CN103013931A

CN103013931A - 一种鸭甲肝病毒js株及其在鸭病毒性肝炎防治中的应用

Info

Publication number: CN103013931A
Application number: CN2012105621517A
Authority: CN
Inventors: 王彬; 藏玉婷; 邬立权; 柴华; 王琪; 宋扬; 刘洪斌; 涂映霞; 王峰; 张杨; 丁国杰
Original assignee: HARBIN PHARMACEUTICAL GROUP BIOLOGICAL VACCINE CO Ltd
Current assignee: HARBIN PHARMACEUTICAL GROUP BIOLOGICAL VACCINE CO Ltd
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-12-21
Also published as: CN103013931B

Abstract

本发明公开了一种新型鸭甲肝病毒JS株及其在鸭病毒性肝炎防治中的应用。所述的鸭甲肝病毒JS株经分离培养、鸭胚中和试验、病毒的PCR检测及病毒的测序检测实验获得，并确定所述毒株为鸭甲肝病毒血清3型，微生物保藏编号为：CGMCC No.6852。本发明将新型鸭甲肝病毒JS株作为生产疫苗的病毒株，接种10日龄SPF鸭胚，挑选在孵育48小时之后死亡的胚胎，收集胚液，灭活后经乳化制备新型鸭甲肝病毒灭活疫苗。临床应用证实，制备的灭活疫苗安全性良好。该疫苗有利于新型鸭甲肝病毒病的防控，可有针对性的防治新型鸭甲肝病毒的感染与爆发，可规模化生产并应用于临床。

Description

一种鸭甲肝病毒JS株及其在鸭病毒性肝炎防治中的应用

技术领域

本发明涉及一种分离得到的病毒株及其应用，特别涉及一种鸭甲肝病毒JS株及其在鸭病毒性肝炎防治中的应用。属于生物疫苗防治领域。

背景技术

鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)是鸭病毒性肝炎的致病病原。国际病毒分类系统于2010年4月修订：鸭肝炎病毒命名为鸭甲肝病毒（DHAV），属小RNA病毒科，禽肝炎病毒属。目前鸭甲肝病毒分为3个血清型，即：血清1型，血清2型和血清3型。其中血清1型为传统鸭肝炎病毒，血清2型和血清3型为近几年发现的新型病毒株，对应台湾新型和韩国新型，3个血清型之间无交叉反应。

随着鸭甲肝病毒1型鸡胚化弱毒疫苗、高免卵黄抗体的研制成功及临床应用，使本病在很大程度上的很好的控制。近几年，在山东、河北、广东等地免疫接种过1型鸭肝炎弱毒疫苗或注射过1型鸭肝炎高免卵黄抗体的鸭群中仍发生鸭肝炎，死亡率为20%-80%，经病毒分离鉴定为血清3型，即韩国新型。目前市场上还未见鸭甲肝病毒3型疫苗，因此对于鸭甲肝病毒3型的防治，国内还为空白。对于鸭甲肝病毒3型疫苗的研制刻不容缓。

发明内容

本发明目的之一是提供一株新分离的鸭甲肝病毒;

本发明目的之二是将上述鸭甲肝病毒制备新型鸭甲肝病毒灭活疫苗。

本发明目的之三是提供一种制备上述新型鸭甲肝病毒灭活疫苗的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株新分离的鸭甲肝病毒毒株由专利发明人自行分离得到，通过毒种的分离培养、鸭胚中和试验、病毒的PCR检测及病毒的测序检测实验，确定该毒株为一株新型鸭甲肝病毒，并命名为鸭甲肝病毒JS株（DHAV-JS），微生物保藏编号是：CGMCCNo.6852。分类名是：鸭甲肝病毒；保藏时间是：2012年11月13日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明鸭甲肝病毒（DHAV）JS株的分离结果显示：病毒盲传5代，多数鸭胚于48～120h死亡。剖检鸭胚可见绒毛尿囊膜水肿，胚头，颈部、胸部、爪、翅尖及喙旁均有出血。收获的鸭胚尿囊液经红细胞凝集试验检测无血凝活性。

本发明鸭甲肝病毒（DHAV）JS株的鸭胚中和试验结果显示：试验组鸭胚全部存活，而对照组经5d全部死亡，死亡鸭胚出血。说明血清3型鸭甲肝病毒抗血清可中和该病毒。

本发明鸭甲肝病毒（DHAV）JS株的病毒的PCR检测结果显示：通过鸭甲肝病毒特异性引物和相应的PCR试验，经1%琼脂糖凝胶电泳，约在714bp处出现了特异性的DNA条带。见附图1。

