CN109021081B - 一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒及其构建方法与应用。本发明将牛病毒性腹泻病毒C‑E0‑E1‑E2‑P7基因与杆状病毒表达载体连接，采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞生物反应器中安全、高效地生产牛病毒性腹泻病毒样颗粒，所制备的牛病毒性腹泻病毒样颗粒与真实病毒粒子形态结构相似，与灭活病毒相比，病毒样颗粒免疫可以有效诱发细胞免疫反应，且没有弱毒疫苗毒力回复的风险，与其它疫苗相比更能真实地展示病毒抗原构象，易于被免疫系统识别，高效诱导机体产生中和抗体，填补了国内此类疫苗的空白。本发明的制备方法适于工业化生产，具有成本低、安全性高等优点。

Description

一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒及其构建方法与应用，属于免疫学及基因工程技术领域。
背景技术
牛病毒性腹泻黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVDMD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea viruses，BVDV)引起的急性、接触性传染病。BVDV除感染牛外，还可感染猪、鹿、羊、骆驼及其他野生动物，宿主相当广泛。该病主要以腹泻及消化道黏膜坏死、糜烂或溃疡为特征。既能水平传播也能垂直传播，公牛精液也有病毒存在，感染病毒的怀孕母牛以消化道溃疡为特征。BVDV主要通过呼吸道和消化道感染，也可通过胎盘感染胎儿，分娩产出带毒犊牛。大多数病牛呈持续性感染，易引起免疫抑制并诱发细菌感染。近年来，BVDV传播迅速并成为危害我国养牛业的主要疫病。BVDV具有高突变率以及临床症状也较为复杂，给养殖产业发展带来较大困扰，亟待研制新型防控制品。
BVDV基因组为单股正链RNA，长度为12.3kb～12.5kb，包括一个5′非翻译区，一个编码4种结构蛋白的(C、E0、E1和E2)和8种非结构蛋白的开放阅读框(open reading frame，ORF)以及一个3′非翻译区。该ORF编码一个近4000个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白由细胞和病毒基因编码的蛋白酶在翻译的同时或翻译后加工至少1种成熟的蛋白质，编码蛋白质的基因在基因组对应的位置为5′-p20(Npro)–p14(C)-gp48(E0)-gp25(E1)-gp53(E2)-p7-p125(NS2-3)-p10(NS4A)-p30(NS4B)-p58(NS5A)-p75(NS5B)-3′，其中C、E0、E1、E2是病毒的结构蛋白，是中和抗体决定区，也是BVDV疫苗研究的主要区域，其余为非结构蛋白，其功能也在不断加深认识，特别是P7蛋白，与病毒出芽相关。
BVDV疫苗研究进展与趋势：
1弱毒苗
弱毒苗会对子宫以及免疫系统造成危害，导致怀孕母牛流产，还可能导致母牛子宫感染。因为其危险性相比之下过高，超过了其能带来的好处，所以很多国家没有批准生产该疫苗。
2灭活苗
灭活苗优势在于其安全性相对较高，因此这种疫苗的发展在世界上是属于最活跃的，多个疫苗被批准使用。但是，灭活苗仍然存在滴度低、与流行毒株匹配度不高等一些不稳定因素。
3亚单位疫苗
近年来，国外许多学者进行了E2亚单位疫苗的研究。ISCOM为基础研制而成的新型牛病毒性腹泻疫苗，其最早是由丹麦研究人员研发，它不仅可以作用在BVDV的防疫上，同时对于丹麦野外的分离株不受感染的保护也起到了一定的作用，但是该疫苗因成本高等因素限制了其进一步发展与应用。
4DNA疫苗
DNA疫苗具有易于制备、保存运输简便，是近年来BVDV疫苗研制中的一个热点。但是DNA疫苗的安全性和低免疫原性尚未解决，现阶段的DNA疫苗还在研制过程当中。
5发展趋势
BVDV毒株变异性较高，防治工作困难较多，而我们使用BVDV疫苗已有30多年的历史，常规疫苗中无论是弱毒苗还是灭活苗，没有一个是安全高效的。所以要从根本上解决防治问题，还需研制BVDV新型疫苗。从目前国内外学者研究情况来看，新型疫苗在使用效果、安全性等方面都要优于常规疫苗。
病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)，是一种特别的亚单位疫苗，由病毒的一种或多种蛋白构成，与真实病毒粒子形态结构相似，与灭活病毒相比，病毒样颗粒免疫可以有效诱发细胞免疫反应，且没有弱毒疫苗毒力回复的风险，与其它疫苗相比更能真实地展示病毒抗原构象，易于被免疫系统识别，是一种快速安全研发烈性传染病疫苗的途径。近年来，已有多种病毒样颗粒疫苗被美国批准上市，如乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒(Influenza virus)、猪圆环病毒(PCV2)等。2013年，我国也批准了第一个病毒样颗粒疫苗，即戊肝病毒(HEV)样颗粒疫苗，并有多种疫苗正在进行临床试验。目前，BVDV病毒样颗粒(BVDVLPs)相关研究尚未开展。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒及其构建方法。
本发明还提供了上述牛病毒性腹泻病毒样颗粒的应用。
本发明的技术方案如下：
一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒样颗粒为具有囊膜结构的球状颗粒，直径大小为30～100nm，其编码基因为牛病毒性腹泻病毒基因组的C-E0-E1-E2-P7基因区域经优化合成的C-E0-E1-E2-P7基因，所述C-E0-E1-E2-P7基因区域的原始核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化合成后的C-E0-E1-E2-P7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
