CN102965344A - 用细胞系生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用细胞系生产鸡传染性支气管炎病毒的方法，包括使用如Vero细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、Marc145细胞系、ST细胞系、IBRS-2细胞系，在上述细胞系形成生长良好的细胞单层后，接种鸡传染性支气管炎病毒，并使之吸附于上述细胞系；换用细胞维持液培养后，加入孵育剂对细胞进行孵育20-40分钟，以进行鸡传染性支气管炎病毒的增殖；当CPE达到75％以上时，收获鸡传染性支气管炎病毒。本发明用细胞系生产的鸡传染性支气管炎病毒疫苗的方法，可以实现以更安全、更有效地生产鸡传染性支气管炎病毒及疫苗的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种用细胞系生产的鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎活疫苗或灭活疫苗及其制备方法，属于兽用疫苗领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种高度接触性的病毒性传染病。IBV主要引起鸡的呼吸系统疾病、肾炎并伴随产蛋量和蛋品质的下降。目前防治本病多采用弱毒株IB H120和IB H52的鸡胚组织弱毒苗及IB M41的鸡胚组织灭活苗。虽然目前该苗安全性好，免疫效果理想，但鸡胚苗的生产，需要大量SPF鸡胚，其制备方法除了劳动强度大、产量偏低外，还面临着我国目前SPF鸡胚紧缺的问题。而采用一般鸡胚制苗，不仅可能受鸡胚中母源抗体干扰，使疫苗效价不稳定，而且胚源性病原体极易随着疫苗的研制、生产和发放使用造成某些疫病的人为传播。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用细胞系生产的鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎活疫苗或灭活疫苗的方法及产品，以实现以更安全、更有效地生产鸡传染性支气管炎病毒及疫苗的目的。
技术方案
本发明提供一种用细胞系生产鸡传染性支气管炎病毒的方法，包括以下步骤：
1)将细胞系经消化传代，以细胞生长液进行培养，形成生长良好的细胞单层；
2)将鸡传染性支气管炎病毒接种于上述细胞单层，进行鸡传染性支气管炎病毒的吸附；
3)将上述吸附病毒的细胞，换用细胞维持液培养，进行鸡传染性支气管炎病毒的增殖；
4)当CPE达到75％以上时，收获鸡传染性支气管炎病毒。
优选地，本发明所述细胞系为Vero细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、Marc145细胞系、ST细胞系、IBRS-2细胞系任意一种或几种细胞系。
优选地，本发明所述细胞系为Vero细胞系。
优选地，本发明步骤2)中在接种病毒后，还包括加入孵育剂对细胞进行孵育20-40分钟的过程。
优选地，本发明所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖。
更优选地，本发明所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖。
优选地，本发明所述的孵育时间为30分钟。
优选地，本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒是鸡传染性支气管炎病毒H120株、H52株、M41株。
优选地，本发明步骤2)中接种用的鸡传染性支气管炎病毒是在鸡胚中传代获得的鸡传染性支气管炎病毒。
由上可见，本发明可以获得一种根据上述所述的方法制备的鸡传染性支气管炎病毒，所述病毒为使用细胞系生产的鸡传染性支气管炎病毒。
本发明另一目的在于提供一种用细胞系生产鸡传染性支气管炎灭活疫苗的方法，包括使用上述方法获得的鸡传染性支气管炎病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为鸡传染性支气管炎灭活疫苗。
由上可见，本发明可以获得一种鸡传染性支气管炎疫苗，所述疫苗为使用细胞系生产鸡传染性支气管炎灭活疫苗。
本发明另一目的在于提供一种用细胞系生产鸡传染性支气管炎活疫苗的方法，包括使用上述方法获得的鸡传染性支气管炎病毒，加入冻干保护剂，制备为鸡传染性支气管炎活疫苗。
由上可见，本发明可以获得一种鸡传染性支气管炎活疫苗，其特征在于，使用细胞系生产鸡传染性支气管炎灭活疫苗。
由上面的技术方案及本发明后续的具体实施方式可以看出，发明人意外地发现在鸡传染性支气管炎病毒繁殖时对细胞进行孵育可以帮助鸡传染性支气管炎病毒适应细胞系，使得用细胞系繁殖鸡传染性支气管炎病毒成为了可能，从而实现了用细胞系生产鸡传染性支气管炎疫苗。而在现有技术中，国内外无论使用Vero细胞、BHK-21细胞、PK-15细胞、Marc145细胞、ST细胞、IBRS-2细胞等何种细胞或细胞系，或者使用同步培养、带毒传代等方法，都没有实现鸡传染性支气管炎病毒在细胞系(细胞)中获得有效的增殖，并达到利用细胞系生产鸡传染性支气管炎病毒或疫苗的程度。
其次，发明人还发现在传染性支气管炎病毒接种细胞前可先在鸡胚上进行传代，可以帮助传染性支气管炎病毒更容易适应于细胞系，促进病毒在细胞系的增殖并加快产生细胞病变的速度及提高细胞生产传染性支气管炎病毒的滴度和质量。
具体实施方式
本发明实施例中使用了常见的商业化的容易培养的细胞系如Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、BHK-21细胞(幼仓鼠肾传代细胞)、PK-15细胞(猪肾细胞)、Marc145细胞(上皮样细胞，来源于猴肾细胞)、ST细胞(猪睾丸细胞)、IBRS-2细胞(猪肾细胞)等细胞或细胞系生产鸡传染性支气管炎病毒及疫苗。
本发明实施例中接种用的鸡传染性支气管炎病毒优选使用鸡胚传代适应的鸡传染性支气管炎病毒，或优选使用细胞系生产获得的鸡传染性支气管炎病毒；但是使用鸡胚传代适应的或细胞系生产的鸡传染性支气管炎病毒用于接种，其目的仅为了提高接种用的鸡传染性支气管炎病毒的效价，并使得接种用的鸡传染性支气管炎病毒更适应在细胞中生长，以及使鸡传染性支气管炎病毒在细胞上能更快的出现细胞病变，获得的鸡传染性支气管炎病毒的滴度更高、鸡传染性支气管炎疫苗的效力更佳。因此，本发明的接种用鸡传染性支气管炎病毒并不限于使用经鸡胚传代适应的鸡传染性支气管炎以及经细胞系培养的鸡传染性支气管炎病毒，其他来源的鸡传染性支气管炎病毒如组织来源的鸡传染性支气管炎病毒液也可以用于接种细胞系生产鸡传染性支气管炎病毒及疫苗。
本发明的细胞培养液中血清为牛血清，优选胎牛血清，其他的动物性血清如兔血清、羊血清等均可以作为细胞培养液。
