CN115976108A - 一种表达PCV2、PCV3 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体、构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达PCV2、PCV3Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体、构建方法与应用，属于疫苗技术领域。该构建方法包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO.1序列插入到pEGFP‑gI28k真核表达质粒中，获得pEGFP‑gI28k‑2Cap‑3Cap‑IL4质粒；(2)pEGFP‑gI28k‑2Cap‑3Cap‑IL4质粒和psgRNA‑gE质粒转染BHK‑21细胞，再接种PRV‑XJ‑ΔTK病毒液；(3)待细胞出现80％的病变并观察到发出绿色荧光的病毒蚀斑时，反复冻融，离心取上清，上清液中含有PRV真核表达载体rPRVXJ‑ΔgE/gI/TK‑2Cap‑3Cap‑IL4；(4)纯化载体。
Description
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，尤其涉及一种表达PCV2、PCV3 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体、构建方法与应用。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是环状单链DNA病毒，无囊膜，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)。PCV2自1998年被发现后，一直是一种全球传播的频发病原，感染的猪只会出现多系统衰竭症、肠炎、肺炎和生殖障碍等症状，这些疾病被统称为猪圆环病毒病(PCVD)或猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。2016年，PALINSKI在患有猪皮炎肾病综合征(PDNS)、生殖衰竭、心肌炎和多系统炎症的母猪的流产胎儿中检测到了一种新型圆环病毒，命名为PCV3，其与PCV2仅有37％的同源性。随着进一步的研究发现，PCV3在患病或部分健康猪只中均可检测出，主要导致猪只生殖障碍、皮肤疾病以及多系统炎症。许多研究报道指出，猪单独感染PCV单一亚型时不会产生严重的PCVD症状，而PCV2与PCV3之间的共感染会加重临床症状的表现。因此，同时免疫PCV2和PCV3的联合疫苗的研发，对生产上有重要意义。
细胞因子在免疫反应中发挥着重要作用，基于他们功能的不同，细胞因子可以分为炎性因子，Th1和Th2型细胞因子。其中，IL-4是由Th2细胞分泌的细胞因子，它主要在体液免疫中发挥重要作用,如影响免疫球蛋白的产生、类型转变和分泌。除此之外，IL-4在调节淋巴细胞，巨噬细胞，成纤维细胞等细胞的增殖、凋亡方面也发挥着不可替代的作用。因此将其作为疫苗的分子佐剂，可以有效增强免疫反应，加强疫苗效果。
PCV2、PCV3和PRV是危害全球养猪业的重要传染病，在我国很多猪场流行，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2和PCV3作为近年来常见的混合感染病毒，到目前为止尚无联合疫苗用来防控。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种表达PCV2、PCV3 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将SEQ ID NO.1序列插入到含有伪狂犬gI和28K基因序列同源臂的pEGFP-gI28k真核表达质粒中，获得pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4载体；
(2)pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4质粒和psgRNA-gE质粒转染BHK-21细胞，再接种PRV-XJ-ΔTK病毒液；
(3)待细胞出现80％的病变并观察到发出绿色荧光的病毒蚀斑时，将细胞反复冻融，离心取上清，上清液中含有表达PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4且缺失gE、gI、TK的PRV真核表达载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4。
进一步地，所述步骤(1)中SEQ ID NO.1序列插入了pEGFP-gI28k真核表达质粒XhoI和BclI酶切识别位点之间。
更进一步地，所述步骤(2)中pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4质粒和psgRNA-gE质粒转染BHK-21细胞24h后，再接种PRV-XJ-ΔTK病毒液。
更进一步地，还包括步骤(4)rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4的纯化。
更进一步地，所述步骤(4)rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4的纯化采用了96孔板有限稀释法和6孔板病毒噬斑纯化方法。
本发明的目的之二在于提供上述构建方法构建得到的重组伪狂犬病毒载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4。
本发明的目的之三在于提供上述重组伪狂犬病毒载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4在制备猪圆环病毒疫苗中的应用。
