CN102086447B - 鸭病毒性肝炎毒株及灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭病毒性肝炎毒株及灭活疫苗的制备方法，该毒株是由以下方法得到的：从发生鸭病毒性肝炎的鸭场采集发生明显病变的鸭肝病料，用含双抗的灭菌PBS冲洗，稀释研磨，两次冻融，离心分离；将分离得到的病毒用灭菌PBS稀释，接种鸡胚，选接种后48～96h死亡且病变典型的鸡胚，分别收获鸡胚液，连续传18～25代，获得鸭肝炎病毒鸡胚适应株。以此毒株作为生产用毒株，接种于鸡胚，收获鸡胚液，灭活后乳化，制备灭活疫苗。本发明的疫苗安全性高，对雏鸭免疫效果好，对种鸭免疫时间长，种鸭抗体水平高，种鸭孵育的小鸭能够抵抗鸭病毒性肝炎。

Description

鸭病毒性肝炎毒株及灭活疫苗

技术领域

本发明涉及一种鸭病毒性肝炎病毒及灭活疫苗的制备方法，更具体地，本发明涉及一种鸭病毒性肝炎病毒及灭活疫苗，属于生物制品技术领域。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck virus Hepatitis，简称DVH)是雏鸭的一种急性致死性传染病。该病发病急、传播快，主要引起雏鸭发病，发病率和致死率可高达100％，其临床表现主要是角弓反张，病变主要为肝脏肿大并有出血斑点。本病最早发生于美国，其后在英国、加拿大、德国、意大利、印度等国陆续流行。我国自1958年在上海首次分离到鸭肝炎病毒(DHV)以来，相继在全国许多省市流行发生，造成巨大的经济损失，已成为影响养鸭业健康发展的重要威胁。

鸭病毒性肝炎的病毒颗粒无囊膜，属于微RNA病毒科。病毒粒子呈二十面体对称，直径20～40nm。鸭病毒性肝炎有三个血清型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，目前我国普遍存在的鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒Ⅰ型引起的。

近年来鸭病毒性肝炎已在我国蔓延，严重阻碍了我国养鸭业的健康发展，出现了使用Ⅰ型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗或高免卵黄抗体预防或治疗无效的鸭群爆发疑似鸭肝炎的现象，怀疑为Ⅰ型鸭肝炎变异株或新型鸭肝炎。用弱毒疫苗免疫雏鸭，受雏鸭本身免疫机能和母源抗体的影响，造成了鸭病毒性肝炎的局部暴发，给养殖业造成了巨大的损失。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种鸭病毒性肝炎毒株，命名为DHV YC，该毒株保藏号为CGMCC NO.3594。

本发明的另一方面在于提供一种制备本发明所述鸭病毒性肝炎毒株的方法，包括以下步骤：

(1)病料处理：从发生鸭病毒性肝炎的鸭场，采集发生明显病变的鸭肝病料，用含青霉素和链霉素双抗的灭菌PBS冲洗后，再用灭菌PBS稀释研磨，将制得的匀浆液经两次冻融后，离心取上清液再用氯仿震荡，离心取上层清液，滤膜过滤得鸭肝炎病毒悬液，分装，冻存；

(2)鸭肝炎病毒鸡胚适应株的建立：将步骤(1)获得的鸭肝炎病毒悬液用灭菌PBS作稀释，经尿囊腔接种SPF鸡胚，孵育，弃去24h内的死胚，选接种后48～96h死亡且病变典型的鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌容器中，将检验无菌的鸡胚液混合，定量分装，将所述的鸡胚液连续传18～25代，获得鸭肝炎病毒鸡胚适应株。

优选地，本发明所述制备鸭病毒性肝炎毒株的方法，步骤(1)为从发生鸭病毒性肝炎的鸭场，采集发生明显病变的鸭肝病料，用含100IU/ml青霉素、100mg/ml链霉素的双抗的灭菌PBS冲洗3次后，用病料5倍重量的灭菌PBS稀释研磨；将制得的匀浆液经-20℃冻结，20℃融化两次冻融后，以3000r/min和8000r/min的转速各离心15min，上清液用氯仿在室温下震荡10～15min，离心取上层清液，0.22μm滤膜过滤，分装，-70℃冻存。

优选地，本发明所述制备鸭病毒性肝炎毒株的方法，步骤(2)为将分离的病毒用灭菌PBS作1∶100稀释，经尿囊腔接种20枚9日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育，弃去24h内的死胚，选接种后48～96h死亡且病变典型的鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌容器中，将检验无菌的鸡胚液混合，定量分装，每瓶1ml，以1∶1的比例加入含5％质量百分比蔗糖、12％质量百分比脱脂奶的冻干保护剂，冻干后，置-20℃保存。