本发明的疫苗为灭活疫苗或活疫苗。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1 Vero细胞生产鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎灭活疫苗
本实施例中，选择Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，作为生产鸡传染性支气管炎病毒与鸡传染性支气管炎灭活疫苗的细胞系，鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：94％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：99％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，1％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2。
以下为使用Vero细胞生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗的具体步骤：
1.生产用鸡传染性支气管炎病毒种的制备：首先可先将鸡传染性支气管炎病毒M41株用无菌pH7.2磷酸盐缓冲液按体积比1∶100倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有SPF鸡胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，用SPF鸡胚连续传10代，无菌收集尿囊液并以3000rpm高速4℃离心50min，取上清液即为所需的鸡传染性支气管炎病毒(经测定，鸡胚毒力为108EID50/ml)，备用。
将Vero细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；接种100倍稀释的上述步骤制备的鸡传染性支气管炎病毒，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时CPE达到75％时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-20℃保存，作为生产用毒种。
2.制苗用鸡传染性支气管炎病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡传染性支气管炎病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡传染性支气管炎病毒，具体步骤为：
将上述细胞生长液培养获得的生长良好的Vero细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在Vero细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时CPE达到75％时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡传染性支气管炎病毒液。
制苗用鸡传染性支气管炎病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验及EID50的测定，每1ml病毒液的病毒含量为108EID50，且对1％的鸡红细胞无凝集。将得到的鸡传染性支气管炎病毒液置于-20℃进行保存。
3.疫苗的制备：在上述收获的鸡传染性支气管炎病毒加入40％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％v/v。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡传染性支气管炎疫苗，分装后2～8℃保存即可完成鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备。具体步骤如下：
水相制备：将灭活后的鸡传染性支气管炎抗原加4％体积比吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。
油相制备：白油94份、司本-80 6份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。
乳化：按油相∶水相＝2∶1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为9,000～13,000rpm，温度10～20℃的情况下，将水相以0.6ml/s的速度加入油相中，再继续以速度13,500～17,500rpm乳化3～7min，获得鸡传染性支气管炎灭活疫苗。制备获得三批鸡传染性支气管炎灭活疫苗，批号为2010601、2010602、2010603，其中每羽份中病毒灭活前含量为5×107EID50。
4.鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全性及效力检验
1).安全性试验
用3周龄的SPF鸡，肌肉注射2ml(4羽份)。疫苗注射后部分试验鸡出现短时间精神不振，1-2小时后即恢复正常。共观察3周，所有试验鸡精神良好，吃喝正常。3周后捕杀。所有脏器未见异常变化，注射部位未见异常，无肿胀溃烂现象。试验证明疫苗安全，结果如表1。
表1 鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全检验结果
注：“-”表示无反应。
2).效力检验
每批疫苗用3周龄SPF鸡10只，肌肉注射疫苗0.3ml，另5只不接种作为对照。接种后35日，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。结果显示免疫组HI抗体效价的几何平均值均高于1∶64，对照组HI抗体效价的几何平均值均低于1∶8。详细结果见表2。
表2 鸡传染性支气管炎灭活疫苗效力检验结果
实施例2 Vero细胞生产鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎活疫苗
本实施例中，选择非洲绿猴肾细胞系Vero细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)作为生产鸡传染性支气管炎病毒与鸡传染性支气管炎活疫苗的细胞系，鸡传染性支气管炎病毒H120株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：94％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：99％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，1％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2。
