CN103143008B - 一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法。本发明利用一株人工致弱的鸭坦布苏病毒WF100株（保藏号是CGMCC No.7306）作为生产病毒株，制备一种安全、有效的预防和控制鸭坦布苏病毒病的活疫苗。相比灭活疫苗具有免疫后动物副反应更小及可用于动物发生鸭出血性卵巢炎时的紧急免疫等优点。

Description

一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

2010年4月以来，我国主要蛋鸭养殖区福建、山东、浙江、上海、江苏等地陆续暴发一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病。在疫病流行初期，根据主要病变和临床特点，将该流行性疾病称为鸭出血性卵巢炎（DuckHemorrhagicOvaritis，DHO)。随着病原学研究的深入，该病被确诊是由一种新型黄病毒——鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus，DTMUV）引起。2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会将该病名称统一为“鸭坦布苏病毒病”。我们从某大型鸭场的发病种鸭群中分离到一株病毒，经初步鉴定该病毒为有囊膜的RNA病毒。RT-PCR扩增测序显示该病毒与黄病毒科黄病毒属的坦布苏病毒亲缘关系最近，随将该病毒称为鸭坦布苏病毒WFG36株。

由于对该新型流行疾病无特效治疗方法，疫苗的研制开发是控制该疾病的首选措施。

目前已有灭活疫苗的研究报道，此前，申请人已经于2011年8月31日提交了灭活疫苗的发明专利申请，申请号为201110254517.X。但在实际应用中，活疫苗相比灭活疫苗有着产生抗体快、副反应小等优势，目前，申请人通过人工驯化，获得了鸭坦布苏病毒的弱毒株，可用于制备鸭坦布苏病毒活疫苗的制备。申请人将鸭坦布苏病毒WFG36株，在CEF细胞（鸡胚成纤维细胞）上经人工连续传代培养，病毒对实验鸭的致病力显著降低，并保持了良好的免疫原性和遗传稳定性，命名为“鸭坦布苏病毒WF100株”。

发明内容

本发明的目的在于利用本发明人自行分离、鉴定、保存的一株鸭坦布苏病毒WFG36株，在CEF细胞上连续传代致弱而筛选出具有良好免疫保护率的弱毒疫苗株WF100株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对目前中国流行鸭坦布苏病毒的攻击提供良好免疫保护效力。

本发明技术方案

1..本发明所涉及的鸭坦布苏病毒活疫苗，含有经人工致弱的鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus）病毒株WF100株，该病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.7306。

2.鸭坦布苏病毒活疫苗的制备方法是将鸭坦布苏病毒WF100株接种生长良好的CEF细胞、VERO细胞和BHK21细胞中任一种细胞单层繁殖，连续观察72～96小时，当细胞病变达80%左右时，收获感染的细胞病毒液，加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，制备成鸭坦布苏病毒活疫苗。

3.一种鸭坦布苏病毒活疫苗的应用是给鸭接种有效剂量的一种鸭坦布苏病毒活疫苗能使接种鸭获得对鸭坦布苏病毒产生有效预防的免疫力。

具体实施方式

1.疫苗生产用弱毒株的培育

使用9～10日龄活力良好的SPF鸡胚制备CEF细胞，待细胞长成单层后，用鸭坦布苏病毒（DTMUV）WFG36强毒株按照5%接种量接种细胞，观察细胞病变情况，72～96小时后，无菌收集细胞悬液，进行下一次传代。连续传至100代，进行致弱评价试验，如下：

将WFG36株P40、P60、P80、P100代毒分别接种230日龄左右产蛋鸭（产蛋率85%～90%），每只肌肉注射1ml，并设置生理盐水对照组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸭群的发病情况、采食量和产蛋量。

WFG36株P40、P60代毒接种产蛋鸭后第2天，采食量明显下降，第7～8天采食开始恢复，第11～12天采食恢复正常水平，产蛋率在接种后第9日降至30%，此后开始回升，21日时恢复至约60%。P60代毒接种产蛋鸭后第2天，采食量下降约50%，第6～7天采食基本恢复正常水平，产蛋率在接种后第6日降至约42.5%，第7天又开始回升，21日时恢复至约80%。P40、P60代毒接种产蛋鸭后有部分鸭只表现走路摇晃、站立不稳，排绿色稀便。剖检可见卵泡膜充血、出血，卵泡变形、变性，输卵管炎性病变等病理变化。P80、P100代毒接种产蛋鸭后，采食量无明显下降，产蛋量仅表现一过性下降，4天后恢复正常。剖检未见卵泡膜充血、出血，卵泡变形、变性，输卵管炎症等特征性病理变化，与对照鸭一致。说明P80、P100代毒已经致弱，对产蛋鸭没有致病性。选取P100代毒作为疫苗研制的候选毒株，命名为鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus）WF100株（简称DTMUVWF100株），该病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.7306。

