CN105296507A - 拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用 - Google Patents

拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用。本发明将拉沙热病毒Z、N、GPC基因分别与昆虫细胞表达载体连接，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产拉沙热病毒样颗粒。将所述拉沙热病毒样颗粒与防腐剂和佐剂混合，即制备得到拉沙热疫苗。本发明的拉沙热病毒样颗粒及其疫苗能高效诱导机体产生中和抗体，填补了国内此类疫苗的空白。本发明的制备方法适于工业化生产，具有成本低、安全性高等优点。

Description

拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用,属于免疫学及基因工程技术领域。
背景技术
拉沙热(Lassafever)是一种急性病毒性疾病，其病原为拉沙热病毒(Lassavirus，LASV)。在20世纪50年代首次发现拉沙热的发生，但直到1969年才分离出拉沙热病毒。其临床症状表现差异很大，导致诊断非常困难。拉沙热主要在西非流行，据统计，每年西非LASV感染者超过20万人，造成3000多人死亡。LASV感染的主要途径是与拉沙热病人和纳塔尔种多乳房鼠(Mastomysnatalensis)(一种广泛分布、高度共栖的啮齿类动物)接触。最近报道有旅客经商务飞机将LASV传入德国、荷兰、英国和美国，表明该病原体高危险、高传染性，有传入我国的可能。LASV被列为A类生物武器制剂，在世界范围内，拉沙热一直是公共卫生方面受关注的一个焦点，但是目前尚没有批准的拉沙热疫苗。
LASV是一种两节段的单股负链RNA病毒，有包膜，表面覆盖长约8～10nm的方形树突，属沙粒病毒科(Arenaviridae)的旧世界群(OldWorldgroup)。LASV基因组由两节段的双义(ambisense)单链RNA组成，编码5个结构蛋白，分别是3.4kb的S链和7.2kb的L链。S链的两个基因编码核蛋白(NP)、包膜糖蛋白GP1和GP2。L链的两个基因编码病毒聚合酶蛋白(L)和Z蛋白。GP1与GP2蛋白，是由G基因编码的前体糖蛋白GPC经翻译后裂解而来，GP1与GP2以四聚体形式构成横跨病毒囊膜的表面纤突，其上具不同抗原决定簇，与病毒的中和作用有关。
近年来，应用病毒样颗粒作为疫苗逐渐受到重视，特别是生物安全要求高的烈性病毒。病毒样颗粒是由病毒的结构蛋白自主包装形成，与天然病毒的形态一致，且能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫。且病毒样颗粒不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性，是一种安全的抗原。
目前尚无利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统制备拉沙热病毒样颗粒方面的报道。因此，探索拉沙热病毒样颗粒的制备方法，应对日趋严峻的拉沙热疫情防控形势成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统高效制备拉沙热病毒样颗粒的方法。
本发明的另一目的是提供拉沙热病毒样颗粒及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种拉沙热病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒GPC基因；
所述拉沙热病毒Z基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；拉沙热病毒N基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；拉沙热病毒GPC基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；
(2)将步骤(1)制得的拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒GPC基因分别插入到昆虫细胞表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒，制得整合了拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒Bacmid质粒；
(3)将步骤(2)制得的重组杆状病毒Bacmid质粒分别转染昆虫细胞，拯救获得整合了拉沙热病毒Z基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒N基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒；
(4)将步骤(3)制得的整合了拉沙热病毒Z基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒N基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒混合后接种昆虫细胞，培养后收获上清，上清经纯化，制得拉沙热病毒样颗粒。
