CN104805060B - 一种伪狂犬病病毒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病病毒及其在制备疫苗中的应用，本发明提供的猪伪狂犬病病毒的保藏编号为CGMCC No.10266。本发明筛选的猪伪狂犬病病毒具有安全性好，且保护率高的特点，用本发明猪伪狂犬病病毒PRV‑QD株接种Vero细胞，收获细胞毒液，提取该分离株的DNA，采用基因工程的方法对该分离株进行毒力基因TK、gE和gI基因的缺失，并在细胞上进行拯救后，繁毒，加入保护剂后制成疫苗。制成的疫苗对仔猪的保护率为100％，效果明显优于Bartha‑K61组(20％)，此疫苗具有高效、安全性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于家畜病源微生物筛选技术领域，具体涉及一种伪狂犬病病毒及其在制备疫苗中的应用。
背景技术
猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科猪疱疹病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病(Pseudorabies,PR)。该病在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。目前尚无治疗PR的有效药物，因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。世界上使用最广泛的疫苗主要是PRVBartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状为现有该疫苗不能完全保护新流行PRV的攻击，给免疫猪场造成了一定的经济损失。因此，需要在国内分离新的流行株，并对其毒力基因进行缺失，获得一株新的PRV基因缺失疫苗来预防该病毒对养殖业的侵袭。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病病毒及其在制备疫苗中的应用；用该病毒制备的疫苗具有高效、安全性好、保护率高的优点，从而为猪伪狂犬病防控措施的制定提供可靠的依据。
本发明提供的猪伪狂犬病病毒QD株(疱疹病毒Ⅰ型Porcine herpesvirus Type Ⅰ)已于2015年3月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10266。
上述的猪伪狂犬病病毒为PRV QD株。
本发明的猪伪狂犬病病毒用于制备疫苗。
本发明筛选的猪伪狂犬病病毒具有安全性好，且保护率高的特点，用本发明猪伪狂犬病病毒PRV QD株接种Vero细胞，收获细胞毒液，提取该分离株的DNA，采用基因工程的方法对该分离株进行毒力基因TK和gE基因的缺失，并在细胞上进行拯救后，繁毒，加入保护剂后制成疫苗。制成的疫苗对仔猪的保护率为100％，效果明显优于Bartha-K61组(20％)，此疫苗具有高效、安全性好的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：猪伪狂犬病病毒的分离
最近几年我国多个猪场都发生了伪狂犬病，其中大部分是种猪场，而发病猪群之前已经注射了伪狂犬疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病猪群中进行了猪伪狂犬病毒的筛选。
取发病猪内脏样本,包括:心脏、肝脏、肺脏、脾脏、扁桃体和淋巴结等。将内脏样本与PBS(0.1M,pH7.2)以V/V1:5制成匀浆，反复冻融3次，3000r/min离心15min，取上清中加双抗，37℃感作1h，经0.22μm滤膜过滤除菌。取1ml病毒滤液接种于长成单层的Vero细胞，盲传三代，观察细胞病变(CPE)。将出现CPE的细胞培养液进行空斑纯化，纯化后的病毒分装保存至-70℃备用，并测定病毒含量。
实施例2：筛选的猪伪狂犬病病毒的培育及鉴定
1.培育 将筛选的猪伪狂犬病病毒命名为PRV QD株，经PCR鉴定该毒株为强毒，经Vero细胞培养驯化，病毒含量达107.0TCID50/0.1ml以上。该病毒已于2015年3月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10266。
2.鉴定
2.1 引物设计 参照已发表的PRV gE基因片段，采用Oligo 7.0设计1对引物扩增全长：
F1:5′-ATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCC-3′；
F2:5′-TTAAGCGGGGCGGGACATCAACAGGC-3′。
