CN108329394A

CN108329394A - 一种鸭短喙矮小综合征疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN108329394A
Application number: CN201810089279.3A
Authority: CN
Inventors: 夏振强; 金宏丽; 石晶; 殷玉和; 刘迪
Original assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHANGCHUN SR BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2018-07-27

Abstract

本发明提供了一种鸭短喙矮小综合征疫苗及其制备方法，是将优化后的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2基因与白介素‑2基因融合表达，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒。将所述鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒与防腐剂和佐剂混合，制备得到鸭短喙矮小综合征疫苗。本发明的鸭短喙矮小综合征疫苗具有产量高、生产成本低、免疫原性强、安全性好、便于大规模生产等优点，对鸭短喙矮小综合征具有良好的免疫预防效果。

Description

一种鸭短喙矮小综合征疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及在制备疫苗中的应用。

背景技术

2015年以来，福建、安徽、山东、河南、江苏和浙江等省的半番鸭和樱桃谷鸭暴发流行一种以软脚、短嘴、舌头外露、易骨折、生长障碍、羽毛生长不良等为临床特征的新疫病(俗称“短嘴鸭”、“长舌鸭”、“玻璃鸭”、“大舌鸭”等，暂名“鸭短喙矮小综合征”)，发病率10％～100％，死亡率2％～10％，僵鸭淘汰率20％～80％，给养鸭业造成很大的经济损失。经流行病学调查、病原分离和全面系统鉴定(电镜形态、动物回归、基因组序列、理化生物学特性、血清学等)，率先明确了该病病原为新型鹅细小病毒或鹅细小病毒变异株，鉴于该病以短喙和生长障碍为临床特征，暂将该病毒命名为短嘴型小鹅瘟病毒或短喙矮小综合征鹅细小病毒(Short beak and dwarfism syndrome goose parvovirus,SBDS-GPV)。

至今该病无特效治疗药物，而疫苗是预防和控制病毒病的有效措施。由于鸭短喙矮小综合征病毒流行株基因序列与传统小鹅瘟毒株存在较大差异，因此现有的鹅细小病毒疫苗和卵黄抗体对本病虽有一些交叉保护，仍不能有效防控和净化鸭短喙矮小综合征。目前市场上尚没有针对鸭短喙矮小综合征的疫苗。

白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)是一种细胞因子，主要由T细胞和自然杀伤性细胞产生，具有激活淋巴因子活化的生物学活性，可刺激T辅助细胞和自然杀伤细胞产生细胞因子和促进细胞因子的繁殖，在机体免疫应答中起重要作用。哺乳动物的IL-2研究较早，但由于种属特异性，禽类的IL-2研究较为滞后。本发明拟将番鸭IL-2与SBDS-GPV VP2融合表达，构建重组VLPs，在模拟野生型病毒空间构象的同时，促进抗原特异性免疫应答效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用。

本发明的另一目的是提供一种鸭短喙矮小综合征疫苗、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒。

本发明首先提供一种融合蛋白，由IL-2融合表达于鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2蛋白N端组成，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供编码上述融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，该基因中编码鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2蛋白的基因序列根据昆虫细胞偏爱进行密码子优化。

本发明还提供一种鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2基因进行优化，将SEQ ID NO.6所示的鸭IL-2基因与优化的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2基因插入到昆虫细胞表达载体中，转化DH10Bac感受态，提取重组杆状病毒基因组；(2)将重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，按MOI＝0.1-1接种昆虫细胞，4-5天后收获混合物，即得鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒。

所述优化的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述鸭IL-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

其中所述的昆虫细胞表达载体选自pFastBac1、pFastBac HT、pFastBac Dual、pFastBac1-Gus、pFastBac HT-GAT、pFastBacDual-Gus/GAT，更优选为pFastBac Dual。

其中所述的昆虫细胞选自Sf9、Sf21、High Five、Tn-368、BTI-TN-5B1-4，更优选为Sf9。

本发明还提供所述鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒在制备鸭短喙矮小综合征疫苗中的应用。

