CN113398259A - 一种h9n2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用 - Google Patents

一种h9n2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于疫苗研制技术领域，具体为一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用，该VLPs由H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白和M1蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；因为该VLPs免疫后仅能刺激机体产生特异性的H9N2亚型禽流感病毒的HA抗体和M1抗体，而不会产生针对H9N2亚型禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS的抗体，所以其可以作为标记疫苗用于区分临床上H9N2亚型禽流感病毒的野毒感染和灭活疫苗免疫；因此，利用该VLPs进行免疫，可以为H9N2亚型禽流感的净化提供技术支持。

Description

一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及疫苗研制技术领域，具体为一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用。
背景技术
禽流感是由A型流感病毒感染引起的家禽和野生禽类的高度接触性传染病。根据禽流感病毒致病性的高低，可以将禽流感分为高致病性、低致病性和非致病性。引起H9N2亚型禽流感的病原属于低致病性流感病毒，虽然其致死率不高，但常导致家禽呼吸道症状、产蛋率下降，且容易引起并发感染，给养禽业造成严重的经济损失。疫苗免疫是预防禽流感最有效和最经济的手段，对提高我国的禽病防制水平，保障我国养禽业的健康发展具有十分积极的意义。目前国内用来预防H9N2亚型禽流感的疫苗主要是灭活疫苗。灭活疫苗制备技术有其优点，但亦存在着很大的缺陷。由于禽流感病毒易突变，且双重及多重亚型病毒之间易发生遗传物质重组及抗原漂移，使灭活疫苗的长期安全性及有效性受到了极大挑战，难以应付新的突变型禽流感病毒的传染，因此研制更有效的疫苗来预防和控制H9N2亚型禽流感至关重要。
由于病毒样颗粒疫苗的免疫效果及其安全性优于灭活疫苗，因此成为近年的研究热点。病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，安全性高，可模拟病毒粒子的天然结构，能够激活细胞免疫和体液免疫，诱导的免疫保护更为全面。利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产VLP疫苗。由于杆状病毒表达系统不依赖鸡胚生产，能够保证禽流感大流行时疫苗的充足供应，且具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势，因此利用杆状病毒表达系统生产的VLP疫苗具有较大的应用潜力。
前期研究发现利用流感病毒的四种蛋白，即M1、M2、NA和HA，可以组装形成流感病毒VLPs，因此，当时对流感病毒VLPs的相关研究主要集中在这四种结构蛋白上面。后来研究表明，用流感糖蛋白(单独HA或HA和NA)和基质蛋白M1构建的禽流感VLPs，同样能够刺激机体产生大量的特异性抗体，且被免疫的实验动物均能抵抗同源或异源同亚型病毒的攻击。因此，在构建禽流感VLPs时，当HA和M1在细胞中共表达时，无论是否有NA，都会自发形成VLPs。
据此，本发明利用昆虫-杆状病毒表达系统，使H9N2亚型禽流感病毒HA 蛋白和的M1蛋白在该系统中自行组装形成空心化结构的VLPs。因为该VLPs 免疫后仅能刺激机体产生特异性的H9N2亚型禽流感病毒的HA抗体和M1抗体，而不会产生针对H9N2亚型禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和 NS抗体，所以其可以作为标记疫苗用于区分临床上H9N2亚型禽流感病毒的野毒感染和灭活疫苗免疫。因此，利用该VLPs进行免疫，可以为H9N2亚型禽流感的净化提供技术支持。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
因此，本发明的目的是提供一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用，能够实现利用该VLPs进行免疫，可以为H9N2亚型禽流感的净化提供技术支持。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用，其包括如下步骤：
步骤一：提取含有A/chicken/Jilin/DH109/2012(H9N2)的HA蛋白和M1蛋白；
步骤二：编码HA蛋白的核苷酸基序列；
步骤三：编码M1蛋白的核苷酸基序列；
步骤四：根据A/chicken/Jilin/DH109/2012(H9N2)的HA基因和M1基因设计引物；
步骤五：构建表达禽流感病毒结构蛋白的重组杆状病毒，具体为：