优选地，本发明所述的鸭病毒性肝炎毒株制备的鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法，由以下步骤制备的：

(1)接种：将权利要求1所述鸭病毒性肝炎毒株，用灭菌PBS稀释后接种于SPF鸡胚，收集48～96h内死亡且病变明显的鸡胚液；

(2)灭活：将检验合格的鸡胚液加入灭活剂，灭活后在37℃水浴条件下水解，作为制苗用抗原液；

(3)乳化制备疫苗：油相制备：取白油、司本-80，混匀后加入硬脂酸铝；水相制备：取抗原液、吐温-80，加入免疫增强剂，再加入灭菌生理盐水，混匀备用。取油相置于乳化缸中，预乳化同时缓慢加入水相乳化，终止前加入硫柳汞水溶液，得到鸭病毒性肝炎灭活疫苗；

(4)分装：定量分装，加盖密封，2～8℃保存。

优选地，本发明所述的制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法中所述步骤(2)中加入的灭活剂为终浓度0.1％～0.3％体积百分比的甲醛溶液或0.025％～0.05％质量百分比的β-丙内酯。

优选地，本发明所述的制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法中所述步骤(3)乳化的水相制备中加入的免疫增强剂为异丙肌苷。

优选地，本发明所述的制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法中所述步骤(3)为：成品含异丙肌苷的质量百分比为0.56％～2.22％。

本发明的另一目的在于提供一种使用上述鸭病毒性肝炎毒株及方法制备的鸭病毒性肝炎灭活疫苗。

技术效果

采用本发明方法获得鸭病毒性肝炎病毒毒株，病毒的毒价高，免疫原性强；采用本发明方法获得鸭病毒性肝炎灭活疫苗，对雏鸭免疫效果好，对种鸭免疫时间长，种鸭抗体水平高，种鸭孵育的小鸭能够抵抗鸭病毒性肝炎。注射疫苗后，试验雏鸭、产蛋鸭均未出现局部和全身的不良反应，疫苗的安全性好。本发明方法获得疫苗的抗体水平高，时间维持长。免疫鸭对疫苗的应激反应很小，采食正常，精神良好，产蛋率和体重未受影响。

其次，本发明中灭活病毒采用的灭活剂是甲醛溶液或β-丙内酯，优选β-丙内酯，因为β-丙内酯灭活时间短，易降解，对动物机体刺激小。本发明的疫苗中包含异丙肌苷作为免疫增强剂，其能够提高免疫动物的抗体水平。加入免疫增强剂的疫苗的保护率明显高于没有免疫增强剂的疫苗，在免疫种鸭、孵化的雏鸭，鸭病毒性肝炎的保护率明显高于未加免疫增强剂的疫苗。

最后，目前缺乏鸭病毒性肝炎的弱毒疫苗和灭活疫苗，无法获得正规的相关产品进行比较试验，因此本实施例对本发明的鸭病毒性肝炎病毒株(DHV YC)制备的灭活苗和加免疫增强剂的灭活苗与研究中常用的标准毒株DRL-62(ATCC保藏，保藏号VR-1313)的效力进行了比较。结果发现，使用本发明的疫苗免疫种鸭后孵化的雏鸭，明显高于常用的标准株DRL-62制备的疫苗免疫效果，且免疫效果明显高于未加免疫增强剂的疫苗，并且抗体水平高，时间维持长。

综上所述，本发明提供了一种鸭病毒性肝炎毒株及灭活疫苗及二者的制备方法，实现了有效控制鸭病毒性肝炎的蔓延与局部暴发的目的。

具体实施方式

在本发明中，术语“SPF”鸡是指生长在屏障系统或隔离器中、无国际、国内(尤其是国内)流行的主要鸡传染病病原的鸡群，其所产蛋即为SPF种蛋。SPF鸡胚对各种病原微生物有敏锐的感受性，且重复性好，是研制人和禽等多种生物制品的高标准原材料。

在本发明中，所述“灭菌PBS”即浓度为0.01mol/L，pH为7.2的磷酸盐缓冲液。

本发明所述鸭病毒性肝炎毒株，株名命名为DHV YC，分类命名：鸭病毒性肝炎病毒(拉丁文学名：Duck Hepatitis Virus)，属于小RNA病毒科肠道病毒属，该毒株已于2010年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.3594。