本发明还提供一种鸭短喙矮小综合征疫苗，其是将上述制备的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成。其中，所述防腐剂为硫柳汞，优选终浓度为0.005％；所述佐剂为油佐剂。本发明的鸭短喙矮小综合征疫苗为肌肉或皮下注射疫苗。

本发明进一步提供上述制备的鸭短喙矮小综合征疫苗在预防鸭短喙矮小综合征中的应用。

本发明将鸭IL-2融合表达于密码子优化的SBDS-GPV VP2蛋白中，构建重组VLPs，属于国内外首次报道，获得的SBDS-GPV病毒样颗粒不仅可以增强免疫效果，也可弥补在后期纯化中，存在两种目的抗原不方便纯化的不足。本发明以杆状病毒作为表达载体，以Sf9细胞作为生物反应器，制备的鸭短喙矮小综合征疫苗具有滴度高、免疫原性高、安全性好、便于大规模生产等优点，肌肉免疫可诱导机体产生高水平的特异性抗体，对鸭短喙矮小综合征具有良好的免疫及预防效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后的情况；其中，A为正常细胞孔，B为病毒感染孔。

图2为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后间接免疫荧光检测结果；其中，A为病毒感染孔，B为正常细胞孔。

图3为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原的SDS-PAGE鉴定结果；其中，泳道1为实施例1的重组杆状病毒感染细胞收获的抗原，泳道2为蛋白Marker，泳道3为空杆状病毒感染细胞收获的抗原。

图4为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后收获抗原的电镜观察结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒的制备及鉴定

对福建省农业科学院畜牧兽医研究所病毒室分离的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒M15株进行测序，获得VP2序列，VP2序列为非经典的ACG起始，将其更改为经典的ATG起始密码子。再根据Sf9细胞偏爱性进行优化，并送公司进行基因合成。优化后的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2序列如SEQ ID NO.3所示。

对优化后的序列，使用引物(SEQ ID NO.4-5所示)进行扩增VP2基因，通过PstI-HindIII连入pFastBac Dual载体的pH MCS中，再在VP2N端通过RsrII-PstI引入IL-2基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。通过PCR将IL-VP2基因扩增(引物如SEQ IDNO.7-8所示)，利用SmaI-XhoI连入p10MCS处，最终获得携带有双拷贝外源片段的转移载体。将转移载体转化DH10Bac感受态进行重组，获得携带有双拷贝外源片段的重组杆状病毒基因组Bacmid。将Bacmid转染Sf9细胞后，拯救获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染Sf9细胞，可产生明显的细胞病变，如体积增大、细胞脱落、细胞内颗粒增多(图1)。对24孔板中已长单层的Sf9细胞接种重组杆状病毒，48h后使用针对抗GPV特异性单克隆抗体(由福建省农业科学院畜牧兽医研究所病毒室制备)进行间接免疫荧光检测，可见有特异性的亮绿色荧光(图2)，表明可成功表达目的蛋白。

将重组杆状病毒按MOI＝0.1接毒量接种悬浮培养的Sf9细胞，接毒后4天收获抗原，对抗原进行SDS-PAGE检测，结果可见有目的蛋白条带(图3)。对抗原负染后，进行电镜观察，结果可见有直径20-25nm的病毒样颗粒，形态与天然病毒相似(图4)，表明表达的目的蛋白可成功组装成病毒样颗粒。以乳胶凝集试验测定收获抗原凝集价为1:2⁶，效价高于利用鸭胚生产活病毒的效价(1:2⁴)。

实施例2雏鸭免疫试验

将实施例1制得的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒以PBS进行稀释，使其乳胶凝集效价为1:2⁴，按终浓度0.005％比例加入硫柳汞，抗原和油佐剂按1:1.5的混合后乳化制成病毒样颗粒疫苗，于4℃保存。再将鸭胚尿囊液毒灭活后制备的抗原(乳胶凝集效价为1:2⁴)和油佐剂按1:1.5的混合后乳化制成病毒样颗粒疫苗，于4℃保存。