将步骤四中的HA基因和M1基因分别克隆至转移载体pFastBac1中，获得重组质粒pFastBac1-HA和pFastBac1-M1；
将重组质粒pFastBac1-HA和pFastBac1-M1分别转化Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞，筛选获得重组杆粒rBacmid-HA和rBacmid-M1；
利用脂质体介导转染法，将重组杆粒rBacmid-HA和rBacmid-M1分别转染宿主Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBV-HA和rBV-M1；
步骤六：禽流感VLPs的制备和纯化，具体为：
将重组杆状病毒rBV-HA和rBV-M1以MOI＝5共感染宿主Sf9昆虫细胞，两种结构蛋白在表达并自行组装后，所形成的VLPs会分泌到细胞培养上清中，经离心去除细胞碎片，再经超速离心和蔗糖密度梯度离心后得到纯化的VLPs。
作为本发明所述的一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用的一种优选方案，其中：该VLPs免疫后仅能刺激机体产生特异性的H9N2亚型禽流感病毒的HA抗体和M1抗体，而不会产生针对H9N2亚型禽流感病毒的 PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS抗体，所以其可以作为标记疫苗用于区分临床上H9N2亚型禽流感病毒的野毒感染和灭活疫苗免疫。
作为本发明所述的一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用的一种优选方案，其中：HA蛋白的核苷酸基序列为SEQIDNO.1：
>SEQIDNO.1
atggm1ccgtatcattgataactatgctactagtagcaacagtaagcaatgcagacaaaatctgcatcggataccaatcaacaaactccacagaaactgtaga cacactaacagaaaacaatgtccctgtgacacatgccaaagaattgctccacacam1cacaatgggatgctatgtgcaacaaacttgggacatcctcttattctagac acctgtaccattgcaggactaatctatggcaatccttcttgtgatctattgctggm1gaam1aatggtcttacatcgtcm1agaccatcggctgtcaatggattgtgcta ccccgggaatgtagaaaatctagaagaactaaggtcacttttcagttctgctagttcttatcaaagaatccagatttttccggacacaatatggaatgtgtcttacagtgga acaagcaaagcatgttcagattcattctacagaagcatm1atggttgacccaaaagaacaacgcttaccctattcaagacgcccaatacacaaataatcm1aaaaga acattcttttcatgtggggtataaatcacccacccaccm1actacacagacagatctgtacacaagaaccgacacaacaacaagtgtggcaacagaagaaataaata ggaccttcaaaccattgataggaccaaggcctcttgtcaatggtttgcagggaagaattgattattattggtcggtattgaaaccaggtcaaacactgcm1taagatcca atgggaatctaatagctccatggtatggacacattctttcagm1am1ccacggaagaatcctgaagactgatttgaaaaggggtagctgtacagtgcaatgtcagac agaaaaaggtggcttaaacacaacattgccattccaaaatgtaagtaagtatgcatttggaaactgctcgaaatatgttgm1taaam1tctcaaacttgcagttggtctm1gaatgtgccttctaaatctagtam1gactatttggggccatagctggattcatam1gm1gttggtcaggactagttgctggttggtatggattccagcattcaaat gaccaaggggttggtatggcagcagatam1actcaacccaaaaggcaattgataaaataacatccaaagtgaataacatagtcgataaaatgaacaaacagtatga aattattgatcatgaattcagcm1gttgaaaatagacttaacatgatcaataataagattgatgatcaaattcaagacatatgggcatataacgcagaactgctagtgcta cttgaaaaccagaaaacactcgatm1catgatgcaaatgtaaataatctatataataaagtgaam1ggcattgggttccaatgcagtggaagatgggaaaggatgttt cm1ctatatcacagatgtgattaccagtgcatgm1acaattcggaacgggacctacaacagm1gaaatatcaam1gaatcaaaattagaaaggcam1aatam 1ggggtcaagctgm1tctgaaggaacttacaaaattctcaccatttattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgccttcttgttctgggccatgtc caatgggtcttgcagatgcaacatttgtatataa；
