CN104926939A

CN104926939A - 一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用

Info

Publication number: CN104926939A
Application number: CN201410710085.2A
Authority: CN
Inventors: 程安春; 汪铭书; 朱德康; 杨乔; 陈孝跃
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2015-09-23

Abstract

本发明提供了一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用，通过选取血清1型鸭肝炎病毒CH60株DHAV-1或血清3型鸭肝炎病毒CH-1株DHAV-3在9～10日龄鸡胚或10～12日龄鸭胚尿囊腔接种进行增殖并处理得到鸭肝炎病毒免疫原，将该鸭肝炎病毒免疫原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合成不同浓度，对免疫动物进行多次免疫后采血收集得到高免血清，该高免血清能用于在鸭肝炎病毒诊断、检测。本发明制备方法条件要求低，操作简单，但获得的免疫原可满足制备特异性抗血清的要求。

Description

一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用

技术领域

本发明属于动物免疫学领域，尤其涉及一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)引起的一种高度致死性传染病，以发病急、病程短、发病率和死亡率高为特点。鸭病毒性肝炎分为3个各自独立的没有血清学关系的血清型：I型、II型和III型。其中，血清I型鸭肝炎病毒(DHV-I)又称鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，是目前我国流行的主要鸭肝炎病毒，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养鸭业的健康发展。

鸭甲型肝炎病毒目前发现有三种基因型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，根据报道，我国目前流行的主要是DHAV-1，三种基因型均属于小RNA病毒科禽肝病毒属，病毒粒子呈球形或类球形，核衣壳呈20面体对称，直径为20～40nm，无囊膜，胞浆内繁殖，核酸为不分节段的单股正链RNA。该病毒对乙醚、氯仿、甲醇、胰酶、硫酸铵、常用消毒剂等有一定程度的抵抗力；能耐受pH3.0的酸性环境；对热也有较强抵抗力，56℃加热1小时仍有部分病毒存活。鸭甲型肝炎病毒不能凝集任何动物的红细胞，可在鸭胚和鸡胚的绒毛尿囊腔及鸡胚组织、鸭胚肝细胞、鸭胚肾细胞、鹅胚肾细胞等中增殖。

在免疫学相关的实验研究和生产实践中，常常涉及到免疫原的制备。其中由于病毒必须在活的宿主细胞中才能增殖，因此获得的病毒材料实际上是病毒与增殖该病毒的宿主成分的一个混合物。当然，在以病毒作为免疫原的用途中，有的可以直接使用该病毒与宿主成分的混合物作为免疫原，如制备灭活苗或弱毒苗的免疫原，但在有的方面，需要尽可能去除宿主成分，如病毒单克隆抗体制备中的免疫原，如尽可能去除宿主成分，将在单克隆抗体的筛选中可减少假阳性的非目标杂交瘤细胞；又如在制备诊断检测用途的病毒多克隆抗体时，需要尽可能去除宿主成分以保证获得的多克隆抗体的特异性，但由于病毒的培养增殖、形态大小、结构组成等方面的特殊性，不可能像纯化细菌那样方便、快速地获得纯的免疫原，目前为止，还没有一个通用、简便的获得较纯净的病毒免疫原的方法；正是由于获得较纯的病毒免疫原的困难，同时也导致获得高特异性的高免血清的困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭肝炎病毒免疫原及高免血清的制备方法与应用，旨在解决由于获得较纯的病毒免疫原的困难，同时也导致获得高特异性的高免血清的困难的问题。

本发明是这样实现的，一种鸭肝炎病毒免疫原的制备方法，包括以下步骤：

(1)将鸭肝炎病毒在9～10日龄鸡胚或10～12日龄鸭胚尿囊腔接种进行增殖，收集36～60h内死亡并且胚体有明显病变的尿囊液，将尿囊液反复冻融3次，5000r/m离心30min，取上清；

