CN111172122B

CN111172122B - 鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用

Info

Publication number: CN111172122B
Application number: CN202010013179.XA
Authority: CN
Inventors: 张青婵; 郭大伟; 孟照洁; 彭建云; 陈俊霞; 贾爱琴; 赵妮; 徐龙涛; 王蕾; 张连秀
Original assignee: Qilu Animal Health Products Co ltd
Current assignee: Qilu Animal Health Products Co ltd
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN111172122A

Abstract

本发明涉及一株鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用。该鸭呼肠孤病毒弱毒Q株是由鸭呼肠孤病毒强毒17117株经Vero细胞连续传代致弱获得，在Vero细胞上增殖水平高，接种1日龄雏鸭无明显临床症状和病理变化，安全性好。用该弱毒Q株制备的活疫苗接种1日龄雏鸭可产生有效免疫保护。

Description

鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用

技术领域

本发明涉及一株鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)是呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属中的一员，基因组为分节段双链RNA，有10个节段，常见于鸡、火鸡、鸭、鹅及一些鸟类等宿主体内，以病毒性关节炎、肠道病、腱鞘炎、矮小综合征、免疫抑制性疾病及吸收不良综合征等为临床特征。2005年上半年，我国山东、福建、江苏、河北、河南等地饲养的樱桃谷肉鸭，相继发生了一种以脾脏坏死为主要病变的疾病，俗称“脾坏死病”。2011年下半年，在山东、河北、江苏等地樱桃谷肉鸭也发生一种以肝脏不规则坏死或混杂出血斑为特征剖检病变的疾病。2015年以来，山东、江苏、河北等樱桃谷鸭饲养密集区的许多鸭群又发生了以脾脏出血、白色坏死灶或大理石样硬化病变的疾病，病鸭可见肺、心肌、肾、腺胃和肠粘膜等组织出血等病变。种鸭可见跗关节肿大，内有黄色或血样渗出物，严重者关节腔内有干酪样渗出物，患鸭出现不同程度跛行，给养鸭业造成严重经济损失。病原分离鉴定为鸭呼肠孤病毒。该病毒与现已报道流行的鸡源呼肠孤病毒、番鸭源呼肠孤病毒进行遗传进化分析，属于不同分支，为一种新型鸭呼肠孤病毒。

免疫接种是防治该病的最有效手段。

发明内容

本发明的目的在于利用本发明人自行分离、保存的一株鸭呼肠孤病毒强毒株，在Vero细胞上连续传代致弱而筛选出增殖水平高、高度适应Vero细胞、具有良好免疫保护效果的弱毒株，该弱毒株安全性好，可用于作为生产毒株制备鸭呼肠孤病毒病疫苗，有效预防新流行鸭呼肠孤病毒的攻击。经过试验研究发现，该毒株Sigma B蛋白和Sigma C蛋白氨基酸序列与已公开的新型鸭呼肠孤病毒相比有特殊的氨基酸位点差异。

本发明的技术方案

1.一种鸭呼肠孤病毒弱毒株，其特征在于该毒株是由鸭呼肠孤病毒强毒17117株经Vero细胞传代获得，该毒株传代后的Sigma B、Sigma C蛋白氨基酸序列为序列6和序列12，该毒株被命名为鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)Q株(简称DRV Q株)，该两毒株已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为：CGMCC No.18889和CGMCCNo.18890。

2.本发明所述的鸭呼肠孤病毒弱毒株的应用，其特征在于该毒株可用于鸭呼肠孤病毒病活疫苗的制备。

3.本发明所述的鸭呼肠孤病毒弱毒株的应用，其特征在于所述鸭呼肠孤病毒病活疫苗的制备过程包括使用Vero细胞或BHK细胞或CEF细胞或LMH细胞或DF-1细胞作为疫苗抗原制备用细胞。

本发明的技术效果

本发明涉及一株鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用。该毒株是由鸭呼肠孤病毒强毒株经Vero细胞连续传代致弱获得，在Vero细胞上增殖水平高，接种1日龄雏鸭无明显临床症状和病理变化，安全性好。用该弱毒株制备的活疫苗接种1日龄雏鸭可产生有效免疫保护。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明人2017年由发病樱桃谷种鸭自行分离到并保存的一株鸭呼肠孤病毒强毒株17117株通过在Vero细胞上连续传代致弱而筛选出增殖水平高、高度适应Vero细胞、具有良好免疫保护效果的弱毒株，该株病毒被命名为鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)Q株(简称DRV Q株)，该两株毒株(鸭呼肠孤病毒强毒17117株和弱毒Q株)已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为为：CGMCC No.18889和CGMCC No.18890。

