CN114107170B - 猫肾悬浮细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents

猫肾悬浮细胞系及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了猫肾悬浮细胞系及其构建方法与应用。该猫肾悬浮细胞系，名称为猫肾悬浮细胞CRFK‑SC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021239，目前已传至52代，形态以均一透亮圆形为主；病毒敏感性试验显示，该猫肾悬浮细胞系对猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒敏感；该细胞系可用于培养、分离、检测病毒，制备病毒疫苗，筛选用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。

Description

猫肾悬浮细胞系及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猫肾悬浮细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
随着宠物行业的不断发展，宠物饲养数量逐年增多，以宠物猫和宠物狗为主，在宠物带给人们快乐的同时，宠物健康问题也威胁着公共安全。目前危害宠物猫的病毒主要有猫细小病毒，犬细小病毒，猫冠状病毒，猫疱疹病毒等，而对宠物猫产生严重危害的病毒就是猫细小病毒。
猫肾细胞系CRFK细胞，取自雌性个体，由猫肾原代细胞通过传代克隆筛选转化而来的工程细胞系，体外培养呈贴壁生长，可进行连续传代培养，CRFK细胞对多种宠物病和特产经济动物病病毒比较敏感，如犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)、猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPLV)、猫疱疹病毒(feline herpesvirus，FHV)、犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)、猫冠状病毒(feline coronavirus，FCoV)、犬冠状病毒(canine coronavirus，CCoV)、猫流感(猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)、猫传染性鼻气管炎病毒(Feline infectious rhinotracheitis virus，FIRV)、水貂病毒性肠炎病毒(Minkenteritis virus，MEV)、水貂阿留申病毒(aleutian mink disease virus)等等，目前广泛应用于这几种疫病疫苗病毒的制备。
CRFK细胞具有培养容易、增殖快、猫细小病毒感染效率高等的特点，是国内外公认的最适合猫细小病毒培养的细胞系。其通常是以贴壁培养生长，细胞之间互相衔接或呈镶嵌状排列，并会在表面集合形成紧密的连接蛋白，从而形成单层贴壁细胞。但是，该培养方式存在一些缺陷，比如贴壁培养受基质表面积限制导致病毒产量下降；贴壁培养过程中换液等程序较为复杂繁琐，血清的使用易受微生物、病毒和支原体等的污染。
随着兽用疫苗行业的发展，疫苗的制备技术也已经从沿袭数年的传统转瓶工艺向生物反应器悬浮技术发展，很多专利均公开了利用纸片载体或微载体细胞悬浮培养方法生产病毒疫苗的方法；依赖载体的悬浮培养技术的应用在一定程度上提高了生产自动化，克服了转瓶工艺技术的众多不足，但本质上还是贴壁培养，仍需要转瓶提供种子细胞，需要添加昂贵的载体，还要增加载体培养消化等步骤，细胞生长仍需要高血清含量的培养基，而且细胞生长受众多因素限制不能最大化生长，细胞密度提高幅度有限，尤其是在工业放大方面有重大的先天缺陷，这限制了该技术的大规模化应用。随着兽用疫苗生产发展自动化、规模化的需求，无载体全悬浮细胞培养技术成为新的发展趋势。生物反应器细胞全悬浮培养技术中，细胞生长不再受载体限制，省掉了载体培养消化等步骤，细胞培养更为简易，更有线性化放大的优势，适于工业化大规模生产，这在宠物疫苗方面也有公开。
因为无血清贴壁培养也只适用于试验研究，不适用于大规模培养，不能满足病毒疫苗等实际生产需要。因此，驯化CRFK细胞使之适应低血清或无血清悬浮培养、以之作为载体生产猫细小病毒疫苗，是成为制备安全、有效、质量可控的宠物疫苗的关键。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种猫肾悬浮细胞系。
本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的猫肾悬浮细胞系的构建方法。
本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的猫肾悬浮细胞系的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种培养病毒的方法。
本发明第五方面的目的，在于提供一种病毒疫苗的制备方法。
本发明第六方面的目的，在于提供一种病毒疫苗。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种猫肾悬浮细胞系，名称为猫肾悬浮细胞CRFK-SC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021239。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系的构建方法，包括如下步骤：1)对贴壁培养型CRFK细胞进行低血清驯化，然后进行全悬浮培养基驯化，得到适应全悬浮培养基低血清贴壁培养型CRFK细胞系；2)对适应全悬浮培养基低血清贴壁培养型CR FK细胞系进行全悬浮无血清驯化，得到猫肾悬浮细胞系。
优选地，步骤1)中所述低血清驯化包括如下步骤：依次将贴壁培养型CRFK细胞接种至含7.5～8.5％、5.5～6.5％、3.5～4.5％、1.5～2.5％胎牛血清的MEM培养基中进行传代培养。
优选地，不同浓度的胎牛血清的MEM培养基中培养3～10代。