以下为使用Vero细胞生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗的具体步骤：
1.生产用鸡传染性支气管炎病毒种的制备：首先，先将鸡传染性支气管炎病毒H120株，用无菌pH7.2磷酸盐缓冲液按体积比1∶100倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有活SPF鸡胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，用SPF鸡胚连续传10代，无菌收集尿囊液并以3000rpm高速4℃离心50min取上清液即为所需的鸡传染性支气管炎病毒(对鸡胚毒力为108EID50/ml)，备用。
将Vero细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；接种100倍稀释的上述步骤制备的鸡传染性支气管炎病毒，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时CPE达到75％时(或细胞单层出现75％圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-20℃保存，作为生产用毒种。
2.制苗用鸡传染性支气管炎病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡传染性支气管炎病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡传染性支气管炎病毒，具体步骤为：
将上述细胞生长液培养获得的生长良好的Vero细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在Vero细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时CPE达到75％时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡传染性支气管炎病毒液。
制苗用鸡传染性支气管炎病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验及EID50的测定，每1ml病毒液的病毒含量为108EID50，且对1％的鸡红细胞无凝集。将得到的鸡传染性支气管炎病毒液置于-20℃进行保存。
3.活疫苗的制备：经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液混合后，再与蔗糖明胶保护剂按9∶1(病毒液∶保护剂)配苗，冻干保护剂以40℃-50℃为宜(8％明胶、40％蔗糖保护剂，经115℃高压灭菌40分钟，放4℃保存，72小时内用完)。在添加的过程中应摇动病毒液，充分混合均匀后，即为鸡传染性支气管炎活疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封即可得到鸡传染性支气管炎冻干活疫苗。制备三批样品，批号为2010611、2010612、2010613，其中每羽份中病毒含量为104EID50。
4.鸡传染性支气管炎活疫苗安全性及效力检验
1)安全性试验
用4-7日龄SPF雏鸡40只，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，将上述10羽份的冻干活疫苗稀释至0.1ml的剂量，实验组滴鼻接种稀释好的疫苗0.1ml，对照组注射等量的生理盐水，在相同条件下饲养管理，观察30日。结果显示，该疫苗安全可靠，所有雏鸡生理活动正常，剖检无传染性支气管炎特异病变。详情见表3。
表3 鸡传染性支气管炎活疫苗安全检验结果
| 批号 | 雏鸡数 | 接种剂量 | 精神状况及采食 | 临床反应 | 病理变化 |
| 2010611 | 10 | 0.1ml(10羽份) | 正常 | 无 | 无 |
| 2010612 | 10 | 0.1ml(10羽份) | 正常 | 无 | 无 |
| 2010613 | 10 | 0.1ml(10羽份) | 正常 | 无 | 无 |
| 对照组 | 10 | 0.1ml(生理盐水) | 正常 | 无 | 无 |
2)效力检验
用1-3日龄SPF雏鸡40只，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，每只滴鼻一个使用剂量的疫苗，对照组滴鼻生理盐水1-2滴，10-14日后，连同对照鸡10只，用10倍稀释的M41强毒滴鼻(EID50为107/ml)，每只鸡1-2滴，观察10日。对照鸡全发病，均出现精神萎靡，羽毛松乱等传染性支气管炎临床症状，在观察期内全部死亡，解剖后支气管、肺脏有充血、出血等病变。免疫鸡完全保护，观察期结束后剖检均未发现特异性病理变化。结果见表4。
表4 鸡传染性支气管炎活疫苗效力检验结果
| 批号 | 免疫鸡只 | 免疫保护率 | 死亡率 |
| 2010611 | 10 | 10/10 | 0/10 |
| 2010612 | 10 | 10/10 | 0/10 |
| 2010613 | 10 | 10/10 | 0/10 |
| 对照组 | 10 | 0/10 | 10/10 |
实施例3 Vero细胞生产鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎活疫苗
本实施例中，选择非洲绿猴肾细胞系Vero细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)作为生产鸡传染性支气管炎病毒与鸡传染性支气管炎活疫苗的细胞系，鸡传染性支气管炎病毒H52株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：94％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：99％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，1％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2。
以下为使用Vero细胞生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗的具体步骤：