一种上述牛病毒性腹泻病毒样颗粒的构建方法，步骤如下：
(1)将优选的牛病毒性腹泻病毒基因组的C-E0-E1-E2-P7基因区域经优化合成C-E0-E1-E2-P7基因，所述C-E0-E1-E2-P7基因区域的原始核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化合成后的C-E0-E1-E2-P7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
(2)将步骤(1)优化合成后的C-E0-E1-E2-P7基因插入到杆状病毒表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒，即得整合了牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因的重组杆状病毒Bacmid质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得整合了牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因的重组杆状病毒；
(4)将步骤(3)获得的整合了牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后收获混合物，经纯化，制得牛病毒性腹泻病毒样颗粒。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，C-E0-E1-E2-P7基因区域的原始核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，优化合成后的C-E0-E1-E2-P7基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，杆状病毒表达载体选自：AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL 945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual之一或两种以上的混合；进一步优选的，所述步骤(2)中，杆状病毒表达载体为pFastBac1。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，重组杆状病毒为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒rAcMNPV。
根据本发明优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中，昆虫细胞选自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21细胞系、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞系、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)Se 301细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG1细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4细胞系、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)BTI-Tn-5B1-4细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾(Spodoptera litura)ZSU-S1-1细胞系、IBL-SL1A细胞系、家蚕卵巢细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞系。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，整合了牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因的重组杆状病毒为AcMNPV-C-E0-E1-E2-P7。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，培养采用常规贴壁培养或悬浮培养。
上述牛病毒性腹泻病毒样颗粒在制备牛病毒性腹泻疫苗中的应用。
上述牛病毒性腹泻病毒样颗粒在制备预防和/或诊断和/或治疗牛病毒性腹泻黏膜病的药物中的应用。
上述制备方法中的操作如无特别说明，均可采用本领域常规操作条件。
有益效果
本发明采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞生物反应器中安全、高效地生产牛病毒性腹泻病毒样颗粒，所制备的牛病毒性腹泻病毒样颗粒与真实病毒粒子形态结构相似，与灭活病毒相比，病毒样颗粒免疫可以有效诱发细胞免疫反应，且没有弱毒疫苗毒力回复的风险，与其它疫苗相比更能真实地展示病毒抗原构象，易于被免疫系统识别，高效诱导机体产生中和抗体，填补了国内此类疫苗的空白。本发明的制备方法适于工业化生产，具有成本低、安全性高等优点。
附图说明
图1为本发明实施例3中重组杆状病毒AcMNPV-C-E0-E1-E2-P7感染Sf9细胞产生细胞病变的显微镜照片；
图中，A：空白Sf9细胞；B：感染重组杆状病毒AcMNPV-C-E0-E1-E2-P7的Sf9细胞。
图2为本发明实施例4中免疫荧光鉴定重组杆状病毒表达BVDV C-EO-E1-E2-P7蛋白的结果；
图中，A：感染野生型杆状病毒；B：感染重组杆状病毒AcMNPV-C-E0-E1-E2-P7。
图3为本发明实施例5中牛病毒性腹泻病毒样颗粒的电镜鉴定结果；
图4为本发明实施例5中牛病毒性腹泻病毒样颗粒的免疫电镜鉴定结果；
图5为本发明实施例6中小鼠脾细胞IFN-γ和IL-4分泌分析结果；
图中，A：小鼠脾细胞中分泌IL-4的细胞数；B：小鼠脾细胞中分泌IFN-γ的细胞数；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；