本发明鸭甲肝病毒（DHAV）JS株的测序检测，其中鸭甲肝病毒JS株VP1基因序列为SEQ ID NO.1所示，结果显示：利用DNA MAN软件，将JS株VP1基因序列与参考毒株的相应序列进行比较表明，JS3与DHAV血清1型VP1的基因序列核苷酸同源性在62.0%～64.4%之间，JS3与DHAV血清2型VP1的基因序列核苷酸同源性在63.6%～63.8%之间，JS3与DHAV血清3型VP1的基因序列核苷酸同源性在92.3%～98.5%之间。进化树分析表明，所分离到的JS3株与SD02（DHAV血清3型病毒）株的亲缘关系较近。见附图2、3。

进一步的，本发明还提出了所述的鸭甲肝病毒JS株在制备鸭甲肝病毒灭活疫苗中的应用。

本发明的一种鸭甲肝病毒灭活疫苗，其特征在于有效成分为灭活后的鸭甲肝病毒JS株，所述的鸭甲肝病毒JS株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：CGMCC No.6852。

更进一步的，本发明还提供了一种制备以上所述的鸭甲肝病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：培养上述鸭甲肝病毒JS株，得到鸭甲肝病毒抗原液，将鸭甲肝病毒抗原液灭活，浓缩，分别配制油相和水相，将油相和水相混合在一起后乳化，即得鸭甲肝病毒灭活疫苗。

在本发明中，优选的，所述的抗原液按照以下方法制备：

将所述的鸭甲肝病毒JS株（保藏编号为：CGMCC No.6852）接种10日龄SPF鸭胚，挑选在孵育48～120小时之间死亡的胚胎，收集抗原液。

优选的，进一步的，将得到的抗原液进行10倍浓缩。

更优选的，将抗原液中加入福尔马林溶液使得福尔马林溶液的终浓度为0.1％，置灭活罐中37℃温箱16小时灭活。

在本发明中，优选的，所述的油相按照以下方法制备：白油94份（以毫升为单位），司本-806份（以毫升为单位），混合后加热，加入硬脂酸铝2份（以克为单位），混合均匀，即得油相。

在本发明中，优选的，所述的水相按照以下方法制备：吐温-804份（以毫升为单位），灭活浓缩后的病毒抗原液96份（以毫升为单位），混合均匀，即得水相。

在本发明中，优选的，所述水相和油相按体积比1：2混合，并加入1%（w/v）硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%（w/v）。

此处“w/v”表示的是质量（g）与体积（ml）的比，1%（w/v）硫柳汞溶液即100ml水中含有硫柳汞的量为1g。

相较于现有技术，本发明的有点在于：

1、采用浓缩工艺，从而减少疫苗注射剂量，降低动物的应激反应，提高生产性能。

2、本发明不同剂量及批次灭活疫苗对雏鸭的免疫试验，注射0.05mL该灭活疫苗，对雏鸭的保护率为98.9%。

3、本发明灭活疫苗免疫1日龄雏鸭后，当雏鸭血清中和抗体效价≥2^5.5时，雏鸭抗1000LD₅₀/0.2mL的鸭甲肝病毒JS株攻击，保护率为100%。

4、本发明灭活疫苗免疫种鸭，种鸭血清中和抗体效价≥2^6.0时，其下一代雏鸭可获得有效被动免疫保护。

5、本发明灭活疫苗安全性试验，按照一次单剂量、重复单剂量和一次大剂量（0.5mL/只）注射雏鸭，在观察时间内，均无任何不良反应，表明制备的新型鸭甲肝病毒灭活疫苗安全性良好。

附图说明

图1为PCR检测结果；

图2为不同毒株的VP1基因序列比较分析；

图3为鸭甲肝病毒JS株和其它几株DHAV VP1的进化树分析；

图4为鸭甲肝病毒灭活疫苗的方法流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：鸭甲肝病毒JS株的分离培养

1病料采集：无菌采集雏鸭的肝、脾等组织病料，将病料剪碎，磨细，用无菌pH7.4PBS作1：5稀释，经3000rpm离心30min，取上清液加入抗生素，2000IU青霉素和2000μg/mL链霉素，于37℃作用30min，将离心的上清液按4：1加入三氯甲烷，充分混匀后，置37℃作用60min，经3000rpm离心30min，取上清液加入抗生素，2000IU青霉素和2000μg/mL链霉素，于37℃作用30min作为分离病毒材料。

2分离培养：将上述病毒分离材料接种10日龄SPF鸭胚，0.2mL/胚，置37℃～38℃孵化箱内孵化，每天照胚2～4次，观察5d，将48～120h死亡的胚胎放置4℃～8℃过夜冷却收缩血管，吸取尿囊液及胚体保存和作无菌检验，并观察胚胎病变。反复冻融3次，4000rpm离心30min，吸取上清，冻结保存。