1.生产用鸡传染性支气管炎病毒种的制备：首先可先将鸡传染性支气管炎病毒H52株用无菌pH7.2磷酸盐缓冲液按体积比1∶100倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，用SPF鸡胚连续传10代，无菌收集尿囊液并以3000rpm高速4℃离心50min取上清液即为所需的鸡传染性支气管炎病毒(对鸡胚毒力为108EID50/ml)，备用。
将Vero细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；接种100倍稀释的上述步骤制备的鸡传染性支气管炎病毒，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现75％圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-20℃保存，作为生产用毒种。
2.制苗用鸡传染性支气管炎病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡传染性支气管炎病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡传染性支气管炎病毒，具体步骤为：
将上述细胞生长液培养获得的生长良好的Vero细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在Vero细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡传染性支气管炎病毒液。
制苗用鸡传染性支气管炎病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验及EID50的测定，每1ml病毒液的病毒含量为108EID50，且对1％的鸡红细胞无凝集。将得到的鸡传染性支气管炎病毒液置于-20℃进行保存。
3.疫苗的制备：经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液混合后再与蔗糖明胶保护剂按9∶1(病毒液∶保护剂)配苗，冻干保护剂以40℃-50℃为宜(8％明胶、40％蔗糖保护剂，经115℃高压灭菌40分钟，放4℃保存，72小时内用完)。在添加的过程中应摇动病毒液，充分混合均匀后，即为疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封即可得到鸡传染性支气管炎冻干活疫苗。制备三批活疫苗，批号为2010621、2010622、2010623，其中每羽份中病毒含量为104EID50。
4.鸡传染性支气管炎活疫苗安全性及效力检验
安全性试验
用25-35日龄SPF雏鸡40只，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，将上述10羽份疫苗稀释至0.1ml的剂量，实验组滴鼻接种稀释好的疫苗0.1ml，对照组注射等量的生理盐水，在相同条件下饲养管理，观察30日。结果显示，该疫苗安全可靠，所有雏鸡生理活动正常，剖检无传染性支气管炎特异病变。详情见表5。
表5 鸡传染性支气管炎活疫苗安全检验结果
| 批号 | 雏鸡数 | 接种剂量 | 精神状况及采食 | 临床反应 | 病理变化 |
| 2010621 | 10 | 0.1ml(10羽份) | 正常 | 无 | 无 |
| 2010622 | 10 | 0.1ml(10羽份) | 正常 | 无 | 无 |
| 2010623 | 10 | 0.1ml(10羽份) | 正常 | 无 | 无 |
| 对照组 | 10 | 0.1ml(生理盐水) | 正常 | 无 | 无 |
效力检验：
用21日龄SPF鸡40只，每批疫苗使用10只，对照组鸡10只，每只滴鼻一个使用剂量的疫苗，对照组滴鼻生理盐水1-2滴，14日后，连同对照鸡10只，采血并分离血清，按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)要求测定血清的中和抗体效价。经血清中和抗体效价检测，免疫组均达到1∶16以上，符合《规程》要求(＞1∶8)的质量标准，对免疫鸡群有很好的保护作用。对照组检测不到抗体。结果见表6。
表6 鸡传染性支气管炎活疫苗效力检验结果
实施例4
BHK-21细胞生产鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎灭活疫苗
本实施例中，选择幼仓鼠肾细胞系BHK-21细胞(购自中国兽医药品监察所)作为生产鸡传染性支气管炎病毒与鸡传染性支气管炎灭活疫苗的细胞系，鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：95％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，5％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：99％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，1％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2。
以下为使用BHK-21细胞生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗的具体步骤：
1.生产用鸡传染性支气管炎病毒种的制备：首先可先将鸡传染性支气管炎病毒M41株用无菌pH7.2磷酸盐缓冲液按体积比1∶100倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有活胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，用SPF鸡胚连续传10代，无菌收集尿囊液并以3000rpm高速4℃离心50min取上清液即为所需的鸡传染性支气管炎病毒(对鸡胚毒力为108EID50/ml)，备用。
将BHK-21细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；接种100倍稀释的上述步骤制备的鸡传染性支气管炎病毒，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-20℃保存，作为生产用毒种。
2.制苗用鸡传染性支气管炎病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡传染性支气管炎病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡传染性支气管炎病毒，具体步骤为：
