACGTCAACTACTCTTCCAGACACACTATTACCCAGCCATTCTCGTATCACTCCAGATACTTCACCCCTAAGCCAGTTTTGGACTCTACTATCGACTACTTCCAACCAAATAACAAGAGAAACCAGTTGTGGCTGAGACTTCAAACCGCTGGTAACGTCGATCACGTTGGTCTCGGAACTGCCTTCGAGAACTCCATCTACGACCAAGAATACAACATCAGAGTGACTATGTACGTCCAGTTTAGAGAGTTCAACCTGAAGGACCCACCTTTGAACCCATAA(SEQ ID NO:3)。

在另一个实施方式中，本发明的猪圆环病毒2a亚型(PCV2a)Cap蛋白VLP的氨基酸序列如下：

MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTVKATTVRTPSWAVDMMRFNIDDFVPPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWMRLQTSRNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLKP*(SEQ ID NO:5)

优选地，经密码子优化后的所述猪圆环病毒2a亚型(PCV2a)Cap蛋白的编码核苷酸序列如下：

ATGACTTACCCAAGAAGAAGATACAGAAGAAGAAGACACAGACCAAGATCTCACTTGGGTCAAATCTTGAGAAGAAGACCATGGTTGGTTCACCCAAGACACAGATACAGATGGAGAAGAAAGAACGGTATCTTCAACACTAGATTGTCTAGAACTTTCGGTTACACTGTTAAGGCTACTACTGTTAGAACTCCATCTTGGGCTGTTGACATGATGAGATTCAACATCGACGACTTCGTTCCACCAGGTGGTGGTACTAACAAGATCTCTATCCCATTCGAGTACTACAGAATCAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCATGTTCTCCAATCACTCAAGGTGACAGAGGTGTTGGTTCTACTGCTGTTATCTTGGACGACAACTTCGTTACTAAGGCTACTGCTTTGACTTACGACCCATACGTTAACTACTCTTCTAGACACACTATCCCACAACCATTCTCTTACCACTCTAGATACTTCACTCCAAAGCCAGTTTTGGACTCTACTATCGACTACTTCCAACCAAACAACAAGAGAAACCAATTGTGGATGAGATTGCAAACTTCTAGAAACGTTGACCACGTTGGTTTGGGTACTGCTTTCGAGAACTCTATCTACGACCAAGACTACAACATCAGAGTTACTATGTACGTTCAATTCAGAGAATTCAACTTGAAGGACCCACCATTGAAGCCA(SEQ ID NO:6)

在另一个实施方式中，本发明的猪圆环病毒2b亚型(PCV2b)Cap蛋白VLP的氨基酸序列如下：

MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLLHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSIYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP*(SEQ ID NO:7)

优选地，经密码子优化后的所述猪圆环病毒2b亚型(PCV2b)Cap蛋白的编码核苷酸序列如下：

ATGACTTACCCTAGAAGAAGATACAGACGTAGAAGACACAGACCTCGTTCTCATCTGGGACAAATCTTGAGAAGGAGACCTTGGCTGTTGCACCCAAGACACCGTTACAGATGGAGAAGAAAGAACGGCATCTTCAACACCAGATTGTCCAGAACCTTCGGTTACACTATCAAGAGAACCACTGTCAAGACCCCATCTTGGGCTGTTGACATGATGAGATTCAACATCAACGACTTCCTGCCTCCAGGTGGAGGCTCGAACCCTAGATCCGTTCCATTTGAATACTACAGAATCCGTAAGGTGAAGGTTGAGTTCTGGCCTTGCTCTCCAATCACTCAGGGAGACAGAGGTGTCGGTTCCTCGGCAGTTATCTTGGATGACAACTTCGTGACCAAGGCTACTGCCCTGACCTACGACCCATACGTCAACTACTCTTCCAGACACACTATTACCCAGCCATTCTCGTATCACTCCAGATACTTCACCCCTAAGCCAGTTTTGGACTCTACTATCGACTACTTCCAACCAAATAACAAGAGAAACCAGTTGTGGCTGAGACTTCAAACCGCTGGTAACGTCGATCACGTTGGTCTCGGAACTGCCTTCGAGAACTCCATCTACGACCAAGAATACAACATCAGAGTGACTATGTACGTCCAGTTTAGAGAGTTCAACCTGAAGGACCCACCTTTGAACCCATAA(SEQ ID NO:8)