图6为本发明实施例6中牛病毒性腹泻病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后中和抗体水平；
图中，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例所用的药品及试剂，如无特殊说明，均为普通市售产品。
室温：是指25±2℃；
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1重组转移载体的构建
1、BVDV结构基因的获得
BVDV毒株较多，但结构与功能基本一致，本发明选择GenBank登录号为U63479.1毒株的C-E0-E1-E2-P7基因区域的原始核苷酸序列作为研究对象，并进行优化合成，核苷酸序列由南京金斯瑞合成，长度为2910bp，并将优化合成后的目的序列连接至PUC57载体(购自Thermo Fisher Scientific公司)，命名为PUC57-C-E0-E1-E2-P7。
BVDV C-E0-E1-E2-P7基因区域的原始核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，由它们编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。优化合成后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，由它们编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2、酶切、连接、转化及鉴定
将pFastBac1载体(购自Invitrogen公司)和PUC57-C-E0-E1-E2-P7质粒进行酶切处理，酶切体系50μL，组成如下：
DNA 10μL，限制性内切酶BamHI/限制性内切酶NotI各2μL，10×M缓冲溶液5μL，ddH2O31μL。
混匀后，在37℃条件下酶切5h。然后，纯化后的酶切产物用于DNA连接，连接体系20μL，组成如下：
缓冲液2μL，T4连接酶1μL，酶切PUC57-C-E0-E1-E2-P7质粒纯化产物7.5μL，酶切pFastBac1载体纯化产物1.5μL，ddH2O 8μL。混匀后，16℃连接8h。
最后，将连接产物与感受态细胞(E.coli DH5)采用热休克方法进行转化，筛选获得阳性质粒pFastBac1-C-E0-E1-E2-P7，即得重组转移载体。
实施例2重组杆状病毒的构建
1、重组杆状病毒基因组的构建
按照Invitrogen公司的操作说明进行，简述如下。将实施例1获得的pFastBac1-C-E0-E1-E2-P7阳性质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体杆状病毒AcMNPV基因组，Invitrogen Cat NO.10359-016)，转化条件如下：
将2μL pFastBac1-C-E0-E1-E2-P7阳性质粒与100μL大肠杆菌DH10Bac感受态细胞混匀后，冰浴35min，42℃热应激50s后，再进行冰浴3min，然后，加入1mL无抗性LB培养基，在37℃、200rpm条件下培养4～5h后，菌液进行10-1、10-2、10-3倍比连续稀释，从各稀释液中分别取100μL涂布在含有三抗抗性细菌培养皿上(含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环霉素、X-gal)，37℃培养48h后，进行蓝白斑筛选。
2、重组杆状病毒基因组的提取
在上述培养皿中，挑取白斑菌落，划线于含有三抗和X-gal的细菌培养皿上，继续培养48h后，挑取白色菌落，接菌至含三抗抗性的液体LB培养基(蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,氯化钠10g/L)中，在37℃、200rpm条件下培养12～16h后，采用碱裂解与异丙醇沉淀结合的方法提取整合了BVDV C-E0-E1-E2-P7基因的重组杆状病毒Bacmid质粒。
实施例3重组杆状病毒的拯救
按照Invitrogen公司的表达系统和脂质体Lipfectin 2000的操作说明进行，简述如下。将实施例2提取的重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9细胞系，转染过程如下：
(1)将4μg重组杆状病毒Bacmid质粒加入到250μL无血清和双抗的Grace培养液中，混匀，室温静止5min；
(2)将6μL脂质体Lipfectin 2000加入到250μL无血清和双抗的Grace培养液中，混匀，室温静止5min；
(3)将上述(1)和(2)溶液等体积混合，室温静置20min；
(4)将用6孔板培养好的Sf9细胞(覆盖孔底面积已经达到70～80％，购自Invitrogen公司)用无血清和双抗的Grace培养液轻洗三次，然后，每孔加入1mL新鲜的无血清和双抗的Grace培养液，将(3)中混合溶液轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在27℃条件下静置培养5～6h；
(5)将上述(4)静置培养结束后的每孔中的液体弃掉，加入2mL完全Grace培养液(含有双抗和10％血清)，27℃条件下静置培养48～72h，收集细胞上清液，用其感染新培养的Sf9细胞，提高重组杆状病毒滴度，反复接种2代后，显微镜下观察细胞状态，收集细胞上清液，得整合了牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因的重组杆状病毒，4℃保存备用。重组杆状病毒命名为AcMNPV-C-E0-E1-E2-P7。
将重组杆状病毒AcMNPV-C-E0-E1-E2-P7感染Sf9细胞，并于显微镜下观察细胞形态，结果如图1所示，重组杆状病毒AcMNPV-C-E0-E1-E2-P7在Sf9细胞产生明显的细胞病变，空白Sf9细胞未见病变。
