CN104726414A - 血清3型鸭甲型肝炎病毒活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血清3型鸭甲型肝炎(DHAV-3)活疫苗及其制备方法。目前血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)一般只能通过鸭胚进行分离和培养，这对于该病毒的研究和血清3型鸭肝炎活疫苗的研制造成很大的障碍。本发明采用鸡胚卵黄囊接种途径，由患鸭肝炎病鸭肝脏组织分离获得血清3型鸭甲型肝炎病毒，并通过鸡胚连续传代培育得到一株致弱毒株HuB60株(CGMCC No.10307)，该致弱毒株可用于制备血清3型鸭甲型肝炎(DHAV-3)活疫苗，也可以与血清1型鸭甲型肝炎弱毒株(如A66株)以适易比例混合制备鸭甲型肝炎二价活疫苗。

Description

血清3型鸭甲型肝炎病毒活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种血清3型鸭甲型肝炎活疫苗(DHAV-3)及其制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)属微RNA病毒科成员(陆承平.兽医微生物学.(第五版)北京：中国农业出版社,2012,460-466.)，是引致雏鸭肝炎的最重要病原，主要感染4周龄以下的雏鸭发生以肝脏出血为特征的急性肝炎，发病急、传播快、发病率和死亡率可达90％以上。由DHAV引起的鸭肝炎自上世纪五十年代在美国被发现以后，迅速在世界养鸭地区爆发和蔓延，我国黄均建(黄均建.小鸭病毒性肝炎研究，上海农业科学院畜牧兽医研究所单行本，1963.)1963年首次报道了上海地区鸭场爆发此病，王平等(王平等.北京小鸭病毒性肝炎的研究.北京大学学报(自然科学版)，1980，1：55)1980年首先在北京地区发病鸭场分离到病毒，之后我国养鸭地区均有本病的发生和流行。随着近几年来鸭肝炎弱毒活疫苗和高免卵黄抗体的研制成功及临床应用，使本病在很大程度上得到很好的控制。

1992年Sandhu等(Sandhu,T.S.,B.W.Calnek,and L.Zeman.1992.Pathologic and serologiccharacterization of a variant of duck hepatitis type Ⅰ virus.Avian Dis 36:932-936.)报道鸭肝炎病毒发生变异现象，2002年苏敬良等(苏敬良等.新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定.中国兽医科技,2002,1:15-16.)报道北京和广西等地区免疫过鸭肝炎疫苗或注射过鸭肝炎高免卵黄抗体的鸭群仍然发生鸭肝炎，并且证明分离到的鸭肝炎病毒与经典的鸭肝炎病毒无血清学交叉反应，故暂称新型鸭肝炎病毒。2007年，台湾学者Tseng(Tseng C.H.,Tsai H.J.,Molecularcharacterization of a new serotype of duck hepatitis virus.Virus Res,2007,126:19-31.)和韩国学者Kim(Kim M.C.,Kwon Y.K.,Joh S.J.,et al.Recent Korean isolates of duck hepatitis virus revealedthe presence of a new geno-and serotype when compared to duck hepatitis virus type1 typestrains.Arch Virol.2007,1 52:2059-2072.)分别报道分离到不同于经典的鸭肝炎病毒的新型鸭肝炎病毒，通过分子生物学和血清学鉴定，表明台湾和韩国分离的新型鸭肝炎病毒均属DHAV，但它们之间也存在着明显的血清学差异，所以现在已明确将DHAV分为3个血清型^[1]，并将经典的鸭肝炎病毒、台湾新型鸭肝炎病毒和韩国新型鸭肝炎病毒分别归属到血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)、血清2型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-2)和血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)之中。通过分子生物学鉴定和血清学试验证实，我国大陆自2002年以来分离鉴定的所有新型鸭肝炎病毒株与韩国新型鸭肝炎病毒高度同源，均为血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)。

众所周知，我国是养鸭大国，目前鸭的年饲养量已达40亿只，占全世界鸭饲养总量的70％以上，鸭肝炎一直是我国养鸭生产的头号疫病，近年来随着血清1型鸭甲型肝炎活疫苗和高免卵黄抗体的推广应用，使血清1型鸭甲型肝炎得到有效控制，但近十年来由于新出现血清3型鸭甲型肝炎在我国养鸭地区爆发和迅速蔓延，又成为制约我国养鸭生产新的严峻问题。因此，血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)弱毒株的培育和活疫苗的研制，以及针血清1型和血清3型鸭甲型肝炎二价活疫苗的研制成为当务之急。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)的弱毒株及其单价活疫苗和血清1型与血清3型二价活疫苗的制备方法。