在一个实施方式中，本发明的猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白VLP的氨基酸序列如下：

MRHRAIFRRRPRPRRRRRHRRRYVRRKLFIRRPTAGTYYTKKYSTMNVISVGTPQNNKPWHANHFITRLNEWETAISFEYYKILKMKVTLSPVISPAQQTKTMFGHTAIDLDGAWTTNTWLQDDPYAESSTRKVMTSKKKHSRYFTPKPILAGTTSAHPGQSLFFFSRPTPWLNTYDPTVQWGALLWSIYVPEKTGMTDFYGTKEVWIRYKSVL*(SEQID NO:2)。

优选地，经密码子优化后的所述猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白的编码核苷酸序列如下：

ATGAGACACAGAGCTATCTTCAGACGTAGACCTAGACCAAGAAGACGTAGAAGACACAGAAGACGTTACGTTAGAAGAAAGTTGTTCATCAGAAGACCTACTGCTGGTACTTACTACACCAAGAAGTATTCTACTATGAACGTCATTTCTGTTGGAACCCCTCAGAACAACAAGCCTTGGCACGCTAACCACTTCATCACCAGACTGAACGAGTGGGAAACTGCTATTTCTTTCGAGTATTACAAGATCTTGAAGATGAAGGTCACTCTTTCCCCAGTTATTTCTCCTGCTCAGCAAACCAAGACTATGTTCGGACACACTGCTATCGACTTGGACGGTGCTTGGACTACCAACACTTGGCTGCAGGACGATCCTTACGCTGAATCTTCCACTAGAAAGGTCATGACTTCTAAGAAGAAACACTCCAGATACTTCACTCCTAAGCCAATCTTGGCTGGAACTACCTCTGCCCACCCAGGTCAGTCTCTTTTCTTTTTCTCCAGACCAACCCCTTGGTTGAACACTTACGACCCTACCGTTCAGTGGGGTGCTCTTTTGTGGTCTATCTACGTCCCAGAGAAGACTGGTATGACTGACTTCTACGGAACTAAGGAAGTCTGGATCAGATACAAGTCCGTTTTGTAA(SEQ ID NO:4)。

组合物和施用方法

本发明提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的病毒样颗粒组合、本发明的可编码本发明第一病毒样颗粒和第二病毒样颗粒的多核苷酸的组合，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物可包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是二价的(仅含有两种重组病毒样颗粒或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多种重组病毒样颗粒或多核苷酸)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(i)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明病毒样颗粒组合或多核苷酸组合。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的重组病毒样颗粒。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的病毒样颗粒组合)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明病毒样颗粒组合)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO 90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是二价的或多价疫苗。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒组合直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予本发明的疫苗组合物，即病毒样颗粒组合的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：猪圆环病毒感染等。

在各疫苗剂份中所选用的重组病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予

本发明的主要优点包括：

1)本发明通过毕赤酵母表达系统，经济、快速、稳定、高效表达形态均一的PCV2、PCV3 Cap蛋白VLP。本发明方法获得的PCV2、PCV3 Cap蛋白VLP结构上类似于天然病毒，可用作疫苗抗原。

2)VLP由多个单体构成，分子量巨大，在电镜下可观察到颗粒状重复性结构，具有较强的免疫原性。

3)本发明制备的疫苗抗原不含有病毒的遗传物质，不会有潜在的感染可能性，是更合适的PCV2及PCV3抗原。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1：PCV2d VLP的获得

1.1 pPICZ-PCV2d Cap重组表达载体的构建

设计5’端和3’端分别含有BstBI酶切位点和KpnI酶切位点的衣壳蛋白DNA编码序列并进行全基因合成，获得SEQ ID NO:3所示序列的核苷酸片段。

采用BstBI酶和KpnI酶的混合酶酶切处理PCV2d衣壳蛋白DNA编码序列与pPICZ B质粒(购自Life technologies)，酶切后的片段由T4 DNA连接酶连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养。挑取部分克隆抽提质粒，以BstBI和KpnI酶切鉴定(图2)，构建成功的重组质粒命名为pPICZ-PCV2d Cap(图1)。

