CN109797139B - 一种3型鸭甲肝病毒弱毒株ch-p60及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH‑P60及其应用，该病毒株于2018年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO：V201861。所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株对雏鸭安全，无致病力，且可保护同源强毒的攻毒，具有实际和广泛的应用价值。

Description

一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种3型鸭甲肝病毒弱毒 株CH-P60及其应用。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitisvirus，DHV)感染雏鸭引起的一种急性、高度接触性传染病。 目前世界上主要养鸭地区均有本病的存在，具有间歇爆发、地方流行 性等特点，是危害养鸭业的主要疾病之一。该病主要侵害一月龄以内 的雏鸭，具有发病急，传播迅速，病程短和死亡率高等特点；临床主 要表现为雏鸭死前发生痉挛，头向背部后仰，呈“角弓反张”；病理 变化主要为剖检可见肝脏肿大发炎和大量的出血性斑点。该病主要由 属于小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝病毒属(Avihepatovirus)的 鸭甲肝病毒(Duck hepatitis Avirus，DHAV)引起。DHAV具有三种血清型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。近年来，我国流行的DHAV主 要是DHAV-1和DHAV-3。

当前市场上对DHAV的防控主要是使用DHAV-1的弱毒疫苗，它 们可以有效防控DHAV-1在我国的流行，但是不能完全阻止属于不同 血清型的DHAV-3病毒的流行给养殖业造成了巨大的经济损失。因此， 研制适合我国DHAV-3流行情况的疫苗迫在眉睫。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种3型 鸭甲肝病毒弱毒株，并对其在鸭病毒性肝炎预防方面的应用进行研究。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种3型鸭甲肝病毒CH-P60株DHAV-3CH-P60，该 病毒株于2018年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地 址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为 CCTCC NO：V201861。

本发明所述3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60是由DHAV-3分离株作 为种子病毒，经过多次传代致弱获得，具体是使用9日龄健康鸭胚对 DHAV-3进行连续传代致弱，每个代次通过尿囊腔接种5枚鸭胚，每 枚鸭胚接种0.2mL，置于37℃恒温培养箱内孵育36～48小时后无菌 收集鸭胚尿囊液，然后将尿囊液使用灭菌生理盐水稀释100倍后，使 用前述方法做同样处理，将病毒连续传至第60代，获得的病毒即为 CH-P60株。

对病毒株CH-P60进行VP1基因遗传进化分析，其核苷酸序列如 SEQ ID NO：7所示，从GenBank上搜索下载已公布的37株具有代表 意义的DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3毒株VP1基因序列，并应用MEGA 7.0软件按Clustal W法对序列进行比对，然后并按Neighbor-Joining法，选bootstrap method 1000参数，构建系统进化树进行病毒遗传进 化分析，病毒株CH-P60在遗传进化树中与流行于中国地区3型鸭甲 肝病毒属于同一分支，与流行于韩国地区的3型鸭甲肝病毒属于不同 分支。

进一步，本发明通过ELD50测定、雏鸭致病力试验、鸭胚中和实 验和雏鸭攻毒保护试验来测定弱毒株生物学特性。试验结果表明 CH-P60毒株对鸭胚适应性增强，对雏鸭不具有致死性，且免疫雏鸭 后，雏鸭的攻毒保护率升高。

在本发明的另一方面，所述的CH-P60毒株在制备预防3型鸭甲 肝病毒疫苗中的应用也在本发明的保护范围内。

在本发明的另一方面，一种预防3型鸭甲肝病毒疫苗，该疫苗有 效成分为3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60。

上述所预防3型鸭甲肝病毒疫苗通过以下步骤制备：

将3型鸭甲肝病毒弱毒株(CH-P60)作为种毒用灭菌生理盐水稀 释后，尿囊腔接种9日龄鸭胚，收集24-72小时死亡鸭胚尿囊液，按 照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌和支原体检验，并测 定病毒含量(ELD50)；