(2)将步骤(1)得到的上清与等量氯仿相混合，4℃作用1h后，5000r/m离心30min，取上清，如此重复两次；

(3)将步骤(2)中经氯仿离心处理后的上清在40000r/m下离心2h，用PBS溶解沉淀得到鸭肝炎病毒免疫原。

优选地，在步骤(1)中，所述鸭肝炎病毒为血清1型鸭肝炎病毒CH60株或血清3型鸭肝炎病毒CH-1株。

优选地，在步骤(3)中，所述PBS的用量为：20ml尿囊液对应使用0.5ml PBS，鸭肝炎病毒免疫原含量为1500μg/ml。

本发明进一步提供了一种鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，以上述鸭肝炎病毒免疫原为抗原，包括以下步骤：

(1)将弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂在研钵中研磨均匀，然后边磨边加入抗原，研磨充分后得到免疫注射液；

(2)用弗氏完全佐剂与抗原制备而成的免疫注射液1ml在免疫动物背部皮下多点注射进行第一次免疫；其中，免疫注射液的抗原终浓度为500μg/ml；

间隔7～10d后，用弗氏不完全佐剂与抗原制备而成的免疫注射液2ml进行第二次免疫，免疫途经和部位与第一次免疫相同；其中，免疫注射液的抗原终浓度为500μg/ml；

(3)间隔7～10d后，进行第三次免疫，免疫注射液、免疫剂量和注射方法与第二次免疫相同；

(4)间隔7～10d后用生理盐水稀释鸭肝炎病毒免疫原至其抗原浓度为500μg/ml，采用耳缘静脉缓慢注射方式进行第四次免疫，免疫剂量为1ml；

(5)7d以后，用琼脂扩散法测定血清效价，当免疫动物的琼扩效价达到1:32及以上时，颈动脉无菌采血分离血清，-20℃保存，即为粗制鸭肝炎病毒高免血清。

优选地，在步骤(5)之后还包括步骤：

(6)取所述粗制鸭肝炎病毒高免血清按1:1～10:1比例加入鸡胚或鸭胚尿囊液冻干制剂，充分混匀，37℃感作2h，取出，1200转/min离心，取上清；重复上述操作，每次获得上清用琼脂扩散法测定血清效价，当琼脂沉淀线为单一条带且血清效价不再下降，所获得的血清上清即为鸭肝炎病毒高免血清。

优选地，在步骤(2)中，所述不完全弗氏佐剂的制备过程为：将石蜡油和羊毛脂按体积比为1:5的比例混合，用超声波使之混匀，高温灭菌后得到。

优选地，在步骤(4)中，注射液研磨充分的判断标准为：成均匀的乳白色油包水状态的液体，取一滴该液体置于冰水上3～5min不扩散。

优选地，在步骤(6)中，所述鸡胚或鸭胚尿囊液冻干制剂为9～10日龄鸡胚或10～12日龄鸭胚尿的尿囊液按常规方法直接真空冷冻干燥获得。

本发明进一步提供了上述制备方法得到的鸭肝炎病毒高免血清在鸭肝炎病毒诊断、检测中的应用。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明的鸭肝炎病毒免疫原的制备方法条件要求低，操作简单，但获得的免疫原可满足制备特异性抗血清的要求；利用该免疫原制备的高免血清经本发明的技术进一步处理后所获得的特异性抗体，在鸭肝炎病毒诊断、检测中具有高的特异性和应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中DVH人工感染死亡鸭的肝脏的IFA方法检测结果图；

图2是本发明实施例中DVH人工感染死亡鸭的脾脏的IFA方法检测结果图；

图3是本发明实施例中DVH人工感染死亡鸭的肾脏的IFA方法检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1血清1型鸭肝炎病毒免疫原的制备

1、病毒株

血清1型鸭肝炎病毒CH60株(鸭甲型肝炎病毒，Duck Hepatitis A Virus)，该病毒株为本申请人分离致弱的病毒株，已申请专利(申请号为201310011872.3)并于2012年11月20号在中国典型培养物保藏中心进行生物材料保藏，保藏编号为CCTCC NO.V201248，保藏地址为：武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。

