CN102716484A - 一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉,包括以下组分:鸭病毒性肝炎卵黄抗体85-88%、辛酸0.8-1.0%、硫柳汞0.01-0.02%、甲醛0.2-0.3%、4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。该冻干粉的优点保存时间长、溶解快、抗体效价高、生物活性良好,最重要是本产品的抗体纯度高于市场现在产品。本发明同时公开了一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉的制备方法,包括以下步骤:在经常发病地区自行分离毒株制备疫苗,免疫健康鸭群制得高免蛋,将高免蛋经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、冻干等得到鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体冻干粉。本申请制备方法中在酸化水处理时应用了巴氏消毒的温度加热卵黄液,不仅达到消毒的作用同时可以提高抗体的回收率和酸化处理时溶液的澄清度,制得的卵黄抗体的优势特征过生物活性高、抗体保存时间、效价降低速度减缓等优点。
Description
技术领域
本发明属于禽类用生物制品技术领域,尤其是一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉及其制备方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎简称鸭肝炎,是危害雏鸭最严重的疫病之一,主要危害20日龄以内的雏鸭,雏鸭日龄越小,死亡率越高,最高死亡率可达90%-95%,并且所有的抗菌素对本病无效。1945年在美国首次发现本病,并命名为I型鸭病毒性肝炎,1965年在英国发现了鸭病毒性肝炎II型,1969年在美国发现了鸭病毒性肝炎III型。鸭病毒性肝炎病毒I型属于小RNA病毒科,呈球形或类球形,直径在20-40NM,无囊膜,无血凝性,可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力强,在自然环境中可较长时间存活。鸭肝炎I型引起雏鸭的严重死亡,死亡率高达90%,中成鸭一般不发病,病雏鸭的特征是意识紊乱,频频抽搐,肝脏呈斑点状出血,胆囊肿大,胆汁颜色变淡。DVH病毒II型属于星状病毒,DVH-III属于小RNA病毒。DVH病毒三种血清型之间无交叉保护作用。目前,I型呈世界性分布,并曾报道在印度、埃及和美国发现I型鸭肝炎病毒的变异株。II型和III型鸭病毒性肝炎分别局限于英国和美国,未发现变异毒株。鸭病毒性肝炎早在1958年在我国发现,20世纪80年代初期起本病在我国再次流行,此后,各地疫情此起彼伏,疫情能够被鸭病毒性肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控制;1997年以来,本病在某些地区出现较严重的流行,其疫情不能被标准鸭病毒性肝炎I型弱毒疫苗完全地控制,怀疑有I型鸭病毒性肝炎病毒变异株出现。
鸭病毒性肝炎易造成地区性爆发从而造成严重的经济损失。目前,主要防治手段包括抗病毒药、中西药及制剂、卵黄抗体及其他生物制剂等,其中卵黄抗体是最有效的治疗鸭病毒病的方法。
鸡卵黄抗体IgY是鸡的一种免疫球蛋白Ig,鸡IgY在功能上相当于哺乳动物IgG,但结构上有所不同,具有典型的的免疫球蛋白的空间构象。鸡卵黄抗体具有很多优越性。(1)由于鸟类与哺乳类动物种系发生学的差距,鸟类更适于生产抗哺乳动物抗原的特异性抗体。卵黄抗体不会激发补体系统,不与抗哺乳动物抗原的抗体发生反应,不与哺乳动物和细菌的Fc受体结合,这在免疫诊断中具有重要意义。(2)卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白,在贮存、生产、加工、摄食及消化过程中保证其稳定性是非常关键的。多项试验表明,鸡IgY具有较好的稳定性,耐酸、耐碱、耐热。卵黄抗体较易保存,4℃条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响。(3)卵黄抗体量大,成本低,便于规模化生产。卵黄中抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血清抗体浓度的水平上。1只产蛋鸡(以平均每周产蛋5-6枚,平均每枚鸡蛋蛋黄大约15mL计算)所产蛋生产的抗体量相当于90-100mL血清或180-200mL血液中抗体的量,例如1只兔子1个月可提取IgG约200mg,而1个月1只蛋鸡可从蛋中提取IgY2000mg以上。此外,在实际生产中,动物的采血不仅对动物本身是极大的应激,而且费时、费工,大规模生产是不切实际的,而利用蛋鸡生产抗体要方便的多。总的来讲,卵黄抗体对动物没有毒副作用,用高免卵黄抗体治疗动物疾病不但避免了高免血清价格昂贵、产量低的缺点,而且可以避免高免血清在治疗过程中引起的副作用,是一种很有前途的新型免疫球蛋白制剂。因此,卵黄抗体在禽畜疾病诊断、治疗和预防的应用越来越多。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉,该冻干粉的优点是保存时间长、溶解快、抗体效价高、生物活性良好,而且本产品的抗体纯度高于市场现有产品。