1.2 X33-pPICZ-PCV2d Cap重组表达菌株构建

用于表达重组蛋白的毕赤酵母X-33菌株购自Life technologies。将重组构建的pPICZ-PCV2d Cap质粒由SacI酶线性化，电转毕赤酵母X-33，电转条件为1kV。电转后菌液涂布YPD平板(200μg/ml Zeocin)，30℃过夜倒置培养，挑取生长情况较好的一株作为发酵菌种，命名为X33-pPICZ-PCV2d Cap。

1.3 重组蛋白的发酵罐培养

采用YPD培养基对重组表达菌株X33-pPICZ-PCV2d Cap进行活化，在恒温振荡培养器内200rpm，28℃培养过夜，振荡培养20小时左右测得菌液的OD600在1～2的范围，停止培养。

镜检无杂菌后取1ml菌液转接入500mlYPD种子培养基，在恒温振荡培养器内以200rpm，28℃培养过夜。

镜检无杂菌后按1:15接种至发酵罐。

使用BIOLUN 30L发酵罐，发酵采用基础盐BSM培养基。发酵初始温度设定为25～30℃，初始pH 5～6，转速300rpm，通气量0.5vvm，DO值100％，添加PTM1痕量盐类。初始增殖阶段培养20～24小时左右，通过调节搅拌转速、空气流量、罐压和补加纯氧维持溶氧值20～40％。当菌体湿重达到60～90g/L时，补加50％甘油或葡萄糖溶液。维持溶氧值20～40％，补加4～8小时。检测菌体湿重增加到100～200g/L时，停止补料。将温度设定在25～30℃，pH值控制调为6～7，开始加入甲醇诱导，甲醇的补加速度为50～100mL/min。维持溶氧值高于20～40％，温度设定在25～30℃，pH值控制为6～7，诱导30～40小时发酵结束。

采用冷冻离心机对发酵液进行固液离心分离，转速8000rpm，离心10分钟。离心结束后弃上清，收集菌体。

1.4 病毒样颗粒纯化

取100g菌体，加入破菌用缓冲液(50mM PB缓冲液，pH＝6.5)1000ml，混匀，获得菌体混悬液。采用ATS高压均质机高压破碎制备的菌体混悬液，调节均质阀，控制破菌压力为1500bar，重复以上高压破碎过程2-3次，收集破菌液。

采用高速冷冻离心机离心澄清破菌液，设定条件4-8℃，10000rpm，30min离心分离，收集离心后的上清液。上清液中加入固体硫酸铵至终浓度为30～40％，4℃放置过夜后，按10000rpm、30min、8℃条件第二次离心分离，弃去上清保留沉淀物，加入缓冲溶液(50mMPB缓冲液，pH＝6.5)250ml，搅拌2～4h。最后再次按10000rpm、30min、8℃条件离心分离，保留上清用于下一步的层析分离。

将离心获得的上清液上样Bio-Gel P-60层析(40x1500，1500ml)，使用缓冲溶液(50mM PB缓冲液，pH＝6.5)流速10ml/min洗脱，根据紫外吸收峰分部收集样品。SDS-PAGE电泳分析各部分组份，合并含有目的蛋白部分。其中，目标条带为28kd(图3)。

1.5 病毒样颗粒性质鉴定

纯化的病毒样颗粒蛋白样品经过经磷酸钨染色后，电镜观察呈现病毒样颗粒(图4)。

实施例2：PCV3 VLP的获得

2.1 pPICZ-PCV3 Cap重组表达载体的构建

设计5’端和3’端分别含有BstBI酶切位点和KpnI酶切位点的衣壳蛋白DNA编码序列并进行全基因合成，获得SEQ ID NO:4所示序列的核苷酸片段。

采用BstBI酶和KpnI酶的混合酶酶切处理PCV3衣壳蛋白DNA编码序列与pPICZ A质粒(购自Life technologies)，酶切后的片段由T4 DNA连接酶连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养。挑取部分克隆抽提质粒，PCR扩增PCV3基因，并将重组质粒用KpnI酶切鉴定(图6)，构建成功的重组质粒命名为pPICZ-PCV3 Cap。(图5)