实施例2:鸭甲肝病毒灭活疫苗的制备

1、基础种子批建立：取分离的冻干毒种，以pH7.4PBS作1：100稀释，接种10日龄SPF鸭胚，0.2mL/胚，每日照胚2～4次，观察5d，收集48～120h死亡的鸭胚，取尿囊液及胚体保存和作无菌检验，并观察胎儿病变。反复冻融3次，4000rpm离心30min，吸取上清，分装，冻干保存。

2、生产种子批建立：取12日龄SPF鸭胚，接种基础毒种，37～38℃孵育，每天照胚2～4次，观察5d，收集48～120h死亡的鸭胚，取尿囊液及胚体保存和作无菌检验，并观察胎儿病变。反复冻融3次，4000rpm离心30min，吸取上清，定量分装于玻瓶内，置-80℃冰箱内保存，按生产种子批指定的检验标准进行检验，即得生产毒种。

将合格后用作生产毒种的鸭甲肝病毒JS株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号是：CGMCC No.6852。

3、制苗用病毒液的制备

取生产用鹅甲肝病毒JS株毒种（保藏编号为：CGMCC No.6852），用灭菌生理盐水稀释至10^-3～10^-4，尿囊腔内接种10日龄SPF鸭胚，0.2mL/胚，接种后密封针孔，置37℃孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后，每天照蛋2次，将48小时前死亡的鸭胚弃去。此后，每6小时照蛋1次，死亡的胚随时取出，直至120小时，将48-120小时死亡鸭胚置于4℃冷却4～24小时。用碘酊消毒气室部位，然后以无菌方法剥除气室部位卵壳，揭去卵壳膜，挑破绒毛尿囊膜及羊膜，收取鸭胚尿囊液及胚体，反复冻融3次，4000rpm离心30min，吸取上清，冷藏保存。

4、浓缩：取出冷藏的病毒液，在无菌条件下，用装有10层纱布和1层300目铜纱的无菌漏斗过滤制苗用病毒液，除去尿囊液残渣和其它粗颗粒杂质。选用合适孔径的浓缩膜，按照病毒浓缩机操作要求，在2～8℃条件下浓缩病毒液。病毒液浓缩到10倍。

5、灭活：将病毒液注入灭活灌，开启灭活罐的搅拌器，准确量取10%的福尔马林溶液，在不断搅拌时加入含抗原液的灭活灌中，使其充分搅拌均匀。福尔马林溶液终浓度为0.1％。将灭活罐升温至37℃（以罐内温度达到37℃开始计时），维持灭活时间16小时，期间不停缓慢搅拌。灭活结束后，取样10mL，用于做灭活检验和无菌检验。

6、油佐剂灭活疫苗的配制

6.1油相制备：取优质白油94mL，加司本-806mL，混合后加热，另加硬脂酸铝2g，一边加一边搅拌，直至透明为止，高压灭菌，冷却后备用。

6.2水相制备：取4mL吐温-80，加入到灭活的病毒胚液96mL中，使吐温-80充分溶解。

6.3配苗及乳化：取60mL油相加入乳化灌内，开动电机慢速搅拌，同时徐徐加入上述30mL水相，加完后继续搅拌，同时加入1%（w/v）硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%（w/v）；然后通过均质机乳化。制成鸭甲肝病毒灭活疫苗。乳化后，取样3～5mL，以3000rpm离心15min，若有分层现象，应重复乳化1次。

实施例3：鸭甲肝病毒灭活疫苗的应用

1、对雏鸭不同剂量及批次的鸭甲肝病毒灭活疫苗免疫试验

三批鸭甲肝病毒灭活疫苗（按照实施例2方法制备），按0.02mL/只、0.05mL/只和0.10mL/只，接种1日龄易感雏鸭，于接种后24h后攻击鸭甲肝病毒JS株，1000LD₅₀/0.2mL，观察雏鸭的保护情况，结果见表1。

表1不同剂量鸭甲肝病毒灭活疫苗的免疫试验结果

注：分母为试验数，分子为存活数。

结果显示，本发明中鸭甲肝病毒灭活疫苗具有良好的预防鸭甲肝病毒作用。三批次不同剂量鸭甲肝病毒灭活疫苗的免疫试验，分别注射0.02mL/只、0.05mL/只和0.10mL/只，攻击鸭甲肝病毒JS株后，雏鸭耐受强毒攻击，0.05mL/只能保护89/90，保护率为98.9%，而0.02mL/只仅能保护77/90雏鸭，保护率为85.6%。因此以0.05mL/只接种鸭甲肝病毒灭活疫苗，能保护率可达95%以上。