具体实施方式

1.鸭呼肠孤病毒弱毒株的培育

取培养24小时、长成良好单层的Vero细胞，用鸭呼肠孤病毒强毒17117株按照0.5％～1％接种量接种细胞，传代以进行适应性增殖。待细胞病变稳定后，对传代毒进行纯化，纯化毒继续传代至100代、120代，进行安全性评价，试验如下：

将100代、120代毒大剂量接种1～3日龄易感鸭，每只肌肉注射0.5ml，并设置生理盐水对照组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸭的精神状态、饮食和粪便情况，至第7日，剖检脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等病理变化。

结果显示，100代、120代毒接种1～3日龄易感鸭后，精神状态、饮食和粪便均正常。剖检脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等脏器发育正常，无肉眼可见病变。说明100代毒已经致弱，对雏鸭没有致病性，该株120代毒被命名为鸭呼肠孤病毒弱毒Q株。

该两株毒株(鸭呼肠孤病毒强毒17117株和弱毒Q株)已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为为：CGMCC No.18889和CGMCC No.18890。

2.鸭呼肠孤病毒病活疫苗的制备方法

使用鸭呼肠孤病毒弱毒Q株作为疫苗生产用毒种，使用微载体悬浮培养Vero细胞、悬浮培养BHK细胞和转瓶培养的CEF细胞、LMH细胞、DF-1细胞作为抗原制备用材料及方法，将鸭呼肠孤病毒弱毒株接种生长良好的细胞，连续培养观察36～60小时，当细胞病变达80％左右时，收获感染的病毒悬液，加入耐热冻干保护剂，经真空冷冻干燥，制成鸭呼肠孤病毒病活疫苗。

3.病毒株特性研究

(1)鸭呼肠孤病毒弱毒株的增殖

将鸭呼肠孤病毒弱毒株按0.5％～1％接种量接种长成良好单层的Vero细胞或BHK细胞，置37℃、5％CO₂培养箱中静置培养，每天观察CPE，36～60小时后，当细胞病变达80％左右时收获，置低温保存。病毒含量≥10^8.5TCID₅₀/ml。

(2)免疫原性

取30只1日龄易感雏鸭，随机分为3组，10只/组，第1组肌肉注射鸭呼肠孤病毒弱毒株病毒液，0.2ml/只(含10^3.0TCID₅₀)，第2、3组不接种作为攻毒对照和空白对照。免疫后7日，第1组和第2组用鸭呼肠孤病毒强毒攻击，肌肉注射，0.5ml/只。攻毒后观察7日，剖检，免疫鸭和空白对照鸭脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等脏器发育正常，无肉眼可见病理变化，攻毒对照鸭10/10脾脏病变，表现为肿大、出血、有白色坏死灶或大理石样硬化病变等，部分鸭肝脏和肾脏出血。

(3)纯净性

按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011)附录进行，鸭呼肠孤病毒弱毒株毒种无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

(4)特异性

将鸭呼肠孤病毒弱毒株毒种用MEM液稀释至100TCID₅₀/0.1ml，与等量抗鸭呼肠孤病毒特异性血清混合后，37℃中和90min，接种已长成单层的Vero细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。另设病毒对照和正常细胞对照，各接种6孔，每孔0.5ml。将细胞培养板置37℃、5％CO₂培养箱中培养，连续观察96小时。中和组和正常细胞对照组未出现细胞病变效应(CPE)，病毒对照孔全部出现CPE。

4.鸭呼肠孤病毒弱毒株的基因特征序列

(1)DRV强毒株17117株SigmaB基因和弱毒株Q株SigmaB基因

设计一对引物(序列1和序列2)，用于扩增DRV强毒株17117株SigmaB基因(序列3和序列4)和弱毒株Q株SigmaB基因(序列5和序列6)。引物的核苷酸序列如下：

上游引物DRV-F(B):5’-atggaggtgc gtgtgccaaa ct-3’22(序列1)

下游引物DRV-R(B):5’-taccacctac actccaggaa ggac-3’24(序列2)

DRV 17117株Sigma B基因的测序结果为(序列3)：

DRV 17117株SigmaB基因的氨基酸序列为(序列4)：

DRV Q株Sigma B基因的测序结果为(序列5)：

DRV Q株SigmaB基因的氨基酸序列为(序列6)：

DRV Q株SigmaB基因序列的特征

弱毒株Q株的SigmaB基因与强毒株17117株、来源于GeneBank的鸭呼肠孤病毒参考株比较，氨基酸序列存在多个位点的差异，具体结果见表1。

表1弱毒株Q株与强毒株及不同DRV参考株的Sigma B蛋白氨基酸位点差异

以上比较结果显示：

DRV Q株Sigma B基因的测序结果显示，Sigma B基因序列总长度为1104bp，编码氨基酸序列大小为367aa。

将DRV Q株Sigma B基因序列与17117株及参考株比较，核苷酸序列同源性为，所推导氨基酸序列同源性为94.6％-98.4％。

(2)DRV强毒株17117株Sigma C基因和弱毒株Q株SigmaC基因

设计一对引物(序列7和序列8)，用于扩增DRV强毒株17117株Sigma C基因(序列9和序列10)和弱毒株Q株Sigma B基因(序列11和序列12)。引物的核苷酸序列如下：