M1蛋白的核苷酸基序列为SEQIDNO.2：
>SEQIDNO.2
atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcattccatcaggccccctcaaagccgagatcgcgcagagacttgaggatgtttttgcagggaa gaacacagatcttgaggctctcatggaatggataaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttagggtttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgag cgaggactgcagcgtagacgatttgtccaaaacgccctaaacgggaatggagacccaaacaacatggacagggcagttaaattgtacaagaagctgaagagggaa atgacatttcatggagcaaaggaagttgcactcagttactcaactggtgcacttgctagctgcatgggcctcatatacaacaggatgggaacagtggccgcagaaggg gctcttggtctagtatgtgccacctgtgagcagattgctgacgcccaacatcggtcccacaggcagatggcgactactaccaacccactaattaggcatgagaataga atggtactagccagcactacggctaaggctatggagcagatggctggatcaagtgaacaggcagcagaagccatggaagtagcaagtcaggctaggcaaatggtg caggctatgagaacagtcgggacccaccctagctccagtacaggtctaaaagatgaccttattgaaaatttgcaggcttaccagaaacggatgggagtgcaactgcagcgattcaagtga；
HA基因、M1基因的上游引物和下游引物序列为：
H9F：5’-cgggatccatggm1ccgtatcatt-3’；
H9R：5’-cccaagctttcaaatgcaaatgttgcacc-3’；
M9F：5’-cgggatccatgagtcttctaaccgag-3’；
M9R：5’-cccaagctttcacttgaatcgctgcag-3’。
作为本发明所述的一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法及其应用的一种优选方案，其中：将制备的VLPs免疫商品肉鸡，10日龄免疫一次，免疫后每隔7天分别采血监测抗体效价；免疫三周后以106EID50的攻毒剂量进行攻毒，通过检测病毒的体外排毒、体内载毒，以及鸡只体重变化进行免疫保护效果评价。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、VLPs自行组装，具有较好的免疫效果，因为VLPs更接近天然病毒的形态和大小，能够刺激机体产生更好的免疫反应，免疫效果更好。
2、由于VLPs不含病毒基因组，这种空壳结构的VLPs在免疫动物体内就不会发生病毒基因与宿主染色体基因整合，而且整个生产过程中不接触活的有感染力的病毒，因此非常安全。
3、可以区别出灭活疫苗免疫与野毒感染的动物。本发明所制备的VLPs不含流感病毒PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS等蛋白，因此进行血清检测时，用该VLPs免疫的动物将不会产生特异性抗PB2、PB1、PA、NP、NA、M和 NS的抗体，由此该VLPs可以作为一种新型的标记疫苗，用于区分H9N2亚型禽流感病毒的野毒感染和灭活疫苗免疫。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Jilin/DH109/2012的HA基因和M1 基因PCR鉴定结果。其中M为Trans2K DNA Marker；泳道1为目的基因HA采用 HA上游引物/HA下游引物的PCR扩增结果，片段大小约为1700bp；泳道2为目的基因M1采用M1上游引物/M1下游引物的PCR扩增结果，片段大小约为760bp；
图2为两种穿梭质粒的酶切鉴定结果。其中M为Trans2K DNA Marker；泳道1为穿梭质粒pEASY-T1 Simple-HA采用Hind III和BamH I酶切结果，片段大小约为1700bp；泳道1为穿梭质粒pEASY-T1 Simple-M1采用Hind III和BamH I酶切结果，片段大小约为760bp；
