CN116217678B - 一种抗h5n1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗h5n1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。该病毒样颗粒由H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白和H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白组装而成；其中，所述的H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。所述的病毒样颗粒可与药学上可以接受的载体如佐剂混合制成病毒样颗粒疫苗，该疫苗可诱导交叉保护性免疫应答抵抗同源和异源H5N1亚型高致病性禽流感病毒的致死性攻击，显著抑制排毒，可为防控H5N1亚型禽流感提供新的疫苗选择。
Description
技术领域
本发明属于基因工程疫苗技术领域，特别涉及一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
H5N1亚型高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)以及H5Nx亚型流感变种株对食品安全、家禽养殖以及公共卫生安全造成巨大威胁。
疫苗接种是当前防控禽流感病毒感染传播的最有效措施之一。接种疫苗对于家禽养殖业以及公共卫生安全意义重大。当前的禽流感疫苗以灭活疫苗为主，存在诸多缺点，包括：存在内源性病毒污染、流行期间鸡胚供应不足、产生大量废弃物污染环境以及流行期间疫苗株筛选时间长不能及时更新疫苗等缺点。同时禽流感灭活疫苗以体液免疫为主，缺乏细胞免疫应答，对流行变异株流感病毒缺乏有效的交叉保护。因此，需要开发一种广谱有效的H5N1亚型禽流感疫苗，以满足防控H5N1亚型禽流感的需求。
病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)保留了类似天然病毒粒子的结构和免疫原性，且不具有传染性，可同时诱导体液免疫和细胞免疫，是开发禽流感疫苗的理想材料。禽流感病毒样颗粒常由结构蛋白组装而成。流感血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)是流感疫苗开发的主要靶抗原，可诱导针对流感病毒的血清学免疫应答，可与流感基质蛋白(Matrixprotein，M1)一起组装成流感病毒样颗粒。杆状病毒载体表达系统常被用来生产组装流感病毒样颗粒，因其安全性高、易操作、可大规模生产等优点。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒。
本发明的第二个目的在于提供所述抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供所述抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒在制备抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗。
本发明的第五个目的在于提供所述抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗的制备方法。
本发明的第六个目的在于提供所述抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒以及抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒(抗原)，所述病毒样颗粒由H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白和H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白组装而成；其中，
所述的H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
编码所述H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的基因如SEQ ID NO：1所示，编码所述H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白的基因的如SEQ ID NO：2所示。
所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将来源于H5N1亚型禽流感病毒的HA基因和来源于H7N9亚型禽流感病毒的M1基因经密码子优化后分别连接到杆状病毒转递质粒中，得到HA基因重组转递质粒和M1基因重组转递质粒；其中，优化后的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，优化后的M1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(2)将步骤(1)中得到的HA基因重组转递质粒和M1基因重组转递质粒经转化重组，分别得到HA基因重组杆状病毒质粒和M1基因重组杆状病毒质粒；
(3)将步骤(2)中得到的HA基因重组杆状病毒质粒和M1基因重组杆状病毒质粒经脂质体介导转染sf9昆虫细胞，收获培养上清，分别得到P1代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒；
(4)将步骤(3)中得到的P1代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞进行传代，连续传代2次，分别得到P3代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒；
(5)将步骤(4)中得到的P3代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒通过共感染的方式感染昆虫细胞，收取细胞培养上清，得到由HA蛋白和M1蛋白组装而成的病毒样颗粒，即所述抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒。