进一步地，所述猪圆环病毒为PCV2和PCV3。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明以PRV分离株XJ株为亲本毒株，利用同源重组技术和Crisprcas基因编辑技术构建共表达PCV2Cap蛋白、PCV3Cap蛋白和IL-4蛋白的重组伪狂犬病毒，在小鼠模型中对该重组病毒疫苗的体液免疫和细胞免疫效应进行评价。其不仅达到一针多免的效果，还使用分子佐剂增强疫苗的免疫原性，形成PCV2和PCV3重组伪狂犬病毒减毒活疫苗的初步探索，为研究开发出有效的联合疫苗提供思路。
附图说明
图1为实施例1中质粒CRISPR/Cas-gE和pEGFP-gI28K-2Cap-3Cap-IL4共转染24h后表达带有EGFP绿色荧光的蛋白图。
图2为实施例1中rPRVXJ-△gE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4病毒噬斑图。
图3为实施例1中rPRVXJ-△gE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4F21蛋白样品中外源蛋白PCV2Cap、PCV3 Cap、IL-4的表达情况，其中A：PCV2 Cap；B：PCV3 Cap；C：IL-4。
具体实施方式
实施例1
1.转移质粒的设计和合成
根据PCV2 Cap、PCV3 Cap和IL-4蛋白序列，人工设计能够表达PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4蛋白的核酸序列，顺序为XhoI-PCV2Cap-F2A-PCV3Cap-P2A-IL4-BclI，序列见SEQ IDNO.1。其中PCV2Cap蛋白序列见SEQ ID NO.2，PCV3Cap序列见SEQ ID NO.3，IL-4序列见SEQID NO.4。设计好的序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，将合成的序列SEQ ID NO.1采用无缝克隆试剂盒插入到含有伪狂犬gI和28K基因序列同源臂的pEGFP-gI28k真核表达质粒(四川农业大学动物生物技术中心构建)XhoI和BclI酶切识别位点之间，构建好的载体命名为pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4。
2.重组蛋白真核表达载体的构建
常规方法传代BHK-21细胞至12孔板，待细胞长至70％～80％时使用Lipefectamine TM3000转染试剂转染(购于Invitrogen公司)，将转移载体pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4质粒和psgRNA-gE质粒转染BHK-21细胞。具体实施步骤为：配制溶液A和溶液B，溶液A为DMEM70μL+LipofectamineTM30007.5μL；溶液B为DMEM70μL+P3000TM5μL+5μg质粒(pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4和CRISPR-CasgE各2.5μg)。将溶液A和溶液B各自震荡混匀，然后将溶液B加入溶液A后点震几次得到混合液，室温静置孵育15min。将上步得到的混合液逐滴滴入铺有BHK-21细胞的12孔板混匀进行转染，随后将细胞置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。转染后12小时可观察到绿色荧光蛋白的表达(参见图1)，在转染24h后每孔加入5μLPRV-XJ-ΔTK病毒液，构建重组伪狂犬病毒株。继续培养24-48小时，待细胞出现80％的病变并观察到发出绿色荧光的病毒蚀斑时(参见图2)将细胞置-80℃反复冻融三次，12000rpm离心取上清，上清液中含有表达PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4且缺失gE、gI、TK的PRV真核表达载体，简称为rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4。将该上清液经96孔板有限稀释法和6孔板病毒噬斑纯化方法得到纯化的表达载体，于-80℃保存。
96孔板有限稀释法：常规方法传代BHK-21细胞至96孔板中，待细胞长至致密单层时，取-80℃保存的含有rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4表达载体的上清液，使用无血清DMEM细胞培养液进行10倍梯度稀释。取10-3、10-4、10-5、10-6四个稀释度的液体，接种于96孔板中，每孔100uL，每梯度重复24孔。加入病毒稀释液后将96孔板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，每日观察。选取出现较多绿色荧光斑且稀释度较高的孔，-80℃冻融1次，12000rpm离心2min，上清液于-80℃保存。
6孔板病毒噬斑纯化方法：常规方法传代BHK-21细胞至6孔板中，待细胞长至致密单层时，去培养液，用PBS润洗细胞3次。取从上述方法中得到的含rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4表达载体的上清液，使用无血清DMEM细胞培养液进行10倍梯度稀释。取10-3、10-4、10-5三个稀释度的病毒液，接种于6孔板中，每孔接种200uL，37℃，5％CO2培养箱中吸附1h后弃去病毒液，将2×DMEM与2％低熔点琼脂糖1:1混合后加入6孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每日观察。待出现噬斑后，在荧光显微镜下尽量挑取发出绿色荧光的单个病毒噬斑，然后将其在铺有BHK细胞的12孔板中扩大培养。重复96孔板有限稀释法和6孔板病毒噬斑纯化法，直至得到纯化的表达载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4。
3.rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4纯化后外源蛋白表达情况