图3为两种重组杆粒的特异性引物PCR鉴定结果。其中泳道M为Trans2K DNAMarker；泳道1为重组杆粒rBacmid-HA采用HA上游引物/HA下游引物的PCR扩增结果，片段大小约为1700bp；泳道2为重组杆粒rBacmid-M1采用M1上游引物/M1下游引物的PCR扩增结果，片段大小约为760bp；
图4为两种重组杆粒的通用引物M13上游引物/M13下游引物PCR鉴定结果。其中泳道M为Trans2K plus DNA Marker；泳道1为重组杆粒rBacmid-HA采用 M13上游引物/M13下游引物的PCR扩增结果，片段大小约为4050bp；泳道2为重组杆粒rBacmid-M1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR扩增结果，片段大小约为3100bp；
图5为正常Sf9细胞与重组杆粒转染后出现病变的Sf9细胞示意图。其中 (a)正常Sf9细胞；(b)重组杆粒rBacmid-HA转染后出现病变的Sf9细胞；(c) 重组杆粒rBacmid-M1转染后出现病变的Sf9细胞；
图6为P1代重组杆毒基因组的通用引物M13上游引物/M13下游引物PCR鉴定结果。其中泳道M为Trans2K plus DNA Marker；泳道1为重组杆粒rBacmid-HA 采用M13上游引物/M13下游引物的PCR扩增结果，片段大小约为4050bp；泳道 2为重组杆粒rBacmid-M1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR扩增结果，片段大小约为3100bp；
图7为两种重组杆状病毒Western blot鉴定结果。其中泳道M为蛋白标准分子质量；泳道1为rBV-HA鉴定结果；泳道2为rBV-M1鉴定结果；
图8为H9N2亚型禽流感VLPs的血凝结果图；
图9为H9N2亚型禽流感VLPsWestern blot鉴定结果。其中泳道M为蛋白标准分子质量；泳道1为VLPs鉴定结果；
图10为H9N2亚型禽流感VLPs的透射电镜图；
图11为H9N2亚型禽流感VLPs免疫鸡群后的血凝抑制抗体效价消长规律图；
图12为H9N2亚型禽流感VLPs免疫鸡群后的淋巴细胞增殖结果图；
图13为免疫鸡群攻毒后的体重增长率结果图；
图14为实验动物分组与免疫攻毒方案；
图15为H9N2亚型禽流感VLPs免疫攻毒后体外排毒时间检测结果；
图16为H9N2亚型禽流感VLPs免疫攻毒后体内病毒载量检测结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
本发明所提供的H9N2亚型禽流感VLPs，为由毒株A/chicken/Jilin/DH109/2012的HA蛋白和M1蛋白自行组装形成的空心化结构的蛋白颗粒；其中HA蛋白对应的HA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，M1 蛋白对应的M1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
根据A/chicken/Jilin/DH109/2012(H9N2)的HA基因和M1基因设计引物，所述的HA基因、M1基因的上游引物和下游引物序列如下所示：
H9F：5’-cgggatccatggm1ccgtatcatt-3’
H9R：5’-cccaagctttcaaatgcaaatgttgcacc-3’
M9F：5’-cgggatccatgagtcttctaaccgag-3’
M9R：5’-cccaagctttcacttgaatcgctgcag-3’
实施例2
本实施例就H9N2亚型禽流感VLPs制备过程中表达H9N2亚型禽流感病毒结构蛋白的重组杆状病毒的构建过程简要介绍如下：
(1)扩增各结构蛋白基因序列
根据实施例1中SEQIDNO.1～2所示的目的核苷酸序列，参考现有技术通过聚合酶链式反应(PCR法)扩增获得HA基因。
PCR鉴定时，反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、60℃退火 30秒、72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃再延伸10分钟。对PCR扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。
(2)构建穿梭质粒
按照现有技术，将步骤(1)中克隆获得的HA基因和M1基因克隆至T载体(pEASY-T1Simple vector)中，转化后测序，并用BamH I和Hind III双酶切验证并回收酶切产物，获得构建正确的重组克隆质粒pEASY-T1 Simple-HA和 pEASY-T1 Simple-M1，结果如图2所示。
利用T4 DNA连接酶将上述酶切物与pFastBac1(BamH I和Hind III双酶切) 质粒进行连接，连接体系为：重组质粒酶切产物4μL；pFastBac1载体酶切产物1μL；5×Buffer 2μL；T4 DNA连接酶1μL；ddH2O 2μL。25℃连接30分钟后，将连接产物转化至Escherichia coliDH5α感受态细胞中，用含有特定抗生素的(氨苄青霉素终浓度100μg/mL、庆大霉素终浓度100μg/mL)选择培养基筛选阳性菌落。