将上述细胞生长液培养获得的生长良好的BHK-21细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在BHK-21细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡传染性支气管炎病毒液。
制苗用鸡传染性支气管炎病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验及EID50的测定，每1ml病毒液的病毒含量为108EID50，且对1％的鸡红细胞无凝集。将得到的鸡传染性支气管炎病毒液置于-20℃进行保存。
3.疫苗的制备：在上述收获的含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液加入40％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡传染性支气管炎疫苗，分装后2～8℃保存即可完成鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备。具体步骤如下：
水相制备：将灭活后的鸡传染性支气管炎抗原加4％体积比吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。
油相制备：白油94份、司本-80 6份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。
乳化：按油相∶水相＝2∶1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为9,000～13,000rpm，温度10～20℃的情况下，将水相以0.6ml/s的速度加入油相中，再继续以速度13,500～17,500rpm乳化3～7min，获得鸡传染性支气管炎灭活疫苗。制备三批灭活疫苗，批号为2010701、2010702、2010703，其中每羽份中病毒灭活前含量为5×107EID50。
4.鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全性及效力检验
安全性试验
用3周龄的SPF鸡，肌肉注射2ml(4羽份)。疫苗注射后部分试验鸡出现短时间精神不振，1-2小时后即恢复正常。共观察3周，所有试验鸡精神良好，吃喝正常。3周后捕杀。所有脏器未见异常变化，注射部位未见异常，无肿胀溃烂现象。试验证明疫苗安全，结果如表7。
表7 鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全检验结果
注：“-”表示无反应。
效力检验
每批疫苗用3周龄SPF鸡10只，肌肉注射疫苗0.3ml，另5只不接种作为对照。接种后35日，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。结果显示免疫组HI抗体效价的几何平均值均高于1∶64，对照组HI抗体效价的几何平均值均低于1∶8。详细结果见表8.
表8 鸡传染性支气管炎灭活疫苗效力检验结果
实施例5 PK-15细胞生产鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎灭活疫苗
本实施例中，选择猪肾细胞系PK-15细胞(购自中国兽医药品监察所)作为生产鸡传染性支气管炎病毒与鸡传染性支气管炎灭活疫苗的细胞系，鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：94％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：99％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，1％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2。
以下为使用PK-15细胞生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗的具体步骤：
1.生产用鸡传染性支气管炎病毒种的制备：首先可先将鸡传染性支气管炎病毒M41株用无菌pH7.2磷酸盐缓冲液按体积比1∶100倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，用SPF鸡胚连续传10代，无菌收集尿囊液并以3000rpm高速4℃离心50min取上清液即为所需的鸡传染性支气管炎病毒(对鸡胚毒力为108EID50/ml)，备用。
将PK-15细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；接种100倍稀释的上述步骤制备的鸡传染性支气管炎病毒，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-20℃保存，作为生产用毒种。
2.制苗用鸡传染性支气管炎病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡传染性支气管炎病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡传染性支气管炎病毒，具体步骤为：
将上述细胞生长液培养获得的生长良好的PK-15细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在PK-15细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡传染性支气管炎病毒液。
制苗用鸡传染性支气管炎病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验及EID50的测定，每1ml病毒液的病毒含量为108EID50，且对1％的鸡红细胞无凝集。将得到的鸡传染性支气管炎病毒液置于-20℃进行保存。
3.疫苗的制备：在上述收获的含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液加入40％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡传染性支气管炎疫苗，分装后2～8℃保存即可完成鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备。具体步骤如下：
水相制备：将灭活后的鸡传染性支气管炎抗原加4％体积比吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。
油相制备：白油94份、司本-80 6份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。