上述拉沙热病毒Z基因的GenBank登录号为：KM821898，拉沙热病毒N基因的GenBank登录号为：KM821845，拉沙热病毒GPC基因的GenBank登录号为：KM821845。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，昆虫细胞表达载体选自：AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHTA、pFastBacHTB、pFastBacHTC、pFastBacDual之一或两种以上的混合；进一步优选的，所述步骤(2)中，昆虫细胞表达载体为pFastBac1。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，重组杆状病毒为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒rAcMNPV。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf21细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)MimicSf9细胞系、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)Se301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾(Spodopteralitura)ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系、家蚕卵巢细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞选自昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf21细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)MimicSf9细胞系、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)Se301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾(Spodopteralitura)ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系、家蚕卵巢细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，整合了拉沙热病毒Z基因的重组杆状病毒(AcMNPV-Z)、整合了拉沙热病毒N基因的重组杆状病毒(AcMNPV-N)、整合了拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒(AcMNPV-GPC)按MOI(感染复数)比例2：1：1混合。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，纯化为采用蔗糖密度梯度离心进行纯化，蔗糖质量体积浓度为20％、30％和60％，单位g/mL。质量体积浓度30％和60％之间得到纯化拉沙热病毒样颗粒。
一种拉沙热病毒样颗粒，包含拉沙热病毒Z蛋白、拉沙热病毒N蛋白、拉沙热病毒G1蛋白、拉沙热病毒G2蛋白；所述的拉沙热病毒Z蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的拉沙热病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述的拉沙热病毒G1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，所述的拉沙热病毒G2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。
上述拉沙热病毒样颗粒在制备拉沙热疫苗中的应用。
上述拉沙热病毒样颗粒在制备预防和/或治疗拉沙热的药物中的应用。
一种拉沙热疫苗，该疫苗是由上述拉沙热病毒样颗粒为药效成分与其他辅料复配制得。根据本发明优选的，所述其他辅料为防腐剂和/或佐剂。进一步优选的，所述佐剂为206佐剂。
上述制备方法中的操作如无特别说明，均可采用本领域常规操作条件。
有益效果
本发明采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞生物反应器中安全、高效地生产拉沙热病毒样颗粒，所制备的拉沙热病毒样颗粒及其疫苗能高效诱导机体产生中和抗体，填补了国内此类疫苗的空白。本发明的制备方法适于工业化生产，具有成本低、安全性高等优点。
附图说明
图1为本发明实施例3中重组杆状病毒感染Sf9细胞产生细胞病变的结果；
图中，A：空白Sf9细胞；B：感染重组杆状病毒AcMNPV-Z；C：感染重组杆状病毒AcMNPV-N；D：感染重组杆状病毒AcMNPV-GPC。
图2为本发明实施例4中免疫荧光鉴定重组病毒表达拉沙热病毒蛋白的结果；
图中，A：感染野生型杆状病毒；B：感染重组杆状病毒AcMNPV-Z；C：感染重组杆状病毒AcMNPV-N；D：感染重组杆状病毒AcMNPV-GPC。
图3为本发明实施例4中WesternBlot鉴定拉沙热病毒样颗粒组成的结果；
图中，M：蛋白marker；1-2：AcMNPV-Z、AcMNPV-N、AcMNPV-GPC共感染的Sf9细胞；3野生型杆状病毒感染Sf9细胞(对照)。
图4为本发明实施例4中拉沙热病毒样颗粒的电镜与免疫电镜鉴定结果；