优选地，不同浓度的胎牛血清的MEM培养基中的传代比例为1:(2～5)。
优选地，所述传代培养的条件为35～38℃，4～6％CO2，pH6.5～7.5。
优选地，所述全悬浮培养基驯化的步骤如下：将经过低血清驯化的贴壁培养型CRFK细胞接种至1.5～2.5％胎牛血清的全悬浮培养基中进行传代培养。
优选地，所述全悬浮无血清驯化包括如下步骤：依次将适应全悬浮培养基低血清贴壁培养型CRFK细胞系接种至0.75～1.5％、0.25～0.75％、0％胎牛血清的全悬浮培养基。
本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系的应用：
本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系在培养病毒中的应用；
本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系在制备培养病毒的产品中的应用；
本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系在分离病毒中的应用；
本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系在制备分离病毒的产品中的应用；
本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系在非诊断治疗目的地检测病毒中的应用；
本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系在制备检测病毒的产品中的应用；
本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系在制备疫苗中的应用；
本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系在药物筛选中的应用，所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。
优选地，所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种。
优选地，所述猫细小病毒为FPLV BJ04。
本发明的第四个方面，提供一种培养病毒的方法，将病毒接种至本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系，培养。
优选地，所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种。
优选地，所述猫细小病毒为FPLV BJ04。
优选地，所述培养的条件为31～39℃、4～6％CO2；进一步为33～37℃、5％CO2。
本发明的第五个方面，提供一种病毒疫苗的制备方法，将病毒接种至本发明第一方面的猫肾悬浮细胞系，培养，灭活，得到病毒疫苗。
优选地，所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种。
优选地，所述猫细小病毒为FPLV BJ04。
本发明的第六个方面，提供一种病毒疫苗，通过本发明第五方面的制备方法得到。
本发明的有益效果是：
本发明通过发明人的大量创造性劳动，首次构建得到猫肾悬浮细胞系，名称为猫肾悬浮细胞CRFK-SC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021239，目前已传至52代，形态以均一透亮圆形为主，可在无血清全悬浮培养基中正常生长；病毒敏感性试验显示，该猫肾悬浮细胞系对猫细小病毒、犬细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒敏感；该细胞系可用于培养、分离、检测病毒，制备病毒疫苗，筛选用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。
附图说明
图1是实施例4中对照组中猫肾悬浮细胞的结果图。
图2是实施例4中猫肾悬浮细胞按1MOI接毒量接FPLV-BJ04毒株48h后的结果图。
图3是实施例4中猫肾悬浮细胞按1MOI接毒量接FPLV-BJ04毒株72h后的结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中所使用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
本实施例中采用的CRFK贴壁细胞由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所宠物疫病防控创新团队崔尚金老师惠赠，该细胞已在文献：刘琪,史利军,梁琳,等.一株猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其VP2和NS1基因的变异分析[J].畜牧兽医学报,2019,050(005):1106-1112.中公开。
实施例1猫肾悬浮细胞系的构建
1.复苏一支贴壁培养型CRFK细胞，接种到含8％胎牛血清的MEM培养基(以MEM(Gibco公司产品)为基础培养基，分别添加8％胎牛血清(Gibco公司产品)得到)进行培养，培养条件为37℃，5％CO2，pH6.8～7.2；待细胞贴壁、培养瓶中单层汇合度达90％以上后，完全弃去培养液，用0.25％EDTA-胰酶消化分散，按照常规方法传代培养5代；
2.将步骤1所获得的贴壁培养型CRFK细胞依次用含6％、4％、2％胎牛血清的MEM培养基依次各培养6代，传代比例按1：3分瓶，培养条件为37℃，5％CO2，pH6.8～7.2；
3.用含2％胎牛血清的全悬浮培养基(购买自苏州市沃美生物技术有限公司，型号为BS-SFM，BSS20310-2)将步骤2最后一代所获得的细胞进行贴壁培养，待细胞贴壁、培养瓶中单层汇合度达90％以上后，完全弃去培养液，用0.25％EDTA-胰酶消化分散，传代比例按1:2分瓶，培养条件为37℃，5％CO2，pH6.8～7.2，连续传代培养5代，得到适应全悬浮培养基低血清贴壁培养型CRFK细胞系；