步骤(1)中所述的杆状病毒转递质粒优选为pACEBac1。
步骤(2)中所述的转化为转化DH10bac感受态细胞。
步骤(5)中所述的昆虫细胞优选为昆虫细胞High five。
步骤(5)中所述的P3代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒共感染昆虫细胞时，感染复数(MOI)优选为2:1。
步骤(5)中所述的共感染的时间优选为96h。
所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒的制备方法，在步骤(5)之后还包括进一步将病毒样颗粒纯化的步骤；具体为：
将离心管从上至下分别加入浓度为质量体积比20％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，最上方加入病毒样颗粒样品，离心，收取蔗糖层间白色透明带，再次离心去除蔗糖，最后用PBS缓冲液重悬病毒样颗粒样品。
所述的离心的条件优选为：4℃，100000×g离心1h。
所述的再次离心去除蔗糖的条件优选为：4℃、10000×g离心1.5h。
所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒在制备抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗中的应用。
一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗，包括上述抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒以及药学上可以接受的载体。
所述的药学上可以接受的载体包括佐剂。
所述的佐剂优选为水包油包水型佐剂和油包水型佐剂中的至少一种；进一步优选为MontanideTM ISA系列佐剂。
所述的水包油包水型佐剂优选为MontanideTM ISA 201VG佐剂。
所述的油包水型佐剂优选为MontanideTM ISA 71VG佐剂。
所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：将上述抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒和佐剂混合乳化，得到抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗。
所述的佐剂优选为水包油包水型佐剂和油包水型佐剂中的至少一种；其中，当佐剂为水包油包水型佐剂时，水包油包水型佐剂和感病毒样颗粒的体积比为1：1；当佐剂为油包水型佐剂时，油包水型佐剂和病毒样颗粒的体积比为7：3。
所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒和所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗中的至少一种在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。
所述的禽流感病毒包括H5N1亚型禽流感病毒；优选为A/Chicken/Shandong/WFZC/2017(H5N1)和A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)中的至少一种；更优选为A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)。
所述的预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物的施用对象包括家禽。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一种禽流感病毒样颗粒的制备方法：将来源于H5N1亚型禽流感病毒的HA基因和来源于H7N9亚型禽流感病毒的M1基因分别制备成重组杆状病毒，然后将两种重组杆状病毒以共感染的方式感染sf9细胞组装成病毒样颗粒(VLP)，再通过间接免疫荧光方法、SDS-PAGE和Western blot鉴定HA和M1蛋白的表达情况，并利用透射电镜观察到病毒样颗粒的大小和形态(直径约100nm)，最后经血凝学鉴定，结果表明VLP的血凝效价可达13log2。
(2)本发明将H5N1禽流感病毒样颗粒与MontanideTM ISA 201VG佐剂混合乳化制备疫苗，评估该疫苗的同源攻毒保护效力：3周龄SPF鸡单次免疫40μg剂量的VLP疫苗，免疫后3周，同源毒株作为4单位抗原，VLP疫苗组平均血凝抑制(HI)效价达6.9log2；免疫后第3周使用A/Chicken/Shandong/WFZC/2017(H5N1)毒株以106.0EID50(0.2ml)的剂量攻毒，攻毒后第5天采集咽喉和泄殖腔拭子检测排毒，结果显示：攻毒后，PBS组在2天内全部死亡，且伴随发病症状；疫苗组SPF鸡全部存活，且未检测到排毒。
(3)本发明将H5N1禽流感病毒样颗粒与MontanideTM ISA 71VG佐剂混合乳化制备疫苗，评估该疫苗针对异源毒株的交叉保护效力：3周龄SPF鸡单次免疫80μg剂量的VLP疫苗，免疫后3周，采集血清检测HI和中和抗体，针对同源4HAU，平均HI抗体达9.25log2；针对异源4HAU，平均HI抗体达2.625log2；针对异源毒株，平均中和抗体效价达1:140；攻毒后第3周使用异源毒株A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)(H5N1-D889)以106.0EID50(0.2ml)的致死剂量攻毒，攻毒后第3、5、7天采集咽喉和泄殖腔拭子检测排毒，结果显示PBS对照组鸡在攻毒后1天内全部死亡；疫苗组SPF鸡全部存活，且未检测到排毒。
(4)本发明提供的禽流感病毒样颗粒表达量高，血凝效价可达13log2，且本发明制备的禽流感病毒样颗粒疫苗可诱导交叉保护性免疫应答抵抗同源和异源H5N1亚型高致病性禽流感病毒的致死性攻击，显著抑制排毒，可为防控H5N1亚型禽流感提供新的疫苗选择。