本发明的目的同时在于提供一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉的制备方法。
为了实现以上目的,本发明所采用的技术方案是:
一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉,包括以下重量百分数的各组分:鸭病毒性肝炎卵黄抗体85-88%、辛酸0.8-1.0%、硫柳汞0.01-0.02%、甲醛0.2-0.3%、4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。
一种所述鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉的制备方法为:分离毒株制备疫苗,免疫健康鸭群制得高免蛋,将高免蛋经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、冻干得到鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体冻干粉。
所述的鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉的制备方法,具体步骤为:
1)分离毒株制备疫苗:本次病毒样品主要从江苏南京和福建分别采集鸭病毒性肝炎样品和鸭瘟样品,经过无菌采集临床上发病症状明显的病例,将采集的样品研磨,经过3次冻融,15000rpm/min高速离心留取上清液,将上清液接种于鸡胚囊中传代经过62代的传递,根据传代胚胎病变和人工致病试验,验证得弱毒株JSNJ62株;
2)免疫健康鸭群制得高免蛋:免疫接种鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.5mL(含毒103.2ELD50/0.1Ml),第一次免疫健康鸭群使用鸭病毒性肝炎灭活疫苗,每次免疫间隔5天时间,以后免疫加1倍量,免疫三次,第二次免疫后开始检测抗体效价,使抗体效价达到1:256时,开始收集蛋,收集的蛋进行清理、消毒,晾干备用;
3)水稀释法酸化处理:分离高免蛋卵黄,加入等体积的无菌水,搅拌混匀至颜色发白,得到卵黄溶液;将卵黄溶液放入60-65℃水浴锅内均匀加热30min,然后加入pH为4.9-5.2的、温度为4-6℃的酸化水溶液,加入量为卵黄溶液体积的6倍,混匀,静置沉淀,取上清液,离心20min,15000rpm/min,留上清液;
4)辛酸处理;向步骤3)上清液中加入辛酸,加入量为溶液体积的0.8-1.0%,混匀,静置,弃去杂质漂浮物,离心10min,20000rpm/min,留取上清液,静置;
5)用0.45μm的滤膜对步骤4)所得上清液过滤,用于截流分子量大于200KD的大分子物质,再经0.22μm滤膜过滤,留滤液,经超滤装置浓缩,使使500mL/500羽份的卵黄抗体液浓缩至2.5mL/500羽份为止;
6)向步骤5)所得卵黄溶液加入甲醛、硫柳汞防腐,甲醛的加入量为0.2-0.3%,硫柳汞为0.01-0.02%;
7)再加入辅料4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇;
8)预冻:将浓缩后的卵黄抗体放置-80℃,充分冷冻;
9)将步骤7)所得卵黄抗体溶液冻干,冻干曲线程序是-40℃开始升华,2h后升到-35℃保持14h。
本发明免疫采用是健康的鸭作为免疫对象,这可以增加针对性,可以使抗体效价快速达到1:256,提高工作效率,应用同种动物产生多元抗体针对鸭种预防免疫范围广、强度大。通过鸭强化免疫后制成的卵黄抗体对鸭病毒性肝炎病见效快、疗效显著,而且针对性强,同时对鸭的这种病具有很好的预防效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的阐述。
实施例1.本实施例鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉,包括以下组分:鸭病毒性肝炎卵黄抗体85.99%、辛酸0.8%、硫柳汞0.01%、甲醛0.2%、葡萄糖5%、山梨醇2%、甘氨酸3%、甘露醇3%。