按照常规方法传代BHK-21细胞至96孔板，置37℃，5％CO2培养箱中培养至致密单层。取纯化后F1、F10、F20、F21代rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4，使用含2％血清DMEM进行10倍梯度稀释至10-8得到10-1-10-9，接至96孔板，每梯度重复24孔。接种后置37℃，5％CO2培养箱中培养。将培养后的96孔板置于倒置荧光显微镜下观察各稀释度孔是否出现细胞病变并同时产生绿色荧光，记录各稀释度细胞绿色荧光数量，根据Reed-Muench方法计算rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4的TCID50分别为106.8TCID50/ml、106.6TCID50/ml、106.6TCID50/ml、106.6TCID50/ml。
取F21代rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4接种BHK-21细胞，36h后收取细胞蛋白样品，通过WB进行外源蛋白PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4的检验(参见图3)(PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4抗体由四川农业大学动物生物技术提供)。
4.rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4安全性试验
6周龄雌性BALB/c小鼠(平均体重18±2g)购自北京华阜康生物科技股份有限公司。将小鼠随机分为4组，前3组为实验组，每组8只小鼠，每组分别按照107TCID50、106TCID50、105TCID50的剂量注射rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4病毒液。第4组选择4只小鼠作为对照组，肌肉注射0.2mLDMEM。连续观察15天，记录小鼠存活情况。15天后用4％多聚甲醛固定小鼠脑组织进行组织病理学观察，评价rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4对小鼠的安全性。
实验结果表明，各浓度rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4均无死亡，且组织切片无病理变化，与对照组相比无明显差异。该重组病毒对小鼠是安全的。
5.重组病毒在小鼠上的免疫效果测定
购买6周龄雌性BALB/c小鼠60只(北京华阜康生物科技股份有限公司)。将小鼠随机分为两组(免疫组和对照组，每组30只)，取纯化后的重组病毒用无血清DMEM稀释，免疫组经肌肉注射106TCID50rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4200μl，对照组经肌肉注射DMEM200μl；两周后加强免疫。分别于初次面以后第0、1、3、5、7、14、21、28、35、42天(dpv)通过尾静脉采血收集血液，同时分离14和28dpv小鼠脾细胞。
5.1rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4在小鼠上的细胞免疫效果测定
(1)用细胞因子检测试剂盒(欣博盛：IL-6(EMC004.96)；IFN-γ(EMC101g.96))检测免疫组和对照组小鼠外周血中14与28dpvIL-4与IFN-γ分泌情况。结果见表1。
表1小鼠外周血IL-6与IFN-γ细胞因子检测结果
(2)分离14及28dpv免疫组和对照组小鼠脾细胞，每组设三只小鼠为重复。使用细胞计数板计数，1640培养基稀释脾细胞至细胞个数在5×106/mL时，铺于96孔板(每孔100μL)。在三种处理条件下测量每只小鼠脾细胞增殖情况：①10μg/ml的PCV2Cap纯化蛋白，每孔100μL；②10μg/ml的PCV3Cap纯化蛋白，每孔100μL；③10μg/ml的刀豆蛋白A(MPBiomedicals，LLC:195283)(ConcanavalinA，ConA)，每孔100μL；④1640培养基，每孔100μL。每孔三次重复取平均值。培养72h后，利用CCK-8(Beyotime,China)检测试剂盒检测每孔OD450nm吸光值后计算刺激指数以评估脾脏淋巴细胞增殖情况。刺激指数(SI)计算公式为：SI＝(免疫组OD值-对照组OD值)/(阴性对照组OD值-对照组OD值)。结果见表2，当用纯化的PCV2Cap、PCV3Cap蛋白和ConA刺激时，接种rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4小鼠组的SI值显著高于接种DMEM小鼠组，其SI值有显著差异。
表2小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验
(3)将14及28dpv分离的免疫组和对照组小鼠的脾细胞用PBS稀释至2×104/mL，取500μL，使用FITC-CD3、APC-CD4和PE-CD8抗体(FITCanti-mouseCD3Antibody：100204；APCanti-mouseCD4Antibody：100412；PEanti-mouseCD8aAntibody：100708，Biolegend，使用浓度为1：250)室温避光染色30min后用流式细胞仪检测，采用flowjo10软件对数据进行分析。结果见表3，在免疫后第28天，测定小鼠脾脏淋巴细胞CD3+、CD3+CD4+(体液免疫相关)、CD3+CD8+(细胞免疫相关)T细胞比值，发现免疫组小鼠CD3+CD4+T细胞百分比明显高于对照组，CD3+CD8+T细胞百分比略高于对照组。
表3小鼠脾脏淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+百分比
5.2rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4在小鼠上的体液免疫效果测定