附图说明
图1是通过间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白表达的结果图；其中，a为rBac-HA感染sf9细胞结果图；b为对照(sf9细胞)；c为rBac-M1感染sf9细胞结果图；d为对照(sf9细胞)。
图2是HA和M1基因重组杆状病毒共感染sf9细胞组装的VLP的SDS-PAGE和Westernblot结果图。
图3是禽流感病毒样颗粒电镜图。
图4是同源H5N1攻毒保护结果图；其中，a为免疫后第3周的HI抗体结果；b为同源毒株攻击后临床观察14天内SPF鸡的存活情况。
图5是疫苗免疫(40μg VLP)后的抗体水平检测结果图；其中，a为以同源毒株为4HAU的HI结果；b为以异源毒株为4HAU的HI结果；c为中和抗体反对异源毒株结果。
图6是异源毒株攻击后临床观察14天内SPF鸡的存活情况图(40μg VLP)。
图7是疫苗免疫(80μg VLP)后的抗体水平检测结果图；其中，a为以同源毒株为4HAU的HI结果；b为以异源毒株为4HAU的HI结果；c为中和抗体反对异源毒株结果。
图8是异源毒株攻击后临床观察14天内SPF鸡的存活情况图(80μg VLP)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和实验材料均可通过商业途径获得。
本发明实施例中涉及的H5N1亚型禽流感病毒为A/Chicken/Shandong/WFZC/2017(H5N1)(H5N1-SD57)，由华南农业大学兽医学院国家禽流感专业实验室(广州)提供。
本发明实施例中涉及的H7N9亚型禽流感病毒为A/Chicken/Guangdong/16876/2016(H7N9)，该病毒株以及M1蛋白已在中国专利申请(申请号为“202111069024.9”、名称为“一种编码重组禽流感病毒HA蛋白的基因、病毒样颗粒、疫苗及制备与应用”)中公开。
本发明实施例中涉及的H5N1-D889毒株为A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)，由华南农业大学兽医学院国家禽流感专业实验室(广州)提供，已在中国专利申请(申请号为“201910117092.4”、申请名称为“基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗及制备与应用”)中公开(文中命名为：H5亚型禽流感病毒H5N1)。
实施例1HA和M1基因的重组杆状病毒质粒的构建
(1)委托华大基因公司，将来源于A/Chicken/Shandong/WFZC/2017(H5N1)的HA基因和来源于A/Chicken/Guangdong/16876/2016(H7N9)的M1基因(序列在申请号为“202111069024.9”的专利中已公开)经密码子优化、基因合成后连接到杆状病毒转递质粒pACEBac1(G eneva Biotech公司，网址：https://geneva-biotech.com/product_category/insect-cell-expression/multibac/)中，分别得到重组转递质粒pACEBac-HA和pACEBac-M1；其中，密码子优化后的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；密码子优化后的M1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列如SEQ ID N O：4所示。
密码子优化后的HA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)：
ATGGAGAAGATCGTCCTGCTGTTCGCCACTATCTCCCTGGTGAAGTCCGACCACATCTGCATCGGTTACCACGCCAACAACAGCACCGAGCAGGTGGACACCATCATGGAAAAGAACGTGACCGTCACTCACGCTAAGGACATCCTGGAGAAGACCCACAACGGTAAACTGTGCGACCTGAACGGCGTGAAGCCCCTGATCCTGAAGGACTGCAGCGTGGCCGGCTGGCTGCTGGGTAACCCTCTGTGCGACGAGTTCACCAACGTGCCTGAGTGGTCCTACATCGTGGAGAAGGCTAACCCTGCCAACGACCTGTGCTACCCTGGCAAGTTCAACGACTACGAGGAGCTGAAGCACCTGCTGAGCCGCATCAACCACTTCGAGAAGATCCAGATCATCCCCAAGGACTCCTGGAGCGACCACGAAGCTAGCCTGGGCGTGAGCGCCGCTTGCTCCTACCAGGGCAGCTCCTCCTTCTTCCGTAACGTCGTGTGGCTGATCAAGAAGGACAACGCTTACCCCACCATCAAGAAGTCCTACAACAACACTAACCGCGAGGACCTGCTGATCCTGTGGGGTATCC ACCACCCCAACGACGAGGCTGAGCAGACTAAGCTGTACCAGAACCCCACTACTTACATCTCCATCGGTACTAGCACCCTGAACCAGCGTCTGGTGCCTAAGATCGCTACTCGCAGCAAGATCAACGGTCAGTCCGGTCGTATCGACTTCTTCTGGACCATCCTGAAGCCTAACGACGCCATCCACTTCGAGAGCAACGGTAACTTCATCGCTCCCGAATACGCTTACAAGATCGTCAAGAAGGGTGACTCCACTATCATGCGCTCCGAGGTGGAGTACGGCAACTGCAACACTCGTTGCCAGACTCCTGTGGGCGCCATCAACAGCAGCATGCCCTTCCACAACATCCACCCCCTGACTATCGGCGAATGCCCTAAGTACGTGAAGTCCAACAAGCTCGTTCTGGCTACCGGCCTGCGCAACTCCCCTCAGCGCGAGTCCCGCGGACTGTTCGGTGCCATCGCCGGCTTCATCGAGGGCGGTTGGCAGGGCATGGTCGACGGCTGGTACGGTTACCACCACTCCAACGAGCAGGGCTCCGGTTACGCTGCTGACAAGGAGAGCACCCAGAAGGCTATCGACGGCGTGACCAACAAGGTGAACTCCATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAAGCCGTCGGTCGCGAGTTCAACAACCTGGAACGTCGCATCGAAAACCTGAACAAGAAGATGGAAGACGGTTTCCTGGACGTGTGGACCTACAACGCTGAGCTGCTGGTCCTGATGGAAAACGAGCGTACTCTGGACTTCCACGACAGCAACGTCAAGAACCTGTACGACAAGGTCCGTCTGCAGCTGAAGGACAACGCCAAGGAGCTCGGTAACGGTTGCTTCGAATTTTACCACAAGTGCAACAACGAGTGCATGGAATCCGTCCGCAACGGCACCTACGACTACCCCCAGTACTCCGAAGAGGCCCGCCTGAAGCGTGAAGAGATCTCCGGTGTCAAGCTGGAAAGCATCGGTATCTACCAGATCCTGTCCATCTACTCCACTGTCGCCTCCAGCCTGGTGCTGGCTATCATGATGGCTGGCCTGAGCCTGTGGATGTGCTCCAACGGTAGCCTGCAGTGCCGCATCTGCATCCACCACCACCACCATCACTAA；
HA蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：3)：
MEKIVLLFATISLVKSDHICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAKDILEKTHNGKLCDLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPLCDEFTNVPEWSYIVEKANPANDLCYPGKFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKDSWSDHEASLGVSAACSYQGSSSFFRNVVWLIKKDNAYPTIKKSYNNTNREDLLILWGIHHPNDEAEQTKLYQNPTTYISIGTSTLNQRLVPKIATRSKINGQSGRIDFFWTILKPNDAIHFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMRSEVEYGNCNTRCQTPVGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPQRESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLKDNAKELGNGCFEFYHKCNNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLVLAIMMAGLSLWMCSNGSLQCRICIHHHHHH.
密码子优化后的M1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)：
ATGTCTCTGCTGACCGAGGTGGAGACTTACGTGCTGTCCATCATCCCTTCCGGTCCTCTGAAGGCTGAGATCGCTCAGCGTCTGGAGGATGTGTTCGCTGGTAAGAACGCTGACCTGGAGGCTCTGATGGAGTGGATCAAGACCCGCCCTATCTTGTCCCCTCTGACCAAGGGTATCCTGGGTTTCGTGTTCACCCTGACCGTGCCTTCCGAACGTGGTCTGCAACGTCGTCGTTTCGTGCAGAACGCTCTGAACGGTAACGGTGACCCTAACAACATGGACAAGGCTGTGAAGCTGTACAAGAAGCTGAAGCGCGAGATGACCTTCCACGGTGCTAAGGAGGTGGCTCTGTCCTATTCCACCGGTGCTCTGGCTTCTTGCATGGGTCTGATCTACAACCGCATGGGCACCGTGACTGCTGAAGGTGCTCTGGGTCTGGTTTGTGCTACCTGCGAGCAGATTGCTGACGCTCAGCACCGTTCCCATCGTCAAATGGCTACCACCACCAACCCTCTGATCCGCCACGAAAACCGCATGGTGCTGGCTTCTACCACCGCTAAGGCTATGGAGCAGATGGCTGGTTCCTCCGAGCAAGCTGCTGAGGCTATGGAGGTGGCTTCCCAAGCTCGCCAGATGGTGCAAGCTATGCGCACTGTGGGTACTCACCCTAACTCCTCCACCGGTCTGAAGGACGACCTGATCGAGAACCTGCAGGCTTACCAGAACCGCATGGGTGTTCAACTGCAGCGCTTCAAGCACCATCA CCACCACCACTAA；
M1蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：4)：
MSLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNADLEALMEWIKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYKKLKREMTFHGAKEVALSYSTGALASCMGLIYNRMGTVTAEGALGLVCATCEQIADAQHRSHRQMATTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASQARQMVQAMRTVGTHPNSSTGLKDDLIENLQAYQNRMGVQLQRFKHHHHHH.
