CN102220290A

CN102220290A - 一种鸭黄病毒细胞培养方法

Info

Publication number: CN102220290A
Application number: CN2011101368587A
Authority: CN
Inventors: 傅光华; 黄瑜; 施少华; 万春和; 程龙飞; 陈红梅; 林建生; 林芳
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明提供了一种鸭黄病毒细胞培养方法，该方法以贴壁生长的乳仓鼠肾细胞BHK21接种附着于细胞培养容器的表面，形成单细胞层，然后以病毒接种单细胞层，接种了病毒的单层细胞置于37℃的5%CO₂培养箱中培养，将细胞培养物作为下一轮传代的接种物，依次连续传代。根据本发明提供的细胞培养方法，病毒在细胞单层上连续传代5-7代后，可获得稳定的增殖，在接种细胞3-4天后，可形成明显的细胞病变。为研究病毒的生物学特性，病毒致病的分子基础及有效防控该病而开展的疫苗研究提供便利、直观的病毒操作平台。

Description

一种鸭黄病毒细胞培养方法

技术领域

本发明涉及一种鸭黄病毒的细胞培养方法，适用于该病毒的分离培养和增殖，属于生物技术领域。

背景技术

2010年4月以来，我国江苏、浙江、福建、山东、上海、河南、江西、河北、北京等多个地区饲养的开产种鸭和蛋鸭暴发了一种以食欲急剧减退、产蛋量骤降为主要特征的疫病，对我国养鸭业造成的经济损失高达30亿元。流行病学调查表明该病毒主要危害樱桃谷种鸭、半番鸭母本、各种开产的蛋用鸭、野鸭等，尤其对开产蛋鸭，群内发病率几乎100%，病死率为0-12%不等；产蛋鸭产蛋量从高产蛋率（如80%-95%）迅速下降至10%-30%、严重的甚至停产，刚开产种（蛋）鸭产蛋率上升缓慢或减蛋，长时间低产蛋率或无产蛋高峰出现。剖检病变主要为卵泡膜出血、充血，卵泡变形萎缩等，部分出现脑膜出血。对从表现产蛋骤降的病死鸭中采集样品进行病原分离鉴定，对所获得的病毒进行形态学观察、理化特性测定、动物回归实验和部分基因序列分析表明，该病毒为黄病毒科黄病毒属的成员，遗传进化分析表明与坦布苏病毒（Tembusu virus）亲缘关系最近（见参考文献1,2）。

黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）的成员多为虫媒病毒，较常见的有日本脑炎病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒和圣路易脑炎病毒等，这些病毒通过蚊虫或蜱叮咬吸血在人与动物间造成疾病流行，从而引起人和动物严重的自然疫源性疾病，又被称为动物源性人畜共患病病毒。鉴于黄病毒具有重要的公共卫生意义，应加紧对该病毒开展分子流行病学及分子致病机理等相关研究。由于引起种（蛋）鸭产蛋骤降的黄病毒为我国首次报道，目前对其仅开展了部分病原生物学特性和检测方法的研究，主要通过鸭胚或鸡胚进行分离鉴定和培养增殖，该技术不能满足开展病毒分子生物学研究的需求，目前尚未能找到合适的细胞培养方法，大大限制了对其开展分子致病机理及基因工程疫苗研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种适合鸭黄病毒增殖的鸭黄病毒细胞培养方法，为进一步开展病毒的分子致病机理和基因工程疫苗研究提供一个稳定，便利的操作平台。

本发明采取的技术方案如下：

本发明的一种鸭黄病毒细胞培养方法，以贴壁生长的乳仓鼠肾细胞BHK21接种附着于细胞培养容器的表面，形成单细胞层，然后以病毒接种单细胞层，接种了病毒的单层细胞置于37℃的5% CO₂培养箱中培养，将细胞培养物作为下一轮传代的接种物，依次连续传代。