2.2 X33-pPICZ-PCV3 Cap重组表达菌株构建

用于表达重组单边的毕赤酵母X-33菌株购自Life technologies。将重组构建的pPICZ-PCV3 Cap质粒由SacI酶线性化，电转毕赤酵母X-33，电转条件为1kV，。电转后菌液涂布YPD平板(200μg/ml Zeocin)，30℃过夜倒置培养，挑取生长情况较好的一株作为发酵菌种，命名为X33-pPICZ-PCV3 Cap。

2.3 重组蛋白的发酵罐培养

采用YPD培养基对重组表达菌株X33-pPICZ-PCV3 Cap进行活化，在恒温振荡培养器内200rpm，28℃培养过夜，振荡培养20小时左右测得菌液的OD600在1～2的范围，停止培养。

镜检无杂菌后取1ml菌液转接入500mlYPD种子培养基，在恒温振荡培养器内以200rpm，30℃培养过夜。镜检无杂菌后按1:15接种至发酵罐。

采用冷冻离心机对发酵液进行固液离心分离，转速10000rpm，离心30分钟。离心结束后弃上清，收集菌体。

2.4 病毒样颗粒纯化

将离心获得的上清液上样Bio-Gel P-60层析(40x1500，1500ml)，使用缓冲溶液(50mM PB缓冲液，pH＝6.5)流速10ml/min洗脱，根据紫外吸收峰分部收集样品。SDS-PAGE电泳分析各部分组份，合并含有目的蛋白部分。其中，目标条带为25kd。(图7)

实施例3：PCV2b VLP的获得

3.1 pPICZ-PCV2b Cap重组表达载体的构建

设计5’端和3’端分别含有BstBI酶切位点和KpnI酶切位点的衣壳蛋白DNA编码序列并进行全基因合成，获得SEQ ID NO:8所示序列的核苷酸片段。

采用BstBI酶和KpnI酶的混合酶酶切处理PCV2b衣壳蛋白DNA编码序列与pPICZ B质粒(购自Life technologies)，酶切后的片段由T4 DNA连接酶连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养。挑取部分克隆抽提质粒，以BstBI和KpnI酶切鉴定，构建成功的重组质粒命名为pPICZ-PCV2b Cap(图8)。

3.2 X33-pPICZ-PCV2b Cap重组表达菌株构建

用于表达重组蛋白的毕赤酵母X-33菌株购自Life technologies。将重组构建的pPICZ-PCV2b Cap质粒由SacI酶线性化，电转毕赤酵母X-33，电转条件为1kV。电转后菌液涂布YPD平板(200μg/ml Zeocin)，30℃过夜倒置培养，挑取生长情况较好的一株作为发酵菌种，命名为X33-pPICZ-PCV2b Cap。

3.3 重组蛋白的发酵罐培养

采用YPD培养基对重组表达菌株X33-pPICZ-PCV2b Cap进行活化，在恒温振荡培养器内200rpm，28℃培养过夜，振荡培养20小时左右测得菌液的OD600在1～2的范围，停止培养。

镜检无杂菌后按1:15接种至发酵罐。

3.4 病毒样颗粒纯化

将离心获得的上清液上样Bio-Gel P-60层析(40x1500，1500ml)，使用缓冲溶液(50mM PB缓冲液，pH＝6.5)流速10ml/min洗脱，根据紫外吸收峰分部收集样品。SDS-PAGE电泳分析各部分组份，合并含有目的蛋白部分。其中，目标条带为28kd(图9)。

3.5 病毒样颗粒性质鉴定

纯化的病毒样颗粒蛋白样品经过经磷酸钨染色后，电镜观察呈现病毒样颗粒(图10)。

实施例4：PCV2a VLP的获得

4.1 pPICZ-PCV2a Cap重组表达载体的构建

设计5’端和3’端分别含有BstBI酶切位点和KpnI酶切位点的衣壳蛋白DNA编码序列并进行全基因合成，获得SEQ ID NO:6所示序列的核苷酸片段。

采用BstBI酶和KpnI酶的混合酶酶切处理PCV2a衣壳蛋白DNA编码序列与pPICZ B质粒(购自Life technologies)，酶切后的片段由T4 DNA连接酶连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养。挑取部分克隆抽提质粒，以BstBI和KpnI酶切鉴定，构建成功的重组质粒命名为pPICZ-PCV2a Cap。