将经无菌和支原体检验合格的鸭胚尿囊液病毒用无菌PBS或生 理盐水稀释为所需的ELD50，直接作为3型鸭甲肝病毒弱毒(CH-P60) 疫苗；或者向病毒液中加入终浓度为0.1％甲醛溶液，37℃处理24小 时后获得灭活的病毒液，然后使用灭菌磷酸盐缓冲溶液将其稀释至适 当浓度后与弗氏不完全佐剂按照1:1体积比混合，乳化后即制成3型 鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60灭活疫苗。

本发明的有益效果为：

本发明所述3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60是经过连续传代致弱 手段获得的，并且对雏鸭无毒力，将所述弱毒株制成疫苗安全有效， 可保护同源强毒的攻毒，具有实际和广泛的应用价值。

附图说明

图1为病毒分离株接种鸭胚后死亡鸭胚胚体；

图2为RT-PCR方法检测3型鸭甲肝病毒的琼脂糖凝胶电泳结果；

图3为3型鸭甲肝病毒分离株和弱毒株(CH-P60)与其他37株 鸭甲肝病毒参考毒株VP1蛋白氨基酸序列的遗传进化树。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明，不是对本发明的 进一步限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常 规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从 商业途径得到。

实施例1 3型鸭甲肝病毒分离鉴定

1.病毒分离

DHAV-3CH分离株于2013年从四川省成都市周边鸭场9日龄发 病北京鸭中分离，具体过程如下：

无菌采集病死雏鸭肝脏，按体积比1:5的比例加入灭菌磷酸盐缓 冲溶液，研磨，反复冻融3次，12000g离心10min，上清液经0.22μ m滤器过滤除菌后经尿囊腔途径接种9日龄鸭胚10枚，每胚接种0.2 mL，接种后的鸭胚置于37℃恒温培养箱内孵育，每8小时照胚1次，记录接种7天内鸭胚死亡情况，弃去24小时之内的死亡鸭胚，收集 其余死亡鸭胚尿囊液，如此盲传5代，死亡鸭胚均呈现典型的鸭肝炎 病毒病变，如图1所示，表现为鸭胚发育不良、胚体四肢水肿严重， 充血等，接种鸭胚死亡时间集中在在接种后36～56小时之间，收获 的病毒(CH-P5)存于-80℃。

2.病毒含量测定

用无菌生理盐水溶液倍比稀释3型鸭甲肝病毒分离株(CH-P5)， 选择10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8这6个稀释度，分别以每胚 0.2mL的量经尿囊腔途径接种5枚9日龄的鸭胚，另设灭菌生理盐水 对照5个，接种后置于37℃恒温培养箱内孵育，24小时内死亡鸭胚不计，观察并记录7天内接种鸭胚的死亡和存活情况，按Reed-Muech 法计算ELD50，结果显示每0.2mL鸭胚尿囊液中3型鸭甲肝病毒含量 为10^-5.50ELD50。

3.病毒鉴定

3.1血清中和试验

采用固定病毒稀释血清法测定兔抗3型鸭甲肝病毒血清对病毒 分离株的中和效价，首先将发明人所在实验室前期制备的兔抗 DHAV-3标准血清(效价≥1:128)用灭菌生理盐水作倍比稀释从2^-1到2^-9这9个稀释度，同时将经毒价滴定的病毒稀释成每个单位剂量(0.2mL)含200ELD50，然后两者等量混合并加入5％的青、链霉素 双抗37℃水浴l小时，然后以每胚0.2mL的计量接种9日龄健康鸭 胚尿囊腔内，每个稀释度接种5枚鸭胚。另设病毒对照(3型鸭甲肝 病毒CH1株)、阳性血清对照(兔抗CH1株血清)、阴性血清对照(健 康兔血清)和空白对照组(灭菌生理盐水)，弃去24小时内死亡的鸭 胚，观察并记录7天内的鸭胚死亡和存活的情况，然后计算病毒的中 和效价。