2.2 鉴定结果 对于本发明筛选的毒株进行PCR检测，测序后进行blast分析，发现保藏编号为CGMCC No.10266的猪伪狂犬病病毒的gE基因与2012年之后报道的猪伪狂犬病病毒的相对应的序列虽然存在至少2个氨基酸的差异，但是亲缘关系较近，均处于一个相对独立的分支中，与之前分离的毒株亲缘关系较远。且与最近分离的毒株具有相同的分子特征，即在gE基因第48位和第492-496位各有1个天冬氨酸的插入，其他报道也证实也这一点。而以前分离到的毒株只个别有一个位置插入氨基酸，绝大部分没有插入。因此可以推测上述的差异正是导致已有的猪伪狂犬病病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。
该毒株作100倍稀释后，与等量猪伪狂犬病病毒抗血清中和，病毒均能被高免血清特异性中和；而与等量猪细小病毒、猪流感病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒抗血清中和组，细胞呈现明显的细胞病变，可见该病毒特异性好。该毒株制备的疫苗免疫BALB/C小鼠后，能降低小鼠的死亡率。
2.3 毒种保存 由表内结果可见，本发明分离毒湿毒在-70℃保存36个月病毒含量仍较稳定。(参见表1)
表1：保存不同时间病毒含量测定
2.4 物理特性 PRV对热敏感，56℃30min可灭活。
实施例3：制苗用抗原的制备
从临床分离的猪伪狂犬病病毒中提取该分离株的DNA，采用基因工程的方法对该分离株依次进行毒力基因TK、gE和gI基因的缺失，并在细胞上进行拯救后命名为PRV/TK-/gE-/gI-毒种，繁毒，加入保护剂后作为种子毒。
PRV/TK-/gE-/gI-毒种安全性试验：用PBS将抗原稀释10倍，肌肉接种100克小鼠四只，每只0.2mL，观察14天，其反应或死亡的不得超过两只。结果表明：该疫苗对小鼠是安全的，无伪狂犬特异性症状，不影响生长发育。
上述毒种安全性试验结果说明本发明改造的猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗(PRV/TK-/gE-/gI-)是安全的，可以用来制备疫苗。
PRV/TK-/gE-/gI-的免疫效力检测：
将6周龄的BALB/C小鼠随机分成3组，每组5只并称重，分别注射疫苗株Bartha-K61、缺失株PRV/TK-/gE-/gI-和DMEM。对照组每只注射100μL DMEM，其它两组后肢肌肉注射104TCID50病毒剂量的疫苗。免疫后每日观察小鼠的临床症状，有无精神萎靡、厌食、瘙痒、震颤等，21d再次称重，并于14d、21d尾静脉采血，分离血清，用PRV QD株全病毒包被的ELISA板检测血清抗体水平。免疫后21d用PRV QD株攻毒，以104TCID50的剂量接种各试验组及对照组，采用后肢肌肉注射，接种病毒后连续观察14d。
对小鼠的免疫效力试验结果表明：采用疫苗株Bartha-K61和缺失株PRV/TK-/gE-/gI-免疫6周龄的BALB/C小鼠，小鼠精神状态良好，食欲正常，无瘙痒症状，说明缺失株和Bartha-K61株对小鼠是安全的。免疫后21d，Bartha-K61、PRV/TK-/gE-/gI-组及DMEM对照组小鼠平均增重分别为4.4g、3.8g、4.5g，增重差异不大，说明缺失株对小鼠的增重无抑制作用。免疫后14d时仍未检到抗体，21d时PRV/TK-/gE-/gI-组抗体水平明显升高，其他组仍没有明显变化。表明PRV/TK-/gE-/gI-缺失株可诱导小鼠产生明显的免疫反应。免疫21d后用PRVQD株攻毒，PRV/TK-/gE-/gI-组保护率明显高于Bartha-K61组，保护率分别为100％和20％。
实施例4疫苗的制备及效果检测
1 材料
1.1 毒种
制造疫苗用猪伪狂犬病病毒，保藏编号为：CGMCC No.10266。
1.2 试验动物
BALB/C小白鼠，购自山东大学实验动物中心。
1.3 制苗用其它仪器、试剂
均由山东信得科技股份有限公司提供。
2 方法
2.1 制苗过程
Vero细胞按常规方法培养,以5-10 PFU病毒感染细胞,当细胞病变(CPE)达90％左右时收获病毒，置-80℃反复冻融三次，测定病毒的TCID50。根据收获病毒液的毒价，进行适当的稀释，稀释后的病毒液与保护剂的体积比为1:1.5，充分混合，其中蔗糖终浓度为20％，明胶终浓度为4.8％。每瓶装2.5mL，并置冻干机中进行冻干。
2.2 成品检验
2.2.1 性状
观察疫苗的外观颜色、性状、与瓶壁脱离情况及加稀释液后溶解情况。
2.2.2 无菌检验
按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。