图中，A-C：拉沙热病毒样颗粒电镜结果；D-F：拉沙热病毒样颗粒免疫电镜结果。
图5为本发明实施例5中脾细胞SFCs和脾细胞产生细胞因子水平的分析结果；
图中，A：小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的细胞数；B：小鼠脾细胞上清中产生的IL-2浓度；C：小鼠脾细胞上清中产生的IFN-γ浓度；D：小鼠脾细胞上清中产生的IL-4浓度。
图6本发明实施例5中拉沙热病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后中和抗体水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1重组转移载体的构建
1、拉沙热结构基因的获得
拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因、拉沙热病毒GPC基因的核苷酸序列来源于GenBank(登录号分别为KM821898、KM821845和KM821845)，核苷酸序列由上海生工合成，长度分别为297bp、1476bp和1710bp，并将目的序列连接至PUC57载体(购自ThermoFisherScientific公司)，分别命名为PUC57-Z，PUC57-N，PUC57-GPC。
拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因、拉沙热病毒GPC基因的原始核苷酸序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示，由它们编码的氨基酸序列分别如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6所示。
2、酶切、连接、转化及鉴定
将pFastBac1载体(购自Invitrogen公司)和PUC57-Z质粒进行酶切处理，酶切体系50μl，组成如下：
DNA10μl，限制性内切酶BamHI/限制性内切酶NotI各2μl，10×M缓冲溶液5μl，ddH2O31μl。
混匀后，在37℃条件下酶切5h。然后，纯化后的酶切产物用于DNA连接，连接体系20μl，组成如下：
缓冲液2μl，T4连接酶1μl，酶切目的产物7.5μl，载体1.5μl，ddH2O8μl。混匀后，16℃连接8h。
最后，将连接产物与感受态细胞(E.coliDH5)采用热休克方法进行转化，获得阳性质粒pFastBac1-Z。同样，按照上述方法通过酶切连接将拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒GPC基因连接至pFastBac1载体，分别命名为pFastBac1-Z、pFastBac1-N、pFastBac1-GPC。
实施例2重组杆状病毒的构建
1、重组杆状病毒基因组的构建
将pFastBac1-Z、pFastBac1-N、pFastBac1-GPC转移载体转化E.coliDH10Bac感受态细胞(含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒AcMNPV基因组，InvitrogenCatNO.10359-016)，转化条件如下：
将2μlpFastBac1-Z、pFastBac1-N或pFastBac1-GPC与E.coliDH10Bac混匀后，冰浴35min，42℃热应激50s后，再进行冰浴3min，然后，加入1ml无抗性LB培养基，在37℃、200rpm条件下培养4～5h后，菌液进行10-1、10-2、10-3倍比连续稀释，从各稀释液中分别取100μl涂在含有三抗抗性细菌培养皿上(含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环霉素、X-gal)，37℃培养48h后，进行蓝白斑筛选。
2、重组杆状病毒基因组的鉴定
在上述培养皿中，挑取白斑菌落，划线于含有三抗和X-gal的细菌培养皿上，继续培养48h后，挑取白色菌落，接菌至含三抗抗性的液体LB培养基(蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,氯化钠10g/L)中，在37℃、200rpm条件下培养12～16h后，采用碱裂解与异丙醇沉淀结合的方法提取重组杆状病毒基因组DNA。
实施例3重组杆状病毒的拯救
将提取的重组杆状病毒基因组DNA转染昆虫细胞Sf9，转染过程如下：
(1)将4μg重组DNA加入到250μl无血清和双抗的Grace培养液中，混匀，室温静止5min；
(2)将6μl脂质体Lipfectin2000加入到250μl无血清和双抗的Grace培养液中，混匀，室温静止5min；
(3)将上述(1)和(2)溶液等体积混合，室温静止20min；
(4)在上述(3)静止期间，将用6孔板培养好的草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系(覆盖孔底面积已经达到70～80％，购自Invitrogen公司)用无血清和双抗的Grace培养液轻洗三次，然后，每孔加入1ml新鲜的Grace培养液，待备用；将(3)中混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在27℃条件下静止培养5～6h。
