CN102397556A - 鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用 Download PDF

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苏敬良
胡燕宾
赖�志
高俊锋
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Abstract

本发明涉及鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用，将冻干保护剂基质按一定的比例混合、配制，将保护剂分别进行无菌处理，对可以进行高压灭菌的保护剂组份溶于双蒸水中，108～121℃灭菌15～30分钟；将不耐高压灭菌的保护剂组份按配比溶于双蒸水中用0.22μm的滤膜除菌，再将两者混合成为耐热保护剂，然后将该耐热保护剂和鸭病毒性肝炎病毒液进行1∶1～1.2混合，采用相应的冻干曲线冻干，与现有技术相比，本发明鸭病毒性肝炎弱毒疫苗的研制提供了很好的资源，另外克服国产疫苗保存工艺落后现状，提高疫苗质量以及市场竞争力，在2～8℃条件下保存24个月，疫苗效价均保持在每羽份≥106.0EID50。

Description

鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及动物用病毒性疾病活疫苗制造领域，尤其是涉及鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由鸭病毒性肝炎病毒(DuckHepatitis Virus，DHV；属小核糖核酸病毒)引起的小鸭的一种急性传染病，对小鸭具有高度致死性。严重影响养鸭业的发展。临床上已报道有多种病毒可引起小鸭病毒性肝炎。已确定有小RNA病毒科1型鸭病毒性肝炎病毒、新血清型鸭病毒性肝炎病毒和1型鸭病毒性肝炎病毒变异株，以及星状病毒科的2型、3型鸭病毒性肝炎病毒等。我国自1980年在北京分离到本病毒并确定为血清1型鸭病毒性肝炎病毒以来，该病在全国各地均有不同程度的流行。1950年，Levine和Fabricant首次在美国长岛发现本病，并通过鸡胚分离到鸭病毒性肝炎病毒。以后各国均有本病流行的报道。我国于1963年由上海畜牧兽医研究所黄均健首次报道；北京大学王平、潘文石等在北京地区某鸭场分离到了鸭病毒性肝炎病毒。证实北京地区有本病发生。以后发现全国各地都有本病发生。
本病主要危害1～3周龄的雏鸭，因此防治方法主要针对雏鸭。具体方法大体上可以为两大类，即雏鸭的被动免疫方法和主动免疫方法。雏鸭的被动免疫方法主要包括对雏鸭注射康复鸭血清、高免母鸭或母鸡的蛋黄匀浆；及用DHV免疫种鸭，使后代雏鸭获得蛋传抗体。雏鸭的主动免疫方法就是用各种DHV疫苗(鸡胚化弱毒、细胞毒、强毒灭活苗和弱毒灭活苗等)接种雏鸭，使其自身产生抗体，以达到防治DVH的目的。而无论是用以上方法免疫种鸭还是雏鸭，均很难在雏鸭10日龄之前产生足够效价的抗体，因此雏鸭在1-10日龄爆发鸭病毒性肝炎死亡率非常高且难以控制。
弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，而目前国内没有一例鸭病毒性肝炎活疫苗问世。究其原因主要有：(1)自然分离得到的鸭病毒性肝炎强毒株在人工复制病例中，不能稳定致死5日龄以上的雏鸭，要分离到够稳定致死7-8日龄雏鸭的鸭病毒性肝炎强毒非常困难。而没有强毒对照，就没有办法进行疫苗的后续研发工作；(2)获得1株免疫原性良好、毒力稳定，且疫苗免疫后抗体产生快，能够保护10日龄以内雏鸭的鸭病毒性肝炎致弱疫苗毒株也比较困难，研究发现该病毒致弱后往往免疫原性不佳或易发生毒力反强。
此外，在疫苗保护剂方面，国内疫苗企业常用的疫苗保护剂主要是乳糖，牛奶，明胶等，组方简单，保护性差。如果在2℃～8℃条件下，保存期只有3～6个月，大多需要在-15℃以下保存。而国内传统的动物用疫苗保护剂的研制相对滞后，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易造成疫苗因保存不当而失效，导致疫苗免疫失败而造成疫病流行。所以，耐热保护剂的研究非常急需，发达国家在二十世纪八十年代就已开始进行耐热保护剂的研究，目前已经基本采用耐热冻干保护剂生产冻干疫苗，但由于保护剂的研究和应用属于专利资料，处于保密状况中。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种克服国产疫苗保存工艺落后现状，提高疫苗质量以及市场竞争力的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂，其特征在于，该保护剂包括以下组分及重量百分比含量：