乳化：按油相∶水相＝2∶1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为9,000～13,000rpm，温度10～20℃的情况下，将水相以0.6ml/s的速度加入油相中，再继续以速度13,500～17,500rpm乳化3～7min，获得鸡传染性支气管炎灭活疫苗。制备三批灭活疫苗，批号为2010801、2010802、2010803，其中每羽份中病毒灭活前含量为5×107EID50。
4.鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全性及效力检验
安全性试验
用3周龄的SPF鸡，肌肉注射2ml(4羽份)。疫苗注射后部分试验鸡出现短时间精神不振，1-2小时后即恢复正常。共观察3周，所有试验鸡精神良好，吃喝正常。3周后捕杀。所有脏器未见异常变化，注射部位未见异常，无肿胀溃烂现象。试验证明疫苗安全，结果如表9。
表9 鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全检验结果
注：“-”表示无反应。
效力检验
每批疫苗用3周龄SPF鸡10只，肌肉注射疫苗0.3ml，另5只不接种作为对照。接种后35日，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。结果显示免疫组HI抗体效价的几何平均值均高于1∶64，对照组HI抗体效价的几何平均值均低于1∶8。详细结果见表10。
表10 鸡传染性支气管炎灭活疫苗效力检验结果
实施例6 Marc 145细胞生产鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎灭活疫苗
本实施例中，选择Marc 145细胞(上皮样细胞，来源于猴肾细胞，购自中国兽医药品监察所)作为生产鸡传染性支气管炎病毒与鸡传染性支气管炎灭活疫苗的细胞系，鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：94％v/vDMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：98％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，2％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2。
以下为使用Marc 145细胞生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗的具体步骤：
1.生产用鸡传染性支气管炎病毒种的制备：首先可先将鸡传染性支气管炎病毒M41株用无菌pH7.2磷酸盐缓冲液按体积比1∶100倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，用SPF鸡胚连续传10代，无菌收集尿囊液并以3000rpm高速4℃离心50min取上清液即为所需的鸡传染性支气管炎病毒(对鸡胚毒力为108EID50/ml)，备用。
将Marc 145细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；接种100倍稀释的上述步骤制备的鸡传染性支气管炎病毒，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-20℃保存，作为生产用毒种。
2.制苗用鸡传染性支气管炎病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡传染性支气管炎病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡传染性支气管炎病毒，具体步骤为：
将上述细胞生长液培养获得的生长良好的Marc 145细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在Marc 145细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡传染性支气管炎病毒液。
制苗用鸡传染性支气管炎病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验及EID50的测定，每1ml病毒液的病毒含量为108EID50，且对1％的鸡红细胞无凝集。将得到的鸡传染性支气管炎病毒液置于-20℃进行保存。
3.疫苗的制备：在上述收获的含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液加入40％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡传染性支气管炎疫苗，分装后2～8℃保存即可完成鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备。具体步骤如下：
水相制备：将灭活后的鸡传染性支气管炎抗原加4％体积比吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。
油相制备：白油94份、司本-80 6份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。
乳化：按油相∶水相＝2∶1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为9,000～13,000rpm，温度10～20℃的情况下，将水相以0.6ml/s的速度加入油相中，再继续以速度13,500～17,500rpm乳化3～7min，获得鸡传染性支气管炎灭活疫苗。制备三批，批号为2010901、2010902、2010903，其中每羽份中病毒灭活前含量为5×107EID50。
4.鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全性及效力检验
安全性试验
用3周龄的SPF鸡，肌肉注射2ml(4羽份)。疫苗注射后部分试验鸡出现短时间精神不振，1-2小时后即恢复正常。共观察3周，所有试验鸡精神良好，吃喝正常。3周后捕杀。所有脏器未见异常变化，注射部位未见异常，无肿胀溃烂现象。试验证明疫苗安全，结果如表11。
表11 鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全检验结果
注：“-”表示无反应。
效力检验
每批疫苗用3周龄SPF鸡10只，肌肉注射疫苗0.3ml，另5只不接种作为对照。接种后35日，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。结果显示免疫组HI抗体效价的几何平均值均高于1∶64，对照组HI抗体效价的几何平均值均低于1∶8。详细结果见表12.