本实施例鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体冻干粉的制备方法,具体步骤为:
1)免疫接种鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.5mL(含毒1032ELD50/0.1Ml),第一次免疫健康鸭群使用鸭病毒性肝炎灭活疫苗,每次免疫间隔5天时间,以后免疫加1倍量,免疫三次,第二次免疫后开始检测抗体效价,使抗体效价达到1:256时,开始收集蛋,收集的蛋进行清理、消毒,晾干备用;
2)收集高免蛋,将高免蛋经过消毒、晾干,分离卵黄,打碎,加入等体积的无菌水,搅拌混匀,直到颜色发白为止,得到卵黄溶液;
3)将上述的卵黄液放入60℃水浴锅内加热30min,期间要间断性的搅拌,使其受热均匀;
4)加热后加入原卵黄液体积的6倍预冷pH为4.8盐酸水溶液,混匀,静置,取上清液,离心20min,15000rpm/min,留上清液;
5)将步骤4)得到的上清液中按体积加入辛酸0.8%,混匀,静置,弃除上浮杂质,留取下清液,离心10min,20000rpm/min,取上清液;
6)将步骤5)上清液经过0.45μm滤膜过滤,得到滤液,经过超滤装置截流分子量大于50KD的物质,采用循环方式浓缩至使500mL/500羽份的卵黄抗体液浓缩至2.5mL/500羽份为止;
7)浓缩液按体积加入甲醛量为0.2%,硫柳汞量为0.01%;
8)配制过程中,加入辅料为葡萄糖5%、山梨醇2%、甘氨酸3%、甘露醇3%物质;
9)预冷,根据冻干曲线程序将配制好的黄抗体浓缩液放置-80℃进行预冻,这一步必须将产品冻的彻底;
10)按照冻干曲线设定冻干程序,冻干曲线程序是-40℃开始升华,2h后升到-35℃保持14h。
为了检测卵黄抗体在常温下的放置时抗体效价变化,以此来确定本产品的保质期,做了以下试验:将本品保存在37℃培养箱中,保存24个月,分别1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后,用琼脂扩散(AGP)法,测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化,结果见表1。
表1.常温放置冻干粉不同时间段效价的变化
项目 | 1周 | 2周 | 1月 | 2月 | 4月 | 8月 | 12月 | 16月 | 20月 | 24月 |
DHV | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:16 | 1;16 | 1:16 | 1:16 | 1:16 |
质量标准:
[性状]本品为淡黄色,呈致密的团块。
[无菌检验]按《中国兽药典》进行,无菌生长。
[支原体检验]按《中国兽药典》进行,无支原体生长。
[外源病毒检验]按《中国兽药典》进行,符合规定。
[安全检验]用7日龄雏鸭5只,各肌肉注射羽份,观察2周,应全部健活,注射部位没有病变。
[效力检验]按生产的规格进行稀释至1羽份/mL。
1)保护力检测:用7日龄雏鸭30只,其中10只,每只肌肉注射1羽份卵黄抗体,另20只对照隔离饲养。24h,取试验组和对照组中的10只雏鸭肌注接种DHV稀释后病毒液,记录96h死亡情况,试验组的保护率在95%以上,攻毒对照组死亡率在85%以上,空白对照组雏鸭无任何变化。
2)治愈力测定:用7日龄雏鸭90只,30只作阴性对照,60只点眼接种DHV稀释的病毒液,感染12h后,其中30只,每只肌肉注射本品,每日1次,连续3日,另30只做阳性对照,隔离饲养。治疗后72h,记录各组死亡情况,攻毒阳性对照组死亡率85%以上,治疗组存活率在95%以上,健康阴性对照组30只无任何变化。
[剩余水分测定]按《中国兽药典》进行,符合兽用生物制品通则规定。
[真空度测定]按《中国兽药典》进行,符合规定。
[保质期]根据常温效价检测实验结果,可以存放2年。
实施例2.本实施例鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉,包括以下组分:鸭病毒性肝炎卵黄抗体87.735%、辛酸1.0%,硫柳汞0.015%、甲醛0.25%、葡萄 糖4.5%、山梨醇1.5%、甘氨酸2.5%、甘露醇2.5%。
本实施例鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体冻干粉的制备方法,具体步骤为:
1)免疫接种鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.5mL(含毒103.2ELD50/0.1Ml),第一次免疫健康鸭群使用鸭病毒性肝炎灭活疫苗,每次免疫间隔5天时间,以后免疫加1倍量,免疫三次,第二次免疫后开始检测抗体效价,使抗体效价达到1:256时,开始收集蛋,收集的蛋进行清理、消毒,晾干备用;