上游引物DRV-F(C):5’-tcttattgtt cttctcgtgc t-3’21(序列7)：

下游引物DRV-R(C):5’-aatagctctt ctcatcgtgc g-3’21(序列8)：

DRV 17117株SigmaC基因的测序结果为(序列9)：

DRV 17117株Sigma C基因的氨基酸序列为(序列10)：

DRV Q株Sigma C基因的测序结果为(序列11)：

DRV Q株SigmaC基因的氨基酸序列为(序列12)：

DRV Q株Sigma C基因序列的特征

弱毒株Q株的Sigma C基因与强毒株17117株、来源于GeneBank的鸭呼肠孤病毒参考株比较，氨基酸序列存在多个位点的差异，具体结果见表2。

表2弱毒株Q株与强毒株及不同DRV参考株的SigmaC蛋白氨基酸位点差异。

以上比较结果显示：

DRV Q株SigmaC基因的测序结果显示，SigmaC基因序列总长度为966bp，编码氨基酸序列大小为321aa。

将DRV Q株SigmaC基因序列与17117株及参考株比较，核苷酸序列同源性为，所推导氨基酸序列同源性为95％～96.9％。

5.鸭呼肠孤病毒病活疫苗的制备

将鸭呼肠孤病毒弱毒株接种良好细胞单层，连续观察36～60小时，当细胞病变达80％左右时，收获感染的细胞病毒液，加入耐热保护剂，用最适合此毒株的冻干曲线进行冻干，制备鸭呼肠孤病毒病活疫苗。

具体有以下制备步骤：

(1)抗原制备，可通过以下3种途径

1)选择微载体培养Vero细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料

将微载体和生物反应器灭菌后，加入细胞生长液，其中，微载体使用密度为2～25g/L，接种制苗用细胞进行悬浮培养，待微载体上的细胞形成致密单层后，接种鸭呼肠孤病毒生产毒种，病毒接种量为0.05～1.0MOI，继续培养，每天观察细胞病变情况，待细胞病变达到80％以上时，收获病毒液，低温冷冻保存。

2)选择纯悬浮培养BHK细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料

在灭菌的生物反应器内加入细胞生长液，接入制苗用细胞进行悬浮培养，待细胞密度达到3×10⁶/ml，细胞活力在90％以上时，接种鸭呼肠孤病毒生产毒种，病毒接种量为0.05～1.0MOI，继续培养，每天观察细胞活力变化情况，待细胞活力下降到50％以下时，收获全悬浮病毒液，低温冷冻保存。

制苗用细胞采用逐级放大的培养模式，生物反应器培养鸭呼肠孤病毒的设定参数为：pH7.0～7.4、温度36.5～37℃、溶氧30％～60％、搅拌速度30～90r/min。

3)选择CEF细胞、LMH细胞、DF-1细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料

将鸭呼肠孤病毒弱毒株生产用毒种用MEM稀释后，按0.5％～1％接种长成良好单层的CEF细胞(或LMH细胞，或DF-1细胞)，放置于转瓶机上培养。接毒后每12小时观察一次，当细胞典型病变时，继续培养36～60小时，至细胞病变达到80％左右，收获毒液，低温冷冻保存。

(2)制备的抗原，应按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011，本发明简称《中国兽药典》)附录逐瓶作无菌检验，并抽样1份测定病毒含量，应无菌生长，每毫升病毒含量应≥10^8.5TCID₅₀。

(3)疫苗的制备

经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒液与耐热冻干保护剂按一定比例配苗。配苗过程中应使耐热冻干保护剂和病毒液充分混匀，无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。

6.鸭呼肠孤病毒病活疫苗的检验

(1)性状检验：疫苗呈海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(3)支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。

(4)鉴别检验：将疫苗用含1％新生牛血清的维持液稀释，与等量抗鸭呼肠孤病毒特异性血清混合后，37℃中和90min，接种已长成单层的Vero细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。同时设不中和病毒对照和正常细胞对照，各接种6孔，每孔0.5ml。将细胞培养板置37℃、5％CO₂培养箱中培养，连续观察96小时。中和组和正常细胞对照组应不出现细胞病变效应(CPE)，不中和病毒对照组应全部出现CPE。

(5)外源病毒检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。

(6)安全检验：取1～3日龄易感鸭或SPF鸭10只，分别肌肉注射疫苗0.2ml(含10羽份)，观察14天，雏鸭应全部健活。

(7)效力检验：将疫苗用灭菌生理盐水稀释至每0.2ml含1羽份，肌肉注射接种1～3日龄易感鸭10只，每只0.2ml，同时设对照鸭10只。免疫后7日每只鸭肌肉注射0.5ml鸭呼肠孤病毒强毒。攻毒观察7日后剖检，免疫组应至少8只保护，对照组应至少8只发病。