实施例4牛病毒性腹泻病毒样颗粒的表达与鉴定
采用间接免疫荧光检测BVDV的C-E0-E1-E2-P7蛋白表达情况。用实施例3收集备用的AcMNPV-C-E0-E1-E2-P7和野生型杆状病毒分别感染96孔板培养的Sf9细胞(培养孔底壁约被细胞覆盖80％；MOI＝2)，在27℃条件下，细胞静置培养48～72h之后，吸掉上清液，轻轻用PBS溶液清洗细胞2次，弃净PBS溶液，每孔加入100μL体积分数为80％的预冷丙酮，在-20℃条件下，固定Sf9细胞2h，用PBST溶液清洗3次后，细胞与BVDV单克隆抗体(VMRD，348，PBS溶液1:500倍稀释)37℃反应2h；用PBST溶液清洗3次后，细胞与FITC标记的羊抗鼠二抗IgG37℃反应1h，用PBST溶液清洗3次后，最后，用荧光显微镜检测，结果如图2所示。
结果显示，AcMNPV-C-E0-E1-E2-P7感染的Sf9细胞展现出高强度的绿色荧光，相比之下，感染野生型杆状病毒的对照组细胞没有绿色荧光出现，表明重组杆状病毒表达了BVDV目的蛋白。
实施例5牛病毒性腹泻病毒样颗粒的培养与形态分析
1、牛病毒性腹泻病毒样颗粒的培养
悬浮草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞，按照常规贴壁培养或悬浮培养方法进行培养。无血清培养基或有血清培养基均可。有血清培养基的配制简述：Grace昆虫细胞培养基，1L培养基加入22.2g粉剂，边加边搅拌至950mL双蒸水中，加入0.35gNaHCO3，用1M NaOH调整pH至6.2，定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌，使用前加入10％灭活血清及双抗；无血清培养基购买成品。1.0×106cell/mL倍增传代，实施例3收集备用的重组杆状病毒按照MOI＝1进行接毒，观察细胞状态，4-5天后收集细胞培养产物。
2、牛病毒性腹泻病毒样颗粒的形态分析
采用电镜检测与分析牛病毒性腹泻病毒样颗粒的形态与结构。将上述细胞培养产物上清吸附到金属网上之后，用质量分数为1％的磷钨酸染色2-3min，然后，用滤纸吸掉金属网上的残余染色液，最后，利用电镜(JEM 1200EXII)观察与分析并记录实验结果，结果如图3所示。
采用免疫电镜进一步观察牛病毒性腹泻病毒样颗粒的形态与结构。将上述细胞培养产物上清吸附到金属网上，用TBST(25mM Tris-Cl,150mM NaCl,0.05％Tween 20,pH7.2)漂洗2次，滤纸吸净网上残余液后，将BVDV特异性抗体(VMRD，BA-26(a))与金属网37℃孵育30min，金属网以同样方法漂洗之后，与TBST稀释的金颗粒标记的蛋白A(A protein A-goldparticles)，直径10-15nm，37℃孵育30min，金属网被漂洗和滤纸处理之后，用质量分数为1％得磷钨酸染色2-3min，最后，用免疫电镜检测与分析，记录实验结果，结果如图4所示。
电镜结果显示，重组杆状病毒按照一定比例感染的Sf9细胞上清液中，可见到具有囊膜结构的球状病毒样颗粒，直径大小在30～100nm范围之内，其形态、结构、大小与文献报道的天然BVDV病毒粒子具有一致性。
免疫电镜结果显示，病毒样颗粒可以与BVDV特异性抗体结合，证明该颗粒为牛病毒性腹泻病毒样颗粒。
实施例6病毒样颗粒的免疫原性研究
1、病毒样颗粒对小鼠的免疫
将纯化的牛病毒性腹泻病毒样颗粒样品免疫小鼠。将健康雌性的BALB/c小鼠20只随机分成2组，每组10只小鼠，分别为空白组(Control)注射PBS，VLPs组注射病毒样颗粒，10μg/只。小鼠免疫2次，两次免疫间隔14d，免疫方法采用小鼠后肢肌肉注射。在加强免疫后不同时间，采集小鼠血液和脾脏，用于免疫指标检测与分析。
2、小鼠IFN-γ与IL-4酶联免疫斑点检测
第二次免疫后第2周，分离小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，具体方法如下：
(1)将小鼠用乙醚麻醉，断颈处死，置于75％乙醇浸泡10min；
(2)无菌取小鼠脾脏，置于70目细胞滤网中研磨，用1640-10％FBS冲洗滤网，并加入20mL红细胞裂解液，室温作用5min，2000rpm离心15min，将上清弃去；
(3)加入红细胞裂解液，重复裂解红细胞一次；
(4)用2mL 1640-10％FBS将细胞沉淀重悬，室温、2000rpm离心10min，弃上清，重复此步骤一次；
(5)用1640-10％FBS重悬脾细胞，适当稀释后进行细胞计数，将脾细胞密度调整至2.5×106cells/mL，备用。
利用预包被的鼠IFN-γ和IL-4ELISpot检测试剂盒对小鼠脾细胞分泌细胞因子情况进行检测，具体方法如下(均在生物安全柜内进行)：
(1)96孔ELISpot反应板用200μL/孔无菌PBS洗涤四次；
(2)加入1640-10％FBS，200μL/孔，室温孵育至少30min；
(3)加入脾细胞悬液(2.5×106cells/mL)，200μL/孔，加入终浓度为10μg/mL纯化的BVDV作为刺激物，同时设立不加刺激物的对照孔，密封ELISpot反应板，注意培养过程中不要挪动反应板，37℃、5％CO2培养36h；
(4)弃上清，用200μL/孔无菌PBS洗板5次，加入PBS-0.5％FBS，100μL/孔，PBS-0.5％FBS中含生物素标记的检测抗体，检测抗体终浓度为1μg/mL，室温孵育2h；
(5)弃上清，用200μL/孔无菌PBS洗板5次，加入PBS-0.5％FBS，100μL/孔，PBS-0.5％FBS中含以1:1000倍稀释的Streptavidin-ALP，室温孵育1h；
(6)弃上清，用200μL/孔无菌PBS洗板5次，加入底物溶液BCIP/NBT-plus(经0.45μm滤膜过滤)，100μL/孔，室温避光显色至出现清晰斑点；
(7)用大量清水冲洗ELISpot反应板终止显色，室温避光自然风干，酶联斑点图像自动分析仪对ELISpot反应板进行斑点形成细胞(spot-forming cells,SFCs)计数。