明胶                1～3％；
乳糖                4～7％；
牛血清白蛋白        1～3％；
胰蛋白胨            2～3％；
EDTA                1～3％；
水解酪蛋白          6～8％；
维生素C             1～3％；
谷氨酸单钠          1～3％；
磷酸氢二钾        1～2％；
磷酸二氢钾        0.52％；
双蒸水            余量。
鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)按照以下组分及重量百分比含量配料：
明胶            1～3％、
乳糖            4～7％、
牛血清白蛋白    1～3％、
胰蛋白胨        2～3％、
EDTA            1～3％、
水解酪蛋白      6～8％、
维生素C         1～3％、
谷氨酸单钠      1～3％、
磷酸氢二钾      1～2％、
磷酸二氢钾      0.52％、
双蒸水          余量；
(2)将明胶、乳糖、EDTA、胰蛋白胨按上述配比溶于双蒸水中，控制温度为108～121℃高压灭菌15～30min；
(3)将牛血清白蛋白、水解酪蛋白、维生素C、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾按上述配比溶于双蒸水中，用0.22μm的滤膜除菌，然后其与步骤(2)中制备得到的组分混合，配制成耐热保护剂。
鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的应用，其特征在于，将制备得到的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂和鸭病毒性肝炎病毒培养液按重量比为1∶(1～1.2)混合得到混合液，然后进行冻干处理得到鸭病毒性肝炎活疫苗的冻干产品。
所述的冻干处理包括以下步骤：将分装好的混合液装入冻干机箱体内，在2～3h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5～6h，开始抽真空至10-4Pa，然后开始升温，14～16h内升至-20℃，之后以2～5℃/h的速度升温至20℃，维持5～6h后加塞出箱即得到冻干产品。
所述的冻干处理的全部时间为42～46h。
所述的鸭病毒性肝炎病毒培养液中所用病毒包括1型鸭病毒性肝炎病毒、2型鸭病毒性肝炎病毒、3型鸭病毒性肝炎病毒或新型鸭病毒性肝炎病毒。
与现有技术相比，本发明为鸭病毒性肝炎弱毒疫苗的研制提供了很好的资源，另外克服国产疫苗保存工艺落后现状，提高疫苗质量以及市场竞争力，发明了鸭病毒性肝炎活疫苗耐热型的制备保存工艺，在2～8℃条件下可以保存24个月，疫苗效价均保持在每头份≥106.0EID50。
附图说明
图1为实施例2的冻干曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
一.1型鸭病毒性肝炎制苗病毒液的获得
(1)1型鸭病毒性肝炎病毒的分离
将采集的病鸭的肝脏在灭菌的乳钵内充分研磨，用灭菌生理盐水制成1∶5悬液，冻融3次，3000r/min离心，15min，取上清液，加2000IU/mL青、链霉素，37℃作用60min。取9～10日龄SPF鸡胚20枚，分为2组，每组10枚，第1组为试验组，经尿囊腔途径接种病料，0.2mL/胚；第2组为对照组，经尿囊腔途径接种无菌生理盐水，0.2mL/胚。接种后继续孵化，每日照蛋2次，收获24～144h死亡胚尿囊液，冷冻保存、备用，观察胚体及内脏病变。按常规方法对分离毒进行检测和鉴定。
(2)1型鸭病毒性肝炎病毒的传代致弱
将分离毒株经9日SPF龄鸡胚尿囊腔接种，0.2mL/枚，连续传代，进行1型鸭病毒性肝炎病毒鸡胚致弱毒培育，选择48～96小时死亡的鸡胚，置4℃冰箱放置24小时，无菌操作，取出卵黄以外的全胚，用组织捣碎机制成匀浆，加入双抗。分装，置-70℃冰箱贮存备用。
(3)1型鸭病毒性肝炎病毒致弱毒株的检测