结果病毒对照组和阴性血清对照组鸭胚全部死亡，阳性血清对照 组和生理盐水对照组鸭胚全部健活，当血清稀释度在2^-1～2^-6之间时， 鸭胚全部健活，当稀释度在2^-7时鸭胚开始失去保护，此时开始，随 稀释度越高，鸭胚保护率越低，直到稀释度为2^-9时鸭胚彻底失去保 护。

3.2RT-PCR鉴定

参照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒的使用说明 书操作，分别从鸭胚尿囊液、肌肉组织和肝脏组织中抽提总RNA，并 使用核酸蛋白检测仪(Bio Rad,Smartspec3000)测定其的核酸浓度和 纯度后，-70℃保存备用。然后使用专利《1型和3型鸭甲肝病毒一步 法双重RT-PCR检测试剂盒、引物对及方法》中的试剂盒以及特异性 引物(表1)对抽提的RNA样品进行一步法双重RT-PCR检测。反应 结束后取PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检查结果，电泳结 束后于凝胶成像系统中观察并记录结果，如图2所示，获得预期大小 的目的条带。

表1鉴定DHAV-1和DHAV-3的引物序列

3.3VP1基因测序与分析

扩增的目的片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用凝胶回收试 剂盒(Omega)切胶回收目的片段。然后将回收的DNA片段送至上 海生工生物工程有限公司进行DNA序列测序，结果显示扩增的目的 基因序列具体为SEQ ID NO：5所示的单链DNA，其与其他3型鸭甲肝病毒VP1基因序列相似性为92～100％。

3.4动物回归试验

将收获的鸭胚尿囊液通过腿部肌肉注射10只1日龄雏鸭，0.2mL/ 只，室内饲养，观察7天，剖解24～96小时内死亡雏鸭。然后取有 典型DVH病变的肝脏制成匀浆并加入双抗溶液(青霉素、链霉素终 浓度均为100IU/mL)，8000g离心10min，取上清液经腿部肌肉再次 注射10只1日龄雏鸭，0.2mL/只，室内饲养，观察7天。结果显示 雏鸭发病率为100％，死亡率为80％。

4.病毒纯化

将含3型鸭甲肝病毒分离株(CH-P5)的鸭胚尿囊液经鸭胚有限 稀释法纯化5次后，获得分离株CH-P10株，具体过程如下：

含有病毒的鸭胚尿囊液做10^-4～10^-9倍的10倍倍比稀释，取各稀 释度的鸭胚尿囊液经尿囊腔途径分别接种5枚9日龄鸭胚，每胚接种 0.2mL，接种后的鸭胚置于37℃恒温培养箱内孵育，每8小时照胚1 次，弃去24小时之内的死亡鸭胚，分别收集其余鸭胚尿囊液，收获 的病毒通过RT-PCR方法检测是否含有DHAV-3病毒。然后取稀释倍数 最低的含毒尿囊液用相同方法连续传代5次进行纯化，最终收获的含 毒尿囊液再次通过病毒含量测定、血清中和试验和动物回归试验，鉴 定纯化效果，结果表明获得纯化的3型鸭甲肝病毒分离株(CH-P10)。

实施例2 3型鸭甲肝病毒弱毒株(CH-P60)的培育

1.毒株连续传代致弱

使用9日龄鸭胚对3型鸭甲肝病毒分离株(CH-P10)进行连续传 代致弱，每代次通过尿囊腔接种5枚鸭胚，0.2mL/枚，接种后置于 37℃恒温培养箱内继续孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，收获24～48 小时内死亡的鸭胚的鸭胚尿囊液混匀，然后使用灭菌生理盐水将胚液 进行100倍稀释后进行下一次传代，如此连续传代50代获得CH-P60， 最后进行病毒含量、无菌和支原体检测、外源病毒检测和对易感雏鸭 的安全性试验以确定毒力是否致弱。