结果如图5所示，二免14d后的小鼠脾细胞被牛病毒性腹泻病毒样颗粒特异性抗原刺激后，VLPs组小鼠脾细胞产生的SFCs阳性数量显著高于(p<0.01)对照组。
与PBS组(Control)相比，VLPs能刺激免疫小鼠脾淋巴细胞产生增多的SFCs。由IL-4和IFN-γELISpot分析结果可看出与PBS组小鼠脾细胞产生的SFCs相比，VLPs免疫小鼠脾细胞所产生的SFCs数量显著增多，差异显著。从分析结果也可以看出，VLPs具有刺激免疫小鼠淋巴细胞分泌IL-4(图5A)和IFN-γ(图5B)的能力，同时具备促进体液免疫和细胞免疫的能力。
3、中和试验
病毒中和试验检测二免后第14d免疫小鼠血清中抗体的中和活性。在进行中和试验过程中，首先，将加热灭活完全的小鼠血清进行1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512倍比稀释；然后，取每个稀释度的每组免疫小鼠血清分别加到96孔板中，50μL/孔，每个平行组设3个复孔，然后，在每孔中加入100个TCID50BVDV溶液，振荡混匀，37℃反应1h后，将MDBK细胞悬液(5×105cell/mL，采用含有10％FBS的DMEM细胞培养液配制)加入96孔板中，100μL/孔，轻轻振荡混匀后，细胞在37℃、5％CO2条件下，静置培养72h。丙酮固定过夜，然后按照实施例4的染色步骤进行免疫荧光染色。最后，用荧光显微镜检测结果，结果如图6所示。以PBS进行上述中和试验作为对照组。
抗体中和活性采用下述公式计算：
抗体中和活性﹦(免疫组表达绿色荧光的细胞数-对照组表达绿色荧光的细胞数)/对照组表达绿色荧光的细胞数×100％。
结果显示，PBS对照组小鼠血清中未检测到特异性IgG抗体与中和抗体。VLPs组小鼠首免两周后(第2周)，小鼠血清中检测到特异性IgG抗体与中和抗体，平均效价为1:80(图6)；再次免疫后两周(第4周)，免疫小鼠体内抗体反应增强，血清中特异性IgG抗体与中和抗体效价明显升高，平均效价提高至1:208(图6)，与首次免疫抗体效价差异显著。因此，中和试验结果表明VLPs能够诱导小鼠产生中和抗体，并且具有较强的中和作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒及其构建方法与应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2910
<212> DNA
<213> Bovine viral diarrhea virus
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atgtccgaca caaaagatga aggggtggtg aggaagaagc aacaaaagcc agataggttg 60
gaaaagggga gaatgaagat aacacctaag gagtcagaga aagacagtaa gaccaagccg 120
ccagatgcta cgatagtggt agatggagtc aagtatcagg taaagaaaaa aggaaaagtc 180
aagagcaaga acacccagga cggcttatac cacaacaaaa ataaacctca agagtcgcgc 240
aagaaactag agaaagccct attggcctgg gcaataatag ccctggtttt ctttcaagtc 300
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gtcatactta tataccacat catagtaatg catcctctaa aatcggtgac ggtgatattg 2880
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<211> 969
<212> PRT
<213> Bovine viral diarrhea virus
<400> 2
Met Ser Asp Thr Lys Asp Glu Gly Val Val Arg Lys Lys Gln Gln Lys
1 5 10 15
Pro Asp Arg Leu Glu Lys Gly Arg Met Lys Ile Thr Pro Lys Glu Ser
20 25 30
Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr Ile Val Val Asp
35 40 45
Gly Val Lys Tyr Gln Val Lys Lys Lys Gly Lys Val Lys Ser Lys Asn
50 55 60
Thr Gln Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro Gln Glu Ser Arg
65 70 75 80
Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Ile Ile Ala Leu Val
85 90 95
Phe Phe Gln Val Thr Met Gly Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu Gln
100 105 110
Asp Asn Gly Thr Glu Gly Ile Gln Arg Ala Met Phe Gln Arg Gly Val
115 120 125
Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile Cys Thr Gly Val
130 135 140
Pro Ser His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Ala Ile His Gly Met
145 150 155 160
Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Arg
165 170 175