本发明可以通过以下技术方案实现：

1.一种血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)弱毒HuB60株，该毒株已于2015年01月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10307。

2.如权利要求1所述血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)HuB60株是通过鸡胚传代培养获得的弱毒株。

3.如权利要求2所述DHAV-3的鸡胚培养方法，包括以下步骤：

(1)选取经抗DHAV-1阳性血清和抗DHAV-3阳性血清在鸭胚上进行中和试验和交叉中和试验确诊为DHAV-3的肝脏组织病料用于鸡胚培养分离病毒；

(2)DHAV-3的组织病料的处理：取少许DHAV-3的肝脏组织，用灭菌生理盐水做1:5(W/V)左右稀释、研磨、冻融2～3次、离心，取离心上清液经0.22μm滤器除菌过滤；

(3)鸡胚接种分离病毒：取上述无菌滤液通过卵黄囊接种途径接种6～8日龄SPF鸡胚，每只胚接种0.2～0.5ml,37℃培养，24h内死胚弃之，连续观察至120h，其间若有鸡胚死亡，随时取出置2～8℃冰箱冷藏数小时或过夜；若无死亡，则于72～96h随机取3枚胚置2～8℃冷藏过夜；

(4)鸡胚传代接种：及时取出胚体，研磨成匀浆、离心取上清液经0.22μm除菌过滤，取滤液经卵黄囊接种6～8日龄SPF鸡胚5～10枚，每只胚0.2～0.5ml；盲传5～10代，随着传代次数的增加，鸡胚死亡时间前移，鸡胚死亡率也逐渐达到100％，表明通过鸡胚分离病毒成功，并逐渐适应鸡胚培养。

4.一种疫苗组合物，其特征在于包含活的如权利要求1所述的DHAV-3弱毒株(如HuB60株)和兽用生物制品可接受的冻干保护剂。

5.一种疫苗组合物，其特征在于包含活的如权利要求1所述的DHAV-3弱毒株(如HuB60株)、DHAV-1弱毒株(如A66株)和兽用生物制品可接受的冻干保护剂。

6.如权利要求3所述DHAV-1弱毒株(A66株)，该毒株已于2013年08月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8020。

本发明的详细描述：

一、生产毒株血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)HuB60株的培育

(一)病料的选择

对湖北某鸭场临床发生典型鸭肝炎症状的5日龄病死鸭，无菌操作取肝脏组织经实验室鉴定：

1.RT-PCR检测：取肝组织样品提取RNA，经PCR扩增和电泳，出现血清3型鸭甲型肝炎病毒特异性条带；

2.病毒分离：取少许肝脏组织，用每毫升含青、链霉素各1000单位的灭菌生理盐水做1∶10(W/V)稀释、研磨、冻融2次、3000r/min离心10min，取离心上清液经0.22μm滤器去菌过滤，取该滤液通过尿囊腔途径接种11日龄敏感鸭胚5只，每只胚接种0.2ml,37℃温箱培养，于接种后48～96h鸭胚全部死亡。

3.血清中和试验鉴定：取死亡鸭胚尿囊液100倍稀释，与等量抗DHAV-1阳性血清和抗DHAV-3阳性血清作用1h后，在鸭胚上进行血清中和试验和交叉中和试验，见表1。实验室检测结果表明，湖北孝感某鸭场临床发生的鸭肝炎为DHAV-3所致。

表1血清中和试验和交叉中和试验结果

(二)DHAV-3HuB毒株的分离

鸡胚卵黄囊接种分离病毒：取已确诊感染DHAV-3的肝脏组织少许，用灭菌生理盐水做1∶5(W/V)稀释、研磨、冻融3次、3000r/min离心10min，离心上清液经0.22μm滤器去菌过滤。取该无菌滤液通过卵黄囊途径接种6日龄无特异性病原鸡(SPF)鸡胚，每只胚经卵黄囊接种0.2ml，接种10枚鸡胚，37℃温箱培养，定时观察鸡胚死亡情况，24h内死胚弃之，连续观察至120h。其间若有鸡胚死亡，随时取出置2～8℃冰箱冷藏数小时或过夜；若无死亡，则于72～96h随机取3枚胚置2～8℃冷藏过夜。鸡胚传代接种：对上述冷藏鸡胚无菌操作取出胚体，并观察胚体病变情况，将鸡胚研磨成匀浆、3000r/min离心10min，离心上清液经0.22μm滤器去菌过滤，将无菌滤液再通过卵黄囊途径接种6～8日龄SPF鸡胚，每只胚接种0.2～0.5ml,每次接种5～10枚鸡胚培养，如此通过鸡胚卵黄囊接种盲传至9代，120h内能致鸡胚100％死亡，表明通过鸡胚分离病毒成功，并命名该分离的DHAV-3为HuB毒株，HuB毒株鸡胚传代分离结果见表2。

