CN109694857A - 表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒及其应用。本发明首先公开了一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS‑1株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.16820。本发明进一步公开了所述重组杆状病毒ChS‑1株在制备预防猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用。本发明还公开了一种猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法，包括：增殖重组杆状病毒ChS‑1株，表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，收获抗原液；将抗原液灭活后与佐剂混合，乳化，即得。本发明所述重组杆状病毒ChS‑1株的Cap蛋白表达量高、病毒滴度高，所制备灭活疫苗的安全性及免疫效果好，能够用于猪圆环病毒3型的防控。

Description

表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒及其应用
技术领域
本发明涉及一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒，还涉及所述重组杆状病毒在制备预防猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用，属于表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建领域。
背景技术
猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种小而无囊膜、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，是目前兽医学上发现的最小的动物病毒。
目前，PCV可分为3个基因型，即PCV-1、PCV-2和PCV3。PCV-1为非致病性PCV，PCV-2和PCV-3均对猪有致病性，可引起PMWS(断奶仔猪多系统衰竭综合征)，又称PMWS相关PCV。PCV-3是由Palinski等从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定，其基因组长2.0kb，随后世界上许多国家和地区都有该病的报道，中国学者对国内部分省区的PCV-3流行情况进行了调查，湛洋等对江苏、湖南、湖北疑似猪皮炎肾炎综合征的病猪组织样品进行PCV-3巢式PCR检测，结果在这些病料中检测到PCV-3的存在；贺会利等从广西某猪场腹泻死亡仔猪的病料样品中检测到PCV-3；刘晓东等对中国10个省区106份样品进行PCR检测，结果表明安徽、江西、山东、福建、河南和广西存在PCV-3阳性猪场，给中国的养猪业造成严重的经济损失。
目前，中国国内尚无猪圆环病毒3型疫苗。由于该病传播流行的快速以及其较高的致病性，应当引起养殖户以及兽医防控机构的高度重视，需要尽早开展针对该病研究。同时结合对PCV-2防控的成功经验，疫苗研制，尤其是新型的猪圆环病毒3型疫苗的研制，已是当务之急。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株在制备预防或治疗猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明从吉林、河北和山东疑似猪圆环病毒发病的病料中提取PCV3毒株DNA，然后用特异性引物分别扩增Cap蛋白基因(ORF2)，连接至载体pOET1构建获得重组质粒pOET1-ORF2-ChS-1、pOET1-ORF2-HaD-1和pOET1-ORF2-RiZ-1。本发明进一步将昆虫病毒DNA(flashBACPrime)与转移质粒(pOET1-ORF2-ChS-1、pOET1-ORF2-HaD-1和pOET1-ORF2-RiZ-1)分别共转染Sf9昆虫细胞，获得3株PCV3重组杆状病毒，分别命名为ChS-1株、HaD-1株和RiZ-1株。本发明对三株重组杆状病毒进行病毒滴度和表达量的测定，结果表明ChS-1株的病毒滴度达到8.2×107pfu/ml，120小时上清中Cap蛋白含量达58.56μg/ml。ChS-1株在病毒含量及Cap蛋白表达量上均明显优于其他两个毒株。
本发明获得的重组杆状病毒ChS-1株，其ORF2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。
本发明将获得的Cap蛋白表达量高、病毒效价良好的表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.16820；分类命名为：表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的杆状病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2018年11月28日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明对重组杆状病毒ChS-1株用特异性引物进行PCR鉴定，结果为阳性。本发明对重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白的鉴定结果表明，重组杆状病毒ChS-1株表达的PCV3Cap蛋白分子量与预期一致；表达的PCV3ORF2蛋白能够形成病毒样粒子，大小约为17nm，与真正的PCV3病毒形态大小相似，证明表达的PCV3衣壳蛋白能够正确的形成病毒样颗粒。
本发明进一步公开了所述的重组杆状病毒ChS-1株在制备预防或治疗猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用。
本发明进一步公开了一种预防猪圆环病毒3型的疫苗组合物，包括：预防上有效量的灭活的重组杆状病毒ChS-1株以及药学上可接受的佐剂或载体。
本发明还公开了一种猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)增殖所述的重组杆状病毒ChS-1株，表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，收获抗原液；(2)将抗原液加入灭活剂进行灭活，灭活后抗原液与佐剂混合，乳化，即得。
其中，步骤(1)将所述的重组杆状病毒ChS-1株接种昆虫细胞进行增殖，收取病变细胞，冻融，离心，取上清液，得到抗原液。