(2)构建重组杆状病毒质粒
将重组转递质粒pACEBac-HA和pACEBac-M1分别转化DH10bac感受态细胞(北京博迈德生物)，具体步骤如下：分别取1μL重组转递质粒与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞混合，冰上静置30min，42℃水浴热激45s后立即冰浴2min；加入900μL无抗LB液体培养基，37℃，220rpm振摇培养4h，使用无抗LB液体培养基对菌液进行10倍稀释，稀释到10-1、10-2、10-3稀释度，各取400μL菌液均匀涂布于三抗LB平板(庆大霉素(7μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10μg/mL))中，37℃温箱中放置48h；培养48h后，挑取白色单克隆菌落进行扩大培养，经PCR鉴定正确后提取质粒，得到重组杆状病毒质粒，分别命名为Bacmid-HA和Bacmid-M1。
实施例2重组杆状病毒BV-HA和BV-M1的获得
1、利用脂质体介导转染法，将实施例1制得的重组杆状病毒质粒(Bacmid-HA和Bacmid-M1)分别转染sf9昆虫细胞(草地贪夜蛾细胞)(Invitrogen公司)。转染的具体步骤如下：
(1)确认待处理六孔板中Sf9细胞处于对数期(1.0～2.5×106cell/mL)，且细胞活率高于95％；
(2)取1μL重组杆状病毒质粒(浓度在1000ng/μL以上)稀释于100μL Grace’s溶液(昆虫细胞液体培养基；Thermo Fisher Scientific)中，轻轻混匀；使用前混匀CellfectinTM II脂质体，吸取6～8μL至100μL Grace’s溶液中，短暂涡旋混匀；将稀释后的重组杆状病毒质粒与稀释的CellfectinTM II混合(总体积约210μL)，轻轻混匀并在室温下孵育15～30min，得到DNA-脂质体混合物；
(3)吸取800μL Grace’s溶液至步骤(2)中的DNA-脂质体混合物中补足1mL；弃去六孔板中的培养基，使用Grace’s溶液清洗一次，清洗完毕后在细胞中逐滴加入上述大约1mL的DNA-脂质体混合物，27℃下孵育细胞3～5h；
(4)吸出DNA-脂质体混合物，使用Grace’s溶液清洗一次，加入2mL Sf-900TM IISFM昆虫细胞培养基；将六孔板放于27℃培养箱中培养，观察到细胞病变后收取细胞培养上清，即可获得第一代重组杆状病毒(P1代)；
2、将P1代重组杆状病毒接种sf9细胞，待细胞病变明显时，收集细胞上清(即P2代重组杆状病毒)，依此方法，继续获得P3代重组杆状病毒，将其分别命名为重组杆状病毒rBac-HA和rBac-M1。
3、使用间接免疫荧光法(IFA)检测目的基因的表达
分别使用P3代重组杆状病毒(rBac-HA、rBac-M1)感染sf9细胞，感染48h后进行间接免疫荧光试验，简要步骤如下：
(1)将六孔板中培养基弃去，每孔加入预冷的纯甲醇溶液，放入4℃冰箱固定10min；
(2)弃去固定液，加入PBS溶液，重复清洗3次；
(3)加入稀释的一抗(针对H5亚型HA蛋白的一抗为H5亚型HA鼠单克隆抗体(溯本源和生物)；针对M1蛋白的一抗为His标签鼠单克隆抗体(Bioword公司))，37℃孵育1h；
(4)弃液，加入PBS溶液清洗，重复3次；
(5)加入稀释的二抗(二抗为FITC偶联羊抗鼠IgG抗体(Bioword公司))，37℃孵育1h；
(6)重复步骤(4)；
(7)使用荧光显微镜观察，以sf9细胞为对照，结果显示HA和M1重组杆状病毒感染孔均可检测到特异性荧光，而sf9对照细胞孔无特异性荧光产生(图1)。
实施例3H5N1病毒样颗粒的组装和纯化
(1)病毒样颗粒的组装和收获
将实施例2中制备的P3代HA和M1重组杆状病毒(rBac-HA、rBac-M1)按照MOI＝2：1的比例共感染High five昆虫细胞(Invitrogen)，悬浮培养，培养96h后收集培养上清。收集的上清经4℃，2 000x g离心30min去除细胞碎片；再经4℃，30000x g离心60min收获病毒样颗粒。收获的病毒样颗粒经PBS重悬后，保存在4℃备用。收获的病毒样颗粒血凝效价可达13log2。
(2)病毒样颗粒的鉴定