本发明所述鸭肝炎病毒鸡胚适应株特性为：

1、理化特性：

毒株对乙醚和氯仿不敏感；经酸处理后病毒含量基本不变，证明对酸不敏感；经热处理后，病毒含量下降1.5个滴度，证明对热有一定的稳定性；经胰蛋白酶处理后，病毒含量基本不变，证明对胰蛋白酶不敏感；经核酸型鉴定证明毒株的核酸为RNA。

2、生物学特性：

(1)对鸡胚的毒力：用灭菌PBS将毒种作1∶100稀释后，经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育。鸡胚应于接种后48～96小时死亡9枚以上。死亡胚胎发育迟缓，全身皮肤和皮下出血，并伴有腹部和后肢严重水肿；肝脏呈红黄色、肿大，并有针尖大小出血点和坏死灶。死亡时间较长的胚胎尿囊液呈浅绿色，肝脏病变和发育受阻明显。

(2)对雏鸭的毒力：用灭菌PBS将毒种作1∶100稀释后，腿部肌肉注射4～7日龄雏鸭10只，每只0.1ml，设空白对照10只，腿部注射生理盐水0.1ml观察10天，雏鸭应全部健活。

(3)病毒含量：每0.1ml含毒量应≥10^5.5ELD₅₀

(4)特异性：病毒为纯净的鸭肝炎病毒I型(即DHV-I)

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1 鸭病毒性肝炎病毒株(DHV YC)的制备

(1)病料处理：河南发生鸭病毒性肝炎的鸭场，采集发生明显病变的鸭肝病料，用含100IU/ml青霉素、100mg/ml链霉素的双抗的灭菌PBS冲洗3次后，用病料5倍重量的灭菌PBS稀释研磨。将制得的匀浆液冻融经-20℃冻结，20℃融化两次冻融后，以3000r/min和8000r/min的转速各离心15min，上清液用氯仿在室温下震荡10～15min，离心取上层清液，0.22μm滤膜过滤，分装，-70℃冻存。

(2)鸭肝炎病毒鸡胚适应株的建立：将步骤(1)获得的病毒悬液用灭菌PBS作1∶100稀释，经尿囊腔接种20枚9日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育，弃去24h内的死胚，选接种后48～96h死亡且病变典型的鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌容器中，将检验无菌的鸡胚液混合，定量分装，每瓶1ml，以1∶1的比例加入含5％(质量百分比)蔗糖、12％(质量百分比)脱脂奶的冻干保护剂，冻干后，置-20℃保存。取一瓶毒种继续传代，将传代的毒种做10^-2稀释，依以上步骤继续传代，连续传至25代，得到鸭病毒性肝炎病毒株(DHV YC)。接毒后鸡胚90％稳定在48～96h死亡，病毒每0.1ml含量应≥10^5.5ELD₅₀，并且保持较高的免疫原性。

实施例2 鸭病毒性肝炎灭活疫苗的制备

(1)将DHV YC株用灭菌PBS稀释100倍，接种于9日龄SPF鸡胚，收集48～96h内死亡且病变明显的鸡胚液。

(2)灭活：将检验合格的鸡胚液加入总量的0.05％(质量百分比)的β-丙内酯，4℃灭活24h后在37℃水浴条件下水解2h，作为制苗用抗原液。

(3)乳化制备疫苗：油相制备：取94ml白油，6ml司本-80，混匀后加入1.5克硬脂酸铝。水相制备：取20ml抗原液，3.6ml吐温-80，免疫增强剂异丙肌苷1.5克，灭菌生理盐水4.9ml，混合均匀。取油相100ml置于乳化缸中，在7500r/min转速下预乳化3min，同时缓慢加入水相50ml，在15000r/min转速下乳化6min，终止前加入1％硫柳汞水溶液，其硫柳汞最终浓度为0.01％。得到油包水型的鸭病毒性肝炎灭活疫苗。

(4)分装：定量分装，加盖密封，4℃保存。

实施例3 鸭病毒性肝炎疫苗的检验

(1)物理性状

外观 乳白色乳状液

剂型 油包水型

黏度 用1ml吸管(出口径为1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，为4.8s，符合规程。

稳定性 在37℃下放置21日或者将疫苗5ml放入离心管，经3000r/min离心15min，不破乳。

(2)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行，无细菌生长。

(3)安全检验 取1日龄樱桃谷鸭10只，各颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，不出现由疫苗注射引起的局部和全身的不良反应。

(4)效力检验 1日龄樱桃谷鸭10只，各颈部皮下注射疫苗0.3ml，21日时，连同条件相同的对照鸭5只，各腿部肌肉注射100LD₅₀鸭肝炎强毒，观察7日全部健活。