2.病毒含量测定

用无菌生理盐水溶液倍比稀释CH-P60，选择10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、 10^-7和10^-8这6个稀释度，分别以每胚0.2mL的量接种于9日龄的鸭 胚，每个稀释度接种5枚鸭胚，另设灭菌生理盐水对照5个，接种后 置于37℃恒温培养箱内孵育，24小时内死亡鸭胚不计，观察并记录7天内接种鸭胚的死亡和存活情况，按Reed-Muech法计算ELD50， 每0.2mL病毒含量为10^{- 8.37}ELD50，表明CH-P60毒株对鸭胚适应性增 强。

3.无菌和支原体检测

将CH-P60按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌和 支原体检验，检测结果均为阴性。

4.外源病毒检测

将CH-P60按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行外源病 毒检测，检测结果均为阴性。

5.对易感雏鸭的安全性试验

使用亲本毒(CH-P10)和CH-P60进行安全性试验，1日龄健康 雏鸭30只随机分为3组，试验组经肌肉注射途径接种亲本毒(CH-P10) 和CH-P60，每只接种10^5.0ELD50/0.2mL，另一组作为对照接种0.2mL 灭菌生理盐水，在不同动物房内隔离饲养，自由饮水采食，接种后每 日观察，记录雏鸭的发病、死亡情况，及时剖检死亡雏鸭，观察7天 后剖检存活雏鸭，记录雏鸭肝脏、肾脏等器官的病变情况。

亲本毒(CH-P10)接种后雏鸭发病率100％，死亡率为80％，而 CH-P60致病力已明显下降，雏鸭在接种后同注射灭菌生理盐水的对 照组雏鸭一样，精神采食完全正常，无神经症状，无死亡，剖检肝脏 和肾脏无病变，结果表明表明该减毒毒株毒力已明显下降。

6.VP1基因遗传进化分析

参照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒的使用说明 书操作，分别从亲本毒(CH-P10)和CH-P60的尿囊液中抽提总RNA， 并使用核酸蛋白检测仪(BioRad,Smartspec3000)测定其的核酸浓度 和纯度后，使用专利《1型和3型鸭甲肝病毒一步法双重RT-PCR检 测试剂盒、引物对及方法》中的试剂盒以及特异性引物(表1)对抽 提的RNA样品进行一步法双重RT-PCR检测。反应结束后取PCR扩增 产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用凝胶回收试剂盒(Omega) 切胶回收目的片段。然后将回收的DNA片段送至上海生工生物工程 有限公司进行DNA序列测序，结果显示扩增的目的基因序列具体为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的单链DNA，它们与分离株(CH-P5) 的VP1基因序列相似性为100％，显示病毒在传代过程中其主要结构 蛋白VP1未发生突变。

另外，从GenBank上搜索下载已公布的37株具有代表意义的 DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3毒株VP1基因序列，并应用MEGA 7.0软 件按Clustal W法对序列进行比对，然后并按Neighbor-Joining法，选 bootstrap method 1000参数，构建系统进化树进行病毒遗传进化分析， 结果如图3所示，本发明中的3型鸭甲肝病毒强毒株(CH-P5和CH-P10) 和弱毒株(CH-P60)在遗传进化树中与流行于中国地区3型鸭甲肝病 毒属于同一分支，与流行于韩国地区的3型鸭甲肝病毒属于不同分支。

实施例3 3型鸭甲肝病毒弱毒株(CH-P60)的应用

1.病毒液的制备

将实施例二获得的3型鸭甲肝病毒弱毒株(CH-P60)作为种毒用 灭菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔接种20枚9日龄鸭胚，每胚0.2mL， 置37℃恒温培养箱内继续孵育，接种后24小时后照蛋1次，弃去死 胚，以后每隔8小时照蛋1次，将死亡的鸭胚随时取出，至48小时，鸭胚全部死亡，将收集的鸭胚气室向上直立，置于4℃冷却8小时， 将冷却后的无菌收集鸭胚尿囊液，置于-20℃保存备用。