将18羽8日龄雏鸭随机分为3组，每组6羽，分别为A组免疫病毒样颗粒疫苗0.3ml/羽，B组免疫全病毒灭活疫苗组0.3ml/羽，C组对照组不免疫。并于免疫前、免疫后14天、21天、28天分别采血，分离血清，应用乳胶凝集抑制试验(LPAI)测定血清中的GPV LPAI抗体效价。

结果显示(表1)，免疫后14天，病毒样颗粒疫苗组和全病毒灭活疫苗组均能刺激机体产生高滴度的病毒特异性抗体，免疫后28天，抗体仍能维持较高水平。而健康对照组的抗GPV LPAI抗体均为阴性。

表1免疫后不同时间血清中的LPAI抗体效价

本发明通过大量实验发现并确认，将鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒表达VP2基因密码子优化后与鸭白介素-2基因融合表达，其能够高水平地表达外源蛋白，正确包装成病毒样颗粒，以乳胶凝集试验测定病毒样颗粒的抗原效价可达1:2⁶，产量为常规方法(利用鸭胚生产病毒)产量的4倍。本发明提供的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒以及相关的表达系统可安全、高效、大规模的生产鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒，且所得病毒样颗粒滴度高、免疫原性好，免疫雏鸭可诱导产生较高水平的特异性抗体，对雏鸭提供很好的保护作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 长春西诺生物科技有限公司

<120> 一种鸭短喙矮小综合征疫苗及其制备方法

<130> KHP181110244.2

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 728

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Cys Lys Val Leu Ile Phe Ser Cys Leu Ser Val Leu Met Leu Met

1 5 10 15

Thr Thr Ala Tyr Gly Ala Pro Leu Ser Glu Lys Asp Asn Thr Leu Thr

20 25 30

Thr Leu Ile Lys Asp Leu Glu Asn Leu Gly Thr Ser Met Asn Gly Ile

35 40 45

Asp Leu Glu Leu Tyr Thr Pro Asn Asp Thr Lys Glu Cys Ser Trp Gln

50 55 60

Thr Leu Gln Cys Tyr Leu Lys Glu Ile Val Thr Leu Glu Lys Glu Ile

65 70 75 80

Glu Asp Glu Asp Glu Ile Glu Asp Glu Asn Val Ser Ser Val Arg Asn

85 90 95

Ile Lys Met Asn Leu Gln Lys Leu Met Asp Leu Ile Pro Pro Arg Thr

100 105 110

Gly Cys Asn Ile Cys Glu Ala Asn Ala Lys Asn Phe Pro Glu Phe Arg

115 120 125

Arg Glu Leu Thr Asn Phe Leu Arg Ser Met Leu Lys Leu Gln Ala Pro

130 135 140

Ala Lys Lys Asn Thr Gly Lys Leu Thr Asp His Tyr Pro Val Val Lys

145 150 155 160

Lys Pro Lys Leu Thr Glu Glu Val Ser Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ala

165 170 175

Val Gln Asp Gly Gly Ala Thr Ala Glu Gly Thr Glu Pro Val Ala Ala

180 185 190

Ser Glu Met Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ala Met Gly Asp Ser Ser Gly

195 200 205

Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser

210 215 220

Gln Trp Met Gly Asn Thr Val Ile Thr Lys Thr Thr Arg Thr Trp Val

225 230 235 240

Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His Ile Tyr Lys Ala Ile Thr Ser Gly Thr

245 250 255

Ala Gln Asp Ala Asn Val Gln Tyr Ala Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly

260 265 270

Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp

275 280 285

Gln Arg Leu Ile Asn Asn His Trp Gly Ile Arg Pro Lys Ser Leu Lys

290 295 300

Phe Lys Ile Phe Asn Val Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Gln Asp Gln

305 310 315 320

Thr Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr

325 330 335

Asp Asp Glu His Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala Thr Glu Gly