收集0、1、3、5、7、14、21、28、35、42dpv的免疫组和对照组小鼠的血清，参照法国ID.vetinnvativedignose猪伪狂犬病毒gE、gB抗体检测试剂盒说明书检测小鼠gE、gB抗体水平，参照深圳真瑞生物科技有限公司猪圆环病毒抗体检测试剂盒说明书进行PCV2Cap抗体检测，在检测时使用HRP-标记的兔抗小鼠二抗(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)代替原试剂盒中的酶标抗体。参照上海科艾博生物科技有限公司小鼠圆环病毒3型检测试剂盒说明书进行PCV3Cap抗体检测。
测定结果显示所有小鼠各时间点gE抗体呈阴性，21dpv(二次免疫1周后)，免疫组小鼠gB抗体、PCV2Cap抗体、PCV3Cap抗体均转为阳性，且抗体水平随时间升高(结果见表4、5、6、7)。
采用微量中和试验法检测小鼠血清中抗PCV2中和抗体，具体操作如下：预先在96孔板中培养PK-15细胞，待细胞长至50-60％时用于血清中和测定。收集7、14、28、35dpv的免疫组和对照组小鼠血清，56℃水浴灭火30min。待测血清(对照组与免疫组)倍比稀释为(1：2-1：64)，将50uL稀释后血清与50uL200TCID50PCV2病毒液混合后在37℃温箱孵育1h，加入PK-15细胞中培养；同时设定细胞对照组，未中和的病毒对照组和阴性血清对照组。培养72h后，用PBS洗涤两次，并用冰丙酮/甲醇(1:1)在-20℃固定20分钟，用3％BSA在PBST中室温封闭1h，加入用PBST1:100稀释PCV2阳性血清(四川农业大学动物生物中心提供)，4℃孵育过夜。PBST洗板后，用Cy3标记的山羊抗小鼠IgG孵育，在荧光显微镜下观察计数在荧光显微镜下测定滴度为最终血清稀释度的倒数，荧光降低70％或更多。最后，采用Reed-Muech方法计算血清中和抗体滴度。
测定结果显示免疫组小鼠自21dpv开始产生PCV2中和抗体，免疫后35天PCV2中和抗体滴度最高，随后开始降低，具体结果见表8。
以PCV2保守基因Cap为模板，建立关于PCV2的荧光定量PCR检测标曲，y＝-3.3986x+40.099，R2＝0.99806。将对照组与免疫组感染200uL104.5TCID50PCV2，收集感染后7、14、28、35天(dpv)小鼠心、肺、肝、脾、肾、空肠、肠系膜淋巴结各100mg，检测对照组与免疫组小鼠组织中PCV2的病毒载量。
检测结果表明，对照组接种PCV2小鼠心、肝、脾、肺、肠淋和粪便病毒载量中较高，在21dpi达到峰值，28dpi时变化不明显。免疫组病毒载量在14dpi达到峰值，随后逐渐降低，具体数据见表9。
表4 gB抗体测定结果
注：S/N％≤40％为阳性；50％≥S/N％＞40％为可疑；S/N％＞50％为阴性。
表5 gE抗体测定结果
注：S/N％≤60％为阳性；70％≥S/N％＞60％为可疑；S/N％＞70％为阴性。
表6 PCV2Cap抗体测定结果
注：S/P值≥0.2判断为阳性；S/P值<0.2判断为阴性。
表7 PCV3Cap抗体测定结果
注：样品OD450nm≥阈值判断为阳性；样品OD450nm<0.2判断为阴性。
表8PCV2中和抗体测定结果
表9PCV2病毒载量测定结果
SEQ ID NO.1：XhoI-PCV2Cap-F2A-PCV3Cap-P2A-IL4-BclI：
ctcgagATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCAT
CTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTG
GAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAA
GCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATG
ACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGA
ATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGG
AGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCAC
CTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCAC
TCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAAC
AACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTGGACCACGTAG
GCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACAA
TGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTgtgaaacagactttgaa
ttttgaccttctcaagttggcgggagacgtggagtccaacccagggcccATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAA
GACCCCGCCCAAGGAGACGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGTCAGAAGAAAACTATT
CATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCAACCATGAACGTCA
TTTCCGTTGGAACCCCTCAGAATAACAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGC
CTAAACGAATGGGAAACTGCGATTAGCTTTGAATATTATAAGATACTAAAAATGAAAGTT
ACACTCAGCCCTGTAATTTCTCCGGCTCAGCAAACAAAAACTATGTTCGGGCACACAGC