2)收集高免蛋,将高免蛋经过消毒、晾干,分离卵黄,打碎,加入等体积的无菌水,搅拌混匀,直到颜色发白为止,得到卵黄溶液;
3)将上述的卵黄液放入62℃水浴锅内加热30min,期间要间断性的搅拌,使其受热均匀;
4)加热后加入原卵黄液体积的6倍预冷pH为5.0的盐酸水溶液,混匀,静置,取上清液,离心20min,15000rpm/min,留上清液;
5)将步骤4)得到的上清液中按体积加入1.0%辛酸,混匀,静置,弃除上浮杂质,留取下清液,离心10min,20000rpm/min,取上清液;
6)将步骤5)上清液经过0.45μm滤膜过滤,得到滤液,经过超滤装置截流分子量大于50KD的物质,采用循环方式浓缩至使500mL/500羽份的卵黄抗体液浓缩至2.5mL/500羽份为止;
7)浓缩液按体积加入甲醛量为0.25%,硫柳汞量为0.015%;
8)配制过程中,加入辅料为葡萄糖4.5%、山梨醇1.5%、甘氨酸2.5%、甘露醇2.5%;
9)预冷,根据冻干曲线程序将配制好的黄抗体浓缩液放置-80℃进行预冻,这一步必须将产品冻的彻底;
10)按照冻干曲线设定冻干程序,冻干曲线程序是-40℃开始升华,2h后升到-35℃保持14h。
为了检测卵黄抗体在常温下的放置时抗体效价变化,以此来确定本产品的保质期,做了以下试验:将本品保存在37℃培养箱中,保存24个月,分别1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后,用琼脂扩散(AGP)法,测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化,结果见表2。
表2.常温放置冻干粉不同时间段效价的变化
项目 | 1周 | 2周 | 1月 | 2月 | 4月 | 8月 | 12月 | 16月 | 20月 | 24月 |
DHV | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:16 | 1:16 | 1:16 |
质量标准:
[性状]本品为淡黄色,呈致密的团块。
[无菌检验]按《中国兽药典》进行,无菌生长。
[支原体检验]按《中国兽药典》进行,无支原体生长。
[外源病毒检验]按《中国兽药典》进行,符合规定。
[安全检验]用7日龄雏鸭5只,各肌肉注射羽份,观察2周,应全部健活,注射部位没有病变。
[效力检验]按生产的规格进行稀释至1羽份/mL。
1)保护力检测:用7日龄雏鸭30只,其中10只,每只肌肉注射1羽份卵黄抗体,另20只对照隔离饲养。24h,取试验组和对照组中的10只雏鸭肌注接种DHV稀释后病毒液,记录96h死亡情况,试验组的保护率在96%以上,攻毒对照组死亡率在90%以上,空白对照组雏鸭无任何变化。
2)治愈力测定:用7日龄雏鸭90只,30只作阴性对照,60只点眼接种DHV稀释的病毒液,感染12h后,其中30只,每只肌肉注射本品,每日1次,连续3日,另30只做阳性对照,隔离饲养。治疗后72h,记录各组死亡情况,攻毒阳性对照组死亡率88%以上,治疗组存活率在97%以上,健康阴性对照组30只无任何变化。
[剩余水分测定]按《中国兽药典》进行,符合兽用生物制品通则规定。
[真空度测定]按《中国兽药典》进行,符合规定。
[保质期]根据常温效价检测实验结果,可以存放2年。
实施例3.本实施例鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉,包括以下组分:鸭病毒性肝炎卵黄抗体86.68%、硫柳汞0.02%、甲醛0.3%、5%葡萄糖、2%山梨醇、3%甘氨酸、3%甘露醇。
本实施例的鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体冻干粉可以采用常规冻干粉的制备方法来制备。
为了检测卵黄抗体在常温下的放置时抗体效价变化,以此来确定本产品的保质期,做了以下试验:将本品保存在37℃培养箱中,保存24个月,分别1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后,用琼脂扩散(AGP)法,测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化,结果见表3。
表3.常温放置冻干粉不同时间段效价的变化
项目 | 1周 | 2周 | 1月 | 2月 | 4月 | 8月 | 12月 | 16月 | 20月 | 24月 |
DHV | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1:32 | 1;16 | 1:16 | 1:16 | 1:16 |
质量标准:
[性状]本品为淡黄色,呈致密的团块。