(5)将上述(4)每孔中的液体弃掉，加入2ml完全Grace培养液(含有双抗和10％血清)，27℃条件下静止培养48～72h，收集细胞上清液，用其感染新培养的Sf9细胞，提高重组杆状病毒滴度，反复接种2代后，显微镜下观察细胞状态，收取细胞上清液，4℃保存备用。重组杆状病毒命名为AcMNPV-Z、AcMNPV-N、AcMNPV-GPC。
结果显示，重组杆状病毒AcMNPV-Z、AcMNPV-N、AcMNPV-GPC在Sf9细胞产生明显的细胞病变，空白组未见病变(图1)。
实施例4拉沙热病毒样颗粒的表达与鉴定
1、间接免疫荧光方法鉴定目的蛋白表达
采用间接免疫荧光检测拉沙热病毒的Z、N、GPC蛋白表达情况。用AcMNPV-Z、AcMNPV-N、AcMNPV-GPC分别感染96孔板培养的Sf9细胞(培养孔底壁约被细胞覆盖80％)(MOI＝2)，在27℃条件下，细胞静止培养48～72h之后，吸掉上清液，轻轻用PBS溶液清洗细胞2次，弃净PBS溶液，每孔加入100μl80％浓度的预冷丙酮，在-20℃条件下，固定Sf9细胞2h，用PBST溶液清洗3次后，细胞与LASV的多抗(1:500倍稀释)37℃反应2h；用PBST溶液清洗3次后，细胞与FITC标记的羊抗鼠二抗IgG37℃反应1h，用PBST溶液清洗3次后，最后，用荧光显微镜检测实验结果。
结果显示，采用LASV多抗作为一抗时，AcMNPV-Z、AcMNPV-N、AcMNPV-GPC分别感染的Sf9细胞展现出高强度的绿色荧光，相比之下，对照组细胞没有绿色荧光出现，表明重组杆状病毒正确表达目的蛋白(图2)。
2、Westernblot鉴定目的蛋白表达
为了分析AcMNPV-Z、AcMNPV-N、AcMNPV-GPC共感染的Sf9细胞对拉沙热病毒的Z、N、GPC蛋白和病毒样颗粒(VLPs)的表达情况，将重组杆状病毒以MOI比例为2：1：1共感染Sf9细胞，细胞培养72h之后，收集细胞上清液，4℃保存备用。采用蔗糖密度梯度离心方法纯化VLPs：首先，将收集的细胞培养上清液3.5×104rpm离心2h，获得的沉淀用PBS溶解后，缓慢加到梯度蔗糖(20％-30％-60％，w/v，单位g/mL)上层液面上，3.5×104rpm离心2h，然后，收集30％-60％蔗糖液面之间的白带，溶解在PBS中，经过去除蔗糖和浓缩后获得VLPs，最后，用BCA方法测定蛋白浓度。取100μl获得的蛋白液，加入5×上样缓冲液25μl混匀，煮沸5min，然后，用于Westernblott检测与分析。在进行Westernblot过程中，封闭液采用5％的脱脂奶粉，室温封闭时间为2h；一抗采用LASV多抗，室温反应2h；二抗采用羊抗鼠的HRP标记的IgG，室温反应1h；显色液选用AB混合液，最后，利用LAS-4000系统照相保存结果。
Westernblot结果显示，重组杆状病毒成功表达LASV的四个结构蛋白Z(40kDa)、N(40kDa)、GPC(GP140kDa,GP236kDa)的特异性条带，与预测大小相符，而对照组没有特异性条带出现，表明目的蛋白表达正确(图3)，经检测，拉沙热病毒Z蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，拉沙热病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，拉沙热病毒G1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，拉沙热病毒G2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。
3、拉沙热病毒样颗粒形态的观察与分析
采用电镜和免疫电镜方法检测与分析拉沙热VLPs的形态与结构。将纯化的VLPs样品吸附到金属网上之后，用1％磷钨酸染色2-3min，然后，用滤纸吸掉金属网上的残余染色液，最后，利用电镜(JEM1200EXII)观察与分析并记录实验结果。
采用免疫电镜进一步观察拉沙热病毒样颗粒的形态与结构。将培养物上清吸附到金属网上，用TBST(25mMTris-Cl,150mMNaCl,0.05％Tween20,pH7.2)漂洗2次，滤纸吸净网上残余液后，将GPC单克隆抗体与金属网37℃孵育30min，金属网以同样方法漂洗之后，与TBST稀释的金颗粒标记的蛋白A(AproteinA-goldparticles)，直径10-15nm，37℃孵育30min，金属网被漂洗和滤纸处理之后，用1％磷钨酸染色2-3min，最后，用电镜检测与分析，记录实验结果。
电镜结果显示，重组杆状病毒按照一定比例感染的Sf9细胞上清液中，可见到圆形且具有囊膜的球状VLPs，直径大小在100～300nm范围之内，其形态结构与文献报道的LASV具有一致性(图4中A、B、C)。
免疫电镜结果显示，病毒样颗粒可以与GPC单抗结合，证明该颗粒存在LASVGPC蛋白(图4中D、E、F)。
实施例5病毒样颗粒的免疫原性研究
1、病毒样颗粒对小鼠的免疫
将纯化的拉沙热病毒样颗粒样品与206佐剂乳化后免疫小鼠。将健康雌性的BALB/c小鼠40只随机分成4组，每组10只小鼠，分别为空白组、206组、VLPs组、206+VLPs组(206与VLPs佐剂等体积乳化制成)，免疫剂量10μg/只。小鼠免疫2次，两次免疫间隔14d，每只小鼠免疫剂量为50μl/只，免疫方法采用小鼠后肢肌肉注射。在加强免疫后不同时间，采集小鼠血液和脾脏，用于免疫指标检测与分析。
2、小鼠免疫指标的检测
(1)ELISpot对特异性T细胞活化的分析