对所筛选的阳性菌落经扩增后提取质粒，采用酶切验证及PCR鉴定，以检测HA基因和M1基因是否正确重组至pFastBac1载体中，经鉴定正确的质粒，即可认为穿梭质粒pFastBac1-HA和pFastBac1-M1构建成功。
(3)构建重组杆粒
将步骤(2)中鉴定正确的重组质粒转化至Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞中，使其进行同源重组，经含有三抗(卡那霉素终浓度100μg/mL、庆大霉素终浓度50μg/mL、四环素终浓度70μg/mL)的IPTG条件筛选培养基(IPTG 终浓度24mg/mL，X-gal终浓度20mg/mL，该筛选培养基可通过菌落形成颜色判定是否发生同源重组，白色菌落即代表重组成功，蓝色菌落则未成功)培养筛 48小时，挑取白斑，获得重组杆粒rBacmid-HA和rBacmid-M1；
对所提取的重组杆粒进一步进行PCR鉴定，以确定重组杆粒构建正确。PCR 鉴定时，分别用步骤(1)中的特异性引物和通用性引物M13(根据Invitrogen 公司Bac-to-
Figure BDA0003048698680000091
Baculovirus Expression System操作说明书中合成)，M13的上游引物和下游引物序列如下所示：
M13F：5’-gttttcccagtcacgac-3’，
M13R：5’-caggaaacagctatgac-3’；
PCR鉴定时，反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒、60℃退火 30秒、72℃延伸90秒，共30个循环；最后72℃再延伸10分钟。
对PCR扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳分析，用步骤(1)中的特异性引物鉴定结果如图3所示。对图3分析可以看出，HA片段大小约为1700bp，M1片段大小约为760bp，结果与预期相符；用M13引物鉴定结果如图 4所示。对图4分析可以看出，HA片段大小约为4050bp，M1片段大小约为 3100bp，结果与预期相符，即HA基因和M1基因片段正确重组进入杆粒中，也即重组杆粒rBacmid-HA和rBacmid-M1构建正确。
(4)构建重组杆状病毒
利用脂质体介导转染法(按照Invitrogen公司的lipo3000说明书进行转染)，将步骤(3)中构建正确的重组杆粒rBacmid-HA和rBacmid-M1，分别转染宿主 Sf9昆虫细胞；
28℃培养72小时，待细胞病变(如图5所示)后，收集细胞上清液即为第一代重组杆状病毒rBV-HA和rBV-M1；
接着继续将第一代重组杆状病毒接种昆虫Sf9细胞，同样培养条件下，收集第二代重组杆状病毒；
以此类推，收集至第四代重组杆状病毒。为便于检测分析，可将每一代重组杆状病毒于-80℃保存备用。
培养过程中，根据情况用通用性引物M13对培养物进行PCR鉴定，以检测含有HA基因和M1基因片段的重组杆状病毒是否完整和正确。
PCR鉴定时，反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性45秒、55℃退火 40秒、72℃延伸4分钟，共30个循环；72℃再延伸10分钟。
对PCR扩增产物进行1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图6所示。对图6分析可以看出，含有HA基因片段的基因组大小约为4050bp；含有M1 基因片段的基因组大小约为3100bp，结果与预期符合，即重组杆状病毒结构完整、有效，可以进一步应用。
(5)Westernblot鉴定
取适量细胞上清，与蛋白上样缓冲液按5:1的比例混匀后，煮沸10分钟，12000g离心5分钟，然后将样品加入上样孔，采用半干式转移，80V恒压运行 2小时。将胶条割至合适大小，并将PVDF膜、滤纸剪至与胶条等大，其中PVDF 膜在甲醇中敏化15秒，然后胶条、PVDF膜、滤纸转移至转膜缓冲液中浸泡15 分钟。转膜时，从下至上依次按阳极碳板、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸和阴极碳板的顺序放置对齐，去除气泡，打开电源，恒压20V，转移20分钟。转移结束后，将膜取出，加入含5％脱脂奶粉的PBS，37℃摇床孵育2小时。弃封闭液，用PBST洗膜3次，每次15分钟。由于所用抗体不同，因此将膜剪开，分别加入一抗，浓度均为1:1000，4℃过夜后弃一抗，用PBST洗膜3次，每次15分钟。然后分别加入二抗，浓度均为1:5000，37℃孵育1小时后弃二抗，用PBST洗膜 3次，每次15分钟。用ECL发光液进行显影，查看结果。结果如图7所示， Westernblot检测到的条带大约65kDa和27kDa，结果与预期相符。
实施例3
本实施例就H9N2亚型禽流感VLPs中结构蛋白的表达、组装及纯化过程简要介绍如下：
(1)VLPs中结构蛋白的表达
将实施例2中所收集的含有第四代重组杆状病毒rBV-HA和rBV-M1的上清以MOI＝5共感染Sf9悬浮细胞，感染时间为96小时；
感染后，将感染的细胞置于28℃、120转/分钟摇床培养；
在此培养过程中，结构蛋白在宿主细胞中分别表达后会自行组装，组装后的VLPs会分泌到细胞培养上清中。