4.用含2％胎牛血清的全悬浮培养基将步骤3最后一代所获得的细胞，密度调整至5×105cells/mL，培养条件为37℃，5％CO2，50r/min摇床培养；待细胞密度达到2×106cells/mL时，用含1％胎牛血清的全悬浮培养基按1：4比例分瓶培养；待细胞密度达到2×106cells/mL时，用含0.5％胎牛血清的全悬浮培养基按1：3比例分瓶培养；连续传代五次后，驯化得到低血清全悬浮培养型CRFK细胞系，培养条件为37℃，5％CO2，pH6.8～7.2，80r/min摇床培养；
5.将步骤4得到的低血清全悬浮培养型CRFK细胞系，离心后加入无血清全悬浮培养基，吹打悬浮细胞并计数，将细胞用无血清全悬浮培养基稀释为10cells/mL，取细胞悬液100μL/孔加入96孔细胞培养板，培养条件为37℃，5％CO2，pH6.8～7.2；
6.在步骤5的96孔细胞培养板中，挑选出多个仅有1个细胞/孔的培养孔，再从中挑选出生长良好的细胞单株，将其转移至24孔板继续培养，弃掉生长状态不好的孔，培养条件为37℃，5％CO2，pH6.8～7.2；
7.在步骤6的24孔细胞培养板中，挑选生长良好的细胞株，将其转移至6孔板继续培养，弃掉生长状态不好的孔，培养条件为37℃，5％CO2，pH6.8～7.2；
8.在步骤7的6孔细胞培养板中，挑选生长良好的细胞株，将其转移至25cm2细胞培养瓶中继续培养，培养条件为37℃，5％CO2，pH6.8～7.2；
9.将步骤8中筛选后得到的细胞，待细胞生长至90％时，转移至摇瓶继续培养，调整细胞密度为5×105cells/mL，培养条件为37℃，5％CO2，pH6.8～7.2，100r/min摇床培养，驯化得到无血清全悬浮培养型CRFK细胞系，命名为猫肾悬浮细胞系，在镜下观察呈单个、透亮、细胞轮廓清晰，透亮度高。细胞按1×106cells/mL密度进行接种传代，48h后细胞密度可达到5～8×106cells/mL。
上述猫肾悬浮细胞系，名称为猫肾悬浮细胞CRFK-SC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021239。
实施例2猫肾悬浮细胞的培养方法
猫肾悬浮细胞的培养方法，包括如下步骤：
1.复苏全悬浮培养型CRFK细胞，加入无血清全悬浮培养基，使初始密度在8×105cells/mL，培养条件为37℃、5％CO2、120r/min摇床培养；
2.传代5次，扩大到3L，以初始密度在8×105cells/mL，接入10L生物反应器培养，培养条件为温度37℃、溶氧50％、pH6.8，50r/min；
3.待密度增殖到6×106cells/mL时，补加3L无血清全悬浮培养基后，继续培养；
4.扩大到45L，以初始密度在8×105cells/mL，接入100L生物反应器培养，培养条件为温度37℃、溶氧50％、pH6.8，50r/min；
5.扩大到340L，以初始密度在8×105cells/mL，接入500L生物反应器培养，培养条件为温度37℃、溶氧55％、pH7.0，50r/min。
实施例3猫细小病毒感染猫肾悬浮细胞系的敏感性
取猫肾悬浮细胞系第45代细胞，37℃、5％CO2、120r/min培养48h，生长稳定后，调整活细胞密度为1×106cells/mL接种于125mL细胞摇瓶中，体积为20mL，猫细小病毒(FPLVBJ04，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所宠物疫病创新团队赠送，已在文献：刘琪,史利军,梁琳,等.一株猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其VP2和NS1基因的变异分析[J].畜牧兽医学报,2019,50(5):1106-1112.中公开)以1MOI进行接毒，培养72h后，活细胞数大于1×106cells/mL，细胞活率在50％时收获。经TCID50检测均不低于107.0TCID50(分别为107.0TCID50、107.5TCID50、107.1TCID50)，且HA效价均在210以上(分别为210、211、211)，已经达到了做疫苗的标准。接毒48、72后，观察细胞病变情况，结果如图2、3所示：有少量细胞团，细胞透亮度降低，细胞碎片渣滓较多，72h取样细胞染色后死细胞占50％，对照组(加入等量全悬浮培养基)细胞图如图1所示：细胞单个生长，透亮度高细胞碎片较少。可见，猫肾悬浮细胞系对猫细小细胞敏感。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种猫肾悬浮细胞系，名称为猫肾悬浮细胞CRFK-SC，于2021年9月16日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021239。
2.权利要求1所述的猫肾悬浮细胞系在（1）～（4）中任一项中的应用；
（1）培养病毒；
（2）制备培养病毒的产品；
（3）非诊断治疗目的地分离病毒；
（4）制备分离病毒的产品；
所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种。
3.权利要求1所述的猫肾悬浮细胞系在（5）～（6）中任一项中的应用；
（5）非诊断治疗目的地检测病毒；
（6）制备检测病毒的产品；
所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种。
4.权利要求1所述的猫肾悬浮细胞系在（7）～（8）中任一项中的应用；
（7）制备病毒疫苗；
（8）药物筛选；
所述药物为用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物；
所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种。
5.一种培养病毒的方法，将病毒接种至权利要求1所述的猫肾悬浮细胞系，培养；所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种。
6.一种制备病毒疫苗的方法，将病毒接种至权利要求1所述的猫肾悬浮细胞系，培养，灭活，得到病毒疫苗；所述病毒为猫细小病毒、犬细小病毒、猫杯状病毒、猫传染性鼻气管炎病毒和水貂病毒性肠炎病毒中的至少一种。
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