4.2 X33-pPICZ-PCV2a Cap重组表达菌株构建

用于表达重组蛋白的毕赤酵母X-33菌株购自Life technologies。将重组构建的pPICZ-PCV2a Cap质粒由SacI酶线性化，电转毕赤酵母X-33，电转条件为1kV。电转后菌液涂布YPD平板(200μg/ml Zeocin)，30℃过夜倒置培养，挑取生长情况较好的一株作为发酵菌种，命名为X33-pPICZ-PCV2a Cap。

4.3 重组蛋白的发酵罐培养

采用YPD培养基对重组表达菌株X33-pPICZ-PCV2a Cap进行活化，在恒温振荡培养器内200rpm，28℃培养过夜，振荡培养20小时左右测得菌液的OD600在1～2的范围，停止培养。

镜检无杂菌后按1:15接种至发酵罐。

4.4 病毒样颗粒纯化

将离心获得的上清液上样Bio-Gel P-60层析(40x1500，1500ml)，使用缓冲溶液(50mM PB缓冲液，pH＝6.5)流速10ml/min洗脱，根据紫外吸收峰分部收集样品。SDS-PAGE电泳分析各部分组份，合并含有目的蛋白部分。其中，目标条带为28kd。

4.5 病毒样颗粒性质鉴定

纯化的病毒样颗粒蛋白样品经过经磷酸钨染色后，电镜观察呈现病毒样颗粒。

实施例5：疫苗配制及小鼠免疫

(1)配制PBS(pH＝7.0)，将PCV2d及PCV3 Cap蛋白分别用PBS稀释到20μg/mL，再等体积混合(浓度为10μg/mL)。取4mL样品，用PBS定容至20mL。取YT108佐剂，并按照抗原：佐剂＝200:1体积比混合。放置在摇床上混匀1h。用无菌的0.22μm滤膜过滤除菌。

(2)取12只6周龄小鼠，经ELISA检测PCV2d及PCV3抗体阴性。分为空白对照组和实验组。实验组皮下注射0.2mL疫苗，空白对照组皮下注射0.2mL生理盐水。免疫2周后进行第二次免疫。第一次免疫3周、4周、5周后分别眼眶取血，分别用ELISA检测血清中的PCV2d及PCV3抗体含量。将小鼠血清从1:500至1:25000范围内稀释，来检测其抗体滴度。抗原使用大肠杆菌表达并纯化的PCV2d和PCV3 Cap蛋白包板。

表1 PCV2d检测结果

	实验组	NC
			二免后7d	1：8000	0
二免后14d	1：16000	0
			二免后21d	1：25000	0

表2 PCV3检测结果

实施例6：仔猪免疫及效力检测

在本实施例中，用本发明的疫苗组合物对仔猪进行了免疫，并测定其免疫效果及安全性。

实验步骤：

(1)配制PBS(pH＝7.0)，将PCV2d及PCV3 Cap蛋白分别用PBS稀释到100μg/mL，再等体积混合(浓度为50μg/mL)。取YT108佐剂，并按照抗原：佐剂＝200:1体积比混合。放置在摇床上混匀1h。用无菌的0.22μm滤膜过滤除菌。

(2)选取实验动物：21日龄的PCV2d及PCV3阴性仔猪10头，随机分组分为2组，每组5只，各组隔离饲养。组别分别为

1.空白对照组(不免疫)，

2.免疫组(免疫剂量为100μg/头份)。

接种方式：颈部肌肉注射。

接种含量：免疫组为100μg/头份。空白对照组不免疫。

免疫次数：1次，免疫后28d后进行检测。

检测指标：免疫14天及28天后用ELISA检测血清中的PCV2d及PCV3抗体含量。

表3 PCV2d及PCV3检测结果

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海杰威医药科技有限公司

<120> 一种猪圆环病毒2型及3型二价疫苗及其制备方法

<130> P2019-1876

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Leu His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

225 230

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Val Arg Arg Lys Leu Phe Ile Arg Arg