步骤(1)所述昆虫细胞为Sf9或Highfive昆虫细胞；采用转瓶培养或生物反应器悬浮培养昆虫细胞，待细胞密度达到1.5-2.0×106.0cells/ml时进行病毒接种；所述接种为按MOI为1.0的接种量进行接种；接种后以110-130r/min 27℃培养96-120h，当80％以上细胞病变时收获培养物。所述抗原液中猪圆环病毒3型Cap蛋白的浓度≥10μg/ml。
步骤(2)所述灭活剂为二乙烯亚胺(BEI)溶液；优选的，所述灭活剂的终浓度为5.0mM。所述灭活的条件为：在pH7.8±0.2，37℃灭活24小时，然后加入终浓度为5.0mM的硫代硫酸钠溶液终止灭活。
按体积比计，步骤(2)灭活后抗原液：佐剂＝9：1；优选的，所述佐剂为MontanideISA 15A VG佐剂。步骤(2)所述乳化的方法具体为：先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟，即制备成猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗。最终疫苗抗原含量应≥10μg/ml。
本发明还公开了所述的制备方法制备得到的猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗。
安全检验结果表明，本发明猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗的安全性良好，接种疫苗的小鼠全部健活，且没有出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。
效力检验结果表明，本发明所制备的猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗能诱导小鼠产生高效价PCV3抗体。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明构建获得了一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株，该重组杆状病毒的Cap蛋白表达量高，且病毒滴度高。本发明利用重组杆状病毒ChS-1株制备的猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗，安全性良好，免疫小鼠的PCV3血清抗体效价高，疫苗的免疫效果良好，是一种安全、有效的重组杆状病毒亚单位疫苗，能够用于猪圆环病毒3型的防控。
附图说明
图1为实施例1中穿梭载体pOET1示意图；
图2为实施例2中PCV3ORF2PCR鉴定结果图；
图3为实施例1中PCV3ORF2目的蛋白Western-blot结果分析图；其中M为Marker，1为空白对照，2为PCV3ORF2目的蛋白；
图4为实施例2中重组杆状病毒表达PCV3ORF2蛋白电镜负染图；
图5为猪圆环病毒3型Cap蛋白灭活疫苗免疫小鼠的血清抗体。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 PCV3ORF2重组杆状病毒的构建
1、重组质粒pOET1-ORF2的构建
用表1中引物对从吉林、河北和山东疑似猪圆环病毒发病的病料中提取的PCV3毒株DNA中分别扩增Cap蛋白基因(ORF2)，回收后，用BamH I和Xho I分别酶切回收产物，然后与同样酶切的质粒pOET1进行连接，获得的重组质粒，经酶切和PCR鉴定，确定获得重组质粒pOET1-ORF2-ChS-1、pOET1-ORF2-HaD-1和pOET1-ORF2-RiZ-1。载体pOET1示意图见图1。
表1扩增PCV3的Cap蛋白基因引物
2、重组病毒ChS-1的获得
将英国Oxford Expression Technologies公司昆虫病毒DNA(flashBACPrime)与转移质粒(pOET1-ORF2-ChS-1、pOET1-ORF2-HaD-1和pOET1-ORF2-RiZ-1)分别共转染Sf9昆虫细胞(Invitrogen)，获得3株PCV3重组杆状病毒，分别命名为ChS-1株、HaD-1株和RiZ-1株。对得到的三株重组杆状病毒进行病毒滴度和表达量的测定，结果见表2。由表2可知，ChS-1株在病毒含量及Cap蛋白表达量上极显著均优于其它两个毒株。因此，本发明选择ChS-1株作为候选毒株。
本发明获得的Cap蛋白表达量稳定、病毒效价良好的PCV3重组杆状病毒ChS-1株ORF2基因全长645bp，表达214个氨基酸。核苷酸具体序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸具体序列如SEQ ID NO.2所示。
表2不同毒株病毒滴度及Cap蛋白表达量的测定结果
对获得的重组杆状病毒ChS-1株用表1引物进行鉴定，结果为阳性，鉴定结果见图2。
将获得的重组杆状病毒ChS-1株感染Sf9细胞，进行扩繁，在转染后72小时收集上清液，作为原始毒种，保存于-80℃。
本发明将表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.16820。
实施例2猪圆环病毒3型重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白的鉴定
1、细胞制备
将冻存的Sf9工作细胞库细胞从液氮中取出后，立即置37℃水浴中快速融化，用吸管转移至75ml细胞瓶中，加入适量的Sf-900II无血清营养液，置27℃恒温培养箱静止培养，待其贴壁后，弃营养液，加入新鲜的Sf-900II无血清营养液，置27℃恒温培养箱中培养观察，待细胞形成单层后，按1:5比例进行传代。以同样的方法进行传代，扩大培养，直到扩增到需要的细胞数量。
2、病毒接种
将处于对数生长期的Sf9细胞用Sf-900II无血清培养基稀释成不超过2×106/ml的细胞悬液，取100ml细胞悬液加入摇瓶中，将毒种按MOI为1.0的接种量接种细胞，置27℃、110r/min的摇床上培养120小时(确保细胞能充分接触到氧气)。从培养瓶中取出少量细胞，在光学显微镜下观察细胞状态，当80％以上细胞被感染，取出，3000r/min离心15min，收集上清，2～8℃保存。
3、病毒样颗粒分子量测定
将处于对数生长期的Sf9细胞用Sf-900II无血清培养基稀释成不超过2.0×106/ml的细胞悬液，取50～200ml细胞悬液加入摇瓶中，按MOI为0.5～1.0将毒种接种到摇瓶中，置27℃、110～130r/min的摇床上培养96～120小时，当80％以上细胞发生病变时收获培养物。经Western-blot转印进行PCV3Cap蛋白分子量鉴定，结果见图3。
4、电镜负染检测
对收集的病毒上清液进行电镜负染检测。结果如图4所示，表达的PCV3ORF2蛋白能够形成病毒样粒子，大小约为17nm，与真正的PCV3病毒形态大小相似，证明表达的PCV3衣壳蛋白能够正确的形成病毒样颗粒。
实施例3猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗的制备及其应用
1、猪圆环病毒3型重组杆状病毒抗原液的获得