His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Glu Pro
180 185 190
Trp Ile Leu Leu Met Asn Lys Thr Gln Ala Asn Leu Thr Glu Gly Gln
195 200 205
Pro Leu Arg Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Arg Asp Ser Asp
210 215 220
Leu Asn Val Val Thr Gln Ala Arg Asp Ser Pro Thr Pro Leu Thr Gly
225 230 235 240
Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Ile Leu Val Gln Gly
245 250 255
Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Val Ser Asp Val Leu Phe Lys Glu His
260 265 270
Asp Cys Thr Ser Val Ile Gln Asp Thr Ala His Tyr Leu Val Asp Gly
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Met Thr Asn Ser Leu Glu Ser Ala Arg Gln Gly Thr Ala Lys Leu Thr
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Thr Trp Leu Gly Arg Gln Leu Gly Ile Leu Gly Lys Lys Leu Glu Asn
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Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Ala Ser Pro Tyr Cys Glu
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Ala Cys Leu Pro Arg Asn Thr Lys Ile Ile Gly Pro Gly Arg Phe Asp
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Thr Asn Ala Glu Asp Gly Lys Ile Leu His Glu Met Gly Gly His Leu
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Ser Glu Val Leu Leu Leu Ser Val Val Val Leu Ser Asp Phe Ala Pro
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Glu Thr Ala Ser Val Ile Tyr Leu Ile Leu His Phe Ser Ile Pro Gln
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Gly His Thr Asp Ile Gln Asp Cys Asp Lys Asn Gln Leu Asn Leu Thr
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Val Glu Leu Thr Thr Ala Glu Val Ile Pro Gly Ser Val Trp Asn Leu
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Thr Val Leu Val Ile Glu Glu Val Gly Gln Val Ile Lys Val Val Leu
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Arg Ala Leu Lys Asp Leu Thr Arg Ile Trp Thr Ala Ala Thr Thr Thr
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Ala Phe Leu Val Cys Leu Val Lys Val Val Arg Gly Gln Val Leu Gln
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Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Arg
165 170 175
His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Glu Pro
180 185 190
Trp Ile Leu Leu Met Asn Lys Thr Gln Ala Asn Leu Thr Glu Gly Gln
195 200 205
Pro Leu Arg Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Arg Asp Ser Asp
210 215 220
Leu Asn Val Val Thr Gln Ala Arg Asp Ser Pro Thr Pro Leu Thr Gly
225 230 235 240
Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Ile Leu Val Gln Gly
245 250 255
Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Val Ser Asp Val Leu Phe Lys Glu His
260 265 270