[无菌检验]按《中国兽药典》进行,无菌生长。
[支原体检验]按《中国兽药典》进行,无支原体生长。
[外源病毒检验]按《中国兽药典》进行,符合规定。
[安全检验]用7日龄雏鸭5只,各肌肉注射羽份,观察2周,应全部健活,注射部位没有病变。
[效力检验]按生产的规格进行稀释至1羽份/mL。
1)保护力检测:用7日龄雏鸭30只,其中10只,每只肌肉注射1羽份卵黄抗体,另20只对照隔离饲养。24h,取试验组和对照组中的10只雏鸭肌注接种DHV稀释后病毒液,记录96h死亡情况,试验组的保护率在96%以上,攻毒对照组死亡率在90%以上,空白对照组雏鸭无任何变化。
2)治愈力测定:用7日龄雏鸭90只,30只作阴性对照,60只点眼接种DHV稀释的病毒液,感染12h后,其中30只,每只肌肉注射本品,每日1次,连续3日,另30只做阳性对照,隔离饲养。治疗后72h,记录各组死亡情况,攻毒阳性对照组死亡率85%以上,治疗组存活率在95%以上,健康阴性对照组30只无任何变化。
[剩余水分测定]按《中国兽药典》进行,符合兽用生物制品通则规定。
[真空度测定]按《中国兽药典》进行,符合规定。
[保质期]根据常温效价检测实验结果,可以存放2年。
实验例
用7日龄雏鸭100只,第一组50只作本产品组,第二组50只作为市售二联卵黄抗体产品组,隔离饲养,点眼接种DHV稀释的病毒液,表现出临床症状时,开始治疗,第一组每只肌肉注射本品2mL,每日1次,连续3日,第二组肌肉注射市售产品2mL,每日1次,连续3日。治疗后72h,记录各组发病及治疗情况。表4。
表4实验情况
项目 | 24h | 48h | 72h | 96h | 108h | 132h | 死亡率 | 成活率 |
第一组 | 2 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 8% | 92% |
第二组 | 1 | 2 | 2 | 1 | 0 | 0 | 12% | 88% |
Claims (3)
1.一种鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉,其特征在于包括以下重量百分数的各组分:鸭病毒性肝炎卵黄抗体85-88%、辛酸0.8-1.0%、硫柳汞0.01-0.02%、甲醛0.2-0.3%、4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇。
2.一种如权利要求1所述鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉的制备方法,其特征在于:分离毒株制备疫苗,免疫健康鸭群制得高免蛋,将高免蛋经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、冻干得到鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体冻干粉。
3.根据权利要求2所述的鸭病毒性肝炎卵黄抗体冻干粉的制备方法,其特征在于具体步骤为:
1)免疫健康鸭群制得蛋:免疫接种鸭病毒性肝炎灭活疫苗1.5mL(含毒103.2ELD50/0.1 Ml),第一次免疫健康鸭群使用鸭病毒性肝炎灭活疫苗,每次免疫间隔7天时间,以后免疫加1倍量,免疫三次,第二次免疫后开始检测抗体效价,使抗体效价达到1:256时,开始收集蛋,收集的蛋进行清理、消毒,晾干备用;
2)水稀释法酸化处理:分离高免蛋卵黄,加入等体积的无菌水,搅拌混匀至颜色发白,得到卵黄溶液;将卵黄溶液放入60-65℃水浴锅内均匀加热30min,然后加入pH为4.9-5.2的、温度为4-6℃的酸化水溶液,加入量为卵黄溶液体积的6倍,混匀,放置4℃环境中静置沉淀,取上清液,离心20min,15000rpm/min,留上清液;
3)辛酸处理;向步骤2)上清液中加入辛酸,加入量为溶液体积的0.8-1.0%,混匀,静置,弃去杂质漂浮物,离心10min,20000rpm/min,留取上清液,静置;
4)用0.45mm的滤膜对步骤3)所得上清液过滤,用于截流分子量大于200KD的大分子物质,再经0.22mm滤膜过滤,留滤液,经超滤装置浓缩,使使500mL/500羽份的卵黄抗体液浓缩至2.5 mL/500羽份为止;
5)向步骤4)所得卵黄溶液加入甲醛、硫柳汞防腐,甲醛的加入量为0.2-0.3%,硫柳汞为0.01-0.02%;
6)再加入辅料4-5%葡萄糖、1-2%山梨醇、2-3%甘氨酸、2-3%甘露醇;
7)预冻:将浓缩后的卵黄抗体放置-80℃,充分冷冻;
8)将步骤7)所得卵黄抗体溶液冻干,冻干曲线程序是-40℃开始升华,2 h后升到-35℃保持14h。
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