表12 鸡传染性支气管炎灭活疫苗效力检验结果
实施例7
ST细胞生产鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎灭活疫苗
本实施例中，选择猪睾丸细胞系ST细胞(购自中国典型培养物保藏中心)作为生产鸡传染性支气管炎病毒与鸡传染性支气管炎灭活疫苗的细胞系，鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：95％v/vα-MEM(Invitrogen公司生产)液，5％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：99％v/vα-MEM(Invitrogen公司生产)液，1％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2。
以下为使用ST细胞生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗的具体步骤：
1.生产用鸡传染性支气管炎病毒种的制备：首先可先将鸡传染性支气管炎病毒M41株用无菌pH7.2磷酸盐缓冲液按体积比1∶100倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有活胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，用SPF鸡胚连续传10代，无菌收集尿囊液并以3000rpm高速4℃离心50min取上清液即为所需的鸡传染性支气管炎病毒(对鸡胚毒力为108EID50/ml)，备用。
将ST细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；接种100倍稀释的上述步骤制备的鸡传染性支气管炎病毒，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-20℃保存，作为生产用毒种。
2.制苗用鸡传染性支气管炎病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡传染性支气管炎病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡传染性支气管炎病毒，具体步骤为：
将上述细胞生长液培养获得的生长良好的ST细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在ST细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡传染性支气管炎病毒液。
制苗用鸡传染性支气管炎病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验及EID50的测定，每1ml病毒液的病毒含量为108EID50，且对1％的鸡红细胞无凝集。将得到的鸡传染性支气管炎病毒液置于-20℃进行保存。
3.疫苗的制备：在上述收获的含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液加入40％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡传染性支气管炎疫苗，分装后2～8℃保存即可完成鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备。具体步骤如下：
水相制备：将灭活后的鸡传染性支气管炎抗原加4％体积比吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。
油相制备：白油94份、司本-80 6份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。
乳化：按油相∶水相＝2∶1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为9,000～13,000rpm，温度10～20℃的情况下，将水相以0.6ml/s的速度加入油相中，再继续以速度13,500～17,500rpm乳化3～7min，获得鸡传染性支气管炎灭活疫苗。制备三批，批号为2010101、2010102、2010103，其中每羽份中病毒灭活前含量为5×107EID50。
4.鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全性及效力检验
安全性试验
用3周龄的SPF鸡，肌肉注射2ml(4羽份)。疫苗注射后部分试验鸡出现短时间精神不振，1-2小时后即恢复正常。共观察3周，所有试验鸡精神良好，吃喝正常。3周后捕杀。所有脏器未见异常变化，注射部位未见异常，无肿胀溃烂现象。试验证明疫苗安全，结果如表13。
表13 鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全检验结果
注：“-”表示无反应。
效力检验
每批疫苗用3周龄SPF鸡10只，肌肉注射疫苗0.3ml，另5只不接种作为对照。接种后35日，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。结果显示免疫组HI抗体效价的几何平均值均高于1∶64，对照组HI抗体效价的几何平均值均低于1∶8。详细结果见表14.