2.2.3 支原体检验
按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。
2.2.4 外源病毒检验
按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。
2.2.5 安全检验
用6周龄的BALB/C小鼠10只，肌肉注射0.2ml(含10羽份)疫苗，观察21日，应全部健活，无任何局部或全身不良反应。
2.2.6 效力检验
下列方法任择其一。
2.2.6.1 用细胞检验
按瓶签注明的羽份，将疫苗用10％DMEM稀释至l羽份/0.2ml，再作10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5四个稀释度，分别接种生长状态良好的Vero细胞，每个稀释度接种8个孔，每孔0.2m1，另取8孔为接种10％DMEM作为对照。37℃孵育CO2培养箱中进行孵育3日后，观察病变情况，按Reed-Muench法计算TCID50，病毒含量应≥104.0TCID50/0.2ml。
2.2.6.2 用小鼠检验
取6周龄BALB/C小鼠10只，每只肌肉注射疫苗1羽份。21日后，连同10只对照小鼠，后肢肌肉注射104.0TCID50/只，观察14日。对照组应至少8只死亡或出现伪狂犬特异性症状，免疫组应至少8只保护。
2.2.7 剩余水分测定
按2010年版《中国兽药典》附录方法进行。
2.2.8 真空度测定
按2010年版《中国兽药典》附录方法进行。
2.2.9 疫苗使用效果检验
试验前选取15头30日龄仔猪，随机分成3组，每组5头并称重，分别注射疫苗株Bartha-K61、缺失株PRV/TK-/gE-/gI-疫苗和DMEM。对照组每头注射2mL DMEM，其它两组后肢肌肉注射105.0TCID50病毒剂量的疫苗。免疫后第4周进行攻毒，肌肉注射107.0TCID50PRV株病毒,观察临床症状，计算保护率情况。
3 结果
3.1 病毒含量测定
猪伪狂犬病病毒含量为106.0TCID50/0.1ml。
3.2 成品检验结果
3.2.1 性状
微黄色海绵状疏松团块，上下摇晃时，样品很容易与瓶壁脱离。加入稀释液后均迅速溶解。
3.2.2 无菌检验
疫苗随机取样10瓶，分别用10％DMEM恢复原量，每瓶分别按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。均无细菌、霉菌生长。
3.2.3 支原体检验
疫苗随机取样5瓶，分别用10％DMEM恢复原量并混合，按2010年版《中国兽药典》附录方法进行检验。疫苗均无支原体生长。
3.2.4 外源病毒检验
提取细胞毒基因组，进行外源病毒的PCR鉴定，结果均为阴性，表明疫苗外源病毒检验合格。
3.2.5 安全检验
疫苗取样3瓶，分别用10％DMEM恢复原量后作适当稀释，各肌肉注射0.2ml疫苗，观察21日。结果显示，接种小鼠均无任何不良反应，且10/10健活。
3.2.6 效力检验
3.2.6.1 用细胞检验
按瓶签注明的羽份，将疫苗用10％DMEM稀释至l羽份/0.2ml，再作10倍系列稀释，接种细胞后按照Reed-Muench法计算TCID50，结果表明每羽份为104TCID50。对照小鼠均无伪狂犬的特异性临床症状。
3.2.6.2 用小鼠检验
取6周龄BALB/C小鼠10只，每只肌肉注射疫苗1羽份。21日后，连同10只对照小鼠，后肢肌肉注射104.0TCID50/只，观察14日。结果：对照组10只死亡或出现伪狂犬特异性症状。
3.2.7 剩余水分测定
疫苗取样4瓶用真空干燥法进行检验。结果检验样品剩余水分含量在2.0％～2.7％，均≤4％。说明疫苗剩余水分测定检验均合格。
3.2.8 真空度测定
疫苗分别用真空检漏仪进行检验。结果检验样品均呈紫色辉光。说明疫苗真空度测定检验均合格。
3.2.9 疫苗使用效果
对30日龄仔猪分别免疫疫苗株Bartha-K61、缺失株PRV/TK-/gE-/gI-疫苗和DMEM，免疫后第4周进行攻毒，攻毒结果表明，PRV/TK-/gE-/gI-组保护率明显高于Bartha-K61组，保护率分别为100％和20％。表明本发明的PRV/TK-/gE-/gI-疫苗在临床上的免疫效果明显优于现在广泛使用的Bartha-K61疫苗。
Claims (2)
1.一种猪伪狂犬病病毒，其特征在于，所述的猪伪狂犬病病毒的保藏编号为CGMCCNo.10266。
2.权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒在制备疫苗的减毒病毒株中的应用。
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