取第25、35、45、55、65、67、71、76、81、86、91、96、101代次鸡胚组织毒，分别进行病毒毒价(ELD50)，稳定性(毒力返强)，免疫原性，免疫产生期以及安全性等检测。结果表明从67代起，病毒毒力稳定在106.0ELD50，71～86代的病毒液毒力非常稳定(在本动物体内连续传10代均未出现毒力返强)，且具有非常好的免疫原性，免疫后3天即可产生中和抗体，免疫后5天抗体达到最高峰值且可维持至少6周。选取第71代弱毒作为生产疫苗的原始种毒，选取72～76代作为生产疫苗的基础种毒，用于生产安全有效的1型鸭病毒性肝炎活疫苗。
二.3型鸭病毒性肝炎制苗病毒液的获得
(1)3型鸭病毒性肝炎病毒的分离
将采集的病鸭的肝脏在灭菌的乳钵内充分研磨，用灭菌生理盐水制成1∶5悬液，冻融3次，3000r/min离心，15min，取上清液，加2000IU/mL青、链霉素，37℃作用60min。取9～10日龄SPF鸡胚20枚，分为2组，每组10枚，第1组为试验组，经尿囊腔途径接种病料，0.2mL/胚；第2组为对照组，经尿囊腔途径接种无菌生理盐水，0.2mL/胚。接种后继续孵化，每日照蛋2次，收获24～144h死亡胚尿囊液，冷冻保存、备用，观察胚体及内脏病变。按常规方法对分离毒进行检测和鉴定。
(2)3型鸭病毒性肝炎病毒的传代致弱
将分离毒株经9日SPF龄鸡胚尿囊腔接种，0.2mL/枚，连续传代，进行3型鸭病毒性肝炎病毒鸡胚致弱毒培育，选择48～96小时死亡的鸡胚，置4℃冰箱放置24小时，无菌操作，取出卵黄以外的全胚，用组织捣碎机制成匀浆，加入双抗。分装，置-70℃冰箱贮存备用。
(3)3型鸭病毒性肝炎病毒致弱毒株的检测
取第25、35、45、55、65、67、71、76、81、86代次鸡胚组织毒，分别进行病毒毒价(ELD50)，稳定性(毒力返强)，免疫原性，免疫产生期以及安全性等检测。结果表明从45代起，病毒毒力稳定在106.0ELD50，55～71代的病毒液毒力非常稳定(在本动物体内连续传10代均未出现毒力返强)，且具有非常好的免疫原性，免疫后3天即可产生中和抗体，免疫后5天抗体达到最高峰值且可维持至少6周。选取第55代弱毒作为生产疫苗的原始种毒，选取56～60代作为生产疫苗的基础种毒，用于生产安全有效的3型鸭病毒性肝炎活疫苗。
实施例1
1型鸭病毒性肝炎活疫苗耐热型保存工艺
(1)冻干保护剂的配方及配制方法
耐热成份：明胶1％、乳糖7％、EDTA1％，然后用双蒸水定溶到合适的刻度，121℃高压灭菌30分钟。
不耐热成份：谷氨酸单钠1％、水解酪蛋白6％、维生素C3％、磷酸氢二钾2％、磷酸二氢钾0.52％，牛血清白蛋白1％、胰蛋白胨2％用双蒸水定溶到合适的刻度，用0.22μm的滤膜除菌，然后两者按1∶1混合。
(2)1型鸭病毒性肝炎病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。
(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在3小时内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持6个小时后，开始抽真空至10-4帕后，在开始升温，14小时内升至-20℃，之后以每小时2℃的速度升温至20℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程为42小时。
实施例2
1型鸭病毒性肝炎活疫苗耐热型保存工艺
(1)冻干保护剂的配方及配制方法
耐热成份：明胶3％、乳糖6％、EDTA1％，然后用双蒸水定溶到合适的刻度。121℃高压灭菌30分钟。
不耐热成份：谷氨酸单钠3％、水解酪蛋白6％、维生素C1％、磷酸氢二钾1％、磷酸二氢钾0.52％，牛血清白蛋白3％、胰蛋白胨2％用双蒸水定溶到合适的刻度，用0.22μm的滤膜除菌，然后两者按1∶1混合。
(2)1型鸭病毒性肝炎病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。
(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在2小时内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5个小时后，抽真空至10-4帕，开始升温，14小时内升至-20℃，之后以每小时2℃的速度升温至20℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程为46个小时。
冻干产品的测试