(2)H9N2亚型禽流感VLPs的纯化与鉴定
收集步骤(1)中的细胞培养上清，经3000转/分钟离心30分钟后，可初步去除大的细胞碎片；再经超速离心和蔗糖密度梯度离心后，此时蔗糖层的中间会形成白色条带，而杆状病毒则沉淀于底部，其它小的杂蛋白会停留在顶层，中间的白色条带层即为纯化的VLPs样品。
对所制备的H9N2亚型禽流感VLPs进行血凝效价检测，结果如图8所示，显示纯化后的H9N2亚型禽流感VLPs血凝效价为7log2。然后对该颗粒进行 Western blot鉴定，过程与实施例2中(5)相同，结果如图9所示。Western blot 检测到的条带大约65kDa和27kDa，结果与预期相符。最后，对纯化后的VLPs 进行电子透射电镜观察，VLPs形态如图10所示。以上结果均表明正确构建H9N2 亚型禽流感VLPs。
实施例4
本实施例就实施例3所制备的VLPs作为疫苗使用时的免疫效果进行简要评价。
(1)免疫程序及攻毒方案
参考中国农业农村部《2020年国家动物疫病强制免疫计划》，将VLPs疫苗免疫组共分为高(40μg/300μL)、中(30μg/300μL)、低(15μg/300μL)共3个免疫剂量，0.3mL/羽；H9N2亚型禽流感商品化疫苗组根据说明书也注射0.3mL/ 羽。免疫途径为腿部肌肉注射。在免疫后第21天进行鼻腔攻毒，采用 A/chicken/Jilin/DH109/2012毒株攻毒，0.05mL/鼻孔，攻毒剂量为106EID50/mL，具体免疫程序及攻毒方案如表1所示。
(2)HI抗体滴度测定
从免疫后第一周开始，每隔一周翅下静脉采血，分离血清，-20℃保存备用。
以H9N2亚型禽流感病毒血凝抑制试验阳性抗原作为检测抗原，倍比稀释血清样品后，加入25μL四单位抗原等体积混合，于37℃作用30分钟，再加入 25μL的1％鸡红细胞，冰上作用30分钟，HI效价为发生红细胞完全凝集抑制的最高血清稀释倍数。
结果如图11所示，各剂量组和商品化疫苗组免疫后抗体水平持续增长，免疫后21天达到峰值。攻毒后抗体水平略有下降，但抗体水平始终在保护线水平以上(2log2)。而且，HI抗体滴度呈现出剂量依赖性，即40μg VLPs组＞30μg VLPs 组＞15μg VLPs组。由此表明，各剂量组和商品化疫苗组均能诱导机体产生良好的HI抗体滴度，提供良好的免疫保护效果，且40μg VLPs组能诱导与商品化疫苗组相当水平的体液免疫。
(3)淋巴细胞增殖试验
通过无菌操作获取脾脏，将脾脏在200目筛网上充分研磨，并用适量淋巴细胞分离液重悬。将研磨液转移至15mL离心管中，2000转/分钟离心10分钟，取中间的白色淋巴细胞层。将红细胞裂解液加入装有白色淋巴细胞的离心管中并重悬，室温作用5分钟后，2000转/分钟离心5分钟。弃上清，加入适量PBS 溶液轻柔混匀，2000转/分钟离心10分钟，重复2次。弃上清，用1640培养基将淋巴细胞的浓度调整至1×106个/mL。在96孔细胞培养板中每孔加入100μL 的淋巴细胞悬液，放入37℃ 5％CO2细胞培养箱中培养2小时。加入ConA、灭活H9N2禽流感病毒、PBS作为刺激物；另设两组对照，一组只加入1640培养基，一组只加入淋巴细胞悬液。每组设三个复孔。放入37℃ 5％CO2细胞培养箱培养24小时。每孔加入10μL CCK-8溶液，再放入37℃ 5％CO2细胞培养箱孵育2小时。使用酶标仪检测490nm处的OD值。
结果判定：SI＝(样本OD值-空白OD值)/(阴性OD值-空白OD值)
结果如图12所示，各免疫组的SI值不断升高，于免疫后第21天达到峰值，且SI值呈现剂量依赖关系，即40μg VLPs组＞30μg VLPs组＞15μg VLPs组。 40μg VLPs组的淋巴细胞活化能力与商品化疫苗组一直无明显差别(p＞0.05)，但所有组别均明显高于PBS组。结果表明，各剂量VLPs组与商品化疫苗组均能诱导产生较好的细胞免疫水平，40μg VLPs组能诱导与商品化疫苗组相当水平的细胞免疫。
(3)体重监测
攻毒后每天早晨喂食前监测动物体重。结果如图13所示，30μg VLPs组与商品化疫苗组的体重增长率无明显差异(p＞0.05)；攻毒3天后，40μg VLPs组体重增长率显著高于商品化疫苗组(p＜0.001)，除攻毒后第10天，二者无明显差异(p＞0.05)，总体上这种差异一直持续到攻毒后第14天；15μg VLPs组与商品化疫苗组在攻毒后第5、14天无明显差异(p＞0.05)，其余时间点，商品化疫苗组均高于15μg VLPs组，二者差异极显著(p＜0.001)。由此表明，所有VLPs 剂量组与商品疫苗组均为实验动物提供了有效保护。
(4)体外排毒时间检测
从攻毒后第3天起，每间隔一天采集口咽以及泄殖腔棉拭子，将拭子放入含有1％双抗(青霉素和链霉素)的500μL PBS溶液中，2000g离心10分钟，取上清，每个样品吸取100μL样品液，接种于9-11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中， 48小时后收取尿囊液进行血凝试验检测排毒情况，排除24小时内死亡的鸡胚。
结果如表2所示，泄殖腔排毒结果与口咽排毒结果均显示，攻毒后第3天， 40μgVLPs和30μg VLPs组无排毒现象；攻毒后第5天，15μg VLPs组和商品化疫苗组停止排毒。结果表明，40μg VLPs组、30μg VLPs组比商品化疫苗组能够更好地阻止病毒复制。