2.病毒株特性

（1）病毒培养

将DTMUVWF100株病毒样品按5%比例接种CEF细胞单层，置37℃、5%CO₂培养箱中静置培养，每天观察CPE，72～96小时后，当细胞出现病变达80%时收获，置-20℃保存。传代毒液作毒价测定。病毒含量稳定维持在10^6.5TCID₅₀/ml～10^7.0TCID₅₀/ml。

（2）免疫原性

取20只1日龄SPF鸭随机分成2组，每组10只，于负压隔离器中隔离饲养。5日龄时，其中一组肌肉注射DTMUVWF100株细胞毒0.5ml，10^4.5TCID₅₀/只，另一组作为对照，每只肌肉注射生理盐水0.5ml。14日后以相同途径和剂量进行二次免疫，自接种之日起，每天观察记录鸭群发病情况。二免后21天，将2组雏鸭用鸭坦布苏病毒WFG36强毒株进行攻毒，肌注0.5ml/只。攻毒后第5天，剖杀，采集每只鸭的脾脏组织，适当处理后，脾脏研磨滤液分别经卵黄囊接种6～7日龄易感鸡胚5枚，0.2ml/胚，进行病毒再分离。免疫组1/10只鸭病毒分离阴性，对照组10只鸭病毒分离阳性。以上实验经过2次重复，结果一致。说明WF100株毒具有良好的免疫保护性。

（3）纯净性

按现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部.中国农业出版社，2011）附录进行，DTMUVWF100株毒种无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

（4）特异性

将毒种用DMEM液稀释100倍（DTMUVWF100株毒种病毒含量为：10^6.0TCID₅₀/1.0ml），与等量抗鸭坦布苏病毒特异性血清混合后，37℃中和1小时，接种已长成单层的CEF细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。另设病毒感染对照和正常细胞对照，各接种6孔，每孔0.5ml。将细胞培养板置37℃、含5%CO₂培养箱中培养，连续观察120～144小时。中和组和正常细胞对照组未出现细胞病变效应（CPE）。病毒对照孔全部出现CPE。

3.鸭坦布苏病毒活疫苗的制备

将DTMUVWF100株接种良好细胞单层，连续观察72～96小时，当细胞病变达80%左右时，收获感染的细胞病毒液，加入冻干保护剂，用最适合此毒株的冻干曲线进行冻干，制备鸭坦布苏病毒活疫苗。

具体有以下制备步骤：

（1）选择鸭坦布苏病毒WF100株作为疫苗生产用种毒；

（2）选择CEF细胞或Vero细胞或BHK₂₁细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料；

（3）抗原的制备，可通过以下3种途径实现：

1）选择CEF细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料

将DTMUVWF100株生产用种毒用DMEM稀释后，按5%接种到单层CEF细胞，放置于转瓶机上培养；接毒后每12h观察一次，当细胞典型病变时，继续培养至72～96h，至细胞病变达到80%左右，收获毒液，置于-20℃保存。

2）选择Vero细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料

将DTMUVWF100株生产用种毒用DMEM稀释后，接种到单层的Vero细胞上，并将细胞瓶置于转瓶机上培养，接毒后每12h观察一次，培养至72～96h，收获毒液，将接毒细胞置于-20℃。

3）用BHK₂₁细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料

将DTMUVWF100株生产用种毒用DMEM稀释后，接种到单层BHK细胞上，并将细胞瓶置于转瓶机上培养，接毒后每12h观察一次，培养至72～96h，细胞病变达到80%左右，收获毒液，置于-20℃保存。

（4）制备的抗原（收获的病毒液），应按《中国兽药典》（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2010，本发明简称《中国兽药典》）附录逐瓶作无菌检验和外源病毒，并抽样1份测定病毒含量（TCID₅₀），应无菌生长，无外源病毒污染，每0.1ml病毒含量应≥10^5.0TCID₅₀。