表2 HuB毒株的鸡胚传代情况

(三)血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)弱毒HuB60株的培育

对通过鸡胚分离并适应鸡胚培养的DHAV-3HuB毒株，取感染鸡胚或尿囊液，用灭菌生理盐水适当稀释(10～100倍稀释)经鸡胚卵黄囊接种连续传代至80代，取其不同代次鸡胚毒接种1～3日龄敏感雏鸭，观察其对雏鸭的致病性。15代次病毒液对雏鸭仍有20％的致死率，所有雏鸭肝脏表现严重出血或充血肿大、多数鸭表现胆汁稀薄和脾脏肿大的变化；30次代的病毒液对雏鸭已无致死性，但仍部分雏鸭肝脏有出血或充血，胆汁异常和脾脏肿大等病变；至60代次时对雏鸭已无致病力，接种雏鸭全部健活，剖检亦无任何肉眼可见变化，见表3。

表3 HuB毒株不同代次鸡胚毒对雏鸭的致病性试验结果

取经鸡胚传代弱毒的HuB60株第60代次鸡胚毒液10倍递进稀释，经皮下注射途径免疫1日龄敏感雏鸭，5天后用HuB强毒1000LD₅₀的剂量攻毒，测定HuB60的半数免疫量(IMD₅₀)。结果半数免疫量为10^4.68IMD₅₀/0.1ml，见表4。试验结果表明，DHAV-3HuB60株具有良好的免疫原性，该致弱毒株被命名为血清3型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHAV-3)HuB60株，并已于2015年01月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10307。

表4 HuB60株半数免疫量(IMD₅₀)测定结果

二、疫苗制备

(一)血清3型鸭甲型肝炎活疫苗(HuB60株)的制备

1.DHAV-3HuB60株 抗原的制备

(1)取DHAV-3HuB60株 (CGMCCNo.10307株)种毒，用灭菌生理盐水作100～1000倍稀释，通过卵黄囊内接种8日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，24h内死胚弃去，收获24～96h死亡鸡胚组织(胎儿、胚膜)，经分组匀浆、留样后冻存。

(2)抗原检验 对每组鸡胚匀浆样品进行无菌检验和病毒含量测定。

2.疫苗配制

将检验合格的DHAV-3(HuB60株)抗原，取出解冻、称重、过滤、按(V/V)1:1比例加入保护剂混匀、按每瓶2ml定量分装、并按设定的冻干曲线冷冻真空干燥、压塞、出箱、轧盖、贴签，产品贮存于-15℃冰柜中。

3.疫苗检验

疫苗成品检验  本发明涉及到的相关检验方法按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版(三部).中国农业出版社，2011，本发明称《中国兽药典》)的方法进行。

(1)性状  淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

(2)无菌检验  按《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

(3)支原体检验  按《中国兽药典》进行检验，应无支原体生长。

(4)外源病毒检验按《中国兽药典》进行检验，应外源病毒污染。

(5)安全检验  用1日龄易感雏鸭15只，其中10只，各皮下或肌肉注射10个使用剂量疫苗，另5只不接种作为对照，两组分别饲养。观察14日，均应健活。如有非特异性死亡，两组均不应超过l只。否则可重检1次。

(6)效力检验  下列方法任择其一：

1)病毒含量测定按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/10.1ml，再作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-53个稀释度，分别尿囊腔内接种8～9日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～120小时死亡的鸡胚，随时取出，计算ELD₅₀，每羽份疫苗中的病毒含量应不低于10^4.0ELD₅₀。

2)用雏鸭检验  用1～3日龄易感雏鸭15只，其中10只，各皮下注射接种1个使用剂量的疫苗，另5只不接种，作对照，隔离饲养。5日后，取全部免疫鸭和对照鸭各皮下注射血清3型鸭甲型肝炎病毒HuB毒株强毒(含1000LD₅₀)，观察7日，免疫组鸭至少有8只存活，对照组应至少有4只发病死亡。