在加强免疫后第14d，选用ELISpot实验检测与分析拉沙热病毒样颗粒特异性T细胞的免疫活性。首先，96孔ELISpot板用抗鼠IFN-γIgG(5μg/ml)包被，100μl/孔，4℃包被过夜，细胞板用PBS清洗后，采用10％牛血清37℃封闭2h，然后，用PBST洗板，待干后，4℃保存备用；每组免疫小鼠的脾细胞被分离后，制成细胞悬液，浓度为5×106/ml；将含有不同刺激物拉沙热病毒样颗粒(5μg/ml)或PMA(50ng/ml)和离子霉素(ionomycin)(1μg/ml)的1640细胞完全培养液加到上述96孔板相应孔中，100μl/孔，相同平行组设置3个复孔，其中，拉沙热病毒样颗粒作为抗原特异性刺激物，PMA和离子霉素作为阳性对照组刺激物，而阴性对照组不含有任何刺激物；然后，将上述新制备的脾细胞悬液加到96孔板中(采用1640细胞完全培养液配制)，100μl/孔，轻轻振荡混匀，细胞在37℃和5％CO2条件下静止培养24h后，洗掉细胞，加入生物素标记的检测抗体，37℃孵育2h，用PBST洗板后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素溶液，37℃孵育2h，同样细胞板洗完后，加入AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)底物进行显色，室温避光孵育10-20min，然后，采用酶联斑点图像自动分析仪检测每孔产生的SFCs(SpotFormingCells)数量。最后，计算分析1×106个脾细胞中能够分泌抗原特异性IFN-γ的SFCs数量。
结果表明，二免14d后的小鼠脾细胞被拉沙热病毒样颗粒特异性抗原刺激后，206+VLPs组小鼠脾细胞产生的SFCs阳性数量显著高于(p<0.01)其它免疫组，包括空白组、206组、VLPs组，如图5中A所示。
(2)细胞因子浓度测定
将含有或不含拉沙热病毒样颗粒(5μg/ml)的1640细胞完全培养液分别加到96孔板中，100μl/孔，然后，将二免疫后第14d每组小鼠的脾细胞制成1×106/ml细胞悬液，加到96孔板中，100μl/孔，轻轻振荡混匀，在37℃、5％CO2条件下，细胞静止培养48-72h后，收集细胞上清液，并分装，-20℃保存备用。利用细胞因子ELISA检测试剂盒，检测上述脾细胞上清液中细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ)浓度。采用标准品的浓度及其OD450nm值绘制细胞因子的标准曲线，将其用于计算样品中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子的浓度。最后，实验数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。
结果表明，二免14d后的小鼠脾细胞经过LASVVLPs处理后，206+VLPs组小鼠脾细胞产生的IL-2和IFN-γ水平显著高于(p<0.01)其它免疫组(空白组、206佐剂组与VLPs组)，并且，VLPs组小鼠脾细胞产生的IL-2和IFN-γ水平明显高于(p<0.01)空白组与206佐剂组；另外，VLPs组与免疫原实验组小鼠脾细胞产生的IL-4水平明显高于空白组与206组(p<0.05)，如图5中B、C、D所示。
(3)中和试验
选用慢病毒包装系统(VSV包装系统)构建的LASV假病毒(EGFP标记)检测二免后第14d免疫小鼠血清中抗体的中和活性。在进行中和试验过程中，首先，将加热灭活完全的小鼠血清进行1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512倍比稀释；然后，取每个稀释度的每组免疫小鼠血清分别加到96孔板中，50μl/孔，每个平行组设3个复孔，然后，在每孔中加入50μlLASV假病毒溶液，振荡混匀，37℃反应1h后，将293T细胞悬液(5×105个细胞/ml，采用含有10％FBS的DMEM细胞培养液配制)加入96孔板中，100μl/孔，轻轻振荡混匀后，细胞在37℃、5％CO2条件下，静置培养72h，最后，用荧光显微镜检测结果。抗体中和活性采用下述公式计算：
抗体中和活性﹦[(免疫组表达绿色荧光的细胞数-对照组表达绿色荧光的细胞数)/对照组表达绿色荧光的细胞数×100％]
结果显示，206+VLPs组小鼠血清在1:128倍稀释时具有100％的中和作用(抑制LASV假病毒感染程度)，并且，血清在1:256倍稀释时，具有80％左右的中和作用；VLPs组小鼠血清在1:64倍稀释时具有100％的中和作用，而血清在1:128倍稀释时具有80％左右的中和作用；但是，空白组、206佐剂组小鼠血清没有中和活性。因此，中和试验结果表明VLPs能够诱导小鼠产生中和抗体，并且具有较强的中和作用(图6)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种拉沙热病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒GPC基因；
所述拉沙热病毒Z基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；拉沙热病毒N基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；拉沙热病毒GPC基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；