实施例

以下实施例是为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。

实施例1——鸭呼肠孤病毒弱毒株的培育

培育鸭呼肠孤病毒弱毒株的强毒株来自本发明人2017年由发病樱桃谷鸭自行分离到并保存的一株鸭呼肠孤病毒强毒株为致弱的出发毒株。

取培养24小时、长成良好单层的Vero细胞，用鸭呼肠孤病毒强毒株按照0.5％～1％接种量接种细胞，传代以进行适应性增殖。待细胞病变稳定后，对传代毒进行纯化，纯化毒继续传代至100代、120代，进行安全性评价，试验如下：

结果显示，100代、120代毒接种1～3日龄易感鸭后，精神状态、饮食和粪便均正常。剖检脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等脏器发育正常，无肉眼可见病变。说明100代毒已经致弱，对雏鸭没有致病性。为保证疫苗安全性，取120代毒作为制苗用毒种。

实施例2——病毒株特性的鉴定

(1)增殖特性

将鸭呼肠孤病毒弱毒株按0.5％～1％接种量接种长成良好单层的Vero细胞，置37℃、5％CO₂培养箱中静置培养，每天观察CPE，36～60小时，细胞病变可达80％左右，冻融后收获病毒悬液，置低温保存。按此方法制备3批病毒液，测定病毒含量，均≥10^8.5TCID₅₀/ml。

(2)安全性

取1日龄易感鸭20只，随机分为2组，每组10只，第1组接种鸭呼肠孤病毒弱毒株，腿部肌肉注射，每只0.2ml(含10^6.0TCID₅₀)，第2组不接种作为对照。接种后观察7天，试验鸭精神、饮食、粪便均正常。接种后7日剖检，各组试验鸭脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等组织发育正常，无肉眼可见病变。接种组与对照组临床表现无差异。

(3)免疫原性

取1日龄易感鸭20只，随机分为2组，每组10只，第1组接种鸭呼肠孤病毒弱毒株，腿部肌肉注射，每只0.2ml(含10^3.0TCID₅₀)，第2组不接种作为攻毒对照。接种后第7日，所有鸭肌肉注射攻击鸭呼肠孤病毒强毒。攻毒后7日剖检，免疫鸭脾脏、肝脏、肾脏、胸腺、法氏囊等组织发育正常，无肉眼可见病变，10/10保护；攻毒对照鸭脾脏不同程度肿大、出血、坏死，部分鸭伴有肝脏、肾脏出血，10/10发病。

(4)纯净性

取鸭呼肠孤病毒弱毒株，按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

实施例3——弱毒疫苗的制备

(1)细胞培养罐灭菌及微载体平衡将清洗干净的细胞培养罐于121℃灭菌30分钟，将灭菌完全的微载体打入细胞培养罐中，加入MEM培养液至最小提交进行平衡。

(2)细胞培养和接种选择生产良好的Vero细胞单层，用胰酶消化后，接种细胞培养罐，接种密度不低于3×10⁵个细胞/ml，连续培养2～3日，待微载体上的细胞形成致密单层后，换以维持液，按0.05～1.0MOI接种鸭呼肠孤病毒弱毒株生产用毒种，继续培养。

(3)观察与收获细胞接毒后每8小时取样观察细胞病变情况，当细胞出现典型病变时，继续培养至60小时左右，即细胞病变达到80％以上时，收获病毒液，低温冷冻保存。按现行《中国兽药典》附录逐瓶进行无菌检验检验，并抽样1份测定病毒含量。经测定，均无菌生长，

(4)病毒含量测定病毒液用含1％新生牛血清的维持液作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度，分别接种长成良好单层的Vero细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种4孔，每孔100μl，同时设不接毒对照孔。置37℃、5％CO₂培养箱中培养，观察96小时，记录细胞病变(CPE)孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀，每毫升病毒含量不低于10^8.5TCID₅₀。

(5)冻干取耐热冻干保护剂，与检验合格的病毒液按体积比1:1充分混匀，无菌定量分装，按照预先设计的冻干曲线迅速冷冻真空干燥，加盖密封。

(6)疫苗批次，按上述方法连续制备3批疫苗，批号分别为1901001、1901002、1901003。

实施例4——疫苗检验

(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

(3)支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。

(4)鉴别检验：将疫苗用含1％新生牛血清的维持液稀释，与等量抗鸭呼肠孤病毒特异性血清混合后，37℃中和90min，接种已长成单层的Vero细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。同时设不中和病毒对照和正常细胞对照，各接种6孔，每孔0.5ml。将细胞培养板置37℃、5％CO₂培养箱中培养，连续观察96小时。中和组和正常细胞对照组均未出现细胞病变效应(CPE)，不中和病毒对照组均全部出现CPE。