(7)剩余水份测定  按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

(8)真空度测定  按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

(二)鸭甲型肝炎二价活疫苗(DHAV-1A66株+DHAV-3HuB60株)的制备

1.抗原制备

(1)DHAV-1(A66株)抗原的制备

1)制备  取DHAV-1A66株种毒(该毒株已于2013年08月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8020。)，用灭菌生理盐水作100～1000倍稀释，通过尿囊腔途径接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，24h内死胚弃去，收获24～96h死亡鸡胚组织(胎儿、胚膜)，经分组匀浆、留样后冻存。

2)抗原检验  对每组鸡胚匀浆样品进行无菌检验和病毒含量测定。

(2)DHAV-3(HuB60株)抗原的制备

1)制备  取DHAV-3弱毒HuB60株种毒，用灭菌生理盐水作100～1000倍稀释，通过卵黄囊途径接种8日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，24h内死胚弃去，收获24～96h死亡鸡胚组织(胎儿、胚膜)，经分组匀浆、留样后冻存。

2)抗原检验  对每组鸡胚匀浆样品进行无菌检验和病毒含量测定。

2.疫苗配制

将检验合格的DHAV-1弱毒(A66株)抗原和DHAV-3(HuB60株)抗原，取出解冻、称重、过滤、按(V/V)1:1比例混合，再以(V/V)1:1加入保护剂混匀、按每瓶4ml定量分装、并按设定的冻干曲线冷冻真空干燥、压塞、出箱、轧盖、贴签，产品贮存于-15℃冰柜中。

3.疫苗检验

(1)按现行《中国兽药典》规定进行性状、无菌检验、支原体检验、鉴别检验、外源病毒检验、剩余水份和真空度测定。

(2)安全性检验  用1～3日龄易感雏鸭15只，其中10只，各皮下或肌肉注射10个使用剂量疫苗，另5只不接种作为对照，两组分别饲养。观察14日，均应健活。如有非特异性死亡，两组均不应超过l只。否则可重检1次。

(3)效力检验

1)病毒含量测定  按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/10.1ml，再作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-53个稀释度，分别与抗DHAV-1和抗DHAV-3血清中和。与DHAV-1抗血清中和处理的样品，每个稀释度经卵黄囊内接种6～8日龄SPF鸡胚5个，与DHAV-3抗血清中和处理的样品，每个稀释度经尿囊腔内接种8～9日龄SPF鸡胚5个。每胚0.2ml，置37℃继续孵育，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～120小时死亡的鸡胚，随时取出，计算ELD₅₀，每羽份疫苗中的DHAV-1病毒含量应不低于10^4.3ELD₅₀，每羽份疫苗中DHAV-3的病毒含量应不低于10^4.0ELD₅₀。

2)用雏鸭检验  用1～3日龄易感雏鸭30只。取10只，各皮下注射接种1/10个使用剂量的疫苗；再取10只，各皮下注射接种1个使用剂量的疫苗；另10只不接种，作对照，隔离饲养。5日后，取免疫1/10个剂量的鸭和5只对照鸭，各皮下注射血清3型鸭甲型肝炎病毒HuB毒株强毒(含1000LD₅₀)，观察7日，免疫组鸭至少有8只存活，对照组应至少有4只发病死亡。5日后，取免疫1/10个剂量的10只鸭和5只对照鸭，各皮下注射血清1型鸭甲型肝炎病毒强毒(含1000LD₅₀)，观察7日，免疫组鸭至少有8只存活，对照组应至少有4只发病死亡；取免疫1个剂量的10只鸭和5只对照鸭，各皮下注射血清3型鸭甲型肝炎病毒强毒(含1000LD₅₀)，观察7日，免疫组鸭至少有8只存活，对照组应至少有4只发病死亡。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及的微生物有：血清3型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus,DHAV-3)弱毒疫苗株HuB60株，该毒株已于2015年01月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10307；安徽省农科院畜牧兽医研究所提供的血清1型鸭甲型肝炎病毒(duckhepatitis A virus,DHAV-1)A66株也是经SPF鸡胚连续传代致弱获得，本发明人已于2013年08月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8020。