将步骤(1)中收获的病毒样颗粒进行SDS-PAGE和Western blot分析。Westernblot分析中，鉴定HA蛋白的一抗为H5亚型流感血凝素HA单克隆抗体(溯本源和生物，北京)，鉴定M1蛋白的一抗为His-tag(4C2)mouse monoclonal antibody(Bioword公司)。二抗为荧光标记的鼠二抗(800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody，LI-COR Biosciences公司)，以正常High five昆虫细胞上清作为阴性对照。结果如图2所示，HA蛋白约为65kDa，M1蛋白约为28kDa。
(3)病毒样颗粒的纯化
配制不同浓度的蔗糖溶液：配制20％、30％、45％、60％(w/v)的蔗糖溶液，0.22μm滤器过滤；离心管从上至下分别加入20％、30％、45％、60％的蔗糖溶液，最上方加入病毒样颗粒样品，经4℃，100000×g离心1h；离心结束后，收取蔗糖层间白色透明带；10000×g，4℃离心1.5h去除蔗糖；使用PBS缓冲液重悬病毒样颗粒样品，4℃保存备用。
(4)透射电镜观察病毒样颗粒的形态结构
将步骤(3)中收获的病毒样颗粒样品滴加到碳涂层铜网上吸附，在室温下孵育2min。用吸水纸轻轻吸去铜网上的多余液体，干燥后用1wt.％的磷钨酸负染样品，并在室温下孵育10min；再用吸水纸缓慢吸弃铜网上多余的磷钨酸，室温晾干。透射电子显微镜观察结果如图3所示：颗粒大小约100nm，表面可见纤突。
实施例4 H5N1 VLP疫苗同源保护效力评估
(1)疫苗的制备
将实施例3中制备的病毒样颗粒(简称VLP)以免疫剂量与MontanideTM ISA 201VG佐剂(简称ISA 201)按照1：1(v/v)的比例混合乳化制备疫苗。
(2)疫苗的免疫程序
3周龄SPF鸡购于广东省新兴大华农禽蛋有限公司，随机分为2组，分组及免疫情况见表1。疫苗组经颈部皮下免疫病毒样颗粒疫苗，0.3ml(含40μg VLP)/鸡；对照组注射PBS缓冲液，0.3ml/鸡。
表1动物免疫实验分组
| 分组 | SPF鸡数量(只) | 免疫剂量 |
| VLP+ISA 201 | 10 | 40μg VLP |
| PBS | 5 | 0.3mL |
(3)血清抗体检测结果
免疫后第3周对所有试验鸡采血并分离血清，利用常规血清抑制(HI)试验进行抗体检测。H5N1-SD57毒株制备同源四单位抗原(四单位抗原配制：测定禽流感病毒抗原的血凝效价，以完全血凝的最高稀释倍数为终点，终点稀释倍数除以4即为4HAU的稀释倍数，使用PBS缓冲液将抗原稀释至4HAU。4HAU复核：准备96孔V型板，每孔加入25μL PBS缓冲液；第1孔加入25μL的4HAU，连续2倍倍比稀释至第3孔；加入25μL的1％鸡红细胞悬液，室温静置30min，观察结果)。结果如图4a所示，免疫后3周，病毒样颗粒疫苗诱导的平均HI效价达6.9log2。
(4)同源攻毒保护实验结果
免疫后第3周使用H5N1-SD57毒株以106.0EID50的剂量攻毒，滴鼻接种，0.2ml/鸡。攻毒后14天内观察试验鸡的发病和死亡情况并记录。在攻毒后第5天采集咽喉和泄殖腔拭子进行病毒分离，统计排毒情况。存活结果如图4b所示，攻毒后PBS组在2天内全部死亡，且伴随典型禽流感发病症状；攻毒后14天内疫苗组SPF鸡全部存活，且无临床症状表现。排毒结果如表2所示，攻毒后第5天疫苗组未检测到鸡只排毒。
表2疫苗攻毒保护结果
注：a,因实验鸡死亡未采集拭子样品。
实施例5 H5N1 VLP疫苗异源保护效力评估试验1
(1)疫苗的制备
将实施例3中制备的病毒样颗粒(简称VLP)以免疫剂量与MontanideTM ISA 201VG佐剂(简称ISA 201)按照1：1(v/v)的比例混合乳化制备疫苗；以免疫剂量与MontanideTMISA71VG佐剂(简称ISA 71)按照3：7(v/v)的比例混合乳化制备疫苗。
(2)疫苗的免疫程序
3周龄SPF鸡购于广东省新兴大华农禽蛋有限公司，随机分为3组，分组及免疫情况见表3。疫苗组经颈部皮下免疫病毒样颗粒疫苗，0.3ml(含40μg VLP)/鸡；对照组注射PBS缓冲液，0.3ml/鸡。
表3动物免疫实验分组
| 分组 | SPF鸡数量(只) | 免疫剂量 |
| VLP+ISA 201 | 10 | 40μg VLP |
| VLP+ISA 71 | 10 | 40μg VLP |
| PBS | 5 | 0.3mL |
(3)血清抗体检测结果