1.1细胞制备
将冻存的Sf9工作细胞库细胞进行无血清培养，待细胞形成单层后，按1:5比例进行传代。以同样的方法进行传代，扩大培养，直到扩增到需要的细胞数量。
1.2一级生物反应器细胞培养
取上述培养的细胞，调整细胞浓度至4.0×106.0cells/ml，按一定比例加入一级生物反应器，使细胞浓度达到0.5×106.0cells/ml，27℃培养48～72h，待细胞密度达4.0×106.0cells/ml时，接种到二级生物反应器扩大，进行扩大细胞培养。
1.3二级生物反应器培养
将一级生物反应器细胞按一定比例接种至二级生物反应器，扩大培养，使细胞密度为0.5×106.0cells/ml，进行全悬浮无血清培养。待细胞密度达1.5～2.0×106.0cells/ml时，进行病毒接种。
2、病毒接种
当生物反应器中细胞密度达到1.5～2.0×106.0cells/ml时，将生产用毒种按MOI为1.0接种量进行接种，调整生物反应器搅拌转速为110r/min，溶氧为70％，pH为6.2左右。接毒后逐日取样观察细胞病变状况，当80％以上细胞病变时收获。反复冻融3次后，离心去除细胞碎片，收集上清，依次经过用孔径为0.45μm滤膜和0.22μm滤膜进行过滤除菌，2～8℃保存过滤液。
3、病毒灭活
向收获的抗原液中加入终浓度为5.0mM的BEI溶液，充分搅拌，在pH7.8±0.2、37℃条件下搅拌灭活24小时，加入终浓度为5.0mM的硫代硫酸钠溶液，中和BEI，以保证PCV3重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的安全性。
取灭活后的抗原液，按培养基总量的5％接种于已形成良好单层的Sf9细胞，置27℃培养观察4日，冻融2次后，再盲传2代，最后一代培养7日后进行间接免疫荧光检测。没有出现特异性荧光，抗原液灭活完全。
4、灭活疫苗的制备
将灭活检验合格的猪圆环病毒3型重组杆状病毒ChS-1株Cap蛋白抗原液，按照与Montanide ISA 15A VG佐剂＝9:1的比例混合，先将水相加入乳化罐内慢速搅拌，然后缓慢加入油相佐剂，加完后以800r/min搅拌30分钟，再静止30分钟，制备成猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗。最终疫苗抗原含量应≥10μg/ml。
5、疫苗效价检验
5.1安全检验
取体重16～18g小鼠8只，每只腹腔接种0.5ml，观察7日时全部健活，且没有出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。
5.2效力检验
取20只16～18g小鼠(SPF)，随机分2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗0.1ml(相当于正常免疫剂量的1/20)；第2组不免疫，作空白对照，接种相同剂量的乳化剂(以PBS为液相，与佐剂按9:1比例乳化)。免后24天采血，分离血清，测定PCV3的ELISA抗体效价，结果见图5。检测结果表明，本发明所制备的灭活疫苗能诱导小鼠产生高效价PCV3抗体。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈药集团生物疫苗有限公司
<120> 表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒及其应用
<130> HLJ-3002-181025A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 645
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(642)
<400> 1
atg aga cac aga gct ata ttc aga aga aga ccc cgc cca agg aga cga 48
Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg
1 5 10 15
cga cgc cac ata aag cgc tat gtc aga aga aaa cta ttc att agg agg 96
Arg Arg His Ile Lys Arg Tyr Val Arg Arg Lys Leu Phe Ile Arg Arg
20 25 30
ccc aca gct ggc aca tac tac aga aag aaa tac tcc acc atg aac gtc 144
Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Arg Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val
35 40 45
att tcc gtt gga acc cct cag aat aac aag ccc tgg cac gcc aac cac 192
Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His
50 55 60
ttc att acc cgc cta aac gaa tgg gaa acc gcg att agc ttt gaa tac 240
Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr
65 70 75 80
tat aag ata cta aag atg aaa gtt aca ctc agc cct gta att tct ccg 288
Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro
85 90 95
gct cag caa aca aaa act atg ttc ggg cac aca gcc ata gat cta gac 336
Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp
100 105 110
ggc gcc tgg acc aca aac act ttg ctc caa gac gac cct tat gca gaa 384
Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Leu Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu
115 120 125
agt tcc act cgt aaa gtt atg act tct aaa aaa aaa cac agc cgt tac 432
Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr
130 135 140