本发明的积极意义

本发明涉及一种血清3型鸭甲型肝炎(DHAV-3)活疫苗及其制备方法。目前血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)一般只能通过鸭胚进行分离和培养，这对于该病毒的研究和血清3型鸭甲型肝炎活疫苗的研制造成很大的障碍。本发明采用鸡胚卵黄囊接种途径，由患鸭肝炎病组织分离获得血清3型鸭甲型肝炎病毒，并通过鸡胚连续传代培养得到一株致弱毒株(HuB60株)，该致弱毒株可用于制备血清3型鸭甲型肝炎(DHAV-3)活疫苗，也可以与血清1型鸭甲型肝炎弱毒株(如A66株)以适易比例混合制备鸭甲型肝炎二价活疫苗，用于预防血清1型和3型的鸭甲型肝炎病毒引起的感染。

实施例

下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明，本实施例不对本发明构成限制。

实施例1

——DHAV-3弱毒活疫苗(HuB60株)的制备

1.抗原的制备

(1)种毒DHAV-3弱毒HuB60株F60、F65、F70、F75、F80代种毒，8日龄SPF鸡胚等；

(2)鸡胚接种和抗原处理

经检验合格的DHAV-3弱毒HuB60株F60、F65、F70、F75、F80代种毒，用灭菌生理盐水作100～1000倍稀释，通过卵黄囊途径接种8日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，24h内死胚弃去，收获24～96h死亡鸡胚组织(胎儿、胚膜)，经分组匀浆、留样后冻存。

(3)抗原检验 对每组鸡胚匀浆样品进行无菌检验和病毒含量测定。

(4)抗原制备和检验结果，详见表5。

表5五批HuB60株抗原制备和检验结果

2.疫苗配制

将检验合格的DHAV-3(HuB60株)抗原，取出解冻、称重、过滤、按(V/V)比例1:1加入保护剂混匀、按每瓶2ml定量分装、按设定的冻干曲线冷冻真空干燥、压塞、出箱、轧盖、贴签，产品贮存于-15℃冰柜中。共计生产5批产品。

3.疫苗检验

按现行《中国兽药典》规定进行性状、无菌检验、支原体检验、鉴别检验、外源病毒检验、剩余水份和真空度测定，以及产品的安全性和效力检验。

(1)5批次的DHAV-3弱毒活疫苗(HuB60株)实验室产品外观、性状、真空度及剩余水测定均符合现行《中国兽药典》规定，测定结果见表6。

(2)产品的无菌检验、支原体检验、特异性检验及外源病毒检验符合现行《中国兽药典》规定；检验结果见表7。

(3)安全检验  用1日龄易感雏鸭15只，其中10只，各皮下或肌肉注射10个使用剂量疫苗，另5只不接种作为对照，两组分别饲养。观察14日，均应健活。如有非特异性死亡，两组均不应超过l只。否则可重检1次，结果见表7。

(4)效力检验  下列方法任择其一：

1)病毒含量测定  按瓶签注明的羽份，将疫苗用灭菌生理盐水稀释至1羽份/10.1ml，再作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-53个稀释度，分别卵黄囊内接种6～8日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～120小时死亡的鸡胚，随时取出，计算ELD₅₀，每羽份疫苗中的病毒含量应不低于10^4.0ELD₅₀，结果见表7。

2)用雏鸭检验  用1～3日龄易感雏鸭15只，其中10只，各皮下注射接种1个使用剂量的疫苗，另5只不接种，作对照，隔离饲养。5日后，取全部免疫鸭和对照鸭各皮下注射3型鸭甲型肝炎病毒HuB毒株强毒(含1000LD₅₀)，观察7日，免疫组鸭至少有8只存活，对照组应至少有4只发病死亡，结果见表7。

表6 5批DHAV-3活疫苗(HuB60株)的性状、真空度及剩余水分测定结果

表7 5批DHAV-3活疫苗(HuB60株)纯净性、安全性及效力检验结果

实施例2

——鸭甲型肝炎二价活疫苗(DHAV-1A66株，DHAV-3HuB60株)的制备

1.抗原制备

(1)种毒鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus)DHAV-1A66株E66、E70、F72、E75、E80代种毒该毒株是本发明人于1986年由我国安徽分离到的鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus)A株经SPF鸡胚连续传代致弱获得，该株鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus)已于2013年08月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8020。

(2)鸡胚接种和抗原处理

经检验合格的DHAV-1A66株E66、E70、F72、E75、E80代种毒，用灭菌生理盐水作100～1000倍稀释，通过尿囊腔途径接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，36h内死胚弃去，收获36～72h死亡鸡胚组织(胎儿、胚膜、胚液)，经分组匀浆、留样后冻存。