将不同实施案例冻干的产品，置于100℃、37℃、2～8℃条件下保存，不同时间取样，测定病毒含量及其物理性状，结果见表1、2、3。
表1 冻干制品置于100℃间接煮沸10分钟后的物理性状和滴度的测定结果
  组别   干后   物理性状   100℃10分钟   EID50/0.1mL
  实施例1   10-6.50   疏松海绵状   未收缩   10-4.50
  实施例2   10-6.20   疏松海绵状   未收缩   10-4.20
  普通冻干   10-6.50   疏松海绵状   收缩成胶状   0
表2 冻干前后疫苗于37℃保存不同时间EID50/0.1mL
Figure BDA0000063116810000071
表3 冻干前后疫苗于2～8℃保存不同时间EID50/0.1mL
Figure BDA0000063116810000072
实施例3
3型鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的制备方法包括以下步骤：
耐热成份：明胶1％、乳糖7％、EDTA1％，然后用双蒸水定溶到合适的刻度。121℃高压灭菌30分钟。
不耐热成份：谷氨酸单钠1％、水解酪蛋白8％、维生素C3％、磷酸氢二钾2％、磷酸二氢钾0.52％，牛血清白蛋白1％、胰蛋白胨2％用双蒸水定溶到合适的刻度，用0.22μm的滤膜除菌，然后两者按1∶1混合。
(2)3型鸭病毒性肝炎病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。
(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在3小时内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持6个小时后，开始抽真空至10-4帕后，在开始升温，15小时内升至-20℃，之后以每小时2℃的速度升温至20℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程为42个小时。
实施例4
3型鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的制备方法包括以下步骤：
3型鸭病毒性肝炎活疫苗耐热型保存工艺
(1)冻干保护剂的配方及配制方法
耐热成份：明胶3％、乳糖6％、EDTA1％，然后用双蒸水定溶到合适的刻度。121℃高压灭菌30分钟。
不耐热成份：谷氨酸单钠3％、水解酪蛋白6％、维生素C1％、磷酸氢二钾1％、磷酸二氢钾0.52％，牛血清白蛋白3％、胰蛋白胨2％用双蒸水定溶到合适的刻度，用0.22μm的滤膜除菌。
然后两者按1∶1混合。
(2)3型鸭病毒性肝炎病毒经过培养后，进行无菌检验和病毒含量的测定，将合格的病毒液和配制好的冻干保护剂1∶1混合后，充分摇匀，定量分装后立即进行冷冻干燥。
(3)将分装好的疫苗装入冻干机箱体内，在2小时内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持6个小时后，抽真空至10-4帕，开始升温，16小时内升至-20℃，之后以每小时2℃的速度升温至20℃，维持6小时加塞出箱。冻干全程为46个小时。
冻干产品的测试
将不同实施案例冻干的产品，置于100℃、37℃、2～8℃条件下保存，不同时间取样，测定病毒含量及其物理性状，结果见表4、5、6。
表4 冻干制品置于100℃间接煮沸10分钟后的物理性状和滴度的测定结果
  组别   干后   物理性状   100℃10分钟   EID50/0.1mL
  实施例3   10-6.55   疏松海绵状   未收缩   10-5.55
  实施例4   10-6.45   疏松海绵状   未收缩   10-5.25
  普通冻干   10-6.40   疏松海绵状   收缩成胶状   0
表5 冻干前后疫苗于37℃保存不同时间EID50/0.1mL
Figure BDA0000063116810000081
表6 冻干前后疫苗于2～8℃保存不同时间EID50/0.1mL
Figure BDA0000063116810000082
实施例5
2型鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂及其制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)按照以下组分及重量百分比含量：明胶3％、乳糖4％、牛血清白蛋白2％、胰蛋白胨3％、EDTA 3％、水解酪蛋白7％、维生素C 1％、谷氨酸单钠3％、磷酸氢二钾1％、磷酸二氢钾0.52％，余量为双蒸水；