（5）疫苗制备

经无菌检验和病毒含量测定合格的细胞毒液与牛奶冻干保护剂按1:1配苗。配苗过程中应使冻干保护剂和病毒液充分混匀。疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。

4.鸭坦布苏病毒活疫苗的检验

（1）性状：疫苗呈微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

（2）无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

（3）支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。

（4）鉴别检验：将疫苗用含1%新生牛血清的维持液稀释至1羽份/ml后再做10倍稀释，与等量抗鸭坦布苏病毒特异性血清混合后，37℃中和1小时，接种已长成单层的CEF细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。同时设不中和对照组（将疫苗稀释至1羽份/ml后再做10倍稀释，与等量含1%新生牛血清的维持液混合）和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔0.5ml。将细胞培养板置37℃、含5%CO₂培养箱中培养，观察120～144小时。中和组和细胞对照组应不出现细胞病变效应（CPE），不中和对照组应全部出现CPE。

（5）外源病毒检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。

（6）安全检验：取1～2周龄SPF鸭（购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心）10只，分别颈背皮下或肌肉注射疫苗1头份，观察14天，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。

（7）效力检验：将疫苗用灭菌生理盐水稀释至0.5ml含1羽份，肌肉接种3～7日龄健康易感鸭或SPF鸭10只，每只0.5ml，同时设对照鸭10只。一免后14日，按照同样剂量和接种途径对免疫鸭进行二次免疫，二免后21日每只肌肉注射1mlWFG36株强毒（约含10×10^4.0ELD₅₀）。攻毒后观察5日，剖杀，取脾脏进行病毒分离。对照组应至少8只病毒分离阳性，免疫组应至少7只病毒分离阴性。

本发明涉及微生物的资源信息

本发明人将自行分离鉴定获得的鸭坦布苏病毒WFG36株（CGMCCNo.4718），通过在CEF细胞（鸡胚成纤维细胞）上经人工连续传代培养，病毒对实验鸭的致病力显著降低，并保持了良好的免疫原性和遗传稳定性，命名为“鸭坦布苏病毒WF100株”经人工致弱的鸭坦布苏病毒（DuckTembusuvirus）病毒株WF100株，该病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.7306。

本发明的积极意义

本发明涉及一种鸭坦布苏病毒活疫苗及其制备方法。本发明利用一株人工致弱的鸭坦布苏病毒WF100株（保藏号是CGMCCNo.7306）作为生产病毒株，制备一种安全、有效的预防和控制鸭坦布苏病毒病的活疫苗。相比灭活疫苗具有免疫后动物副反应更小及可用于动物发生鸭出血性卵巢炎时的紧急免疫等优点。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

免疫攻毒对比试验

疫苗A：鸭坦布苏病毒活疫苗（WF100株）

疫苗B：鸭坦布苏病毒灭活疫苗（WFG36株）

取2周龄SPF鸭30只，平均分为三组，一组、二组分别颈部皮下注射疫苗A、疫苗B各1头份，三组为对照组不注射疫苗。14日后以相同途径和剂量进行二次免疫，二免后14日，三个组各取5只用鸭坦布苏病毒强毒WFG36株攻毒，肌注0.5ml/只；免疫后21天，将三个组各剩余的5只用鸭坦布苏病毒强毒WFG36株攻毒，肌注0.5ml/只，攻毒保护结果见表。

表1  鸭坦布苏病毒活疫苗（WF100株）和灭活疫苗（WFG36株）攻毒对比试验

结果显示，疫苗A在第二次免疫后14天即可产生有效保护，疫苗B在第二次免疫后21天可产生有效保护。

实施例2

生产用毒种制备

取生长良好的CEF细胞单层，弃去生长液，按维持液液量的5%的比例，将鸭坦布苏病毒WF100株毒种加入到细胞瓶中，置37℃培养，84小时后，待80％的细胞出现病变时收获，定量分装，冷冻保存，注明收获日期，毒种代数等。病毒含量稳定维持在10^6.5TCID₅₀/ml以上。

实施例3

鸭坦布苏病毒活疫苗的制备——用CEF细胞制备

1.种毒接种细胞

将鸭坦布苏病毒WF100株生产用种毒用DMEM稀释后，按1%接种量接种单层的CEF细胞，放置于转瓶机上培养；

2.观察与收获

接毒后每12h观察一次，当细胞出现典型病变时，继续培养至72～96h，即细胞病变达到80%左右，收获毒液，置于-20℃。按《中国兽药典》（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2010，本发明简称《中国兽药典》）附录逐瓶作无菌检验和外源病毒，并抽样1份测定病毒含量（TCID₅₀）。经测定，均无菌生长，无外源病毒污染。