2.毒液的检验

收获的病毒液按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌 和支原体检验，并抽样一份测定病毒含量(ELD50)，结果收获的病毒液 无菌生长，每0.2mL病毒含量为10^7.91ELD50。

3.疫苗的制备方法

将上述经无菌和支原体检验合格的鸭胚尿囊液病毒用无菌PBS 或生理盐水稀释为所需的ELD50，直接作为3型鸭甲肝病毒弱毒 (CH-P60)疫苗；同时采用终浓度为0.1％的甲醛溶液处理检验合格 的病毒液，37℃灭活24小时，然后使用灭菌磷酸盐缓冲溶液将病毒含量稀释至10⁶ELD50/0.1mL后与弗氏不完全佐剂等体积乳化混匀， 即制成3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60灭活疫苗。

4.疫苗的安全性试验

以10倍免疫剂量免疫1日龄雏鸭，检验疫苗的安全性，疫苗免 疫1日龄雏鸭10只，每只经腿部肌肉接种途径接种3型鸭甲肝病毒 弱毒(CH-P60)活疫苗0.2mL(10⁶ELD50)或10羽份灭活疫苗，同 时取10只雏鸭注射灭菌生理盐水作为对照组，隔离饲养，自由饮水 采食，每日观察记录雏鸭的健康情况，观察7天后剖解雏鸭，结果3 型鸭甲肝病毒弱毒(CH-P60)活疫苗和灭活疫苗免疫组与对照组雏鸭 在接种7天内均无发病，且肝脏、肾脏等器官无病变，表明疫苗对1 日龄雏鸭没有致病性。

5.疫苗的效力试验

1日龄雏鸭30只随机分为3组，第一组10只免疫一羽份上述制 备得到的3型鸭甲肝病毒弱毒(CH-P60)活疫苗，腿部肌肉注射途径 每只10⁵ELD50/0.2mL；第二组10只免疫一羽份上述制备得到的3型 鸭甲肝病毒弱毒(CH-P60)灭活疫苗；第三组注射等量灭菌生理盐水作为对照，隔离饲养，自由饮水采食，接种后每日观察记录雏鸭的情 况，5天后用10倍LD50剂量亲本毒(CH-P10株)进行攻毒，攻毒后 每日观察记录雏鸭的发病、死亡情况，及时剖检死亡雏鸭，持续观察 1周，剖检存活雏鸭，记录肝脏、肾脏等器官的病变情况。

免疫后5天内实验组和对照组雏鸭均正常，攻毒后对照组第2天 有雏鸭精神不振，出现神经症状，至第7天，共5只死亡，存活雏鸭 有不同程度的肝脏出血等病变，发病率80％(8/10)，死亡率60％ (6/10)，而免疫组雏鸭无发病死亡，雏鸭健康无异常，表明用致弱 的CH-P60病毒制备的疫苗安全有效，可以保护同源强毒的攻毒。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明 加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要 求的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctgccattt acatcaacca c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctatataac ctggcatgtt gt 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctctccatt gagtgcaga 19

<210> 5

<211> 720

<212> DNA

<213> 病毒(CH-P5)

<400> 5

ggtgattcca atcagcttgg cgatgatgaa ccagtgtgtt ttctcaattt tgagactgca 60

aatgtgccaa tacaagggga gtcacacact ttggtgaaac atctttttgg tcgtcaatgg 120

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<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> 病毒(CH-P10)

<400> 6

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<213> 病毒(CH-P60)

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Claims (3)

1.一种3型鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus）弱毒株CH-P60，其特征在于，所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60于2018年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201861；

所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60的VP1核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

2.权利要求1所述的3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60在制备预防3型鸭甲肝病毒疫苗中的应用。

3.一种预防3型鸭甲肝病毒疫苗，其特征在于，该疫苗有效成分为3型鸭甲肝病毒弱毒株CH-P60。

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