ttc acc ccc aaa cca att ctg gcg gga act acc agc gct cac cca gga 480
Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly
145 150 155 160
caa agc ctc ttc ttt ttc tcc aga ccc acc cca tgg ctc aac aca tat 528
Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr
165 170 175
gac ccc acc gtt caa tgg gga gca ctg ctt tgg agc att tat gtc ccg 576
Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro
180 185 190
gaa aaa act gga atg aca gac ttc tac ggc acc aaa gaa gtt tgg att 624
Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile
195 200 205
cgt tac aag tcc gtt ctc taa 645
Arg Tyr Lys Ser Val Leu
210
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> Artifical sequence
<400> 2
Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg His Ile Lys Arg Tyr Val Arg Arg Lys Leu Phe Ile Arg Arg
20 25 30
Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Arg Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val
35 40 45
Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His
50 55 60
Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr
65 70 75 80
Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro
85 90 95
Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp
100 105 110
Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Leu Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu
115 120 125
Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr
130 135 140
Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly
145 150 155 160
Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr
165 170 175
Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro
180 185 190
Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile
195 200 205
Arg Tyr Lys Ser Val Leu
210
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
cgcggatccc cgccatgaga cacagagcga ggcg 34
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
ccgctcgagt cacttagaga acggacttgt aac 33

Claims (10)

1.一株表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒ChS-1株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.16820。
2.按照权利要求1所述的重组杆状病毒ChS-1株，其特征在于，其ORF2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。
3.权利要求1或2所述的重组杆状病毒ChS-1株在制备预防或治疗猪圆环病毒3型的药物或试剂中的应用。
4.一种预防猪圆环病毒3型的疫苗组合物，其特征在于，包括：预防上有效量的灭活的权利要求1或2所述重组杆状病毒ChS-1株以及药学上可接受的佐剂或载体。
5.一种猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)增殖权利要求1或2所述的重组杆状病毒ChS-1株，表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，收获抗原液；(2)将抗原液加入灭活剂进行灭活，灭活后抗原液与佐剂混合，乳化，即得。
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)将权利要求1或2所述的重组杆状病毒ChS-1株接种昆虫细胞进行增殖，收取病变细胞，冻融，离心，取上清液，得到抗原液。
7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述昆虫细胞为Sf9或Highfive昆虫细胞；
所述接种为按MOI为1.0的接种量进行接种；
所述抗原液中猪圆环病毒3型Cap蛋白的浓度≥10μg/ml。
8.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活剂为二乙烯亚胺溶液；优选的，所述灭活剂的终浓度为5.0mM；
所述灭活的条件为：37℃灭活24小时，然后加入终浓度为5.0mM的硫代硫酸钠溶液终止灭活。
9.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：按体积比计，步骤(2)灭活后抗原液：佐剂＝9：1；
优选的，所述佐剂为Montanide ISA 15A VG佐剂。
10.权利要求5至9任何一项所述的制备方法制备得到的猪圆环病毒3型重组杆状病毒灭活疫苗。
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