20 25 30

Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val

35 40 45

Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His

50 55 60

Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro

85 90 95

Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu

115 120 125

Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly

145 150 155 160

Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr

165 170 175

Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro

180 185 190

Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile

195 200 205

Arg Tyr Lys Ser Val Leu

210

<210> 3

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgacttacc ctagaagaag atacagacgt agaagacaca gacctcgttc tcatctggga 60

caaatcttga gaaggagacc ttggctgttg cacccaagac accgttacag atggagaaga 120

aagaacggca tcttcaacac cagattgtcc agaaccttcg gttacactat caagagaacc 180

actgtcaaga ccccatcttg ggctgttgac atgatgagat tcaacatcaa cgacttcctg 240

cctccaggtg gaggctcgaa ccctagatcc gttccatttg aatactacag aatccgtaag 300

gtgaaggttg agttctggcc ttgctctcca atcactcagg gagacagagg tgtcggttcc 360

tcggcagtta tcttggatga caacttcgtg accaaggcta ctgccctgac ctacgaccca 420

tacgtcaact actcttccag acacactatt acccagccat tctcgtatca ctccagatac 480

ttcaccccta agccagtttt ggactctact atcgactact tccaaccaaa taacaagaga 540

aaccagttgt ggctgagact tcaaaccgct ggtaacgtcg atcacgttgg tctcggaact 600

gccttcgaga actccatcta cgaccaagaa tacaacatca gagtgactat gtacgtccag 660

tttagagagt tcaacctgaa ggacccacct ttgaacccat aa 702

<210> 4

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagacaca gagctatctt cagacgtaga cctagaccaa gaagacgtag aagacacaga 60

agacgttacg ttagaagaaa gttgttcatc agaagaccta ctgctggtac ttactacacc 120

aagaagtatt ctactatgaa cgtcatttct gttggaaccc ctcagaacaa caagccttgg 180

cacgctaacc acttcatcac cagactgaac gagtgggaaa ctgctatttc tttcgagtat 240

tacaagatct tgaagatgaa ggtcactctt tccccagtta tttctcctgc tcagcaaacc 300

aagactatgt tcggacacac tgctatcgac ttggacggtg cttggactac caacacttgg 360

ctgcaggacg atccttacgc tgaatcttcc actagaaagg tcatgacttc taagaagaaa 420

cactccagat acttcactcc taagccaatc ttggctggaa ctacctctgc ccacccaggt 480

cagtctcttt tctttttctc cagaccaacc ccttggttga acacttacga ccctaccgtt 540

cagtggggtg ctcttttgtg gtctatctac gtcccagaga agactggtat gactgacttc 600

tacggaacta aggaagtctg gatcagatac aagtccgttt tgtaa 645

<210> 5

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro

225 230

<210> 6

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacttacc caagaagaag atacagaaga agaagacaca gaccaagatc tcacttgggt 60

caaatcttga gaagaagacc atggttggtt cacccaagac acagatacag atggagaaga 120

aagaacggta tcttcaacac tagattgtct agaactttcg gttacactgt taaggctact 180

actgttagaa ctccatcttg ggctgttgac atgatgagat tcaacatcga cgacttcgtt 240

ccaccaggtg gtggtactaa caagatctct atcccattcg agtactacag aatcagaaag 300

gttaaggttg aattctggcc atgttctcca atcactcaag gtgacagagg tgttggttct 360

actgctgtta tcttggacga caacttcgtt actaaggcta ctgctttgac ttacgaccca 420

tacgttaact actcttctag acacactatc ccacaaccat tctcttacca ctctagatac 480

ttcactccaa agccagtttt ggactctact atcgactact tccaaccaaa caacaagaga 540

aaccaattgt ggatgagatt gcaaacttct agaaacgttg accacgttgg tttgggtact 600

gctttcgaga actctatcta cgaccaagac tacaacatca gagttactat gtacgttcaa 660

ttcagagaat tcaacttgaa ggacccacca ttgaagcca 699

<210> 7

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Leu His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

