CN1927884A - 防治鸭病毒性肝炎的异源蛋黄抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种用于雏鸭病毒性肝炎的预防和治疗的蛋黄抗体的制备方法。本发明改用异源动物鸡进行抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的制备。即用雏鸭鸭病毒性肝炎病毒灭活油乳剂疫苗免疫产蛋鸡，从鸡蛋蛋黄中提取特异性的免疫球蛋白，用于预防和治疗鸭病毒性肝炎疾病。经临床试验和使用结果表明：用本方法制备的鸭病毒性肝炎蛋黄抗体用于预防和治疗，预防率和治愈率高、药效期长，药物效果显著，且可避免同源抗体垂直传播疾病的危险。

Description

防治鸭病毒性肝炎的异源蛋黄抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于预防和治疗鸭病毒性肝炎疾病的异源蛋黄抗体的制备方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎病是一种主要侵害雏鸭的急性、败血性、接触性传染病。本病多发于3-7日龄的雏鸭，发病后往往为急性经过，发病率可达100％，死亡率高达80-100％。10日龄以上的鸭也可感染发病，但感染后往往呈亚临床或隐性感染，死亡率随着日龄的增大而降低。本病给养鸭业造成巨大经济损失，是养鸭业危害最大的疫病。

本病在世界各地均有暴发，且常常蔓延流行迅速。由于本病发病日龄较早，无母源抗体的雏鸭2-3日龄即可发病。如果进行疫苗免疫，一般往往需5-7天才能产生免疫应答，故用疫苗免疫来控制鸭病毒性肝炎疾病在生产实际中存在着诸多的困难。在国外，控制本病一般使用疫苗免疫产蛋母鸭通过母源抗体让后代获得免疫用于控制本病的发生。而我国，由于规模化饲养程度不高，种鸭养殖户和小鸭孵抱、饲养均为不同的人群，种鸭养殖户免疫意识淡薄或根本不进行种鸭的免疫，造成我国鸭病毒性肝炎疾病的流行。因此，制备特异性的高免血清和高免蛋黄抗体预防和控制鸭病毒性肝炎疾病，成为控制本病暴发流行的最经济有效的办法。

80年代末，鸭病毒性肝炎高免抗血清和特异性蛋黄抗体制剂在我国开始广泛推广应用。由于蛋黄抗体疗效显著、制作方法简便、成本低廉的特点，深受广大养殖户的欢迎。

众所周知，鸭病毒性肝炎蛋黄抗体一般采用动物试验或鸭胚的中和试验测定抗体效价。而不能用琼扩或其它方法进行简便的测定。因动物或鸭胚的来源、品种、检测日龄等差异，因此在生产实际中的检验结果以及重复性较差，生产的产品因检测方法的差异导致效果时好时坏。同时采用动物试验或鸭胚的中和试验测定抗体效价，检测时间长，造成生产的产品不能及时进入生产应用。

结合这种实际情况，我们使用免疫产蛋鸡的方法生产鸡抗鸭病毒性肝炎高免蛋黄抗体，用于预防和治疗鸭病毒性肝炎。用本方法生产的蛋黄抗体，可以使用琼扩方法检验抗体的效价，且检验结果重复性较好，及时准确，有效的解决了生产实际中存在的上述问题。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种用于预防和治疗鸭病毒性肝炎疾病的异源蛋黄抗体的制备方法，使用异源动物鸡用于鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的生产，即通过使用鸭病毒性肝炎灭活油乳剂疫苗免疫健康产蛋鸡，从鸡蛋黄中提取免疫球蛋白。

本发明中使用了琼脂扩散的检测方法进行鸭病毒性肝炎蛋黄抗体效价的检测，检测结果迅速准确，重复性好。

用本方法生产的抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，解决了本动物垂直传播疾病的危险和血清的高过敏原性，同时降低了生产成本和使用成本。