(5)病毒体内分布检测
攻毒后第1天起，每隔一天随机处死3只实验鸡，取其脑、心、肺、脾、肠、胰腺、肌肉等组织脏器，取适量大小的组织放入含有1mL PBS溶液进行研磨，2000g离心10分钟，取上清，提取其RNA并反转录获得cDNA，利用实施例1中HA基因的特异性引物进行qPCR鉴定，检测结果经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，判断是否有病毒的存在。
结果如表3所示，攻毒后第3天，40μg VLPs组和30μg VLPs组所有待检组织均无病毒检出；攻毒后第5天，15μg VLPs组和商品化疫苗组中所有检测组织无病毒存在。结果表明，40μg VLPs组、30μg VLPs组比商品化疫苗组体内病毒载量更低，能够更好地阻止病毒复制。
综上所述，本发明专利设计和制备的H9N2亚型禽流感VLPs可以刺激鸡体产生较强的抗体效价，为免疫后的鸡群提供有效保护，并能显著抑制排毒及病毒在体内的复制。该VLPs可以作为标记疫苗用于区分临床上H9N2亚型禽流感病毒的野毒感染和灭活疫苗免疫。因此，利用该VLPs进行免疫，可以为H9N2 亚型禽流感的净化提供技术支持。
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (4)

1.一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：提取含有A/chicken/Jilin/DH109/2012(H9N2)的HA蛋白和M1蛋白；
步骤二：编码HA蛋白的核苷酸基序列；
步骤三：编码M1蛋白的核苷酸基序列；
步骤四：根据A/chicken/Jilin/DH109/2012(H9N2)的HA基因和M1基因设计引物；
步骤五：构建表达禽流感病毒结构蛋白的重组杆状病毒，具体为：
将步骤四中的HA基因和M1基因分别克隆至转移载体pFastBac1中，获得重组质粒pFastBac1-HA和pFastBac1-M1；
将重组质粒pFastBac1-HA和pFastBac1-M1分别转化Escherichia coli DH10 Bac感受态细胞，筛选获得重组杆粒rBacmid-HA和rBacmid-M1；
利用脂质体介导转染法，将重组杆粒rBacmid-HA和rBacmid-M1分别转染宿主Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBV-HA和rBV-M1：
步骤六：禽流感VLPs的制备和纯化，具体为：
将重组杆状病毒rBV-HA和rBV-M1以MOI＝5共感染宿主Sf9昆虫细胞，两种结构蛋白在表达并自行组装后，所形成的VLPs会分泌到细胞培养上清中，经离心去除细胞碎片，再经超速离心和蔗糖密度梯度离心后得到纯化的VLPs。
2.根据权利要求1所述的一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法，其特征在于：该VLPs免疫后仅能刺激机体产生特异性的H9N2亚型禽流感病毒的HA抗体和M1抗体，而不会产生针对H9N2亚型禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS抗体，所以其可以作为标记疫苗用于区分临床上H9N2亚型禽流感病毒的野毒感染和灭活疫苗免疫。
3.根据权利要求1所述的一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法，其特征在于：HA蛋白的核苷酸基序列为SEQIDNO.1：
>SEQIDNO.1
atggm1ccgtatcattgataactatgctactagtagcaacagtaagcaatgcagacaaaatctgcatcggataccaatcaacaaactccacagaaactgtagacacactaacagaaaacaatgtccctgtgacacatgccaaagaattgctccacacam1cacaatgggatgctatgtgcaacaaacttgggacatcctcttattctagacacctgtaccattgcaggactaatctatggcaatccttcttgtgatctattgctggm1gaam1aatggtcttacatcgtcm1agaccatcggctgtcaatggattgtgctaccccgggaatgtagaaaatctagaagaactaaggtcacttttcagttctgctagttcttatcaaagaatccagatttttccggacacaatatggaatgtgtcttacagtggaacaagcaaagcatgttcagattcattctacagaagcatm1atggttgacccaaaagaacaacgcttaccctattcaagacgcccaatacacaaataatcm1aaaagaacattcttttcatgtggggtataaatcacccacccaccm1actacacagacagatctgtacacaagaaccgacacaacaacaagtgtggcaacagaagaaataaataggaccttcaaaccattgataggaccaaggcctcttgtcaatggtttgcagggaagaattgattattattggtcggtattgaaaccaggtcaaacactgcm1taagatccaatgggaatctaatagctccatggtatggacacattctttcagm1am1ccacggaagaatcctgaagactgatttgaaaaggggtagctgtacagtgcaatgtcagacagaaaaaggtggcttaaacacaacattgccattccaaaatgtaagtaagtatgcatttggaaactgctcgaaatatgttgm1taaam1tctcaaacttgcagttggtctm1gaatgtgccttctaaatctagtam1gactatttggggccatagctggattcatam1gm1gttggtcaggactagttgctggttggtatggattccagcattcaaatgaccaaggggttggtatggcagcagatam1actcaacccaaaaggcaattgataaaataacatccaaagtgaataacatagtcgataaaatgaacaaacagtatgaaattattgatcatgaattcagcm1gttgaaaatagacttaacatgatcaataataagattgatgatcaaattcaagacatatgggcatataacgcagaactgctagtgctacttgaaaaccagaaaacactcgatm1catgatgcaaatgtaaataatctatataataaagtgaam1ggcattgggttccaatgcagtggaagatgggaaaggatgtttcm1ctatatcacagatgtgattaccagtgcatgm1acaattcggaacgggacctacaacagm1gaaatatcaam1gaatcaaaattagaaaggcam1aatam1ggggtcaagctgm1tctgaaggaacttacaaaattctcaccatttattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgccttcttgttctgggccatgtccaatgggtcttgcagatgcaacatttgtatataa；
M1蛋白的核苷酸基序列为SEQIDNO.2：
>SEQIDNO.2
atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcattccatcaggccccctcaaagccgagatcgcgcagagacttgaggatgtttttgcagggaagaacacagatcttgaggctctcatggaatggataaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttagggtttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgatttgtccaaaacgccctaaacgggaatggagacccaaacaacatggacagggcagttaaattgtacaagaagctgaagagggaaatgacatttcatggagcaaaggaagttgcactcagttactcaactggtgcacttgctagctgcatgggcctcatatacaacaggatgggaacagtggccgcagaaggggctcttggtctagtatgtgccacctgtgagcagattgctgacgcccaacatcggtcccacaggcagatggcgactactaccaacccactaattaggcatgagaatagaatggtactagccagcactacggctaaggctatggagcagatggctggatcaagtgaacaggcagcagaagccatggaagtagcaagtcaggctaggcaaatggtgcaggctatgagaacagtcgggacccaccctagctccagtacaggtctaaaagatgaccttattgaaaatttgcaggcttaccagaaacggatgggagtgcaactgcagcgattcaagtga；
HA基因、M1基因的上游引物和下游引物序列为：
H9F：5’-cgggatccatggm1ccgtatcatt-3’；
H9R：5’-cccaagctttcaaatgcaaatgttgcacc-3’；
M9F：5’-cgggatccatgagtcttctaaccgag-3’；
M9R：5’-cccaagctttcacttgaatcgctgcag-3’。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种H9N2亚型禽流感新型标记疫苗的制备方法的应用，其特征在于：将制备的VLPs免疫商品肉鸡，10日龄免疫一次，免疫后每隔7天分别采血监测抗体效价；免疫三周后以106EID50的攻毒剂量进行攻毒，通过检测病毒的体外排毒、体内载毒，以及鸡只体重变化进行免疫保护效果评价。
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