免疫后第3周对所有试验鸡采血并分离血清，利用HI试验和微量中和试验进行抗体检测(检测方法参考文献进行：Kong D,Chen T,Hu X,Lin S,Gao Y,Ju C,etal.Supplementation of H7N9 Virus-Like Particle Vaccine With RecombinantEpitope Antigen Confers Full Protection Against Antigenically Divergent H7N9Virus in Chickens.(2022)13.doi:10.3389/fimmu.2022.785975.)。H5N1-SD57毒株制备同源四单位抗原(4HAU)，异源四单位抗原由H5N1-D889毒株(A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)(H5N1-D889))制备而成(具体制备方法同实施例4)。结果如图5所示，免疫后3周，两疫苗组平均同源HI效价均为6.625log2；VLP+ISA 201疫苗组平均异源HI效价达2log2，VLP+ISA 71疫苗组平均异源HI效价达2.125log2；VLP+ISA 201疫苗组针对异源株的平均中和抗体效价达1:10，VLP+ISA 71疫苗组针对异源株的平均中和抗体效价达1:12。
(4)异源攻毒保护实验结果
免疫后第3周使用H5N1-D889毒株以106.0EID50的剂量分别攻毒，滴鼻接种，0.2ml/鸡。攻毒后14天内观察试验鸡的发病和死亡情况并记录。在攻毒后的3、5、7天采集咽喉和泄殖腔拭子进行病毒分离，统计排毒情况。结果见表4、图6：攻毒后，PBS对照组2天内全部死亡；攻毒14天内VLP+ISA 201疫苗组40％的鸡存活，并且检测到6只鸡排毒；攻毒14天内VLP+ISA 71疫苗组90％的鸡存活，且检测到7只鸡排毒。
表4异源攻毒后排毒结果
注：a，攻毒后天数；b,因实验鸡死亡未采集拭子样品。
实施例6H5N1 VLP疫苗异源保护效力评估试验2
(1)疫苗的制备
将实施例3中制备的病毒样颗粒(简称VLP)以免疫剂量与MontanideTM ISA 71VG佐剂(简称ISA 71)按照3：7(v/v)的比例混合乳化制备疫苗。
(2)疫苗的免疫程序
3周龄SPF鸡购于广东省新兴大华农禽蛋有限公司，随机分为2组，分组及免疫情况见表5。疫苗组经颈部皮下免疫病毒样颗粒疫苗，0.3ml(含80μg VLP)/鸡；对照组注射PBS缓冲液，0.3ml/鸡。
表5动物免疫实验分组
(3)血清抗体检测结果
免疫后第3周对所有试验鸡采血并分离血清，利用常规HI试验和微量中和实验进行抗体检测(检测方法参考文献进行：Kong D,Chen T,Hu X,Lin S,Gao Y,Ju C,etal.Supplementation of H7N9 Virus-Like Particle Vaccine With RecombinantEpitope Antigen Confers Full Protection Against Antigenically Divergent H7N9Virus in Chickens.(2022)13.doi:10.3389/fimmu.2022.785975.)。H5N1-SD57毒株制备同源四单位抗原(4HAU)，异源四单位抗原由H5N1-D889毒株(A/Chicken/Guangdong/D889/2015(H5N1)(H5N1-D889))制备而成(具体制备方法同实施例4)。结果如图7所示，免疫后3周，疫苗组平均同源HI效价达9.25log2，平均异源HI效价达2.625log2；疫苗组针对异源株的平均中和抗体效价达1:140。
(4)异源攻毒保护实验结果
免疫后第3周使用H5N1-D889毒株以106.0EID50的剂量攻毒，滴鼻接种，0.2ml/鸡。攻毒后14天内观察试验鸡的发病和死亡情况并记录。在攻毒后的3、5、7天采集咽喉和泄殖腔拭子进行病毒分离，统计排毒情况。结果见表6、图8：攻毒后，PBS对照组试验鸡1天内全部死亡；攻毒后14天疫苗组试验鸡全部存活，且未检测到排毒。
表6异源攻毒后排毒结果
注：a，攻毒后天数；b,因实验鸡死亡未采集拭子样品。
上述所有的动物试验结果表明：本发明提供的H5N1亚型病毒样颗粒联合佐剂可诱导交叉保护抵抗同源和异源H5N1亚型高致病性禽流感病毒的攻击。本发明制备的病毒样颗粒疫苗为防控H5N1亚型禽流感提供新的疫苗选择。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒在制备抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗中的应用，其特征在于：所述病毒样颗粒由H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白和H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白组装而成；其中，