2、免疫雏鸭中和抗体水平与免疫保护力关系实验三批鸭甲肝病毒灭活疫苗（201201、201202和201203）分别免疫1日龄雏鸭,对每批次血清中和抗体效价分别为2^3.7、2^4.5、2^5.5、和2^6.0的雏鸭进行分组，对每只雏鸭攻毒1000LD₅₀/0.2mL的鸭甲肝病毒JS株，观察5天，记录结果。三批疫苗免疫雏鸭后不同血清中和抗体效价雏鸭抗鸭甲肝病毒JS株攻击结果见表2。

表2三批疫苗免疫雏鸭后不同血清中和抗体效价雏鸭抗鸭甲肝病毒JS株攻击结果

注：1、免疫雏鸭中和效价:是指血清中和抗体效价为2x

2、分母为试验数，分子为存活数。

结果表明：鸭甲肝病毒灭活疫苗免疫1日龄雏鸭后，当雏鸭血清中和抗体效价≥2^5.5时，雏鸭抗1000LD₅₀/0.2mL的鸭甲肝病毒JS株攻击保护率为100%。

3、种鸭血清中和抗体水平与下一代雏鸭被动免疫保护力关系实验

三批鸭甲肝病毒灭活疫苗（201201、201202和201203）分别免疫樱桃谷鸭开产种鸭，对每批次血清中和抗体效价分别为2^4.5、2^5.5、2⁶和2^6.6的产蛋种鸭各选20只母鸭分配为一组，隔离饲养，7天后，再次采血分离血清进一步测定中和抗体效价，同时收集当天所产蛋孵化出1日龄雏鸭用于攻击1000LD₅₀/0.2mL的鸭甲肝病毒JS株，每组10只雏鹅，观察5天，记录结果。判定种鸭血清中和抗体水平与下一代雏鸭被动免疫保护力关系，结果见表3。

表3种鸭血清中和抗体水平与其下一代雏鸭被动免疫保护力关系

注：1、种母鸭血清中和抗体效价:是指血清中和抗体效价为2^x；2、分母为试验数，分子为存活数。结果表明：鸭甲肝病毒灭活疫苗免疫种鸭，种鸭血清中和抗体效价≥2^6.0，其下一代雏鸭可获得有效被动免疫保护。

4、鸭甲肝病毒灭活疫苗安全性试验

4.1一次单剂量注射的安全试验

使用三批鸭甲肝病毒灭活疫苗，一次注射雏鸭0.05mL/只，雏鸭注射局部和全身均无不良反应，结果见表4。

表4一次单剂量注射的安全试验结果

4.2单剂量重复注射抗体的安全试验

使用三批鸭甲肝病毒灭活疫苗，2次重复注射雏鸭0.05mL/只，雏鸭注射局部和全身均无不良反应，结果见表5。

表5单剂量重复注射安全试验结果

4.3一次大剂量注射的安全试验以三批鸭甲肝病毒灭活疫苗一次大剂量注射雏鸭，0.5mL/只，均无任何不良反应，结果见表6。

表6大剂量注射安全试验结果

以三批制备的鸭甲肝病毒灭活疫苗，按照一次单剂量、重复单剂量和一次大剂量（0.5mL/只）注射雏鸭，在观察时间内，均无任何不良反应，表明制备的鸭甲肝病毒灭活疫苗安全性良好。

Claims

1.一种新型鸭甲肝病毒JS株，其特征在于所述的鸭甲肝病毒JS株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年11月13日，微生物保藏编号为：CGMCC No.6852。

2.权利要求1所述的鸭甲肝病毒JS株在制备预防鸭甲肝病毒药物中的应用。

3.一种鸭甲肝病毒灭活疫苗，其特征在于有效成分为灭活后的鸭甲肝病毒JS株，所述的鸭甲肝病毒JS株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：CGMCC No.6852。

4.一种制备权利要求3所述的鸭甲肝病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：将所述的鸭甲肝病毒JS株进行培养，得到鸭甲肝病毒抗原液，将鸭甲肝病毒抗原液灭活，浓缩，分别配制油相和水相，将油相和水相混合后乳化，即得鸭甲肝病毒灭活疫苗。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的抗原液按照以下方法制备：

取所述的鸭甲肝病毒JS株毒种，接种10日龄SPF鸭胚，挑选孵育48-120小时后死亡的胚胎，收集抗原液。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于将得到的抗原液进行10倍浓缩。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的抗原液中加入福尔马林溶液，使得福尔马林溶液的终浓度为0.1％，置灭活罐中37℃温箱16小时灭活。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的油相按照以下方法制备：白油94份（以毫升为单位），司本-806份（以毫升为单位），混合后加热，加入硬脂酸铝2份（以克为单位），混合均匀，即得油相。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述水相按照以下方法制备：吐温-804份（以毫升为单位），灭活浓缩后的病毒抗原液96份（以毫升为单位），混合均匀，即得水相。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述水相和油相按体积比1：2混合，并加入1%（w/v）硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%（w/v）。