(2)将步骤(1)制得的拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒GPC基因分别插入到昆虫细胞表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒，制得整合了拉沙热病毒Z基因、拉沙热病毒N基因和拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒Bacmid质粒；
(3)将步骤(2)制得的重组杆状病毒Bacmid质粒分别转染昆虫细胞，拯救获得整合了拉沙热病毒Z基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒N基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒；
(4)将步骤(3)制得的整合了拉沙热病毒Z基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒N基因的重组杆状病毒、整合了拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒混合后接种昆虫细胞，培养后收获上清，上清经纯化，制得拉沙热病毒样颗粒。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，昆虫细胞表达载体选自：AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、BactoPac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX1.1、pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHTA、pFastBacHTB、pFastBacHTC、pFastBacDual之一或两种以上的混合；进一步优选的，所述步骤(2)中，昆虫细胞表达载体为pFastBac1。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重组杆状病毒为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒rAcMNPV。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf21细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)MimicSf9细胞系、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)Se301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾(Spodopteralitura)ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系、家蚕卵巢细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf21细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)MimicSf9细胞系、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)Se301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾(Spodopteralitura)ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系、家蚕卵巢细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系；
优选的，所述步骤(4)中，整合了拉沙热病毒Z基因的重组杆状病毒(AcMNPV-Z)、整合了拉沙热病毒N基因的重组杆状病毒(AcMNPV-N)、整合了拉沙热病毒GPC基因的重组杆状病毒(AcMNPV-GPC)按MOI(感染复数)比例2：1：1混合；
优选的，所述步骤(4)中，纯化为采用蔗糖密度梯度离心进行纯化，蔗糖质量体积浓度为20％、30％和60％，单位g/mL。
6.一种拉沙热病毒样颗粒，其特征在于，包含拉沙热病毒Z蛋白、拉沙热病毒N蛋白、拉沙热病毒G1蛋白、拉沙热病毒G2蛋白；所述的拉沙热病毒Z蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的拉沙热病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述的拉沙热病毒G1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，所述的拉沙热病毒G2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。
7.权利要求6所述拉沙热病毒样颗粒在制备拉沙热疫苗中的应用。
8.权利要求6所述拉沙热病毒样颗粒在制备预防和/或治疗拉沙热的药物中的应用。
9.一种拉沙热疫苗，其特征在于，由权利要求6所述的拉沙热病毒样颗粒为药效成分与其他辅料复配制得。
10.如权利要求9所述的拉沙热疫苗，其特征在于，所述其他辅料为防腐剂和/或佐剂；优选的，所述佐剂为206佐剂。
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