具体培养步骤如下：

1) 用细胞培养容器培养BHK21细胞使之形成单细胞层；

2) 将种毒接种于BHK21细胞上, 放置37℃的5% CO₂培养箱中感作45-60min，期间每隔10min摇匀1次，第一轮种毒为鸭黄病毒；

3) 用无菌PBS缓冲液清洗未吸附的病毒，弃去洗液，重复1-2次；

4) 加入12-15mL细胞维持液，置于37℃，5%CO₂培养；

5) 观察细胞状态及病变情况；

6) 于连续培养第5d或出现严重的细胞病变后，将细胞培养物冻融3次，取细胞培养物作种毒进行下一轮传代, 重复1-6步骤。

所述细胞维持液为含2-3%胎牛血清及1%双抗的DMEM。

本发明的有益效果：

根据本发明提供的细胞培养方法，病毒在细胞单层上连续传代5-7代后，可获得稳定的增殖，在接种细胞3-4天后，可形成明显的细胞病变。

根据本发明的细胞培养方法，能为研究病毒的生物学特性，病毒致病的分子基础及有效防控该病而开展的疫苗研究提供便利、直观的病毒操作平台。

附图说明

图1病毒感染BHK21细胞。其中A: 对照细胞细胞接种磷酸盐缓冲液（PBS）,细胞未出现病变；B:BHK21细胞感染病毒后60h开始出现细胞病变，96h后出现大量的细胞圆缩、脱落；

图2. PCR检测不同代次的BHK21细胞培养物，结果表明，病毒在BHK21细胞上传3代后，即可在细胞培养物上清中检测到病毒RNA，在随后的各代次的细胞培养物中均检测到病毒。M：DNA分子标准；其中泳道 1-7表示：第1、3、5、7、9、11和13代的细胞培养物,；8：阴性对照；

图3 病毒在BHK21细胞上的多步生长曲线。结果表明，细胞适应毒在接种细胞后12h开始迅速增殖，24-60h之间为对数增殖期，84h后病毒进入增殖平台期。

具体实施方式

根据本发明，以贴壁生长的传代细胞接种附着于细胞培养容器的表面，且在对数生长期中生长，直到形成单细胞层。

本发明采用的第一轮种毒鸭黄病毒DFV-F1已于2011年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，病毒株的登记号为CGMCC NO. 4880，现保存于福建省农业科学院畜牧兽医研究所。种毒在单细胞层吸附感作45-60min时，应放置37℃的5% CO₂培养箱中进行，且每间隔10钟需轻轻摇匀接种细胞的病毒液。

接种了病毒的单细胞层用无菌PBS缓冲液清洗未吸附的病毒，弃去洗液，重复1-2次；再加入细胞维持液，置于37℃的5% CO₂培养箱中培养，连续观察5天，记录细胞状态及病变情况。

根据本发明，第一代细胞培养物作为下一轮传代的接种物（种毒），依次连续传代。传代期间，运用已建立的针对该病毒的特异性RT-PCR诊断方法对细胞培养物进行鉴定，同时通过测定细胞培养物中病毒的TCID₅₀计算病毒在细胞中的增殖滴度。

实施例1，病毒的适应性传代

1、用直径6cm的塑料培养皿培养BHK21细胞使成单层。

2、将种毒接种于BHK21细胞（ATCC Number: CCL-10）上, 放置37℃的5% CO₂培养箱中感作45-60min，期间每隔10min摇匀1次。

3、用无菌PBS缓冲液清洗未吸附的病毒，弃去洗液，重复1-2次。

4、加入12-15mL细胞维持液（含2-3%胎牛血清(Gibco公司)及1%双抗(Fermentas公司)的DMEM(Gibco公司)），置于37℃，5%CO₂培养。

5、每天观察2次，记录细胞状态及病变情况，连续观察5d。

6、于第5d或出现严重的细胞病变后，将细胞培养物冻融3次，取适量培养物作种毒进行下一轮传代，重复1-6步骤。

结果表明，病毒感染后，最初在BHK21细胞上不形成细胞病变（CPE），传6代后，病毒感染细胞90h后，细胞出现圆缩、变得更透明，并逐步脱落,110h后，80%的细胞脱落（图1）。

实施例2 病毒的RT-PCR鉴定

在传代过程中，选取第1、3、5、7、9、11和13代的细胞培养物，用鸭黄病毒特异的检测引物（P1:5’- ctt gca aaa cgt ggt aaa tat ggc-3’;P2: 5’-tgt acc aaa tag ctc tac ta-3’）进行了RT-PCR鉴定，该引物可特异性扩增出鸭黄病毒的部分基因片段，片段大小为400bp，操作步骤参考文献（2）的方法进行。

1. 病毒RNA的提取

细胞培养物中总RNA提取的参照Trizol LS Reagent(Invtrogen)说明书进行。具体为：取培养物上清0.25ml，加入0.75mlTRIZOL后充分混合，15-30℃放置5min，加入0.2ml氯仿，振荡离心管15sec，室温放置2-5min，2-8℃不超过12000g离心15min，将上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相），加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒离心管，充分混匀液体，15-30℃放置10min，2-8℃不超过12000g离心10min，去上清后用75%的乙醇清洗2次。自然干燥5-10min后用适量DEPC水溶解沉淀，55-60℃温育10分钟。可立即做反转录或-20℃保存备用。