将毒液用含1%新生牛血清的维持液作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别接种长成良好单层的CEF细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl，同时设不接毒对照孔。置37℃、含5%CO₂培养箱中培养，观察120小时，记录细胞病变（CPE）孔数。按Reed-Muench法计算TCID₅₀，每0.1毫升病毒含量是10^6.71TCID₅₀。

3.冻干

用常规冻干保护剂（《中国兽药典》）与病毒液的体积比按照1:1混合，分装后，按照设计好的冻干曲线进行冻干，即：－65℃，维持2小时使疫苗迅速冻结，然后抽真空，当真空度达13.3Pa时，开始升温干燥，升华阶段产品温度为－20～－10℃，搁板温度为8℃，升华时间为10个小时；解析温度为30℃，2个小时。

实施例4

鸭坦布苏病毒活疫苗的制备——用VERO细胞制备

1.种毒接种细胞

将鸭坦布苏病毒WF100株生产用种毒用DMEM稀释后，接种单层的Vero细胞，放置于转瓶机上培养；

2.观察与收获

接毒后每12h观察一次，当细胞出现典型病变时，继续培养至72～96h，即细胞病变达到80%左右，收获毒液，置于-20℃。按《中国兽药典》（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2010，本发明简称《中国兽药典》）附录逐瓶作无菌检验和外源病毒，并抽样1份测定病毒含量（TCID₅₀），均无菌生长，无外源病毒污染.

将毒液用含1%新生牛血清的维持液作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别接种长成良好单层的CEF细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl，同时设不接毒对照孔。置37℃、含5%CO₂培养箱中培养，观察120小时，记录细胞病变（CPE）孔数。按Reed-Muench法计算TCID₅₀，每0.1ml病毒含量是10^6.65TCID₅₀。

3.冻干

用常规冻干保护剂（《中国兽药典》）与病毒液的体积比按照1:1混合，分装后，按照设计好的冻干曲线进行冻干，即：－65℃，维持2小时使疫苗迅速冻结，然后抽真空，当真空度达13.3Pa时，开始升温干燥，升华阶段产品温度为－20～－10℃，搁板温度为8℃，升华时间为10个小时；解析温度为30℃，2个小时。

实施例5

鸭坦布苏病毒活疫苗的制备——用BHK细胞制备

1.种毒接种细胞

将鸭坦布苏病毒WF100株生产用种毒用DMEM稀释后，接种单层的BHK细胞，放置于转瓶机上培养；

2.观察与收获

接毒后每12h观察一次，当细胞出现典型病变时，继续培养至72～96h，即细胞病变达到80%左右，收获毒液，置于-20℃。按《中国兽药典》（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2010，本发明简称《中国兽药典》）附录逐瓶作无菌检验和外源病毒，并抽样1份测定病毒含量（TCID₅₀），均无菌生长，无外源病毒污染。

将毒液用含1%新生牛血清的维持液作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别接种长成良好单层的CEF细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl，同时设不接毒对照孔。置37℃、含5%CO₂培养箱中培养，观察120小时，记录细胞病变（CPE）孔数。按Reed-Muench法计算TCID₅₀，每0.1ml病毒含量是10^6.65TCID₅₀。

3.冻干

用常规冻干保护剂（《中国兽药典》）与病毒液的体积比按照1:1混合，分装后，按照设计好的冻干曲线进行冻干，即：－65℃，维持2小时使疫苗迅速冻结，然后抽真空，当真空度达13.3Pa时，开始升温干燥，升华阶段产品温度为－20～－10℃，搁板温度为8℃，升华时间为10个小时；解析温度为30℃，2个小时。

实施例6

疫苗成品检验

性状微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。

鉴别检验将疫苗用含1%新生牛血清的维持液稀释至1羽份/ml后再做10倍稀释，与等量抗鸭坦布苏病毒特异性血清混合后，37℃中和1小时，接种已长成单层的CEF细胞24孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.5ml。同时设不中和对照组（将疫苗稀释至1羽份/ml后再做10倍稀释，与等量含1%新生牛血清的维持液混合）和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔0.5ml。将细胞培养板置37℃、含5%CO₂培养箱中培养，观察120～144小时。中和组和细胞对照组均不出现CPE，不中和对照组应全部出现了CPE。