所述的H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：编码所述H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的基因如SEQ ID NO：1所示，编码所述H7N9亚型禽流感病毒M1蛋白的基因的如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒通过如下方法制备得到：
（1）将来源于H5N1亚型禽流感病毒的HA基因和来源于H7N9亚型禽流感病毒的M1基因经密码子优化后分别连接到杆状病毒转递质粒中，得到HA基因重组转递质粒和M1基因重组转递质粒；其中，优化后的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，优化后的M1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
（2）将步骤（1）中得到的HA基因重组转递质粒和M1基因重组转递质粒经转化重组，分别得到HA基因重组杆状病毒质粒和M1基因重组杆状病毒质粒；
（3）将步骤（2）中得到的HA基因重组杆状病毒质粒和M1基因重组杆状病毒质粒经脂质体介导转染sf9昆虫细胞，收获培养上清，分别得到P1代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒；
（4）将步骤（3）中得到的P1代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞进行传代，连续传代2次，分别得到P3代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒；
（5）将步骤（4）中得到的P3代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒通过共感染的方式感染昆虫细胞，收取细胞培养上清，得到由HA蛋白和M1蛋白组装而成的病毒样颗粒，即所述抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
步骤（1）中所述的杆状病毒转递质粒为pACEBac1；
步骤（2）中所述的转化为转化DH10bac感受态细胞；
步骤（5）中所述的昆虫细胞为昆虫细胞High five；
步骤（5）中所述的P3代HA基因重组杆状病毒和M1基因重组杆状病毒共感染昆虫细胞时，感染复数MOI为2:1。
5.一种抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗，其特征在于：包括权利要求1或2中所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒以及药学上可以接受的载体。
6.根据权利要求5所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗，其特征在于：
所述的药学上可以接受的载体为佐剂；
所述的佐剂为水包油包水型佐剂和油包水型佐剂中的至少一种；
所述的水包油包水型佐剂为Montanide ISA 201 VG佐剂；
所述的油包水型佐剂为Montanide ISA 71 VG佐剂。
7.权利要求5或6所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1或2中所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒和佐剂混合乳化，得到抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：当佐剂为水包油包水型佐剂时，水包油包水型佐剂和感病毒样颗粒的体积比为1：1；当佐剂为油包水型佐剂时，油包水型佐剂和病毒样颗粒的体积比为7：3。
9.权利要求1或2中所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒和权利要求5或6所述的抗H5N1亚型禽流感的病毒样颗粒疫苗中的至少一种在制备预防和/或治疗H5N1亚型禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。
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