(5)硫柳汞含量测定按现行《中国兽药典》附录进行，硫柳汞含量不超过0.01％(质量百分比)

实施例4 鸭病毒性肝炎灭活疫苗的安全性试验

1单剂量不同接种途径对樱桃谷鸭的安全性试验

实施例2的疫苗3个批次(080401、080402、080403)，每批任选5瓶，各批内等量混合，1日龄雏鸭每批混合样皮下、肌肉注射各10只，每只0.3ml；28周龄产蛋鸭每批混合样皮下、肌肉注射各10只，每只0.5ml。隔离饲养，观察14天，所有鸭接种部位未出现肿胀，未见全身不良反应。

2单剂量重复使用不同接种途径对樱桃谷鸭的安全性试验

实施例2的疫苗3个批次(080401、080402、080403)，每批任选5瓶，各批内等量混合，1日龄雏鸭每批混合样皮下、肌肉注射各10只，每只0.3ml，每周1次，重复3次，每次0.3ml；28周龄产蛋鸭每批混合样皮下、肌肉注射各10只，每只0.5ml，每周1次，重复3次，每次0.5ml。隔离饲养，观察14天，所有鸭接种部位未出现肿胀，未见全身不良反应。

3超剂量不同途径接种的安全性试验

将3个批次(080401、080402、080403)的疫苗，每批任选5瓶，各批内等量混合，1日龄雏鸭每批混合样皮下、肌肉注射各10只，每只1ml；28周龄产蛋鸭每批混合样皮下、肌肉注射各10只，每只2ml。隔离饲养，观察14天，所有鸭接种部位未出现肿胀，未见全身不良反应。

4疫苗对产蛋鸭生产性能的影响实验

实施例2的疫苗3个批次(080401、080402、080403)，每批任选5瓶，各批内等量混合，一组40周龄产蛋鸭每批混合样皮下注射各100只，其中50只，每只0.5ml，其余50只，每只1.0ml，对照组皮下注射各50只，注射生理盐水，每只0.5ml；二组40周龄产蛋鸭每批混合样肌肉注射各100只，其中50只，每只0.5ml，其余50只，每只1.0ml，对照组肌肉注射各50只，注射生理盐水，每只0.5ml。隔离饲养，观察14天，免疫鸭对疫苗的应激反应很小，采食正常，精神良好，产蛋率和体重未受影响。结果见表1、2。

表1疫苗皮下注射对产蛋高峰期蛋鸭的影响

表2疫苗肌肉注射对产蛋高峰期蛋鸭的影响

由表1、表2数据可知，本发明的疫苗对雏鸭和产蛋鸭的安全性良好，肌肉注射与皮下注射免疫动物机体没有差异。

实施例5 鸭病毒性肝炎灭活疫苗的效力检验

目前，缺乏鸭病毒性肝炎的弱毒疫苗和灭活疫苗，无法获得正规的相关产品进行比较试验，因此本实施例对本发明的鸭病毒性肝炎病毒株(DHV YC)制备的灭活苗和加免疫增强剂的灭活苗与常用的标准毒株DRL-62(ATCC保藏，保藏号VR-1313)的效力进行了比较。

1对雏鸭的效力检验

实施例2的疫苗3个批次(080401、080402、080403)，每批任选5瓶，各批内等量混合，每批疫苗分为3个注射剂量，肌肉注射0.1ml/只、0.3ml/只、0.5ml/只1日龄的樱桃谷雏鸭，每个剂量20只。将其它步骤同实施例2中不加免疫增强剂的疫苗3个批次(000401、000402、000403)，每批任选5瓶，各批内等量混合，每批疫苗分为3个注射剂量，肌肉注射0.1ml/只、0.3ml/只、0.5ml/只1日龄的樱桃谷雏鸭，每个剂量20只。按照实施例2的方法制备的6批鸭病毒性肝炎常用的标准株DRL-62(ATCC保藏)灭活疫苗，DRL01、DRL02、DRL03为加免疫增强剂组，每批疫苗分为3个注射剂量，肌肉注射0.1ml/只、0.3ml/只、0.5ml/只1日龄的樱桃谷雏鸭，每个剂量20只，DRL04、DRL05、DRL06为不加免疫增强剂组，每批疫苗分为3个注射剂量，肌肉注射0.1ml/只、0.3ml/只、0.5ml/只1日龄的樱桃谷雏鸭，每个剂量20只。7日后每组取10只雏鸭连同对照鸭10只肌肉注射100LD₅₀鸭肝炎DRL-62强毒，剩余10只雏鸭连同对照鸭10只肌肉注射100LD₅₀鸭肝炎YC株鸭胚E1代。观察14日。结果如表3。