外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无外源病毒污染。

安全检验取1～2周龄SPF鸭10只，分别颈背皮下或肌肉注射疫苗1羽份，观察14天，均未出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应（见表2）。

表2  不同细胞制备活疫苗安全试验结果

【效力检验】将三种细胞制备的疫苗分别用灭菌生理盐水稀释至0.5ml含1羽份，各肌肉接种7日龄健康易感鸭和SPF鸭10只，每只0.5ml，同时设对照鸭10只。一免后14日，按照同样剂量和接种途径对免疫鸭进行二次免疫，二免后21日每只肌肉注射1mlWFG36株强毒（约含10×10^4.0ELD₅₀）。攻毒后观察5日，剖杀，取脾脏进行病毒分离。对照组10只鸭病毒分离阳性，3个免疫组鸭病毒分离均为阴性。

表3  不同细胞制备活疫苗免疫攻毒试验结果

实施例7

鸭坦布苏病毒活疫苗安全性试验

1.雏鸭安全性试验

（1）对最小使用日龄雏鸭一次单剂量接种的安全试验将20只3日龄雏鸭随机分成2组，每组10只。第1组肌肉接种鸭坦布苏病毒活疫苗，0.5ml/只（含1羽份）；第2组肌肉接种生理盐水作为对照，0.5ml/只。隔离饲养。每日观察精神状态、饮食及粪便性状，接种部位有无肿块、溃疡等不良反应，至接种后14日。并在第14日时全部剖杀，观察各脏器有无病理变化。结果见表4。

表4  对最小使用日龄雏鸭一次单剂量接种的安全试验结果

（2）对雏鸭单剂量重复接种的安全试验将20只3日龄雏鸭随机分成2组，每组10只。第1组肌肉接种鸭坦布苏病毒活疫苗，0.5ml/只（含1羽份），间隔2周后重复接种1次；第2组肌肉接种生理盐水作为对照，0.5ml/只。隔离饲养。重复接种后，每日观察精神状态、饮食及粪便性状，接种部位有无肿块、溃疡等不良反应，至接种后14日。并在第14日时全部剖杀，观察各脏器有无病理变化。结果见表5。

表5  对雏鸭单剂量重复接种的安全试验结果

（3）对雏鸭一次超剂量接种的安全试验将20只3日龄雏鸭随机分为2组，每组10只。第1组肌肉接种鸭坦布苏病毒活疫苗，0.5ml/只（含10羽份）；第2组肌肉接种生理盐水作为对照，0.5ml/只。隔离饲养。每日观察精神状态、饮食及粪便性状，接种部位有无肿块、溃疡等不良反应，至接种后14日。并在第14日时全部剖杀，观察各脏器有无病理变化。结果见表6。

表6  对雏鸭一次超剂量接种的安全试验结果

2.产蛋鸭安全性试验

（1）一次单剂量接种的安全试验将30只180日龄左右产蛋鸭随机分成2组，每组15只。第1组肌肉接种鸭坦布苏病毒活疫苗，0.5ml/只（含1羽份）；第2组肌肉接种生理盐水作为对照，0.5ml/只。隔离饲养。每日观察精神状态、饮食及粪便性状，接种部位有无肿块、溃疡等不良反应，统计产蛋率，至接种后14日。结果见表7。

表7  对产蛋鸭一次单剂量接种的安全性试验结果

（2）单剂量重复接种的安全试验将30只180日龄左右产蛋鸭随机分成2组，每组15只。第1组肌肉接种鸭坛布苏病毒活疫苗，0.5ml/只（含1羽份），间隔2周后重复接种1次；第2组肌肉接种生理盐水作为对照，0.5ml/只，间隔2周后重复接种1次。隔离饲养。每日观察精神状态、饮食及粪便性状，接种部位有无肿块、溃疡等不良反应，统计产蛋率，至接种后14日。结果见表8。

表8  疫苗对产蛋鸭单剂量重复接种的安全性试验结果

（3）一次超剂量接种的安全试验将30只180日龄左右产蛋鸭随机分为2组，每组15只。第1组肌肉接种鸭坦布苏病毒活疫苗，0.5ml/只（含10羽份）；第2组肌肉接种生理盐水作为对照，0.5ml/只。隔离饲养。每日观察精神状态、饮食及粪便性状，接种部位有无肿块、溃疡等不良反应，统计产蛋率，至接种后14日。结果见表9。