2、实验用胚

9日龄SPF鸡胚。

3、病毒的增殖

将血清1型鸭肝炎病毒CH60株种毒用生理盐水稀释5倍后，按常规加入适量双抗(青霉素、链霉素的终浓度分别为1001U/mL和100μg/mL)，经尿囊腔接种50枚9日龄鸡胚，0.2ml/胚，同时设立生理盐水阴性对照胚5枚。接种后的鸡胚用石蜡封闭进针孔，37℃孵化6天，每天照胚2次，在生理盐水阴性对照胚不死亡的前提下，弃去24小时内死亡的血清1型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚，收集24小时后死亡的血清1型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚，4℃冷藏过夜。在无菌条件下按常规方法吸取尿囊液，混匀，作为病毒免疫原制备的材料。

4、病毒免疫原的制备

(1)取尿囊液200ml反复冻融3次，5000r/m离心30min，取上清。

(2)上清与等量氯仿相混合，4℃作用1h后，5000r/m离心30min，取上清，如此重复两次。

(3)上清用Beckman超速离心机40000r/m离心2h，用5ml PBS溶解沉淀后(免疫原含量约为1500μg/ml)保存于-20℃备用。

实施例2血清3型鸭肝炎病毒免疫原的制备

1、病毒株

血清3型鸭肝炎病毒CH-1株(禽肝病毒属小RNA病毒科3型鸭甲肝病毒，Duck Hepatitis A Vrius type 3，DHAV-3)，该病毒株为本实验室分离的病毒株并于2013年3月25号在中国典型培养物保藏中心进行生物材料保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201305，保藏地址为：武汉市武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。

2、实验用胚

11日龄鸭胚。

3、病毒的增殖

将血清3型鸭肝炎病毒CH-1株种毒用生理盐水稀释5倍后，按常规加入适量双抗(青霉素、链霉素的终浓度分别为100IU/mL和100μg/mL)，经尿囊腔接种50枚11日龄鸭胚，0.2ml/胚，同时设立生理盐水阴性对照胚5枚。接种后的鸭胚用石蜡封闭进针孔，37℃孵化6天，每天照胚2次，在生理盐水阴性对照胚不死亡的前提下，弃去24小时内死亡的血清3型鸭肝炎病毒CH-1株接种鸭胚，收集24小时后死亡的血清3型鸭肝炎病毒CH-1株接种鸭胚，4℃冷藏过夜。在无菌条件下按常规方法吸取尿囊液，混匀，作为病毒免疫原制备的材料。

4、病毒免疫原的制备

(1)取尿囊液200ml反复冻融3次，5000r/m离心30min，取上清。

实施例3血清1型鸭肝炎病毒高免血清的制备

1、免疫原

实施例1中制备的血清1型鸭肝炎病毒CH60株免疫原。

2、实验动物

健康兔5只。

3、佐剂

弗氏完全佐剂购于Sigma公司。将石蜡油和羊毛脂按体积比为1:5的比例混合，用超声波使之混匀，高温灭菌，制成不完全弗氏佐剂。

4、动物的免疫

(1)第一次免疫：将实施例1中制备的血清1型鸭肝炎病毒CH60株免疫原2ml(估算为1500μg/ml×2ml＝3mg)用生理盐水稀释为3ml，与购买的Sigma公司弗氏完全佐剂3ml按常规方法乳化，直至成为均匀的乳白色“油包水”状态(取一滴该液体置于冰水上3～5min不扩散即可)。背部皮下多点注射兔子1ml/只(相当于500μg)。

(2)第二次免疫：第一次免疫后7d，将实施例1中制备的血清1型鸭肝炎病毒CH60株免疫原4ml(估算为1500μg/ml×4ml＝6mg)用生理盐水稀释为6ml，与自制的弗氏不完全佐剂6ml按常规方法乳化，直至成为均匀的乳白色“油包水”状态。背部皮下多点注射兔子2ml/只(相当于1000μg)。