(2)将明胶、乳糖、EDTA、胰蛋白胨按上述配比溶于双蒸水中，控制温度为108℃高压灭菌15min；
(3)将牛血清白蛋白、水解酪蛋白、维生素C、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾按上述配比溶于双蒸水中，用0.22μm的滤膜除菌，然后其与步骤(2)中制备得到的组分混合，配制成耐热保护剂。
将制备得到的鸭病毒性肝炎活疫苗耐热保护剂和鸭病毒性肝炎病毒培养液按重量比为1∶1.2混合得到混合液，鸭病毒性肝炎病毒培养液中所用病毒为2型鸭病毒性肝炎病毒。混合好之后进行冻干处理，包括以下步骤：将分装好的混合液装入冻干机箱体内，在2h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5h，开始抽真空至10-4Pa，然后开始升温，14h内升至-20℃，之后以5℃/h的速度升温至20℃，维持6h后加塞出箱即可，整个冻干处理的全部时间为42h。

Claims (6)

1.鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂，其特征在于，该保护剂包括以下组分及重量百分比含量：
明胶            1～3％；
乳糖            4～7％；
牛血清白蛋白    1～3％；
胰蛋白胨        2～3％；
EDTA            1～3％；
水解酪蛋白      6～8％；
维生素C         1～3％；
谷氨酸单钠      1～3％；
磷酸氢二钾      1～2％；
磷酸二氢钾      0.52％；
双蒸水          余量。
2.如权利要求1所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)按照以下组分及重量百分比含量配料：
明胶            1～3％、
乳糖            4～7％、
牛血清白蛋      1～3％、
胰蛋白胨        2～3％、
EDTA            1～3％、
水解酪蛋白      6～8％、
维生素C         1～3％、
谷氨酸单钠      1～3％、
磷酸氢二钾      1～2％、
磷酸二氢钾      0.52％、
双蒸水          余量；
(2)将明胶、乳糖、EDTA、胰蛋白胨按上述配比溶于双蒸水中，控制温度为108～121℃高压灭菌15～30min；
(3)将牛血清白蛋白、水解酪蛋白、维生素C、谷氨酸单钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾按上述配比溶于双蒸水中，用0.22μm的滤膜除菌，然后其与步骤(2)中制备得到的组分混合，配制成耐热保护剂。
3.如权利要求1所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的应用，其特征在于，将制备得到的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂和鸭病毒性肝炎病毒培养液按重量比为1∶(1～1.2)混合得到混合液，然后进行冻干处理得到鸭病毒性肝炎活疫苗的冻干产品。
4.根据权利要求3所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的应用，其特征在于，所述的冻干处理包括以下步骤：将分装好的混合液装入冻干机箱体内，在2～3h内缓慢降温至-45℃，在此温度下维持5～6h，开始抽真空至10-4Pa，然后开始升温，14～16h内升至-20℃，之后以2～5℃/h的速度升温至20℃，维持5～6h后加塞出箱即得到冻干产品。
5.根据权利要求4所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的应用，其特征在于，所述的冻干处理的全部时间为42～46h。
6.根据权利要求3所述的鸭病毒性肝炎活疫苗用耐热保护剂的应用，其特征在于，所述的鸭病毒性肝炎病毒培养液中所用病毒包括1型鸭病毒性肝炎病毒、2型鸭病毒性肝炎病毒、3型鸭病毒性肝炎病毒或新型鸭病毒性肝炎病毒。
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