2．目的基因的RT-PCR扩增

目的基因的扩增参照Takara公司的RT-PCR一步法试剂盒说明书进行，加下列组分倒置于冰上的小离心管中。同时用灭菌水做阴性对照。

组分加入体积终浓度

5×RT-PCR Buffer 10ul 1×

2.5mM dNTP Mix 5ul 0.25 mM

模板 RNA 5 ul 10pg-1ug

上游引物P1（20pmol/uL） 1ul 0.4pmol/ul

反义引物P2（20pmol/uL） 1ul 0.4pmol/ul

RT/Taq Mix 1ul 0.4U/ul

无菌双蒸水至 50ul 。

轻轻混匀，可稍离心确保所有组分都在管底，如需要可在上面覆一层石蜡油，然后进行热循环：首先在37-40℃孵育30-45 min，94℃预变性5min，随后进行35-40 循环PCR 扩增（94℃，15 sec；55-60℃，30 sec； 72℃，20sec），最后在72℃延伸5-10min即可。

3. PCR产物的电泳检测

取PCR产物5ul与6×loading buffer 1ul 混匀，在1%的琼脂糖凝胶上100V电泳40分钟左右，紫外灯下检测有否目的条带。

结果表明，病毒在BHK21细胞上传3代后，即可在细胞培养物上清中检测到病毒RNA，在随后的各代次的细胞培养物中均检测到病毒（图2）。

实施例3 细胞适应毒的生长特性

为了解细胞适应毒在BHK21细胞上的生长特性，选取第8代细胞培养物冻融3次后作种毒接种BHK21细胞，测定不同时间点的病毒滴度（结果以TCID₅₀表示），测定方法参照文献（3），具体为：

毒种接种BHK21细胞后，分别于接种0、12、24、36、48、60、72、84、96、108及120h后取100ul细胞上清，测定不同时间点细胞上清中病毒含量（以TCID₅₀表示）。

TCID₅₀的测定：将上述取自不同时间点的细胞培养物分别进行10倍梯度稀释，横向接种制备好的BHK21单层细胞96孔板，每稀释度重复3孔，每日观察细胞病变，记录高于50%和低于50％病变孔的病毒稀释度。计算比距，获得TCID₅₀。

计算比距：

（高于50％的病变率－50％）/（高于50％病变率－小于50％病变率）＝比距

结果表明，细胞适应毒在接种细胞后12h开始迅速增殖，24-60h之间为对数增殖期，84h后病毒进入增殖平台期（图3）。

参考文献

1. 万春和施少华程龙飞陈红梅傅光华张大丙林芳林建生黄瑜。一种引起种(蛋)鸭产蛋骤降新病毒的分离与初步鉴定，福建农业学报. 2010，25（6）：63-66.

2. 万春和施少华程龙飞陈红梅傅光华彭春香林芳林建生黄瑜。鸭出血性卵巢炎病毒RT-PCR检测方法的建立，福建农业学报. 2010,26（1）:10-12。

3. 傅光华黄瑜程龙飞施少华彭春香林芳林建生. 雏番鸭感染禽副黏病毒1型的分离鉴定, 江西农业大学学报.2005,27(5):769-772。

Claims

1.一种鸭黄病毒细胞培养方法，其特征在于：以贴壁生长的乳仓鼠肾细胞BHK21接种附着于细胞培养容器的表面，形成单细胞层，然后以病毒接种单细胞层，接种了病毒的单层细胞置于37℃的5% CO₂培养箱中培养，将细胞培养物作为下一轮传代的接种物，依次连续传代。

2.根据权利要求1所述的鸭黄病毒细胞培养方法，其特征在于，具体培养步骤如下：

（1）用细胞培养容器培养BHK21细胞使之形成单细胞层；

（2）将种毒接种于BHK21细胞上, 放置37℃的5% CO₂培养箱中感作45-60min，期间每隔10min摇匀1次，第一轮种毒为鸭黄病毒；

（3）用无菌PBS缓冲液清洗未吸附的病毒，弃去洗液，重复1-2次；

（4）加入12-15mL细胞维持液，置于37℃，5%CO₂培养；

（5）观察细胞状态及病变情况；

（6）于连续培养第5d或出现严重的细胞病变后，将细胞培养物冻融3次，取细胞培养物作种毒进行下一轮传代, 重复1-6步骤。

3.根据权利要求2所述的鸭黄病毒细胞培养方法，其特征在于：所述细胞维持液为含2-3%胎牛血清及1%双抗的DMEM。