Asp Cys Thr Ser Val Ile Gln Asp Thr Ala His Tyr Leu Val Asp Gly
275 280 285
Met Thr Asn Ser Leu Glu Ser Ala Arg Gln Gly Thr Ala Lys Leu Thr
290 295 300
Thr Trp Leu Gly Arg Gln Leu Gly Ile Leu Gly Lys Lys Leu Glu Asn
305 310 315 320
Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Ala Ser Pro Tyr Cys Glu
325 330 335
Val Glu Arg Lys Leu Gly Tyr Ile Trp Tyr Thr Lys Asn Cys Thr Pro
340 345 350
Ala Cys Leu Pro Arg Asn Thr Lys Ile Ile Gly Pro Gly Arg Phe Asp
355 360 365
Thr Asn Ala Glu Asp Gly Lys Ile Leu His Glu Met Gly Gly His Leu
370 375 380
Ser Glu Val Leu Leu Leu Ser Val Val Val Leu Ser Asp Phe Ala Pro
385 390 395 400
Glu Thr Ala Ser Val Ile Tyr Leu Ile Leu His Phe Ser Ile Pro Gln
405 410 415
Gly His Thr Asp Ile Gln Asp Cys Asp Lys Asn Gln Leu Asn Leu Thr
420 425 430
Val Glu Leu Thr Thr Ala Glu Val Ile Pro Gly Ser Val Trp Asn Leu
435 440 445
Gly Lys Tyr Val Cys Val Arg Pro Asp Trp Trp Pro Tyr Glu Thr Ala
450 455 460
Thr Val Leu Val Ile Glu Glu Val Gly Gln Val Ile Lys Val Val Leu
465 470 475 480
Arg Ala Leu Lys Asp Leu Thr Arg Ile Trp Thr Ala Ala Thr Thr Thr
485 490 495
Ala Phe Leu Val Cys Leu Val Lys Val Val Arg Gly Gln Val Leu Gln
500 505 510
Gly Ile Leu Trp Leu Met Leu Ile Thr Gly Ala Gln Gly Tyr Pro Asp
515 520 525
Cys Lys Pro Gly Phe Ser Tyr Ala Ile Ala Lys Asn Asp Glu Ile Gly
530 535 540
Pro Leu Gly Ala Thr Gly Leu Thr Thr Gln Trp Tyr Glu Tyr Ser Asp
545 550 555 560
Gly Met Arg Leu Gln Asp Ser Val Val Glu Val Trp Cys Lys Asn Gly
565 570 575
Glu Ile Lys Tyr Leu Ile Arg Cys Gly Arg Glu Ala Arg Tyr Leu Ala
580 585 590
Val Leu His Thr Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Val Phe Glu Lys Ile
595 600 605
Phe Asp Gly Lys Glu Gln Glu Asp Ile Val Glu Met Asp Asp Asn Phe
610 615 620
Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Arg Pro Leu Ile Arg Gly Lys
625 630 635 640
Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln Met Val Cys Pro
645 650 655
Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val Ser Cys Thr Leu Ala Asn Lys Asp Thr
660 665 670
Leu Ala Thr Ile Val Val Arg Thr Tyr Lys Arg Val Arg Pro Phe Pro
675 680 685
Tyr Arg Gln Asp Cys Val Thr Gln Lys Thr Ile Gly Glu Asp Leu Tyr
690 695 700
Asp Cys Ala Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Pro Gly Asp Ala Leu
705 710 715 720
Arg Tyr Val Ala Gly Pro Val Glu Ser Cys Glu Trp Cys Gly Tyr Lys
725 730 735
Phe Leu Lys Ser Glu Gly Leu Pro His Phe Pro Ile Gly Lys Cys Arg
740 745 750
Leu Lys Asn Glu Ser Gly Tyr Arg Gln Val Asp Glu Thr Ser Cys Asn
755 760 765
Arg Asn Gly Val Ala Ile Val Pro Ser Gly Thr Val Lys Cys Lys Ile
770 775 780
Gly Asp Thr Val Val Gln Val Ile Ala Met Asp Asp Lys Leu Gly Pro