(3)抗原检验 对每组鸡胚匀浆样品进行无菌检验和病毒含量测定。

(4)抗原制备和检验结果，详见表8。

表8五批DHAV-1A66株抗原制备和检验结果

(2)DHAV-3HuB60株抗原的制备

(1)种毒 DHAV-3弱毒HuB60株F60、F65、F70、F75、F80代种毒，8日龄SPF鸡胚等；

(2)鸡胚接种和抗原处理

经检验合格的DHAV-3弱毒HuB60株F60、F65、F70、F75、F80代种毒，用灭菌生理盐水作100～1000倍稀释，通过卵黄囊途径接种8日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置36～37℃继续孵育，24h内死胚弃去，收获24～96h死亡鸡胚组织(胎儿、胚膜)，经分组匀浆、留样后冻存。

(3)抗原检验 对每组鸡胚匀浆样品进行无菌检验和病毒含量测定。

(4)抗原制备和检验结果，详见表5。

2.疫苗配制

将检验合格的DHAV-1弱毒(A66株)抗原和DHAV-3(HuB60株)抗原，取出解冻、称重、过滤、按1:1比例混合，再以1:1(W/V)加入保护剂混匀、按每瓶4ml定量分装、按设定的冻干曲线冷冻真空干燥、压塞、出箱、轧盖、贴签，产品贮存于-15℃冰柜中。共计生产5批实验室产品。

3.疫苗检验

按现行《中国兽药典》规定进行性状、无菌检验、支原体检验、鉴别检验、外源病毒检验、剩余水份和真空度测定，以及产品的安全性和效力检验。

5批次的DHAV二价活疫苗(A66株+HuB60株)实验室产品外观、性状、真空度及剩余水测定均符合现行《中国兽药典》规定，测定结果见表9。

产品的无菌检验、支原体检验、特异性检验及外源病毒检验符合现行《中国兽药典》规定；产品的安全性检验、效力检验符合本产品的规定。检验结果见表10。

表9 5批DHAV二价活疫苗的性状、真空度及剩余水分测定结果

表10 5批DHAV二价活疫苗纯净性、安全性及效力检验结果

Claims (6)

1.一种血清3型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus,DHAV-3)弱毒HuB60株，该毒株已于2015年01月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10307。

2.如权利要求1所述血清3型鸭甲型肝炎病毒DHAV-3HuB60株(CGMCC No.10307株)是通过鸡胚传代培养获得的弱毒株。

3.如权利要求2所述DHAV-3的鸡胚培养方法，包括以下步骤：

(1)选取经抗DHAV-1阳性血清和抗DHAV-3阳性血清在鸭胚上进行中和试验和交叉中和试验，确诊为DHAV-3感染的肝脏组织病料用于鸡胚培养分离病毒；

(2)DHAV-3的组织病料的处理：取少许DHAV-3的肝脏组织，用灭菌生理盐水做1:5(W/V)左右稀释、研磨、冻融2～3次、离心，取离心上清液经0.22μm滤器除菌过滤；

(3)鸡胚接种分离病毒：取上述无菌滤液通过卵黄囊接种途径接种6～8日龄SPF鸡胚，每只胚接种0.2～0.5ml,37℃培养，24h内死胚弃之，连续观察至120h，其间若有鸡胚死亡，随时取出置2～8℃冰箱冷藏数小时或过夜；若无死亡，则于72～96h随机取3枚胚置2～8℃冷藏过夜；

(4)鸡胚传代培养：及时取出胚体，研磨成匀浆、离心取上清液经0.22μm除菌过滤，取滤液经卵黄囊接种6～8日龄SPF鸡胚5～10枚，每只胚0.2～0.5ml；盲传5～10代，随着传代次数的增加，鸡胚死亡时间前移，鸡胚死亡率也逐渐达到100％，表明通过鸡胚分离病毒成功，并逐渐适应鸡胚培养。

4.一种疫苗组合物，其特征在于包含活的如权利要求1所述的DHAV-3弱毒株(如HuB60株，即CGMCC No.10307株)和兽用生物制品可接受的冻干保护剂。

5.一种疫苗组合物，其特征在于包含活的如权利要求1所述的DHAV-3弱毒株(如HuB60株，即CGMCC No.10307株)、DHAV-1弱毒株(如A66株)和兽用生物制品可接受的冻干保护剂。

6.如权利要求3所述DHAV-1弱毒株A66株，该毒株已于2013年08月13日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.8020。