(5)外源病毒检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无外源病毒污染。

(6)安全检验：取1～3日龄易感鸭10只，分别肌肉注射疫苗0.2ml(含10羽份)，观察14天，三批疫苗接种雏鸭全部健活，剖检结果均正常。

(7)效力检验：将疫苗用灭菌生理盐水稀释至每0.2ml含1羽份，肌肉注射接种1～3日龄易感鸭10只，每只0.2ml，同时设对照鸭10只。免疫后7日每只鸭肌肉注射0.5ml鸭呼肠孤病毒强毒。攻毒观察7日后剖检，三批疫苗免疫组均10/10只保护，对照组10/10只发病。

序列表

<110> 齐鲁动物保健品有限公司

<120> 鸭呼肠孤病毒弱毒株及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(上游引物DRV-FB)

<400> 1

atggaggtgc gtgtgccaaa ct 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成(下游引物DRV-RB)

<400> 2

taccacctac actccaggaa ggac 24

<210> 3

<211> 1104

<212> DNA

<213> DRV 17117株(Sigma B基因)

<400> 3

atggaggtgc gtgtgccaaa ctttcactcc tttatcgagg gtattactac tagttacttg 60

tgttctcctg cttgctggaa ttcgaagacg ttatgggata ttgaagaatt tcacacacct 120

gacgtcatca gggtcggcaa cgcttattgt tgcactcagt gctgtggtgt tctgtactat 180

ggtgcccctc cctctgatgg aaactgtttt ccacatcaca agtgtcatca acagcaatat 240

cgtactgaga ctccgctcat gagatatatt aaggtgggtc gcactacaga gcaactgctt 300

gatcaatatg ccattgctct gcatgtcatt gcagattact atgatgaggc gagtaagcaa 360

cctcatgata ttgctgaaac tgagtcaatc gcaccatttg atatcgtaac caggactgaa 420

tctattcgca gtgaccgtgc cgttgacccg gaattctgga cttatccgtt agagagacga 480

ggatacgatg cgcgacatga gattgctaga gcgggttgga agatgatcga tgcttcatcg 540

cgaagtcaca ctcttcctga atgtctggtg tcaaatatgc tacatactag gcatgtcttc 600

agccaaatgt tgaccacgac aaccatctat gatgtcgctg tcacgggtaa agccgttaaa 660

ttcagcccga tggtagcaac catgccaact cgaggagatg gtgctgtggc tctgtcaaga 720

ggtaacttgg atcatgatgt tgaggactgt tggatggatg gttttgcatt ctcccccctc 780

atcggcggtg ttggcatcac tggtcaattt gaacgtggtt cctgccataa ttttggacac 840

cccatgattg ggagcggtaa gaaagcttct cactaccgca atttgttcat ggaatcctgg 900

cgtggatggt caaagtcgtg ctttacatgt gctgcaggaa tggagcccgc ggagtgcgaa 960

tctaggctgc gaggccacgc cagaactatg ttcggacgtt ctcttccgga tatctgtgac 1020

ttcgaggaga ctacccacgt gtgccagtcg tccgcgccat taaagaaggc aacgaaattg 1080

tccttcctgg agtgtaggtg gtaa 1104

<210> 4

<211> 367

<212> PRT

<213> DRV 17117株(Sigma B基因)

<400> 4

Met Glu Val Arg Val Pro Asn Phe His Ser Phe Ile Glu Gly Ile Thr

1 5 10 15

Thr Ser Tyr Leu Cys Ser Pro Ala Cys Trp Asn Ser Lys Thr Leu Trp

20 25 30

Asp Ile Glu Glu Phe His Thr Pro Asp Val Ile Arg Val Gly Asn Ala

35 40 45

Tyr Cys Cys Thr Gln Cys Cys Gly Val Leu Tyr Tyr Gly Ala Pro Pro

50 55 60

Ser Asp Gly Asn Cys Phe Pro His His Lys Cys His Gln Gln Gln Tyr

65 70 75 80

Arg Thr Glu Thr Pro Leu Met Arg Tyr Ile Lys Val Gly Arg Thr Thr

85 90 95

Glu Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Ala Ile Ala Leu His Val Ile Ala Asp

100 105 110

Tyr Tyr Asp Glu Ala Ser Lys Gln Pro His Asp Ile Ala Glu Thr Glu

115 120 125

Ser Ile Ala Pro Phe Asp Ile Val Thr Arg Thr Glu Ser Ile Arg Ser

130 135 140

Asp Arg Ala Val Asp Pro Glu Phe Trp Thr Tyr Pro Leu Glu Arg Arg

145 150 155 160

Gly Tyr Asp Ala Arg His Glu Ile Ala Arg Ala Gly Trp Lys Met Ile

165 170 175

Asp Ala Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Pro Glu Cys Leu Val Ser Asn