785 790 795 800
Met Pro Cys Lys Pro His Glu Ile Ile Ser Ser Glu Gly Pro Val Glu
805 810 815
Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Arg Thr Leu Lys Asn Lys Tyr
820 825 830
Phe Glu Pro Arg Asp Asn Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu
835 840 845
Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Ile Thr Asp His His Arg Asp Tyr
850 855 860
Phe Ala Glu Ser Leu Leu Val Ile Val Val Ala Leu Leu Gly Gly Arg
865 870 875 880
Tyr Val Leu Trp Leu Leu Val Thr Tyr Met Ile Leu Ser Glu Gln Met
885 890 895
Ala Ser Gly Val Gln Tyr Gly Ala Gly Glu Ile Val Met Met Gly Asn
900 905 910
Leu Leu Thr His Asp Ser Val Glu Val Val Thr Tyr Phe Leu Leu Leu
915 920 925
Tyr Leu Leu Leu Arg Glu Glu Asn Thr Lys Lys Trp Val Ile Leu Ile
930 935 940
Tyr His Ile Ile Val Met His Pro Leu Lys Ser Val Thr Val Ile Leu
945 950 955 960
Leu Met Val Gly Gly Met Ala Lys Ala
965

Claims (8)

1.一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒样颗粒为具有囊膜结构的球状颗粒，直径大小为30～100nm，其编码基因为牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因经优化合成的C-E0-E1-E2-P7基因，所述C-E0-E1-E2-P7基因的原始核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化合成后的C-E0-E1-E2-P7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒样颗粒的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因经优化合成C-E0-E1-E2-P7基因，所述C-E0-E1-E2-P7基因的原始核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化合成后的C-E0-E1-E2-P7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
其中，所述C-E0-E1-E2-P7基因的原始核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，优化合成后的C-E0-E1-E2-P7基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
(2)将步骤(1)优化合成后的C-E0-E1-E2-P7基因插入到杆状病毒表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒，即得整合了牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因的重组杆状病毒Bacmid质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得整合了牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因的重组杆状病毒；
(4)将步骤(3)获得的整合了牛病毒性腹泻病毒C-E0-E1-E2-P7基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后收获混合物，经纯化，制得牛病毒性腹泻病毒样颗粒。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述杆状病毒表达载体为pFastBac1。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组杆状病毒为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒rAcMNPV。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中，所述昆虫细胞为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞系。
6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述培养采用常规贴壁培养或悬浮培养。
7.权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒样颗粒在制备牛病毒性腹泻疫苗中的应用。
8.权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒样颗粒在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻黏膜病的药物中的应用。
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