340 345 350

Thr Met Pro Pro Phe Pro Ser Asp Val Tyr Ala Leu Pro Gln Tyr Gly

355 360 365

Tyr Cys Thr Met His Thr Asn Gln Asn Gly Ala Arg Phe Asn Asp Arg

370 375 380

Ser Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr

385 390 395 400

Gly Asn Asn Phe Glu Phe Thr Phe Asp Phe Glu Glu Val Pro Phe His

405 410 415

Ser Met Phe Ala His Ser Gln Asp Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu

420 425 430

Val Asp Gln Tyr Leu Trp Asn Phe Asn Glu Val Asp Ser Asn Arg Asn

435 440 445

Ala Gln Phe Lys Lys Ala Val Lys Gly Ala Tyr Gly Thr Met Gly Arg

450 455 460

Asn Trp Leu Pro Gly Pro Lys Phe Leu Asp Gln Arg Val Arg Ala Tyr

465 470 475 480

Thr Gly Gly Thr Asp Asn Tyr Ala Asn Trp Asn Ile Trp Ser Asn Gly

485 490 495

Asn Lys Val Asn Leu Lys Asp Arg Gln Tyr Pro Leu Gln Pro Gly Pro

500 505 510

Val Ser Ala Thr His Thr Glu Ala Glu Ala Ser Ser Ile Pro Ala Gln

515 520 525

Asn Ile Leu Gly Leu Ala Lys Asp Pro Tyr Arg Ser Gly Ser Thr Ala

530 535 540

Ala Gly Ile Ser Asp Ile Met Val Thr Asp Glu Gln Glu Val Ala Pro

545 550 555 560

Thr Asn Gly Val Gly Trp Lys Pro Tyr Gly Lys Thr Val Met Asn Glu

565 570 575

Gln Asn Thr Thr Arg Ala Pro Thr Ser Ser Asp Leu Asp Val Leu Gly

580 585 590

Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Ile Tyr Leu Gln Gly

595 600 605

Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Lys Thr Asp Gly Lys Phe His Pro Ser

610 615 620

Pro Asn Leu Gly Gly Phe Gly Leu His Asn Pro Pro Pro Gln Val Phe

625 630 635 640

Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Leu Glu Tyr Val Asn

645 650 655

Gln Lys Trp Asn Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Cys Thr

660 665 670

Val Glu Met Val Trp Glu Leu Arg Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn

675 680 685

Pro Glu Ile Gln Phe Thr Ser Asn Phe Gly Asn Arg Thr Ser Thr Met

690 695 700

Phe Ala Pro Ser Glu Thr Gly Gly Tyr Val Glu Asp Arg Leu Ile Gly

705 710 715 720

Thr Arg Tyr Leu Thr Gln Asn Leu

725

<210> 2

<211> 2187

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtgcaaag tactcatctt cagctgcctt tcagtactaa tgcttatgac tacagcttat 60