表9  疫苗对产蛋鸭一次超剂量接种的安全性试验结果

结果表明，用鸭坦布苏病毒活疫苗免疫雏鸭和产蛋鸭，分别进行一次单剂量接种、单剂量重复接种和一次超剂量接种试验。接种后在14日临床观察期间，接种雏鸭和产蛋鸭的精神、饮食、粪便等均正常，接种部位无肿块、溃疡等不良反应，与对照雏鸭和产蛋鸭无明显差别。雏鸭在接种后第14日剖检，肝脏、脾脏及其它脏器等均无明显病理变化。产蛋鸭在接种后14日临床观察期间，每日统计产蛋率，接种产蛋鸭和对照产蛋鸭的产蛋率无明显差别（在接种后第3日至第5日，疫苗接种组和对照组产蛋鸭产蛋率均略有下降，分析为接种引起的应激反应所致）。说明疫苗对雏鸭和产蛋鸭安全性好。

实施例8

鸭坦布苏病毒活疫苗效力试验

1.雏鸭效力试验

分组及免疫攻毒取3～7日龄健康易感雏鸭50只，随机分成5组，10只/组。第1、2、3组分别经肌肉注射0.5ml鸭坦布苏病毒活疫苗，病毒含量分别为10^4.5TCID₅₀/ml、10^4.0TCID₅₀/ml、10^3.5TCID₅₀/ml，第4、5组不免疫分别作为攻毒对照组和空白对照组,。隔离饲养。免疫后14日以相同方式和剂量进行二次免疫。二次免疫后21日，第1～4组每只雏鸭分别肌肉注射10×10^4.0ELD₅₀WFG36株第5代尿囊液毒，第5组肌肉注射正常SPF鸡胚尿囊液。攻毒后观察5日，记录雏鸭发病情况。

病毒再分离免疫攻毒后5日，将试验鸭全部剖杀，观察、记录组织病变情况。同时取脾脏组织进行病毒分离。

RT-PCR检测脾脏样品病毒再分离时，取死亡胚尿囊液（如果同一份样品接种鸡胚有两枚以上发生死亡时，取其混合尿囊液）进行RT-PCR检测，以验证鸡胚死亡是否为鸭坦布苏病毒WFG36株的特异性致死。

试验结果如下：

（1）临床观察和病理剖检结果

在观察期内疫苗免疫组和空白对照组均未出现临床症状。剖检结果，攻毒对照组出现脾脏肿大、出血、有坏死点，肝脏出血等明显病理变化，10^3.5TCID₅₀/羽疫苗免疫组仅表现脾脏轻微出血，其它剂量疫苗免疫组和空白对照组均无剖检病变。具体结果见表10。

表10  对雏鸭免疫攻毒后的临床观察和病理剖解结果

（2）免疫剂量与攻毒保护率之间的相关性

使用鸭坦布苏病毒活疫苗二次免疫雏鸭，根据免疫攻毒后雏鸭脾脏组织病毒分离结果来看，3批疫苗对雏鸭的免疫保护效果无明显差异。以10^3.5TCID₅₀/羽免疫雏鸭时，攻毒保护率在80%以上，以10^4.0TCID₅₀/羽免疫雏鸭时，攻毒保护率在90%以上，以10^4.5TCID₅₀/羽免疫雏鸭时，攻毒保护率为100%。具体结果见表11。

表11  对雏鸭的免疫攻毒保护效果

2.产蛋鸭效力试验

分组及免疫攻毒取75只产蛋鸭，随机分为5组，15只/组。第1、2、3组分别经肌肉注射0.5ml，病毒含量分别为10^4.5TCID₅₀/ml、10^4.0TCID₅₀/ml、10^3.5TCID₅₀/ml，第4、5组注射生理盐水，分别作为攻毒对照组和空白对照组。隔离饲养。免疫后14日以相同方式和剂量进行二次免疫。二次免疫后21日，第1～4组每只蛋鸭分别肌肉注射5×10^4.0ELD₅₀WFG36株第5代尿囊液毒，第5组肌肉注射正常SPF鸡胚尿囊液。