(3)第三次免疫：第二次免疫后10d，免疫注射液、免疫方法及免疫剂量同第二次免疫。

(4)第四次免疫：生理盐水稀释血清1型鸭肝炎病毒CH60株免疫原至500μg/ml，经耳缘静脉分多次间隔缓慢注射，1ml/只。

5、血清1型鸭肝炎病毒高免血清的制备

(1)第四次免疫7d以后，颈动脉无菌采血分离血清，-20℃保存，即为粗制血清1型鸭肝炎病毒高免血清。用琼脂扩散法测定血清效价，结果表明琼扩效价为1:64。

(2)在2ml鸡胚尿囊液冻干制剂取中加入上述获得的粗制血清1型鸭肝炎病毒高免血清10ml，充分混匀，37℃感作2h，取出，1200转/min离心，取上清。重复上述操作1次，琼脂沉淀实验检测线为单一条带且血清效价仍为1:64，所获得的血清上清即为血清1型鸭肝炎病毒高免血清。

实施例4血清3型鸭肝炎病毒高免血清的制备

1、免疫原

实施例2中制备的血清3型鸭肝炎病毒CH-1株免疫原。

2、实验动物

健康兔5只。

3、佐剂

4、动物的免疫

(1)第一次免疫：将实施例2中制备的血清3型鸭肝炎病毒CH-1株免疫原2ml(估算为1500μg/ml×2ml＝3mg)用生理盐水稀释为3ml，与购买的Sigma公司弗氏完全佐剂3ml按常规方法乳化，直至成为均匀的乳白色“油包水”状态(取一滴该液体置于冰水上3～5min不扩散即可)。背部皮下多点注射兔子1ml/只(相当于500μg)。

(2)第二次免疫：第一次免疫后7d，将实施例2中制备的血清3型鸭肝炎病毒CH-1株免疫原4ml(估算为1500μg/ml×4ml＝6mg)用生理盐水稀释为6ml，与自制的弗氏不完全佐剂6ml按常规方法乳化，直至成为均匀的乳白色“油包水”状态。背部皮下多点注射兔子2ml/只(相当于1000μg)。

(3)第三次免疫：第二次免疫后10d，免疫注射液、免疫剂量和免疫方法同第二次免疫。

(4)第四次免疫：生理盐水稀释血清3型鸭肝炎病毒CH-1株免疫原至500μg/ml，经耳缘静脉分多次间隔缓慢注射，1ml/只。

5、血清3型鸭肝炎病毒高免血清的制备

(1)第四次免疫7d以后，颈动脉无菌采血分离血清，-20℃保存，即为粗制血清3型鸭肝炎病毒高免血清。用琼脂扩散法测定血清效价，结果表明琼扩效价为1:32。

(2)在2ml鸭胚尿囊液冻干制剂中加入上述获得的粗制血清3型鸭肝炎病毒高免血清10ml，充分混匀，37℃感作2h，取出，1200转/min离心，取上清。重复上述操作1次，琼脂沉淀实验检测线为单一条带且血清效价仍为1:32，所获得的血清上清即为血清3型鸭肝炎病毒高免血清。

实施例5血清1型鸭肝炎病毒高免血清检测血清1型鸭肝炎病毒及其定位

1、实验材料

1.1实施例3中制备的血清1型鸭肝炎病毒高免血清。

1.2检测材料：正常健康鸭肝脏、脾脏和肾脏；血清1型鸭肝炎病毒人工感染死亡鸭肝脏、脾脏和肾脏；临床送检为DVH死亡鸭的肝脏；鸭瘟、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝脏。

1.3其它主要试剂：FITC标记羊抗兔IgG、马血清、BSA

2、方法

2.1第一抗体兔抗DHAV-1-IgG的制备

实施例3中制备的血清1型鸭肝炎病毒高免血清按常规方法用辛酸-硫酸铵法粗提抗体，再进行High Q(Bio-RAD)离子交换层析，收集洗脱峰，用SDS-PAGE检测抗体纯度，将洗脱峰浓缩即为第一抗体兔抗DHAV-1-IgG，SDS-PAGE检测确认，-20℃保存备用。