225 230

<210> 8

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgacttacc ctagaagaag atacagacgt agaagacaca gacctcgttc tcatctggga 60

caaatcttga gaaggagacc ttggctgttg cacccaagac accgttacag atggagaaga 120

aagaacggca tcttcaacac cagattgtcc agaaccttcg gttacactat caagagaacc 180

actgtcaaga ccccatcttg ggctgttgac atgatgagat tcaacatcaa cgacttcctg 240

cctccaggtg gaggctcgaa ccctagatcc gttccatttg aatactacag aatccgtaag 300

gtgaaggttg agttctggcc ttgctctcca atcactcagg gagacagagg tgtcggttcc 360

tcggcagtta tcttggatga caacttcgtg accaaggcta ctgccctgac ctacgaccca 420

tacgtcaact actcttccag acacactatt acccagccat tctcgtatca ctccagatac 480

ttcaccccta agccagtttt ggactctact atcgactact tccaaccaaa taacaagaga 540

aaccagttgt ggctgagact tcaaaccgct ggtaacgtcg atcacgttgg tctcggaact 600

gccttcgaga actccatcta cgaccaagaa tacaacatca gagtgactat gtacgtccag 660

tttagagagt tcaacctgaa ggacccacct ttgaacccat aa 702

Claims

1.一种基因工程细胞组合，其特征在于，所述基因工程细胞组合中包括第一基因工程细胞和第二基因工程细胞；

并且，所述猪圆环病毒外壳蛋白X和猪圆环病毒外壳蛋白Y是猪圆环病毒的两种不同血清型。

2.如权利要求1所述的基因工程细胞组合，其特征在于，所述的猪圆环病毒外壳蛋白X为猪圆环病毒2型；和/或所述的猪圆环病毒外壳蛋白Y为猪圆环病毒3型；优选地，所述的猪圆环病毒外壳蛋白X的猪圆环病毒2型为2a亚型、2b亚型或2d亚型。

3.一种病毒样颗粒组合，其特征在于，所述病毒样颗粒组合中包括第一病毒样颗粒和第二病毒样颗粒，所述第一病毒样颗粒和第二病毒样颗粒分别由权利要求1所述的基因工程细胞组合中的第一基因工程细胞和第二基因工程细胞表达。

4.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物是二价疫苗组合物，包括以下组分：

(i)如权利要求3所述的病毒样颗粒组合；和

(ii)疫苗上可接受的载体。

5.一种制备如权利要求3所述的病毒样颗粒组合的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在适合表达的条件下，培养如权利要求1所述基因工程细胞中的第一基因工程细胞和第二基因工程细胞，从而表达第一病毒样颗粒和第二病毒样颗粒；和

(ii)分离所述的第一病毒样颗粒和第二病毒样颗粒。

6.一种经密码子优化的分离的多核苷酸的组合，其特征在于，所述组合中包括编码SEQID NO:1所示多肽的第一多核苷酸和编码SEQ ID NO:2所示多肽的第二多核苷酸；

其中，所述第一多核苷酸选自下组：

(a1)序列如SEQ ID NO:3所示的多核苷酸；

(b1)核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(c1)如SEQ ID NO:3所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(d1)与(a1)-(c1)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸；

并且，所述第二多核苷酸选自下组：

(a2)序列如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸；

(d2)与(a2)-(c2)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

7.一种表达载体组合，其特征在于，所述表达载体组合中包括第一表达载体和第二表达载体；

其中，所述第一表达载体含有如权利要求6所述的多核苷酸组合中的第一多核苷酸，并且所述第二表达载体含有如权利要求6所述的多核苷酸组合中的第二多核苷酸。

8.一种宿主细胞组合，其特征在于，所述宿主细胞组合中包括第一宿主细胞和第二宿主细胞；

其中，所述第一宿主细胞含有如权利要求7所述的表达载体组合中的第一表达载体，或者在基因组中整合有如权利要求6所述的多核苷酸组合中的第一多核苷酸；

并且，所述第二宿主细胞含有如权利要求7所述的表达载体组合中的第二表达载体，或者在基因组中整合有如权利要求6所述的多核苷酸组合中的第二多核苷酸。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有如权利要求3所述的病毒样颗粒组合、如权利要求6所述的多核苷酸组合、如权利要求7所述的表达载体组合，或如权利要求8所述的宿主细胞组合，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

10.一种分离的重组多肽的组合，其特征在于，所述重组多肽包括第一重组多肽和第二重组多肽；