180 185 190

Met Leu His Thr Arg His Val Phe Ser Gln Met Leu Thr Thr Thr Thr

195 200 205

Ile Tyr Asp Val Ala Val Thr Gly Lys Ala Val Lys Phe Ser Pro Met

210 215 220

Val Ala Thr Met Pro Thr Arg Gly Asp Gly Ala Val Ala Leu Ser Arg

225 230 235 240

Gly Asn Leu Asp His Asp Val Glu Asp Cys Trp Met Asp Gly Phe Ala

245 250 255

Phe Ser Pro Leu Ile Gly Gly Val Gly Ile Thr Gly Gln Phe Glu Arg

260 265 270

Gly Ser Cys His Asn Phe Gly His Pro Met Ile Gly Ser Gly Lys Lys

275 280 285

Ala Ser His Tyr Arg Asn Leu Phe Met Glu Ser Trp Arg Gly Trp Ser

290 295 300

Lys Ser Cys Phe Thr Cys Ala Ala Gly Met Glu Pro Ala Glu Cys Glu

305 310 315 320

Ser Arg Leu Arg Gly His Ala Arg Thr Met Phe Gly Arg Ser Leu Pro

325 330 335

Asp Ile Cys Asp Phe Glu Glu Thr Thr His Val Cys Gln Ser Ser Ala

340 345 350

Pro Leu Lys Lys Ala Thr Lys Leu Ser Phe Leu Glu Cys Arg Trp

355 360 365

<210> 5

<211> 1104

<212> DNA

<213> DRV Q株(Sigma B基因)

<400> 5

atggaggtgc gtgtgccaaa ctttcactcc tttatcgagg gtattactac tagttacttg 60

tgttctcctg cttgctggaa ttcgaagacg ttatgggata ttgaagagtt tcacacacct 120

gacgttatca gggtcggcaa cgcttattgt tgcactcagt gctgtggtgt tctgtactat 180

ggtgcccctc cctctgatgg aaactgtttt ccacatcaca agtgtcatca acagcaatat 240

cgtactgaga ctccgctcat gagatatatt aaggtgggtc gcactacaga gcaactgctt 300

gatcaatatg ccattgctct gcatgtcatt gcagattact acgatgaggt gagtatgcca 360

cctcatgata tcgctgaacc tgagtcaatc gcaccatttg atatcgtaac caggactgaa 420

tctattcgct gtgaccgtcc cgttgacccg gaattctgga cttatccgtt agagagacga 480

ggatacgacg cgcgacatga gattgctaga gcgggttgga agatgatcga tgcttcatcg 540

cgaagtcgca ctcttcctga atgtctggtg tcaaatatgc tacatactag gcatgtcttc 600

agccaaatgt tgaccacgac aactatctat gatgtcgctg tcacgggtaa agctgttaaa 660

ttcagcccga tggtagcaac catgccaact cgaggagatg gtgctgtggc tctgtcaaga 720

ggtaacttgg atcatgatgt cgaggactgt tggatggatg gttttgcatt ctcccccctc 780

atcggcggtg ttggcatcac tggtcaattt gagcgtggtt cctgccataa ttttggacac 840

cccatggttg ggagcggtaa gaaagcttct cactaccgca atttgttcat ggaatcctgg 900

cgtggatggt cgaagtcgtg ctttacatgt gctgcaggga tggagcccgc ggagtgcgaa 960

tctaggctgc gaggtcatgc cagaactatg ttcggacgtt ctcttccgga tatctgtgac 1020

ttcgaggaga ctacccacgt tggccagtcg tccacgccat taaagaaggc aacgaaattg 1080

tccttcctgg agtgtaggtg gtaa 1104

<210> 6

<211> 367

<212> PRT

<213> DRV Q株(Sigma B基因)

<400> 6

Met Glu Val Arg Val Pro Asn Phe His Ser Phe Ile Glu Gly Ile Thr

1 5 10 15

Thr Ser Tyr Leu Cys Ser Pro Ala Cys Trp Asn Ser Lys Thr Leu Trp

20 25 30

Asp Ile Glu Glu Phe His Thr Pro Asp Val Ile Arg Val Gly Asn Ala

35 40 45

Tyr Cys Cys Thr Gln Cys Cys Gly Val Leu Tyr Tyr Gly Ala Pro Pro

50 55 60

Ser Asp Gly Asn Cys Phe Pro His His Lys Cys His Gln Gln Gln Tyr

65 70 75 80

Arg Thr Glu Thr Pro Leu Met Arg Tyr Ile Lys Val Gly Arg Thr Thr

85 90 95

Glu Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Ala Ile Ala Leu His Val Ile Ala Asp