用鸭病毒性肝炎油乳剂疫苗免疫产蛋母鸡生产的蛋黄抗体，用于鸭病毒性肝炎的预防和治疗，效果确实。

在提取蛋黄抗体的过程中，蛋黄用3倍体积的生理盐水稀释后，充分搅拌均匀，用三氯甲烷进行提取精制，制备蛋黄抗体进行注射使用。

在分离的上清液中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，37℃保温密封8-12小时，以杀灭蛋黄抗体中可能污染或垂直传播的微生物，从而确保产品的安全性。

提取蛋黄抗体的性质稳定，可在室温下保存18个月以上，对于用户在运输、使用上具有独特的优势。

具体实施方式

1、种毒准备及增殖

1.1将冷冻保存的鸭病毒性肝炎病料(肝毒)用灭菌生理盐水做成1∶5捣碎，冻融2次后，离心收集上清液，经56℃处理1小时，加入青、链霉素处理，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，接种9-11日龄非免疫鸭胚尿囊腔，在37℃的恒温箱中孵育，弃去48小时内的死亡鸭胚，收集48-120小时内死亡的胚，采集尿囊液及羊水。死亡胚应出现典型的出血等病理变化。

1.2配制油乳剂抗原

将收获的尿囊毒液中加入0.1％甲醛溶液，37℃密闭灭活48小时。期间每4-6小时振摇一次。灭活完成后，按灭活毒液96份，吐温-80 4份配制，即为制苗用抗原。按油相3份、水相1份的比例进行配制。取油相、水相搅拌均匀，加入高压均质机中，调节压力为35mpa，乳化制备成鸭病毒性肝炎灭活油乳剂疫苗，分装，加入1％硫柳汞溶液使之终浓度为万分之一，摇匀备用。

按照油乳佐剂疫苗的相关检验项目进行检验，检验合格后，即为免疫用油乳剂抗原。置4℃避光保存，6个月内有效。

2、产蛋鸡免疫

基础免疫：以制备的鸭病毒性肝炎灭活油乳剂抗原颈部皮下注射0.5ml/只。

强化免疫：2周后，以制备的鸭病毒性肝炎灭活油乳剂抗原颈部皮下注射1.0ml/只，进行强化免疫。间隔2周后用灭活油乳剂抗原再次强化免疫一次，颈部皮下注射2.0ml/只。

以后间隔8周进行一次强化免疫，每次颈部皮下注射2.0ml/只。

3、高免蛋收集

第二次强化免疫后第7天开始，每隔三天抽样用琼脂扩散方法测定高免鸡蛋蛋黄中抗鸭病毒性肝炎特异抗体效价。蛋黄与生理盐水按1∶3(V/V)稀释后，加蛋黄等体积三氯甲烷萃提，若上清液抗体效价达到1∶64以上即可集蛋，用于制备鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。高免鸡蛋在15℃-25℃可贮存3天，4-10℃贮存期不得超过10天。

4、提取鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体

4.1蛋壳消毒  将高免鸡蛋浸入加热至42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。蛋壳污染严重的，应事先选出，单独消毒并用清水冲洗干净后，再浸泡消毒一次。然后将新洁尔灭消毒后的高免鸡蛋浸入水温为90-95℃的水浴中消毒5秒钟，取出后晾干或吹干备用。

4.2蛋黄分离  采取手工或机械打蛋。打蛋时应充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。

4.3萃提  于蛋黄中加入3倍体积的生理盐水，充分搅拌均匀，然后在蛋黄液中加入与蛋黄等体积的三氯甲烷，充分振荡混合均匀，室温作用60分钟，以3500-4000rpm离心30分钟，收集上层清液备用。

4.4加入灭活剂  在分离的上清液中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，37℃保温密封8-12小时。

4.5除菌过滤  用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，定量分装，即为鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。