表14 鸡传染性支气管炎灭活疫苗效力检验结果
实施例8 IBRS-2细胞生产鸡传染性支气管炎病毒及鸡传染性支气管炎灭活疫苗
本实施例中，选择猪肾细胞系IBRS-2细胞(购自中国兽医药品监察所)作为生产鸡传染性支气管炎病毒与鸡传染性支气管炎灭活疫苗的细胞系，鸡传染性支气管炎病毒M41株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：95％v/v MEM41500(Invitrogen公司生产)液，5％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：99％v/v MEM41500(Invitrogen公司生产)液，1％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2。
以下为使用IBRS-2细胞生产鸡传染性支气管炎病毒与疫苗的具体步骤：
1.生产用鸡传染性支气管炎病毒种的制备：首先可先将鸡传染性支气管炎病毒M41株用无菌pH7.2磷酸盐缓冲液按体积比1∶100倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，弃去24h前死胚，36h后取出所有活胚放入4℃冰箱过夜，收集尿囊液，用SPF鸡胚连续传10代，无菌收集尿囊液并以3000rpm高速4℃离心50min取上清液即为所需的鸡传染性支气管炎病毒(对鸡胚毒力为108EID50/ml)，备用。
将IBRS-2细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；接种100倍稀释的上述步骤制备的鸡传染性支气管炎病毒，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-20℃保存，作为生产用毒种。
2.制苗用鸡传染性支气管炎病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡传染性支气管炎病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡传染性支气管炎病毒，具体步骤为：
将上述细胞生长液培养获得的生长良好的IBRS-2细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在IBRS-2细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖(浓度为300mmol/L)孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时CPE达到75％以上(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡传染性支气管炎病毒液。
制苗用鸡传染性支气管炎病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验及EID50的测定，每1ml病毒液的病毒含量为108EID50，且对1％的鸡红细胞无凝集。将得到的鸡传染性支气管炎病毒液置于-20℃进行保存。
3.疫苗的制备：在上述收获的含有鸡传染性支气管炎病毒的培养液加入40％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡传染性支气管炎疫苗，分装后2～8℃保存即可完成鸡传染性支气管炎灭活疫苗的制备。具体步骤如下：
水相制备：将灭活后的鸡传染性支气管炎抗原加4％体积比吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。
油相制备：白油94份、司本-80 6份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。
乳化：按油相∶水相＝2∶1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为9,000～13,000rpm，温度10～20℃的情况下，将水相以0.6ml/s的速度加入油相中，再继续以速度13,500～17,500rpm乳化3～7min，获得鸡传染性支气管炎灭活疫苗。制备三批，批号为2010201、2010202、2010203，其中每羽份中病毒灭活前含量为5×107EID50。
4.鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全性及效力检验
安全性试验
用3周龄的SPF鸡，肌肉注射2ml(4羽份)。疫苗注射后部分试验鸡出现短时间精神不振，1-2小时后即恢复正常。共观察3周，所有试验鸡精神良好，吃喝正常。3周后捕杀。所有脏器未见异常变化，注射部位未见异常，无肿胀溃烂现象。试验证明疫苗安全，结果如表15。
表15 鸡传染性支气管炎灭活疫苗安全检验结果
注：“-”表示无反应。
效力检验
每批疫苗用3周龄SPF鸡10只，肌肉注射疫苗0.3ml，另5只不接种作为对照。接种后35日，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定。结果显示免疫组HI抗体效价的几何平均值均高于1∶64，对照组HI抗体效价的几何平均值均低于1∶8。详细结果见表16.
表16 鸡传染性支气管炎灭活疫苗效力检验结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种用细胞系生产鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将细胞系经消化传代，以细胞生长液进行培养，形成生长良好的细胞单层；
2)将鸡传染性支气管炎病毒接种于上述细胞单层，进行鸡传染性支气管炎病毒的吸附；
3)将上述吸附病毒的细胞，换用细胞维持液培养，进行鸡传染性支气管炎病毒的增殖；
4)当CPE达到75％以上时，收获鸡传染性支气管炎病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞系为Vero细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、Marc145细胞系、ST细胞系、IBRS-2细胞系任意一种或几种细胞系。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中在接种病毒后，还包括加入孵育剂对细胞进行孵育20-40分钟的过程。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的孵育时间为30分钟。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的鸡传染性支气管炎病毒是鸡传染性支气管炎病毒H120株、H52株、M41株的一种或几种。
7.根据权利要求1～6所述的方法，其特征在于，步骤2)中接种用的鸡传染性支气管炎病毒是在鸡胚中传代获得的鸡传染性支气管炎病毒。
8.一种根据权利要求1～7任意一项所述的方法制备的鸡传染性支气管炎病毒，其特征在于，使用细胞系生产鸡传染性支气管炎病毒。
9.一种用细胞系生产鸡传染性支气管炎灭活疫苗的方法，其特征在于，使用权利要求8所述的鸡传染性支气管炎病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为鸡传染性支气管炎灭活疫苗。
10.一种根据权利要求9所述的方法制备的鸡传染性支气管炎灭活疫苗，其特征在于，使用细胞系生产鸡传染性支气管炎灭活疫苗。
11.一种用细胞系生产鸡传染性支气管炎活疫苗的方法，其特征在于，使用权利要求8所述的鸡传染性支气管炎病毒，加入冻干保护剂，制备为鸡传染性支气管炎活疫苗。
12.一种根据权利要求11所述的方法制备的鸡传染性支气管炎活疫苗，其特征在于，使用细胞系生产鸡传染性支气管炎活疫苗。
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