100 105 110

Tyr Tyr Asp Glu Val Ser Met Pro Pro His Asp Ile Ala Glu Pro Glu

115 120 125

Ser Ile Ala Pro Phe Asp Ile Val Thr Arg Thr Glu Ser Ile Arg Cys

130 135 140

Asp Arg Pro Val Asp Pro Glu Phe Trp Thr Tyr Pro Leu Glu Arg Arg

145 150 155 160

Gly Tyr Asp Ala Arg His Glu Ile Ala Arg Ala Gly Trp Lys Met Ile

165 170 175

Asp Ala Ser Ser Arg Ser Arg Thr Leu Pro Glu Cys Leu Val Ser Asn

180 185 190

Met Leu His Thr Arg His Val Phe Ser Gln Met Leu Thr Thr Thr Thr

195 200 205

Ile Tyr Asp Val Ala Val Thr Gly Lys Ala Val Lys Phe Ser Pro Met

210 215 220

Val Ala Thr Met Pro Thr Arg Gly Asp Gly Ala Val Ala Leu Ser Arg

225 230 235 240

Gly Asn Leu Asp His Asp Val Glu Asp Cys Trp Met Asp Gly Phe Ala

245 250 255

Phe Ser Pro Leu Ile Gly Gly Val Gly Ile Thr Gly Gln Phe Glu Arg

260 265 270

Gly Ser Cys His Asn Phe Gly His Pro Met Val Gly Ser Gly Lys Lys

275 280 285

Ala Ser His Tyr Arg Asn Leu Phe Met Glu Ser Trp Arg Gly Trp Ser

290 295 300

Lys Ser Cys Phe Thr Cys Ala Ala Gly Met Glu Pro Ala Glu Cys Glu

305 310 315 320

Ser Arg Leu Arg Gly His Ala Arg Thr Met Phe Gly Arg Ser Leu Pro

325 330 335

Asp Ile Cys Asp Phe Glu Glu Thr Thr His Val Gly Gln Ser Ser Thr

340 345 350

Pro Leu Lys Lys Ala Thr Lys Leu Ser Phe Leu Glu Cys Arg Trp

355 360 365

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(上游引物DRV-FC)

<400> 7

tcttattgtt cttctcgtgc t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(下游引物DRV-RC)

<400> 8

aatagctctt ctcatcgtgc g 21

<210> 9

<211> 966

<212> DNA

<213> DRV 17117株(Sigma C基因)

<400> 9

atggatcgca acgaggtgat acgcctgata ctttccctcc tcccctgcca gtcaagcgac 60

gtcgatcatc tgaagacaca gatcaaatcc ctccaaagcg ccgtcgactc actcaaggaa 120

tcacaagtgg tggtgttgag acgcctgact acgattacgt cgacggtggc agatccacaa 180

tcaacaactg atatgttgac ctcacaggtg gcaggactta gttcccgtgt ggcttcagtg 240

accgatgagg tagtccgtgt aaattcagtg cttggatcta cgatcactaa tcttgataat 300

gtccggtccg aactatcctc tctctcttcc caagtctcgt cgcagacgtc cactttaacg 360

aatcttacgt cgacagtttc atctcagtct ctttcgattt ctgatctcca gcagcgagtt 420

acggccttag aacgatcggg tggtgcgccg acacagtttg aagctccctt gcaattacag 480

aacggagtcg tctcactcca agcatctccc tccttctgtt ctttgtctcc gatcctctcc 540

ggacctgctg atgctgctgt cttcaaagtt ggtgagtggc tgggaactgt catatctggt 600

caaagtcagt catctgcaat catgaacgtg cggattcatt cgtttgggca gcggaccatg 660

ttacttatgt cctcgcaaaa tgtattcact attccgccag gttcgggtgc gtctttgcag 720

ctagatgtga atcgcataac gactcctgcc attgacgttg ctatggtaac tccttctgct 780

gcgtttgctt ctgcttcctt tatggctgac atagctttca aggactctaa gacaggagaa 840

gtccacgctt tgcacactac tggctctttt cgatcacctt ctttctctat cgcttgggtc 900

ccggttgctt cagaaactcg taattatcaa ataatggcgt tacgcttcac cgtcgccacg 960

ggctag 966

<210> 10

<211> 321

<212> PRT

<213> DRV 17117株(Sigma C基因)

<400> 10

Met Asp Arg Asn Glu Val Ile Arg Leu Ile Leu Ser Leu Leu Pro Cys

1 5 10 15

Gln Ser Ser Asp Val Asp His Leu Lys Thr Gln Ile Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Ala Val Asp Ser Leu Lys Glu Ser Gln Val Val Val Leu Arg Arg