ggagcacctc tatcagagaa agacaacact cttacaactt taataaaaga tttagaaaac 120

ctgggaacaa gcatgaatgg gattgatctt gagctctaca caccaaatga cacaaaggag 180

tgcagctggc aaactctgca atgttacttg aaagaaatag tcaccttgga gaaagaaatt 240

gaagatgaag atgaaattga agatgagaac gtatctagtg ttcggaatat caaaatgaat 300

ctccaaaaac ttatggacct aattccccca agaacgggat gcaatatctg tgaagctaat 360

gccaagaact tccctgaatt tcgccgagag ctgaccaact tcctgagatc tatgctaaaa 420

ctgcaggctc ctgctaagaa gaacaccgga aagctcaccg atcactaccc agtcgtcaag 480

aagcctaagc tcacagaaga agtcagtgct ggcggtggta gtagcgctgt ccaggatggt 540

ggagctacag ctgaaggtac tgaacctgtt gccgctagtg aaatggctga gggaggtgga 600

ggtgctatgg gagatagttc aggtggagcc gatggagtgg gaaacgcttc tggaaactgg 660

cattgcgatt ctcaatggat gggaaacaca gttatcacca agaccacccg cacatgggtc 720

ttgccttctt acaacaacca catctacaag gccatcacca gcggcactgc tcaggatgct 780

aacgttcagt atgccggata ctccacacct tggggttact tcgacttcaa ccgcttccac 840

tgccatttct cccctaggga ctggcaacgt ttgatcaata accactgggg catcaggcct 900

aagtccctca agttcaagat cttcaacgtg caggtcaagg aagtcaccac ccaggaccag 960

accaagacta tcgccaacaa cctcaccagc accatccagg tgttcaccga cgacgaacac 1020

cagttgccat acgtcctggg atctgctaca gaaggtacca tgccaccatt cccaagcgat 1080

gtctacgctc tgccacaata cggttactgc accatgcaca caaaccagaa tggcgctagg 1140

ttcaatgacc gttccgcttt ctactgtctg gagtacttcc cctcccagat gctgagaacc 1200

ggtaacaact tcgagttcac cttcgatttc gaggaagtgc ccttccacag catgttcgcc 1260

cacagccagg atctcgatcg tctcatgaac ccactggttg accagtacct ctggaacttc 1320

aacgaggtgg actccaaccg taacgctcaa ttcaagaagg ccgtcaaagg tgcctacgga 1380

acaatgggca gaaattggct gcccggacct aagttcctgg accaacgtgt gagggcttac 1440

actggaggaa cagacaacta cgctaactgg aacatctggt ccaacggcaa caaggtgaat 1500

ctcaaagacc gccaataccc cctgcaaccc ggtcctgtgt cagctactca caccgaagcc 1560

gaagcctcat caatcccagc ccagaatatc ttgggtctgg ccaaagaccc ttaccgttct 1620

ggtagcacag ccgccggtat ttctgacatt atggtgactg acgaacaaga ggtggcccct 1680

acaaacggtg ttggttggaa gccatacggc aagactgtta tgaacgagca gaacactact 1740

cgtgccccta cttcttccga cctcgacgtt ttgggtgcct tgccaggcat ggtttggcag 1800

aatcgtgaca tctacctgca aggccctatt tgggccaaga tcccaaagac tgacggcaaa 1860

tttcaccctt ctccaaacct gggcggcttt ggcctgcata acccaccccc ccaagttttt 1920

attaagaaca ctcccgtgcc cgccgacccc cccctggaat atgttaacca gaaatggaac 1980

tcatacatca cacaatacag cacaggccaa tgtactgtgg agatggtgtg ggagctccgc 2040

aaagagaact ccaagcgctg gaaccccgag atccaattca catcaaactt tggcaatcgc 2100

acaagcacta tgtttgcccc ctcagagact ggcggctacg ttgaggaccg cctgatcggc 2160

acacgctacc tcactcagaa tctgtaa 2187

<210> 3

<211> 1764

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctcctg ctaagaagaa caccggaaag ctcaccgatc actacccagt cgtcaagaag 60