2.2利用间接免疫荧光法(IFA)检测鸭肝炎病毒组织材料

检测材料用100ml/L缓冲福尔马林或40g/L多聚甲醛固定，按照常规方法进行酒精梯度脱水、石蜡包埋，制作4微米切片。切片经脱蜡至水化，用0.01mol/L pH7.4PBS洗5分钟；用0.01mol/L的柠檬酸(PH6.0)微波修复10min，自然冷却至室温；用含有0.5ml/L Tween-20的0.01mol/L pH 7.4PBS洗涤5分钟，3次；100ml/L马血清或100g/L BSA湿盒中37℃孵育30min，摔去多余的液体；加入1:50稀释兔抗DHAV-1-IgG在湿盒中4℃孵育16h，取出用上述相同洗液摇洗5min3次；加入含有伊文斯兰(1:8000稀释)的PBS稀释FITC标记山羊抗兔IgG(1:100稀释)湿盒中37℃孵育45min。加碳酸甘油缓冲液，用盖玻片封片镜检，观察组织细胞特定区域内是否有明亮的黄绿色荧光。

2.3间接免疫荧光法结果的判定

判断标准：按照荧光显微镜视野下观察到的特定细胞黄绿色荧光的有无、数量、种类及强弱来判定。①高倍镜下没有荧光判为阴性(－)；②低倍镜下不可见，高倍镜下，荧光零星分布的判为弱阳性(+)；③荧光低倍镜下可见，高倍镜下清晰可见为中等阳性(++)；④荧光低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼为强阳性(+++)。

2.4间接免疫荧光法特异性试验

2.4.1阴性和阳性对照

阴性对照为正常健康鸭组织；阳性对照为已知阳性的DHAV-1感染发病死亡的雏鸭各器官组织。

2.4.2吸收试验

用DHAV-1抗原与制备的兔抗DHAV-1 IgG抗体等量混合，37℃孵育2h，8000r/min离心15min，取上清代替兔抗DHAV-1 IgG抗体进行免疫荧光实验。

2.4.3替代实验

非免疫兔正常血清替代兔抗DHAV-1 IgG抗体，或省略其中任何一种免疫试剂，以PBS代替，分别孵育切片进行免疫荧光实验。

2.4.4对其他病原人工感染致死鸭的组织检测

应用建立的方法对鸭瘟、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝脏组织进行检测。

2.5间接免疫荧光方法的临床应用

用建立IFA方法检测25份临床送检可疑为DVH死亡鸭的肝脏组织样品。同时进行病原分离鉴定。

3、结果

3.1第一抗体兔抗DHAV-1-IgG的制备

实施例3中制备的血清1型鸭肝炎病毒高免血清按常规方法用辛酸-硫酸铵法粗提抗体，再进行High Q(Bio-RAD)离子交换层析，收集洗脱峰浓缩获得的第一抗体兔抗DHAV-1-IgG进行SDS-PAGE检测，电泳图显示有两条带，分子量分别与兔子IgG的重链和轻链的分子量相当，表明抗体纯度好。

3.2间接免疫荧光法特异性

对照正常鸭组织免疫荧光检测呈阴性；DHAV-1人工感染发病死亡雏鸭的肝脏、脾脏和肾脏的检测呈阳性或强阳性；兔抗DHAV-1 IgG抗体经DHAV-1抗原吸附后(吸收试验)免疫荧光检测呈阴性；兔正常血清替代兔抗DHAV-1 IgG抗体、正常山羊血清替代酶标抗体、以PBS代替兔抗DHAV-1 IgG抗体(替代实验)免疫荧光检测呈阴性；对其他病原(鸭瘟、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌)人工感染致死鸭的组织检测均显阴性。

阴性和阳性对照、吸收试验、替代实验、对其他病原人工感染致死鸭的组织检测均表明：利用血清1型鸭肝炎病毒高免血清检测血清1型鸭肝炎病毒及其定位具有较好的特异性。

3.3间接免疫荧光方法的临床应用

3.3.1用建立IFA方法检测25份临床送检可疑为DVH死亡鸭的肝脏组织样品，结果有19份为阳性；25份临床送检可疑为DVH死亡鸭的肝脏组织样品同时进行病原分离鉴定，IFA检测为阳性19份样品均分离到DHAV-1，表明血清1型鸭肝炎病毒高免血清可作为检测、鉴定血清1型鸭肝炎病毒的试剂。