表3灭活疫苗对雏鸭的效力实验

注：表中比值的分母为该组雏鸭总数，分子为雏鸭存活数。

由表3结果可知含有免疫增强剂疫苗的保护率明显高于没有免疫增强剂的疫苗，YC毒株制备的疫苗保护效果明显比标准毒株DRL-62制备的疫苗效果好，本发明疫苗0.3ml/只免疫雏鸭即能够使雏鸭对两个毒株攻击的保护率达到100％，而不含免疫增强剂的则需要0.5ml/只的剂量才能对动物产生较好的保护效果。

2对种鸭的效力检验

实施例2的疫苗3个批次(080401、080402、080403)，每批任选5瓶，各批内等量混合，每批疫苗3个注射剂量，肌肉注射0.5ml/只、1.0ml/只、1.5ml/只24周龄(约为产蛋前1个月)的樱桃谷鸭，每个剂量10只，3～4周后二免注射疫苗；按照实施例2的方法制备不加免疫增强剂的疫苗3个批次(000401、000402、000403)，每批任选5瓶，各批内等量混合，每批疫苗3个注射剂量，肌肉注射0.5ml/只、1.0ml/只、1.5ml/只24周龄(约为产蛋前1个月)的樱桃谷鸭，每个剂量10只，3～4周后二免注射疫苗；按照实施例2的方法制备的6批鸭病毒性肝炎标准株DRL-62(ATCC保藏，保藏号VR-1313)灭活疫苗，DRL01、DRL02、DRL03为加免疫增强剂组，每批任选5瓶，各批内等量混合，每批疫苗3个注射剂量，肌肉注射0.5ml/只、1.0ml/只、1.5ml/只24周龄(约为产蛋前1个月)的樱桃谷鸭，每个剂量10只，3～4周后二免注射疫苗；DRL04、DRL05、DRL06为不加免疫增强剂组，每批任选5瓶，各批内等量混合，每批疫苗3个注射剂量，肌肉注射0.5ml/只、1.0ml/只、1.5ml/只24周龄(约为产蛋前1个月)的樱桃谷鸭，每个剂量10只，3～4周后二免注射疫苗。种鸭生产时，将孵出的鸭蛋孵化至雏鸭7日龄时，连同空白对照组，各组抽取10只肌肉注射100LD₅₀鸭肝炎DRL-62强毒，10只雏鸭肌肉注射100LD₅₀鸭肝炎YC株鸭胚E1代。观察14日。同时在二免4周后检测种鸭的抗体水平。结果见表4、表5。

表4灭活疫苗对种鸭的效力实验

表5灭活疫苗接种种鸭的中和抗体水平

由以上结果可知，使用本发明的疫苗免疫种鸭后孵化的雏鸭，明显高于常用的标准株DRL-62制备的疫苗免疫效果，且免疫效果明显高于未加免疫增强剂的疫苗，并且抗体水平高，时间维持长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种鸭病毒性肝炎毒株，命名为DHV YC，该毒株保藏号为CGMCC NO.3594。

2.一种利用权利要求1所述的鸭病毒性肝炎毒株制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，由以下步骤制备的：

(1)接种：将权利要求1所述鸭病毒性肝炎毒株，用灭菌PBS稀释后接种于SPF鸡胚，收集48～96h内死亡且病变明显的鸡胚液；

(2)灭活：将检验合格的鸡胚液加入灭活剂，灭活后在37℃水浴条件下水解，作为制苗用抗原液；

(3)乳化制备疫苗：油相制备：取白油、司本-80，混匀后加入硬脂酸铝；水相制备：取抗原液、吐温-80，加入免疫增强剂，再加入灭菌生理盐水，混匀备用，取油相置于乳化缸中，预乳化同时缓慢加入水相乳化，终止前加入硫柳汞水溶液，得到鸭病毒性肝炎灭活疫苗；

(4)分装：定量分装，加盖密封，2～8℃保存。

3.如权利要求2所述的制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入的灭活剂为终浓度0.1％～0.3％体积百分比的甲醛溶液或0.025％～0.05％质量百分比的β-丙内酯。

4.如权利要求2所述的制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(3)乳化的水相制备中加入的免疫增强剂为异丙肌苷。

5.如权利要求4所述的制备鸭病毒性肝炎灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的异丙肌苷的质量百分比为0.56％～2.22％。

6.一种按照权利要求2-5任意一种方法制备的鸭病毒性肝炎灭活疫苗。