5、产品检验

5.1无菌检验  应无菌生长。

5.2物理性状  本品为微黄色或淡黄色的透明液体。久置后瓶底有少许细小的白色沉淀。pH值5.5-6.5。

5.3安全检验  18-22g健康小鼠5只，各皮下注射本品0.5ml；3日龄易感雏鸭10只，各皮下注射本品3.0ml。观察10天，小鼠和雏鸭均应全部健活。

5.4抗体效价测定  琼扩抗体效价应达到1∶64及以上。

5.5效力检验  用鸭效检3-5日龄易感雏鸭30只，随机分为三组。第一组为健康对照组，不注射任何药品，隔离饲养。第二和三组每只雏鸭皮下接种鸭病毒性肝炎强毒SCG99株肠道病料毒lOOLD₅₀。于攻毒后24小时分别给第二组皮下注射本品2.0ml，第三组皮下注射生理盐水2.0ml。观察每组雏鸭发病、死亡情况至第10天。

结果判定：第一组为健康对照组，试验期间全部雏鸭应健康无病。第三组为攻毒对照组，应于攻毒后3-7天发病，96小时后开始死亡，10天内应死亡8只以上。第二组为早期感染治疗组，注射本品后48小时，即攻毒后3天后，试验雏鸭开始发病，但发病率不得超过30％，至观察结束时试验雏鸭应存活8只及以上。该制品判为合格。

使用油乳剂灭活疫苗免疫产蛋母鸭，从蛋黄中提取免疫球蛋白，该免疫球蛋白对鸭病毒性肝炎疾病具有特异性的预防和治疗作用，且用药后动物体内不存在药物残留，同时药效期长达5-7天，是一种高效、特效、无残留的新型兽药。鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体对鸭病毒性肝炎疾病的预防和治疗实验情况：

实验一：400只1日龄小鸭，随机分成两组，每组200只，按照常规饲养方法进行饲养；第一组实验鸭每只腿部肌肉注射1.0ml鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，第二组实验鸭每只腿部肌肉注射1.0ml生理盐水，分别于注射后24小时、72小时，120小时及168小时从各组中随机抽取50只实验鸭用于攻毒试验，攻毒结果观察并记录直至攻毒后10天。结果表明第一组实验鸭在注射鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体后24小时、72小时、120小时攻毒后100％存活。在168小时攻毒后存活率为84％，而第二组实验鸭在相同时间攻毒后，其存活率分别为34％、42％、48％、62％。结果详见下表一和表二：

表一：注射鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体后不同时间的攻毒保护结果

组别	攻毒时间(h)	攻毒后发病数	攻毒后死亡数	攻毒后存活数	预防保护率
						1	24	0	0	50	100％(50/50)
2	72	0	0	50	100％(50/50)
						3	120	2	0	50	100％(50/50)
4	168	18	8	42	84％(42/50)

表二：对照组在不同日龄的攻毒结果

组别	攻毒日龄(h)	攻毒后发病数	攻毒后死亡数	攻毒后存活数	死亡率
						1	48	50	50	0	100％(50/50)
2	96	50	50	0	100％(50/50)
						3	144	44	42	8	84％(42/50)
4	192	38	29	21	58％(29/50)

实验二：200只2日龄小鸭，随机分成四组，每组50只，按照常规饲养方法进行饲养；在实验室条件下人工感染鸭病毒性肝炎。第1、2、3组试验鸭分别在感染后24小时、48小时、72小时每只鸭腿部肌肉注射鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体1.0ml进行治疗。第4组实验鸭作为空白对照，观察各组的发病及死亡情况并记录直至攻毒后10天。保护试验结果表明：实验鸭在攻毒后24小时、48小时、72小时的保护率分别为100％(50/50)、100％(50/50)、86％(43/50)。而第4组实验鸭存活率为38％(19/50)。结果详见下表三：

表三：攻毒后不同时间鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的治疗效果

组别

治疗时间(h)

治疗时发病数

治疗时死亡数

治疗数

治疗后死亡数

治疗后存活数

治愈数

1	24	4	0	50	0	50	100％
								2	48	16	2	48	0	48	100％
3	72	48	16	34	6	28	82％
								4	-	-	-	-	-	-	-

从上述结果可以看出，鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体对雏鸭鸭病毒性肝炎疾病具有良好的预防和治疗效果。