临床观察攻毒后21日内，每日定时观察，记录产蛋量、采食、发病及死亡等临床表现。

病毒再分离免疫攻毒后第7日，各组随机取5只试验鸭，剖杀，观察、记录组织病变情况。同时分别取卵泡膜进行病毒分离。

RT-PCR检测卵泡膜进行病毒再分离时，取死亡胚尿囊液（如果同一份样品接种鸡胚有两枚以上发生死亡时，取其混合尿囊液）进行RT-PCR检测，以验证鸡胚死亡是否为鸭坦布苏病毒WFG36株的特异性致死。

试验结果如下：

（1）临床观察和病理剖检结果

3批疫苗以不同剂量对产蛋鸭二次免疫后21日攻毒，结果显示，在观察期内10^3.5TCID₅₀/羽以上疫苗免疫组和空白对照组均表现正常；攻毒对照组表现为排浅绿色稀便、食欲下降、走路摇晃等临床症状。剖检结果，10^4.0TCID₅₀/羽以上疫苗免疫组和空白对照组均无病变；10^3.5TCID₅₀/羽疫苗免疫组出现卵泡膜轻微出血，脾脏、肝脏出血等病变；攻毒对照组表现较为严重的卵泡膜充血、出血，卵泡萎缩，脾脏肿大、出血，肝脏、胰腺出血等病理变化。具体结果见表12。

表12  对产蛋鸭免疫攻毒后的临床观察和病理剖解结果

（2）产蛋统计结果

以不同剂量对产蛋鸭二次免疫后21日攻毒，结果显示，在观察期内10^4.5TCID₅₀/羽免疫组、10^4.0TCID₅₀/羽免疫组和空白对照组仅在攻毒后第3、4日出现应激性产蛋下降，第5～6日产蛋恢复正常；10^3.5TCID₅₀/羽疫苗免疫组在攻毒后第3～9日产蛋率一直在66.7%～73.3%（10/15～11/15）之间，第10～12日以后，产蛋基本恢复正常水平（8/10）。攻毒对照组在攻毒后一周内产蛋率由82%下降至33.%，至第9日，产蛋下降至10%，从攻毒后第12日到第21日产蛋一直维持在20%。具体结果见表13。

表13  对产蛋鸭免疫攻毒后的产蛋统计结果

（3）病毒再分离结果

使用鸭坦布苏病毒活疫苗二次免疫产蛋鸭，根据免疫攻毒后产蛋鸭卵泡膜病毒分离结果来看，疫苗对产蛋鸭的免疫保护效果无明显差异。以10^3.5TCID₅₀/羽和10^4.0TCID₅₀/羽免疫产蛋鸭时，攻毒保护率在80%以上，以10^4.5TCID₅₀/羽免疫雏鸭时，攻毒保护率为100%。具体结果见表14。

表14  疫苗对产蛋鸭的免疫攻毒保护效果

试验结果表明：

（1）从对雏鸭免疫攻毒后脾脏病毒再分离结果看，以10^3.5TCID₅₀/羽免疫雏鸭时，攻毒保护率在80%以上，以10^4.0TCID₅₀/羽免疫雏鸭时，攻毒保护率在90%以上，以10^4.5TCID₅₀/羽免疫雏鸭时，攻毒保护率为100%。

（2）对产蛋鸭免疫攻毒后，从卵泡膜病毒再分离结果看，以10^3.5TCID₅₀/羽和10^4.0TCID₅₀/羽免疫产蛋鸭时，攻毒保护率在80%以上，以10^4.5TCID₅₀/羽免疫雏鸭时，攻毒保护率为100%。

（3）效力试验结果显示，鸭坦布苏病毒活疫苗（WF100株）以10^3.5TCID₅₀/羽、10^4.0TCID₅₀/羽和10^4.5TCID₅₀/羽免疫雏鸭和产蛋鸭时，攻毒保护率均能达到80%以上，说明疫苗免疫效果良好。为保证疫苗的临床使用效果，将出厂时标准定为每羽份疫苗病毒含量≥10^4.5TCID₅₀，可达到效力检验标准。

Claims (2)

1.一种鸭坦布苏病毒活疫苗，其特征该疫苗中含有经人工致弱的鸭坦布苏病毒WF100株，该病毒株已于2013年04月12日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.4718。

2.一种制备如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒活疫苗的方法，其特征是将鸭坦布苏病毒WF100株接种生长良好的CEF细胞、VERO细胞和BHK21细胞中任一种细胞单层繁殖，连续观察72～96小时，当细胞病变达80%左右时，收获感染的细胞病毒液，加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，制备成鸭坦布苏病毒活疫苗。