cctaagctca cagaagaagt cagtgctggc ggtggtagta gcgctgtcca ggatggtgga 120

gctacagctg aaggtactga acctgttgcc gctagtgaaa tggctgaggg aggtggaggt 180

gctatgggag atagttcagg tggagccgat ggagtgggaa acgcttctgg aaactggcat 240

tgcgattctc aatggatggg aaacacagtt atcaccaaga ccacccgcac atgggtcttg 300

ccttcttaca acaaccacat ctacaaggcc atcaccagcg gcactgctca ggatgctaac 360

gttcagtatg ccggatactc cacaccttgg ggttacttcg acttcaaccg cttccactgc 420

catttctccc ctagggactg gcaacgtttg atcaataacc actggggcat caggcctaag 480

tccctcaagt tcaagatctt caacgtgcag gtcaaggaag tcaccaccca ggaccagacc 540

aagactatcg ccaacaacct caccagcacc atccaggtgt tcaccgacga cgaacaccag 600

ttgccatacg tcctgggatc tgctacagaa ggtaccatgc caccattccc aagcgatgtc 660

tacgctctgc cacaatacgg ttactgcacc atgcacacaa accagaatgg cgctaggttc 720

aatgaccgtt ccgctttcta ctgtctggag tacttcccct cccagatgct gagaaccggt 780

aacaacttcg agttcacctt cgatttcgag gaagtgccct tccacagcat gttcgcccac 840

agccaggatc tcgatcgtct catgaaccca ctggttgacc agtacctctg gaacttcaac 900

gaggtggact ccaaccgtaa cgctcaattc aagaaggccg tcaaaggtgc ctacggaaca 960

atgggcagaa attggctgcc cggacctaag ttcctggacc aacgtgtgag ggcttacact 1020

ggaggaacag acaactacgc taactggaac atctggtcca acggcaacaa ggtgaatctc 1080

aaagaccgcc aataccccct gcaacccggt cctgtgtcag ctactcacac cgaagccgaa 1140

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gcccctactt cttccgacct cgacgttttg ggtgccttgc caggcatggt ttggcagaat 1380

cgtgacatct acctgcaagg ccctatttgg gccaagatcc caaagactga cggcaaattt 1440

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tacatcacac aatacagcac aggccaatgt actgtggaga tggtgtggga gctccgcaaa 1620

gagaactcca agcgctggaa ccccgagatc caattcacat caaactttgg caatcgcaca 1680

agcactatgt ttgccccctc agagactggc ggctacgttg aggaccgcct gatcggcaca 1740

cgctacctca ctcagaatct gtaa 1764

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taactgcagg ctcctgctaa gaagaacacc 30

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tataagctta cagattctga gtgaggtagc gt 32

<210> 6

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtgcaaag tactcatctt cagctgcctt tcagtactaa tgcttatgac tacagcttat 60

ggagcacctc tatcagagaa agacaacact cttacaactt taataaaaga tttagaaaac 120

ctgggaacaa gcatgaatgg gattgatctt gagctctaca caccaaatga cacaaaggag 180

tgcagctggc aaactctgca atgttacttg aaagaaatag tcaccttgga gaaagaaatt 240

gaagatgaag atgaaattga agatgagaac gtatctagtg ttcggaatat caaaatgaat 300

ctccaaaaac ttatggacct aattccccca agaacgggat gcaatatctg tgaagctaat 360

gccaagaact tccctgaatt tcgccgagag ctgaccaact tcctgagatc tatgctaaaa 420

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taacccggga tgtgcaaagt actcatcttc agct 34

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tatctcgagt tacagattct gagtgaggta gcgt 34

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，由IL-2融合表达于鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2蛋白N端组成，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2基因进行优化，将IL-2基因与优化后的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2基因插入到昆虫细胞表达载体中，转化感受态，提取重组杆状病毒基因组；所述IL-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(2)将重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，按MOI＝0.1-1接种昆虫细胞，4-5天后收获混合物，即得鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的昆虫细胞表达载体选自pFastBac1、pFastBac HT、pFastBac Dual、pFastBac1-Gus、pFastBac HT-GAT、pFastBacDual-Gus/GAT。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的昆虫细胞选自Sf9、Sf21、HighFive、Tn-368、BTI-TN-5B1-4。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述优化后的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒VP2基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

7.由权利要求3-6任一所述的方法制备得到的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒。

8.权利要求7所述的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒在鸭短喙矮小综合征疫苗的制备中的用途。

9.一种鸭短喙矮小综合征疫苗，其特征在于，将权利要求7所述的鸭短喙矮小综合征鹅细小病毒病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成。

10.根据权利要求9所述的鸭短喙矮小综合征疫苗，其特征在于，所述防腐剂为硫柳汞，终浓度为0.005％；所述佐剂为油佐剂；所述疫苗为肌肉或皮下注射疫苗。