35 40 45

Leu Thr Thr Ile Thr Ser Thr Val Ala Asp Pro Gln Ser Thr Thr Asp

50 55 60

Met Leu Thr Ser Gln Val Ala Gly Leu Ser Ser Arg Val Ala Ser Val

65 70 75 80

Thr Asp Glu Val Val Arg Val Asn Ser Val Leu Gly Ser Thr Ile Thr

85 90 95

Asn Leu Asp Asn Val Arg Ser Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Gln Val

100 105 110

Ser Ser Gln Thr Ser Thr Leu Thr Asn Leu Thr Ser Thr Val Ser Ser

115 120 125

Gln Ser Leu Ser Ile Ser Asp Leu Gln Gln Arg Val Thr Ala Leu Glu

130 135 140

Arg Ser Gly Gly Ala Pro Thr Gln Phe Glu Ala Pro Leu Gln Leu Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Val Ser Leu Gln Ala Ser Pro Ser Phe Cys Ser Leu Ser

165 170 175

Pro Ile Leu Ser Gly Pro Ala Asp Ala Ala Val Phe Lys Val Gly Glu

180 185 190

Trp Leu Gly Thr Val Ile Ser Gly Gln Ser Gln Ser Ser Ala Ile Met

195 200 205

Asn Val Arg Ile His Ser Phe Gly Gln Arg Thr Met Leu Leu Met Ser

210 215 220

Ser Gln Asn Val Phe Thr Ile Pro Pro Gly Ser Gly Ala Ser Leu Gln

225 230 235 240

Leu Asp Val Asn Arg Ile Thr Thr Pro Ala Ile Asp Val Ala Met Val

245 250 255

Thr Pro Ser Ala Ala Phe Ala Ser Ala Ser Phe Met Ala Asp Ile Ala

260 265 270

Phe Lys Asp Ser Lys Thr Gly Glu Val His Ala Leu His Thr Thr Gly

275 280 285

Ser Phe Arg Ser Pro Ser Phe Ser Ile Ala Trp Val Pro Val Ala Ser

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Gly

<210> 11

<211> 966

<212> DNA

<213> DRV Q株(Sigma C基因)

<400> 11

atggatcgca acgaggtgat acgcccgata ctttccctcc tcccctacca gtcaagcgac 60

gtcgatcatt tgacgacaca gatcaaatcc ctccaaagcg ccgtctactc gctcaaagaa 120

tcacaagtgg tggtgttgag acgcctgact acgattacgt cgacggtggc cgatctacaa 180

tcaacaattg aattgttgac ctcacaggtg gcaggacttg gttcccgtgt ggcttcagtg 240

actgatgagg tagtccgttt gaattcagtg attggatcta cgatcactaa tcttgacaat 300

gtccggtccg agctatcctc tctctcctcc caagtctcgt cgcagacgtc cactctaacg 360

aaccttacgt caaccgtttc atctcagtct cttgcgattt ctgatctcca gcaacgagtt 420

acggccttag aacgatcggg tggtgcgccg acgcagtttg aagctccctt gcaactacaa 480

aacggagtcg tctcactcca agcatctccc tctttctgtt ctttgtctcc gatcctctcc 540

ggacctgctg atgctgccgt cttcaaggtt ggtgagtggc tgggaactgt catatctggt 600

aaaagtcagt catctgcaat tatgaacgta cggattcatt catttgggca gcggaccatg 660

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ggctag 966

<210> 12

<211> 321

<212> PRT

<213> DRV Q株(Sigma C基因)

<400> 12

Met Asp Arg Asn Glu Val Ile Arg Pro Ile Leu Ser Leu Leu Pro Tyr

1 5 10 15

Gln Ser Ser Asp Val Asp His Leu Thr Thr Gln Ile Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Ala Val Tyr Ser Leu Lys Glu Ser Gln Val Val Val Leu Arg Arg

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Leu Thr Thr Ile Thr Ser Thr Val Ala Asp Leu Gln Ser Thr Ile Glu

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275 280 285

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290 295 300

Glu Leu Arg Asn Tyr Arg Ile Met Ala Leu Arg Phe Thr Val Ala Thr

305 310 315 320

Gly

Claims

1.一种鸭呼肠孤病毒弱毒株，其特征在于该株病毒是由鸭呼肠孤病毒强毒17117株CGMCC No.18889经Vero细胞传代获得，被命名为鸭呼肠孤病毒( Duck reovirus, DRV) Q株，简称DRV Q株，该毒株已于2019年12月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.18890；

所述弱毒株病毒的Sigma B、Sigma C蛋白氨基酸序列分别为序列6和序列12。

2.如权利要求1所述的一株鸭呼肠孤病毒弱毒株的应用，其特征在于该毒株用于鸭呼肠孤病毒病活疫苗的制备；

所述活疫苗的疫苗抗原是由Vero或BHK或CEF或LMH或DF-1细胞制备的。