CATAGACCTAGACGGCGCCTGGACCACAAACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTATGCGG
AAAGTTCCACTCGTAAAGTTATGACTTCTAAAAAAAAACACAGCCGTTACTTCACCCCC
AAACCAATTCTGGCGGGAACTACCAGCGCTCACCCAGGACAAAGCCTCTTCTTTTTCTC
CAGACCCACCCCATGGCTCAACACATATGACCCCACCGTTCAATGGGGAGCACTGCTTT
GGAGCATTTATGTCCCGGAAAAAACTGGAATGACAGACTTCTACGGCACCAAAGAAGTT
TGGATTCGTTACAAGTCCGTTCTCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCA
GGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTatgggtctcacctcccaactgatcccaaccctggtctgcttactg
gcatgtaccagcaacttcgtccacggacacaagtgcgacatcaccttacaagagatcatcaaaaccttgaacattctcacagcgagagagaact
cgtgcatggagctgcccgtgacggacgtctttgctgccccagagaacacgacggagaaggaaaccttctgccgggcctcgactgtgcttcggc
acatctacagacaccacacgtgcatgaagagcctcctgagcggacttgacaggaacctgagcagcatggcaaacatgacctgttctgtgcatgaagccaagaagagcactttgaaagacttcttggaaaggctaaagacgattatgaaggagaaatactcaaagtgtTGATCA。
SEQ ID NO.2：PCV2Cap
MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTIKRTT
VKTPSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSA
VILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSIYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP。
SEQ ID NO.3:PCV3Cap
MRHRAIFRRRPRPRRRRRHRRRYVRRKLFIRRPTAGTYYTKKYSTMNVISVGTPQNNKPWH
ANHFITRLNEWETAISFEYYKILKMKVTLSPVISPAQQTKTMFGHTAIDLDGAWTTNTWLQ
DDPYAESSTRKVMTSKKKHSRYFTPKPILAGTTSAHPGQSLFFFSRPTPWLNTYDPTVQWGALLWSIYVPEKTGMTDFYGTKEVWIRYKSVL。
SEQ ID NO.4:IL-4MGLTSQLIPTLVCLLACTSNFVHGHKCDITLQEIIKTLNILTARENSCMELPVTDVFAAPENTTEKETFCRASTVLRHIYRHHTCMKSLLSGLDRNLSSMANMTCSVHEAKKSTLKDFLERLKTIMKEKYSKC。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种表达PCV2、PCV3Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将SEQ ID NO.1序列插入到含有伪狂犬gI和28K基因序列同源臂的pEGFP-gI28k真核表达质粒中，获得pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4质粒；
(2)pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4质粒和psgRNA-gE质粒转染BHK-21细胞，再接种PRV-XJ-ΔTK病毒液；
(3)待细胞出现80％的病变并观察到发出绿色荧光的病毒蚀斑时，将细胞反复冻融，离心取上清，上清液中含有表达PCV2Cap、PCV3Cap和IL-4且缺失gE、gI、TK的PRV真核表达载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中SEQ ID NO.1序列插入了pEGFP-gI28k真核表达质粒XhoI和BclI酶切识别位点之间。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中pEGFP-gI28k-2Cap-3Cap-IL4质粒和psgRNA-gE质粒转染BHK-21细胞24h后，再接种PRV-XJ-ΔTK病毒液。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，还包括步骤(4)rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4的纯化。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4的纯化采用了96孔板有限稀释法和6孔板病毒噬斑纯化方法。
6.权利要求1-5中任一项所述的构建方法构建得到的重组伪狂犬病毒载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4。
7.权利要求6所述的重组伪狂犬病毒载体rPRVXJ-ΔgE/gI/TK-2Cap-3Cap-IL4在制备猪圆环病毒疫苗中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒为PCV2和PCV3。
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