3.3.2用建立IFA方法检测DVH人工感染死亡鸭的肝脏、脾脏和肾脏进行检测。(1)肝脏：黄绿色荧光多出现在肝细胞的细胞质中，围绕细胞核，细胞膜也有大量荧光信号(图1)。(2)肾脏：肾小管间质存在大量黄绿色荧光，阳性信号出现在肾小管上皮细胞的细胞质中，细胞膜也能发现阳性信号，肾小球细胞检测到的阳性信号较少(图2)。(3)脾脏：强阳性，阳性信号颗粒主要出现在白髓区淋巴细胞胞质中，在红髓区中则较少见(图3)。表明血清1型鸭肝炎病毒高免血清可作为感染雏鸭体内的DHAV-1抗原定位和动态分布提供有效的实验检测试剂。

实施例6血清3型鸭肝炎病毒高免血清分离检测鉴定血清3型鸭肝炎病毒

1、实验材料

1.1实施例4中制备的血清3型鸭肝炎病毒高免血清。

1.2检测材料：可疑为鸭肝炎病毒感染死亡鸭组织中分离到的病毒，可致死鸭胚，鸭胚具有鸭肝炎病毒致死的特征。取致死鸭胚的尿囊液作为检测材料。

1.3其它材料：鸭胚

2、方法

取可疑为鸭肝炎病毒感染死亡鸭组织中分离到的病毒接种鸭胚的尿囊液作为检测材料进行10_- ¹、10_- ²、10_- ³、10_- ⁴和10_- ⁵倍比稀释，分别与实施例3中制备的血清1型鸭肝炎病毒高免血清、实施例4中制备的血清3型鸭肝炎病毒高免血清等量混合后，每个稀释度的混合液各接种5枚鸭胚，同时设置未与高免血清混合的10_- ¹、10_- ²、10_- ³、10_- ⁴和10_- ⁵倍比稀释的尿囊液检测材料作为对照。

3、结果

10_- ¹、10_- ²、10_- ³倍比稀释的尿囊液接种的鸭胚全部在100h内死亡；10_- ¹、10_- ²、10_- ³倍比稀释的尿囊液与实施例3中制备的血清1型鸭肝炎病毒高免血清等量混合的，也全部死亡；10_- ¹、10_- ²、10_- ³倍比稀释的尿囊液与实施例4中制备的血清3型鸭肝炎病毒高免血清等量混合的，全部没有死亡，有100％的保护力。

采用“1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检测试剂盒、引物对及方法”(专利申请号为201310228262.9)检测，结果表明材料中含3型鸭甲型肝炎病毒。

结果表明利用血清3型鸭肝炎病毒高免血清可作为鉴定检测血清3型鸭肝炎病毒的试剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种鸭肝炎病毒免疫原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的鸭肝炎病毒免疫原的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述鸭肝炎病毒为血清1型鸭肝炎病毒CH60株或血清3型鸭肝炎病毒CH-1株。

3.如权利要求1所述的鸭肝炎病毒免疫原的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述PBS的用量为：20ml尿囊液对应使用0.5ml PBS，鸭肝炎病毒免疫原含量为1500μg/ml。

4.一种鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，以上述权利要求1～3任一项所述鸭肝炎病毒免疫原为抗原，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，在步骤(5)之后还包括步骤：

6.如权利要求4所述的鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述不完全弗氏佐剂的制备过程为：将石蜡油和羊毛脂按体积比为1:5的比例混合，用超声波使之混匀，高温灭菌后得到。

7.如权利要求4所述的鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，注射液研磨充分的判断标准为：成均匀的乳白色油包水状态的液体，取一滴该液体置于冰水上3～5min不扩散。

8.如权利要求5所述的鸭肝炎病毒高免血清的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述鸡胚或鸭胚尿囊液冻干制剂为9～10日龄鸡胚或10～12日龄鸭胚尿的尿囊液按常规方法直接真空冷冻干燥获得。

9.权利要求4～8任一项所述制备方法得到的鸭肝炎病毒高免血清在鸭肝炎病毒诊断、检测中的应用。