虽然本文参照优选的实施例说明了本发明的各方面和特征，但上述实施例只是说明性的，并不限制本发明的范围。本发明的范围仅由权利要求书来限制。在不背离权利要求书的实质和范围的条件下，本领域的技术人员易于对本发明进行适当的改动或改变，因此这些改动或改变也应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1、一种鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体制备方法，包括下列步骤：

(a)将冻干保存的鸭病毒性肝炎病毒以1∶1000稀释后，稀释液56℃处理1小时，经0.22um微孔滤膜过滤除菌后，接种13-15日龄非免疫鸭胚尿囊腔，37℃孵育，弃去48小时内的死亡鸭胚，收集48-96小时内的死亡鸭胚，采集尿囊液及羊水；

(b)将收获的尿囊毒液中加入0.1％甲醛溶液，37℃密闭灭活48小时；灭活完成后，按灭活毒液96份，吐温-80 4份配制，即为制苗用抗原；按油相3份、水相1份的比例取油相、水相搅拌均匀，加入高压均质机中，调节压力为35mpa，乳化制备成鸭病毒性肝炎灭活油乳剂疫苗，并加入1％硫柳汞溶液使之终浓度为万分之一；

(c)以制备的鸭病毒性肝炎灭活油乳剂抗原颈部皮下注射0.5ml/只；2周后，以制备的鸭病毒性肝炎灭活油乳剂抗原颈部皮下注射1.0ml/只，进行强化免疫；间隔2周后用灭活油乳剂抗原再次强化免疫一次，颈部皮下注射2.0ml/只；以后间隔8周进行一次强化免疫，每次颈部皮下注射2.0ml/只；

(d)第二次强化免疫后第7天开始，每隔三天抽样用琼脂扩散方法测定高免鸡蛋蛋黄中抗鸭病毒性肝炎特异抗体效价；蛋黄与生理盐水按1∶3(V/V)稀释后，加等体积三氯甲烷萃提，若上清液琼扩抗体效价达1∶64以上即可集蛋，用于制备鸭病毒性肝炎蛋黄抗体；

(e)将蛋壳消毒，打蛋并充分除去蛋清、胚盘和系带，收集蛋黄；于蛋黄中加入3倍体积的生理盐水，充分搅拌均匀，然后在蛋黄液中加入与蛋黄等体积的三氯甲烷，充分振荡混合均匀，室温作用60分钟，以3500-4000rpm离心30分钟，收集上层清液备用；

(f)在分离的上清液中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，37℃保温密封8-12小时；用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得琼扩抗体效价达到1∶32及以上的鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。

2、根据权利要求1所述的鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：

使用异源动物鸡用于鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的生产，即通过使用鸭病毒性肝炎灭活油乳剂疫苗免疫健康产蛋鸡，从鸡蛋黄中提取免疫球蛋白。

3、根据权利要求1所述的鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：

使用了琼脂扩散的检测方法进行鸭病毒性肝炎蛋黄抗体效价的检测，检测结果迅速准确，重复性好。

4、根据权利要求1所述的鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：

用本方法生产的抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体，解决了本动物垂直传播疾病的危险和血清的高过敏原性，同时降低了生产成本和使用成本。

5、根据权利要求1所述的鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：

用鸭病毒性肝炎油乳剂疫苗免疫产蛋母鸡生产的蛋黄抗体，用于鸭病毒性肝炎的预防和治疗，效果确实。

6、根据权利要求1所述的鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：

在提取蛋黄抗体的过程中，蛋黄用3倍体积的生理盐水稀释后，充分搅拌均匀，用三氯甲烷进行提取精制，制备蛋黄抗体进行注射使用。

7.根据权利要求1所述的鸡抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：

在分离的上清液中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，37℃保温密封8-12小时，以杀灭蛋黄抗体中可能污染或垂直传播的微生物，从而确保产品的安全性。

8.根据权利要求1所述的异源抗小鹅瘟蛋黄抗体的制备方法，其特征在于：

提取蛋黄抗体的性质稳定，可在室温下保存18个月以上，对于用户在运输、使用上具有独特的优势。